25 Aufreinigung - TCI @ Uni

25 Aufreinigung
O.-W. Reif, T. Scheper
25.1
25.2
25.3
25.3.1
25.3.2
25.3.3
25.4
Einleitung 430
Wo ist das Produkt? 431
Zellabtrennung 432
Sedimentation 432
Zentrifugation 432
Filtration 432
Produktaufreinigung 435
25.4.1
25.4.2
25.4.3
25.4.4
25.4.5
25.4.6
25.4.7
Fällung 435
Extraktion 436
Chromatographische Methoden 436
Membranadsorbertechnik 441
Filtration 444
Kontaminanteninaktivierung 444
Kristallisation 445
430
O.-W. Reif, T. Scheper
25.1 Einleitung
Das Ziel der Aufarbeitung ist es, das Produkt
schnell und effizient in einer definiert reinen
Form aus der komplexen Fermentationsbrühe zu
isolieren. Dazu ist eine Vielzahl von Aufarbeitungsschritten nötig, in denen das Zielprodukt
aufgereinigt und Störkomponenten abgereichert
werden. Die Einzelschritte sind in Abb. 25.1 zu sehen, wobei die Aufarbeitung im Allgemeinen die
Schritte der Zellabtrennung, der Isolierung und
schließlich der Feinreinigung des Produktes umfasst. Die Zahl der Einzelschritte macht verständlich, weshalb die Aufarbeitungskosten oftmals im
Bereich von 40–60% oder bei rekombinanten Pro-
teinen und monoklonalen Antikörpern im Bereich bis zu 80% der Herstellungskosten liegen.
Je höher die Produktkonzentration im Prozessmedium, desto günstiger sind die Aufarbeitungskosten. Je höher die geforderte Produktreinheit
ist, desto mehr Aufreinigungsschritte werden
benötigt. Dabei gilt meist, dass mit zunehmender
Zahl von Reinigungsschritten der Zuwachs an
Reinheit pro Schritt kleiner wird (Abb. 25.2). Da
mit jeder Prozessstufe ein Produktverlust verbunden ist, nimmt die Ausbeute über den gesamten
Prozess mit der Anzahl der Aufreinigungsschritte
ab.
Abb. 25.1. Schema der Produktaufreinigung
Abb. 25.2. Verhältnis der Zahl der Reinigungsschritte zum Reinigungszuwachs
25 Aufreinigung
25.2
Wo ist das Produkt?
Wenn die löslichen biotechnologischen Produkte
in einem Fermentationsprozess hergestellt wurden, liegt am Prozessende eine Fermentationsbrühe vor. In dieser kann das lösliche Produkt extrazellulär, also außerhalb der Zellen im reinen
Medium vorliegen oder konzentriert in den Zellen. Oftmals sind die Produkte teilweise im extrazellulären Raum, teilweise im intrazellulären
Raum. Liegt nur extrazelluläres Produkt vor, muss
vor der Aufarbeitung eine Abtrennung der Zellen
vom Produktmedium erfolgen. Ansonsten müssen die Zellen aufgeschlossen werden, um das
Produkt in das Medium freizusetzen. Abb. 25.3
zeigt prinzipiell die Möglichkeiten eines Zellaufschlusses zur Produktfreisetzung. Hier wird unterschieden in physikalisch-mechanische, chemische und biochemische Methoden. Durch alle
Verfahren werden Zellwände und Zellmembranen
zerstört und die Produkte ins Medium ausgeschüttet. Physikalische Methoden sind sicherlich vorzuziehen, da bei den chemischen und enzymatischen Methoden weitere Additive ins Me-
Abb. 25.3. Übersicht über mögliche Methoden zum Zellaufschluss
dium gelangen, von denen das Produkt später abgetrennt werden muss.
