Instrumentelle Analytik AFS - Fluorimetrie Seite 2.6 Fluorimetrie und

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2.6 Fluorimetrie und Phosphorimetrie
AES:
Thermische Anregung der Atome
Fluorimetrie: Anregung der Atome oder Moleküle durch Strahlungsabsorption.
(Linienstrahler: HKL, Laser; Kontinuumstrahler: Xe- oder Hg(Xe)-Hochdrucklampe)
Proben:
gasförmig (z.B. Atome im Plasma)
flüssig (z.B. Moleküle in Lösung)
fest
2.6.0 Atom-Fluoreszenz-Spektrometrie AFS
Im Unterschied zur AES erfolgt bei der Atom-Fluoreszenz-Spektrometrie AFS die Anregung der
Atome optisch mit Hilfe von:
• HKL (schmalbandige Einstrahlung und Absorption elementspezifischer Wellenlängen)
• Xenonhochdrucklampe (spektral gefilterter Kontinuumstrahler)
• Laser (z.B. auf eine Absorptionswellenlänge abgestimmte Farbstofflaser)
Messprinzip eines AF-Spektrometers
• Probe wird in heißer Flamme (ICP)
atomisiert. Die Atome befinden sich
in der Flamme überwiegend im
Grundzustand (Boltzmannfaktor).
• Resonanzabsorption der schmalbandigen
Anregungsstrahlung entsprechend
hf = WAbsorption ,
d.h. die Anregungswellenlänge wird auf
einen Absorptionsübergang abgestimmt.
• Unter Emission der Anregungsenergie
oder Teilen davon in Form von
Fluoreszenzlicht kehren die Atome in
den Grundzustand oder einen niedrigeren
Anregungszustand zurück.
• Die Wellenlänge des emittierten Fluoreszenzlichtes ist charakteristisch für die Atomsorte
und wird mit Hilfe eines Filters bzw. Monochromators isoliert und mit einem
geeigneten Detektor gemessen.
• Der Monochromator beseitigt dabei störende Fluoreszenz bei anderen Wellenlängen.
• Um die störende Eigenemission der Flamme zu eliminieren, moduliert man die
Anregungsstrahlung. Damit wird vom Detektor nur das Fluoreszenzlicht registriert,
das durch die Anregungsstrahlung hervorgerufen wird (Lock-In-Verstärker).
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Arten der Atomfluoreszenz
Man unterscheidet verschiedene Arten von Atomfluoreszenz:
1) Resonanzfluoreszenz
(Fluoreszenzstrahlung besitzt die gleiche Wellenlänge wie die absorbierte Strahlung)
2) Thermisch unterstützte Resonanzfluoreszenz
3) Direktlinienfluoreszenz
(Fluoreszenz bei größeren Wellenlängen, als es der absorbierten Strahlung entspricht).
Beispiel: Thallium
Anregungswellenlänge 377,6 nm; Fluoreszenz 535,0 nm in metastabilen Zustand
4) Stufenweise Fluoreszenz
(Das in einen höheren Zustand angeregte Atom geht zunächst durch Deaktivierung in
den ersten angeregten Zustand über).
Beispiel: Natrium
Anregungswellenlänge 330,3 nm (32S1/2  42P3/2); Fluoreszenz 589,0 nm (32P3/2  32S1/2)
5) Thermisch unterstützte Anti-Stokes-Fluoreszenz
6) Thermisch unterstützte Direktlinien-Fluoreszenz
7) Thermisch unterstützte stufenweise Anti-Stokes-Fluoreszenz
Bedeutung der AFS
• AFS ist eine Emissionsmethode  hoher Dynamikbereich bis zu 5 Zehnerpotenzen.
Daher: Erweiterung des Arbeitsbereichs z.B. bei der Quecksilberbestimmung mit
Kaltdampf-AAS durch die Kaltdampf-AFS.
• Die strengsten Normen für die Quecksilberbestimmung in den USA und Europa basieren
auf der Methode der Atomfluoreszenz.
- Für die USA wurde mit der EPA Methode 1631 „Mercury in Water by Oxidation, and Cold
Vapor Atomic Fluorescene Spectrometry” eine Bestimmungsgrenze von 0,5 ng/l
bei einer Nachweisgrenze von 0,2 ng/l festgeschrieben.
- Für Europa gilt die CEN TC 230, die auf Trinkwasser, Oberflächenwasser, Grund- und
Regenwasser anwendbar ist. Der Arbeitsbereich hier liegt von 1 ng/l bis 100 ng/l und die
dazugehörige Verfahrensnachweisgrenze bei < 1 ng/l..
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2.6.1 Fluoreszenzspektrometrie (Molekülfluoreszenz)
Lumineszenz: (Oberbegriff)
Emission von Licht im UV/VIS/IR nach vorangegangener Anregung des Elektronensystems.
