cDNA Arrayanalyse LPC-präparierter melanozytärer Zellen PDF

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cDNA Arrayanalyse LPC-präparierter melanozytärer Zellen
Die Vervollständigung des Humanen Genomprojektes [1] eröffnet für die molekulare Medizin neue
Aufgaben und stellt mit den Sequenzinformationen fantastische Möglichkeiten zur Verfügung. Die
Weiterentwicklung der cDNA-Arraytechnik und der Chiptechnologie bahnen zusammen mit diesen
Informationen den Weg für neue Möglichkeiten, die Biologie der Haut zu verstehen. Aufgrund der
vielfältigen Funktionen, die die Haut für unseren Körper erfüllt, ist auch ihr Aufbau entsprechend
komplex, wie es im Menu „Struktur Hautmodell“ auf dieser Webseite dargestellt ist. Der Vorteil eines
Hautmodells im Vergleich mit einer Biopsie aus pathologisch verändertem Gewebe liegt vor allem in der
Zahl vitaler Zellen im Hautmodell und der einfachen Verfügbarkeit reproduzierbarer Modelle. Zu diesen
wichtigen Vorteilen der Nutzung von Hautmodellen für Sicherheits- und Wirksamkeitstestungen von
Substanzen. kommt hinzu, dass Biomoleküle wie Nukleinsäuren (DNA und RNA) und Proteine für die
Analytik leicht in ausreichenden Mengen aus den Hautmodellen zu isolieren sind.
Es stehen bisher nur wenige pathologisch veränderte Hautmodelle zur Verfügung, weil Hautmodelle in
aller Regel aus primären Zellen gesunder Spender hergestellt werden. Allerdings könnte durch
aufwendige Kulturbedingungen beispielsweise ein hyperproliferatives Wachstum von Keratinozyten in
der Basalzellschicht induziert werden, wie es bei der Entstehung der Psoriasis vorkommt. Ein Vergleich
mit psoriatischer Haut bleibt aber künstlich, da bei der Entstehung der Psoriasis auch immunologische
Prozesse eine Rolle spielen [2]. Nach wie vor ist die Analyse von Biopsiematerial aus pathologisch
verändertem Gewebe wichtig, um pathogenetische Vorgänge zu verstehen. Ich möchte hier deshalb
darstellen, wie es mit modernen Techniken der Polymersekettenreaktion (PCR) möglich ist, aus wenigen
Nanogramm RNA reproduzierbare Proben für die Hybridisierung eines cDNA Chips oder cDNA Arrays
zu synthetisieren.
Mit dem „Laser Pressure Catapulting“ (LPC) können aus histologisch
gefärbten Kryoschnitten
(Hämatoxylin-Eosin/ HE) gezielt einzelne Zellen oder Zellgruppen aus dem Zellverband der Haut
herausgeschnitten werden. Dieses geschieht mit einem Laserstrahl, der über ein Mikroskop gesteuert
wird. In folgender Abbildung ist das typische mikroskopische Bild bei einer LPC-Sitzung zu sehen:
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Abbildung 1: Schritte bei
der Lasermikrodissektion mittels LPC. a: vor Mikrodissektion, b: nach Mikrodissektion, c: nach
Katapultieren der melanozytären Zellen. (a) zeigt einen HE gefärbten Kryoschnitt einer Biopsie eines
melanozytären Nävus. Die melanozytären Zellen wurden mittels Lasermikrodissektion aus dem
Gewebeverband geschnitten (b) und herauskatapultiert (c).
Diese Technik ermöglicht beispielsweise die spezifische Charakterisierung der melanozytären Zellen in
einem Melanom oder einem melanozytären Nävus. Da aus den mit LPC präparierten Zellen nur wenige
Nanogramm RNA isoliert werden können, muss diese in einem darauffolgenden Schritt für die
Arrayhybridisierung durch eine PCR Reaktion amplifiziert werden, Methoden, die auf einer Transkription
über einen T7-Primer basieren, zeigten zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse bei der Arrayanalyse
von neuronalen Zellen und colorektalen Tumoren [3]. Zusammen mit meinen Kollegen konnte ich eine
ebenso zuverlässige, schnelle und preisgünstige PCR Methode präsentieren, die die cDNA-Array
Hybridisierung mit nur 150 Nanogramm RNA ermöglichte [4]. Bei dieser Technik kombinierten wir die
RNA-Isolation aus kontaminationsfrei isolierten Melanozyten mit der Amplifikation der cDNA mittels
der Realtime PCR zur Vermeidung von Amplifikationsartefakten [5]. In folgender Abbildung ist der
Verlauf der PCR Reaktion unter Kontrolle der PCR Produkte nach 22 Zyklen (A) und 25 Zyklen (B)
dargestellt.