Die physikalisch-mechanischen Methoden sind
speziell in der biotechnologischen Produktion
von Bedeutung. Mit Kugelmühlen kann beispielsweise über Glas- oder Metallperlen mechanischer
Stress auf die Zellen ausgeübt werden. Durch dieses Vermahlen werden die Zellen stark belastet
und aufgebrochen. Prinzipiell ist es auch möglich,
die Scherkräfte direkt in Lösung aufzugeben. Dies
kann durch Homogenisatoren (beispielsweise
French Press) oder Ultraschall geschehen. Auch
hydrodynamische Methoden, die mit unterschiedlichen Drücken oder kollidierenden Hochdruckstrahlen arbeiten finden zunehmend Verwendung. Auch hier wird ein Aufbrechen der Zellen erreicht und die Inhaltsstoffe werden ins Medium freigesetzt. Nach dem Zellaufschluss muss
eine Trennung der Zelltrümmer vom produkthaltigen Medium erfolgen.
431
432
O.-W. Reif, T. Scheper
25.3
Zellabtrennung
Um Zellen und Zelltrümmer vom produkthaltigen
Medium zu trennen, werden verschiedene Techniken eingesetzt. Hierzu gehören hauptsächlich:
>
>
>
Sedimentation
Zentrifugation
Filtration
Diese Verfahren werden im Satz- oder im kontinuierlichen Betrieb gefahren.
25.3.1
Sedimentation
Abb. 25.4. Aufbau und Wirkungsweise einer Tellerzentrifuge
Zellen und Zelltrümmer haben die Eigenschaft zu
aggregieren. Durch den Zusatz von Flockulationsmitteln kann dieser Prozess beschleunigt werden. Die Aggregate sinken durch die Gravitation
zum Boden. Der Überstand wird zellarm oder
gar zellfrei. Diese Verfahren sind kostengünstig
und werden beispielsweise in der Klärwerktechnik und in den Brauereiprozessen eingesetzt. Oftmals führen sie aber nur zu einer Reduktion der
Zellen im Überstand und nicht zu zellfreien Medien. Der Sedimentationsprozess kann dort eingesetzt werden, wo kostengünstig eine Zellreduktion erfolgen muss und ausreichend Zeit vorhanden ist, um die langsamen Sedimentationsprozesse ablaufen zu lassen.
25.3.2
Zentrifugation
Die Zentrifugation kann ähnlich der Sedimentation beschrieben werden. Hier wird die Absetzgeschwindigkeit dadurch erhöht, da nicht die
Gravitationskraft allein, sondern die Zentrifugalkraft für die Absetzgeschwindigkeit verantwortlich ist. Im Labormaßstab wird die Zentrifugation
in diversen Zentrifugentypen satzweise durchgeführt. Für die kontinuierliche Zentrifugation
stehen Tellerzentrifugen (Abb. 25.4) zur Verfügung. In diese wird das zellhaltige Medium einge-
speist und die Trennung erfolgt in jedem einzelnen Tellerzwischenraum. Die Feststoffe sinken
ab während das zellfreie bzw. zellreduzierte Medium nach oben strömt. Die stark zellhaltigen Medien können entweder an der Seite oder am oberen Ausgang abgezogen werden. Durch Flockulationszusätze kann die Effizienz gesteigert werden.
Auch hier kann nicht sichergestellt werden, dass
zellfreie Medien am Ausgang des Tellerseparators
anfallen.
25.3.3
Filtration
Um Zellen bzw. Zellbruchstücke vom produkthaltigen Medium zu trennen, werden in immer stärkerem Maße Filtrationstechniken eingesetzt. Diese haben nicht nur den Vorteil der Zellabtrennung, sondern können auf Grund ihrer Materialeigenschaften auch einen wesentlichen Beitrag
zur Abreicherung von Kontaminanten wie z. B.
