Gültigkeit der mRNA Quantifizierung unter Verwendung einer

Gültigkeit der mRNA Quantifizierung unter Verwendung einer externen
rekombinanten RNA sowie einer rekombinanten DNA Kalibrierkurve in der real-time
RT-PCR
Validities of mRNA quantification using recombinant RNA and recombinant DNA external
calibration curves in real-time RT-PCR
Pfaffl, M.W. und Hageleit, M.: Biotechnology Letters 23 (2001) 275-282
Die Reverse Transkription mit folgender Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) ist heutzutage
die Methode der Wahl um extrem niedrige mRNA Expressionen zu detektieren und zu
quantifizieren. Die real-time RT-PCR mittels SYBR Green I Detektion kombiniert die
Praktikabilität mit der nötigen Genauigkeit, um in schnellster Zeit zuverlässige und exakte
Quantifizierungsergebnisse zu erhalten. Doch auch innerhalb der real-time RT-PCR gibt es
verschiedenste Ansätze, die sich in ihrer Genauigkeit, ihrer Reproduzierbarkeit als auch in
ihrem absoluten Messbereich unterscheiden. Um spezifische Transkripte unbekannter
Konzentration im Probenmaterial genau und zuverlässig zu quantifizieren, muss eine externe
Kalibrierkurve hergestellt werden. Generell sind zwei Typen externer Standardkurven
möglich: A) eine externe Kalibrierkurve basierend auf einem rekombinanten RNA (rekRNA)
Standard und B) eine externe Kalibrierkurve basierend auf einem rekombinaten DNA
Standard (rekDNA).
Beide Kalibrierkurven Modelle (rekRNA und rekDNA) wurden mit einer nativen Leber RNA
in einer real-time RT-PCR verglichen. Als Template wurde das IGF-1 mRNA Transcript
herangezogen. IGF-1 ist ein Zytokin und wirkt mitogen auf Zellen, die Proteinsynthese wird
stimuliert, der Proteinabbau reduziert und gleichzeitig wird die Glukoseutilisation in den
Geweben verbessert.
Die real-time RT-PCR wurde als zweistufige RT-PCR durchgeführt, d.h. RT und PCR in
getrennten Reaktionen. Um die mRNA Quantifizierung in der Spezifität als auch in der
Sensitivität zu optimieren und zu verbessern, wurde zu den klassischen drei PCR Schritten
(Denaturierung; Primer Hybridisierung und Elongation durch die Polymerase) noch ein
vierter Schritt bei erhöhtem Temperaturlevel mit einbezogen, bei dem die
Fluoreszenzmessung in LightCycler stattfand. Bei 85°C konnten die unspezifische Produkte
sowie die Primer Dimer Strukturen bereits aufgeschmolzen werden und folglich wurden sie
nicht mehr als falsch positive Signale erfasst. In der folgenden Tabelle sind die Eigenschaften
der beiden Kalibriersysteme im Vergleich mit einer nativen Leber IGF-1 RT-PCR dargestellt.
Tabelle: Charakterisierung der real-time IGF-1 LightCycler PCR mittels rekRNA oder ss
rekDNA externer Kalibrierkurven im Vergleich mit einer nativen Leber total RNA. Intra- and
Inter-Assay Variationen sind als Mittelwerte aus 4 unabhängigen Messungen angegeben.
IGF-1 rekRNA
Kalibrierkurve
IGF-1 rekDNA
Kalibrierkurve
unbekannte
IGF-1 mRNA
Startmatrize
IGF-1 recRNA
IGF-1 recDNA
IGF-1 mRNA
PCR Effizienz
1,77
1,93
1,89
Detektionslimit
16 Moleküle
6 Moleküle
80 pg Leber total
RNA
Quantifizierungslimit
1600 Moleküle
60 Moleküle
500 pg Leber total
RNA
60 – 6 x 1010
Quantifizierungsbereich 1600 - 1.6 x 1010 Moleküle
Moleküle (r =
(Testlinearität)
(r = 0,992)
0,996)
500 pg - 50 ng
Leber total RNA
(r = 0,933)
Intra-Assay Variation
2,7% (n = 4)
0,7% (n = 4)
1,2% (n = 4)
Inter-Assay Variation
4,5% (n = 4)
2,6% (n = 4)
4,9% (n = 4)
Beide Standardsysteme zeigten ein sehr sensitives Detektionslimit von 16 bzw. 6
rekombinanten Molekülen pro Reaktionsansatz. In der nativen Probe konnten in 80pg Leber
total RNA noch 13 Moleküle quantifiziert werden. Der Quantifizierungsbereich in der realtime RT-PCR umfasst bis zu 9 Größenordnungen bei gegebener hoher Testlinearität
(r>0,992). Die Testvarianzen liegen mit <4,9% auf sehr niedrigen Niveau, und garantieren
eine hohe Reproduzierbarkeit. Die PCR Amplifikationseffizienzen sind sich im nativen
System und im rekDNA Modell am nächsten. Die Effizienz im rekRNA Modell ist ca. 12%
geringer.
Schlussfolgerung: Die erreichte Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit in allen
untersuchten Modellen erlaubt eine absolute und korrekte Quantifizierung der IGF-1 mRNA
selbst in Geweben mit geringsten mRNA Konzentrationen (low abundant tissues). Die
Vorteile des rekDNA Modells liegen in der leichteren Herstellung der Kalibrierkurve als auch
in ihrer höheren Reproduzierbarkeit. Unserer Meinung nach ist das Modell mit der rekDNA
besser geeignet als Standardmodel. Es besitzt einen größeren Quantifizierungsbereich, eine
höhere Reproduzierbarkeit sowie PCR-Effizienz und zeigt eine bessere Näherung an die
nativen RT-PCR Bedingungen. Dieses rekDNA Modell wurde bereits auf mehreren Spezies
angewendet, die hohe Sequenzhomologien zum bovinen (Bos taurus) IGF-1 Amplifikat
zeigen: Hausschwein (Sus scrofa), Schaf (Ovis aries) und Primaten (Callithrix jacchus).
© Lehrstuhl für Physiologie,
Letzte Änderung: 06.10.2009, Renate Schöpf