Abbildung 2: Verlauf der
Amplifikation der cDNA. Über den Zykluszahlen ist die in den PCR-Ansätzen akkumulierende
Fluoreszenzintensität aufgetragen. Nach 22 Zyklen (A) und 25 Zyklen (B) wurden Proben der PCR aus
separaten Ansätzen mit einer Gelektrophorese kontrolliert.
Um die Reproduzierbarkeit der von uns angewendeten Methode zu verifizieren, wurden
Lasermikrodissektate von Kryoschnitten aus einem Nävus mittels cDNA-Arrayanalyse verglichen. Wie
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oben beschrieben, wurde die RNA aus unterschiedlichen melanozytären Zellnestern desselben
Kryoschnitts isoliert und die cDNA über Realtime-PCR amplifiziert. Für die Hybridisierung der cDNA
Arrays wurden die PCR-Reaktionen in der linearen Phase der Reaktionsansätze entnommen (Abb. 2 nach
22 Zyklen), radioaktiv markiert und auf cDNA-Arrays hybridisiert. In der folgenden Abbildung ist der
Vergleich von zwei cDNA-Arrays dargestellt, die mit cDNA hybridisiert wurden, die aus zwei
verschiedenen melanozytären Zellnestern desselben Kryoschnitts eines Nävus präpariert wurden.
Abbildung 3: Paarweiser Vergleich der Arrayhybridisierung von zwei Arrays, die mit amplifizierter
cDNA hybridisiert wurden, die durch LPC aus zwei melanozytären Zellnestern eines melanozytären
Nävus gewonnen wurde. Die Punkte innerhalb der Begrenzungslinie markieren Gene auf dem Array, die
nicht reguliert sind (97,8 %) der auf dem Array repräsentierten Gene. 2.2 % der auf den Arrays
repräsentierten Gene (jenseits der grünen und roten Begrenzungslinie) scheinen reguliert zu sein, stellen
hier aber falsch-positive Regulationen dar, wie mit genspezifischen PCRs überprüft wurde.
Mit dieser Methode wurden 22 melanozytäre Läsionen analysiert. Die Genexpressionswerte wurden
statistisch analysiert und ein besonders signifikanter Satz von nur vier regulierten Genen ermöglichte die
korrekte Klassifizierung der analysierten Fälle entsprechend der klinischen Diagnose. In Abbildung 4 ist
das Ergebnis der statistischen Diskriminanzanalyse der untersuchten Fälle dargestellt.
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Abbildung 4: Klassifizierung der untersuchten
Fälle durch eine Diskriminanzanalyse. Die erste und zweite Funktion der Diskriminanzwerte sind für
jeden Fall gegeneinander aufgetragen. Rote Kreise entsprechen Nävi, grüne Dreiecke malignen
Melanomen und blaue Quadrate Melanommetastasen. Die Klassenzentren sind durch entsprechend
gefärbte leere Quadrate angezeigt.
Die Kombination des LPC ermöglicht die spezifische Isolierung von Zellpopulationen aus HE-gefärbten
Kryoschnitten. Die aus den LPC präparierten Zellen isolierte RNA kann nach einem kontrollierten
Amplifikationsprozess für die reproduzierbare Hybridisierung von Arrays verwendet werden und
ermöglicht die Klassifizierung der untersuchten Läsionen entsprechend der klinischen Diagnose [5].
Literatur
1. Human Genome Consortium., Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature,
2004. 431(7011): p. 931-45.
2. Bos, J.D. and M.A. De Rie, The pathogenesis of psoriasis: immunological facts and speculations.
Immunol Today, 1999. 20(1): p. 40-6.
3. Bertucci, F., et al., Sensitivity issues in DNA array-based expression measurements and performance
of nylon microarrays for small samples. Hum Mol Genet, 1999. 8(9): p. 1715-22.
4. Becker, B., et al., Detection of differentially regulated genes in keratinocytes by cDNA array
hybridization: Hsp27 and other novel players in response to artificial ultraviolet radiation. J Invest
Dermatol, 2001. 116(6): p. 983-8.
5. Becker, B., et al., Discrimination of melanocytic tumors by cDNA array hybridization of tissues
prepared by laser pressure catapulting. J Invest Dermatol, 2004. 122(2): p. 361-8.
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