Unterscheidung nach Anregungsart:
• Chemolumineszenz - Anregung durch chemische Reaktionen
• Biolumineszenz - Anregung durch biochemische Reaktionen
• Thermolumineszenz - thermische Elektronenanregung
• Radiolumineszenz - Anregung durch - Teilchen, Ionen oder -Quanten
• Photolumineszenz - analytisch genutzte Anregung durch Absorption von Licht
Photolumineszenz ist der Oberbegriff für Fluoreszenz und Phosphoreszenz.
Fluoreszenzintensität
Nach der Anregung des Elektronensystems durch Absorption existieren drei Möglichkeiten
für die Rückkehr in den Grundzustand:
• strahlungslose Deaktivierung (Energieabgabe durch Stoß, Umwandlung in Wärme)
• Fluoreszenzemission (Strahlungsübergang zwischen Singulettzuständen S1  S0)
• Phosphoreszenz (ISC in einen angeregten Triplettzustand, Emission daraus ist spinverboten
und deshalb wesentlich langsamer - µs bis s)
F 
Anzahl der emittierten Photonen
Anzahl der absorbierten Photonen
Fluoreszenzquantenausbeute
I  I 010 cd
Lambert-Beer
I A  I 0  I 010 cd  I 0 (1  10 cd )
von der Probe absorbiert
I Fl   F I A   F I 0 (1  10 cd )
für A  cd  0,05 liefert Entwicklung
I Fl   F I 0 (ln 10  cd )
Intensität des Fluoreszenzlichtes  c
Kalibration erfolgt üblicherweise in einer Messreihe mit Standards
Für eine vereinfachte Einpunktkalibration gilt
I Fl (Probe)
c(Probe)

I Fl (Standard) c(Standard)
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Entstehung des Fluoreszenzsignals (nach  Franck-Condon-Prinzip)
Potentialdiagramm,
Franck-Condon Prinzip
Kasha-Regel:
Fluoreszenz geht nur vom relaxierten
(= schwingunslosen) S1- Zustand aus.
Ungefähre Spiegelsymmetrie zwischen
Absorptionsspektrum (Anregung) und
Fluoreszenzspektrum (Emission)
Ursache: Franck-Condon Prinzip,
Schwingungsrelaxation im ps-Bereich,
Fluoreszenz im ns-Bereich
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Prozesse bei der Photolumineszenz (Übersicht nach Jablonskischema)
• Absorption A
(S0  Sn)
• Fluoreszenz
(S1  S0)
• Phosphoreszenz P
(T1  S0 strahlend))
• Interne Conversion IC
(S1  S0)
• Intersystem Crossing ISC
(S1  T1)
• Vibronische Relaxation R , VR
(Schwingungsrelaxation
Fluoreszenzfähigkeit und Molekülstruktur
Konkurrenzprozesse: IC zum Grundzustand und ISC zum Triplettzustand. Folglich ist die
Fluoreszenzquantenausbeute groß, wenn Konkurrenzprozesse vergleichsweise langsam sind.
Starke Fluoreszenz: Starrer Molekülbau mit großen mesomeren Systemen und Doppelbindungen
(kleine IC-Raten):
Aromaten, kondensierte Aromaten, Heterocyclen, Carbonylverbindungen
Keine Fluoreszenz: Flexible Moleküle (sehr schnelle IC-Raten):
Halogensubstituierte Substanzen (Jod) haben meist hohe ISC-Raten.
Beispiel: Chininsulfat fluoresziert, Chininhydrochlorid fluoresziert nicht
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Mitunter steigt die Fluoreszenz drastisch, wenn flexible Moleküle starr fixiert werden, z.B. durch
Adsorption, Kondensation, Bildung von Komplexen.
Aufbau eines Spektralfluorimeters
Lichtquelle: Hochdruckgasentladungslampe (Xe, Hg, Hg(Xe))
Anregungsmonochromator: Selektion des Anregungslichtes, meist Wellenlänge des langwelligsten
oder intensivsten Absorptionsmaximums der Probe
Emissionsmonochromator: Messung der spektralen Verteilung des Fluoreszenzlichtes
Empfänger: PMT, Korrektur der spektralen Empfindlichkeit erforderlich
Küvetten: meist vierseitig polierte Quarzglasküvetten
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Messgeometrie:
a) Beobachtung unter 90°
bei schwach absorbierenden Proben.
Zusätzlich kann noch ein Hohlspiegel hinter
der Probe angebracht werden.
b) Beobachtung in Re-Emission (z.B. 30°/60°)
bei stark absorbierenden oder trüben Proben, sowie
bei Feststoffen.
Bei einem Einfallswinkel von 53° tritt kein störender
Reflex auf (Brewster-Winkel für nH2O = 1,33).
Zwei unterschiedliche Messmodi
(Zunächst wird meist das Absorptionsspektrum gemessen.)
Anregungsspektrum
Emissionsmonochromator: steht fest auf E
Emissionsintensität wird als Funktion der
Anregungswellenlänge A registriert: A < E
Emissions/Fluoreszenzspektrum
Anregungsmonochromator: steht fest auf A
Emissionsintensität wird als Funktion der
Emissionswellenlänge E registriert: E > A
Wichtig:
Fluoreszenzanregungsspektrum gleicht dem
Absorptionsspektrum unter folgenden
Bedingungen:
• Absorption der Probe muss hinreichend klein
sein (A < 0,01), damit die Zahl der
absorbierten Quanten proportional zur
Absorption ist.
• Die Fluoreszenzquantenausbeute ist unabhängig
von der Anregungswellenlänge (meist erfüllt).
• Es sind keine absorbierenden Verunreinigungen
vorhanden, die zur Fluoreszenz der
Substanz beitragen!
Wichtiges Reinheitskriterium !
Anregungs- und Emissionsspektrum von Anthrazen
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Lösungsmittel
• Ethanol, Isopropanol, Acetonitril, Wasser, Dioxan, Aceton, Cyklohexan, Pentan
• hohe Reinheitsanforderungen: keine Eigenabsorption, keine Eigenfluoreszenz.
Störungen:
• Quencheffekte (Fluoreszenzlöschung):
z.B. gelöster Luftsauerstoff, polare Lösungsmittel oder Matrixbestandteile
• Selbstabsorption bei zu hoher Konzentration
(keine Linearität von Fluoreszenz und Konzentration).
• spektrale Verschiebungen und Änderungen in der Fluoreszenzausbeute
(besonders in polaren Lösungsmitteln und bei Änderung des ph-Wertes)
Vorteile der Fluoreszenzmessung
• "Null-Methode"  Nachweisempfindlichkeit bis in den ppb-Bereich
• hohe Selektivität und Spezifität (besser als bei Absorptionsmessung):
Differenzierung bezüglich Anregung und Emissionswellenlänge möglich.
• hohe Selektivität:
wenige Substanzen zeigen Fluoreszenz
Messung auch in Gegenwart anderer (nichtfluoreszierender) Stoffe
Quantenausbeute der Fluoreszenz und Phosphoreszenz für einige wichtige Verbindungen
 F  Fluoreszenzquantenausbeute
 P  Phosphoreszenzquantenausbeute
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Dreidimensionale Darstellung der Fluoreszenzspektren eines Polycyclen-Gemisches
Beispiel aus der Pharmazie: Protease-Hemmstoffentwicklung mit Fluoreszenzmarkern
Enzyme, die Proteine spalten können, spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorbildung.
Ein potenter Protease-Hemmstoff inaktiviert z.T. die Protease.
Fluoreszierender
Substituent
Quenchender
Substituent
Hemmstoff
Ein Substratprotein der Protease
wird zunächst mit einem Fluorophor
und – in räumlicher Nähe dazu – mit
einem quenchenden Substituenten
versehen. Das so modifizierte Protein
zeigt keine Fluoreszenz
Aktive Protease zerschneidet das
Substratprotein, u. a. zwischen
Fluorophor und Quencher
Fluorophor und Quencher sind nun
nicht mehr durch Protein
miteinander verbunden und
entfernen sich voneinander. Die
Fluoreszenz nimmt mit der Zeit bis
zu einem Maximalwert zu.
Ein potenter Protease-Hemmstoff
inaktiviert z.T. die Protease. Die
Fluoreszenzintensität nimmt dann
nur langsam zu
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Fluorimetrische und phosphorimetrische Nachweisgrenzen
Verbindung
Nachweisgrenze
in µg/L
Fluorimetrie
1.
2
3.
4.
Aromatische Kohlenwasserstoffe
Benzo[a]pyren
Benzo [ghi]perylen
Dibenz[a, c]anthracen
20 -Methyl-cholanthren
Aminosäuren
Phenylalanin
Tryptophan
Tyrosin
Alkaloide
Cocain
Strychnin
Reserpin
Chinin
Tetrahydrocannibino
Vitamine
Folsäure
Riboflavin
Vitamin-A-Acetat
3
5
7
8
100
3
10
0,1
0,5
8
2
1
7
0,1
1
Phosphorimetrie
1.
2.
3.
4.
Aromatische Kohlenwasserstoffe
Phenanthren
Coronen
Triphenylen
Aromatische Carbonylverbindungen
Benzaldehyd
Benzoesäure
Anthrachinon
Anthron
Aminosäuren
Phenylalanin
Tryptophan
Tyrosin
Pharmazeutjka und Alkaloide
Aspirin
Phenacetin
Atropin
Cocain
Codein
Morphin
Nicotin
30
20
2
4
5
10
1
400
2
10
100
200
100
10
10
10
10