Endotoxine, DNA usw. leisten. Hier sind im Allgemeinen Dead-End-Filtrationen als Batch-Prozess oder Crossflow-Filtrationen als dynamischer
Prozess in der Verwendung (Abb. 25.5). Bei der
Dead-end-Filtration wird das gesamte zu filtrierende Volumen durch das Filterhilfsmittel gepresst. Die Festbestandteile werden hier nach Ei-
25 Aufreinigung
Abb. 25.5. Schematische Darstellung
der Wirkungsweise von Dead-Endund Crossflow-Filtration
genschaften des Filtrationsmittels zurückgehalten. Bei der Crossflow-Filtration wird das zu filtrierende Volumen (auch Trübe oder Feed genannt) tangential am Filtrationsmittel vorbeigeführt. Die Porengröße der Filtermaterialien
(Abb. 25.6) bestimmt die Ausschlussgrenze. Die
für die Biotechnologie wichtigsten Filtrationssysteme sind Mikrofiltration, Ultrafiltration und Nanofiltration. Die reverse Osmose wird für die
Wasseraufbereitung eingesetzt.
Bei der Dead-End-Filtration unterscheidet man
in Tiefen- und Kuchenfiltration. In der Tiefenfiltration werden die Zellen auf der Oberfläche
und in der Tiefe des Filtermediums zurückgehalten. Der Filterwiderstand nimmt in diesem Fall
schlagartig beim Auftreten einer Verblockung
des Filtermedium sehr stark zu. Hier werden zunehmend verschiedene adsorptive grobe Filtermedien (Schichtenfilter) verwendet, die eine
nachfolgenden Klär- und Sterilfiltration schützen.
Bei der Kuchen- bzw. Anschwemmfiltration sieht
man, dass während der Filtration der Filterwiderstand durch die Zunahme des Filterkuchens anwächst. Um weiter hohe Durchflussraten für das
Filtrat zu ermöglichen, ist es deshalb unerlässlich,
einen steigenden Druckunterschied über den Fil-
terkuchen anzulegen. Dies kann durch Aufgeben
von Überdruck auf der Aufgabeseite oder durch
Anlegen von Unterdruck auf der Filtratseite geschehen. Bei biotechnologischen Medien erweist
sich die Filtration oftmals als problematisch, da
die Partikel unter Druck zusammengepresst werden und oftmals schleimige gelatinöse Materialien vorhanden sind, die einen weiteren Anstieg
des Druckverlusts über den Filterkuchen zur Folge haben. Die Zugabe von Filterhilfsmitteln, beispielsweise von Kieselgur ermöglicht es, die Porosität des Filterkuchens größer zu halten, um bessere Filtrationsraten zu erreichen. Dies wird aus
der Abb. 25.7 deutlich. Oftmals wird der Filter
selbst mit einer Schicht des Filterhilfsmittels bedeckt, bevor die Filtration beginnt. Dabei ist zu
beachten, dass das Filterhilfsmittel nicht die Produkte adsorbiert und somit die Filtration ineffizient gestaltet. Zu beachten ist auch, dass der Filterkuchen dann mit dem Filterhilfsmittel belastet
ist und oftmals nicht einfach entsorgt werden
kann. Darüber hinaus kann es unter nicht sterilen
Bedingungen bei längeren Filtrationszeiten zu
Fouling-Problemen kommen. Falls Sterilfilter verwendet werden, lässt sich das Filtrat unter sterilen
Bedingungen gewinnen.
433
434
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Abb. 25.6. Porengröße und herausgefilterte Materialien bei der Crossflow-Filtration
Abb. 25.7. Einsatz von Filterhilfsmitteln in der
Kuchenfiltration, um gute Filtrationsraten zu erzielen
Die Filtrationsleistung eines solchen Filters
kann relativ einfach beschrieben werden. Die
Abb. 25.8 zeigt, dass der Filtrationskuchen als
poröses zylinderförmiges System betrachtet werden kann. Durch die Poren mit einem Durchmesser r fließt das Filtrat, getrieben von einer Druckdifferenz Dp. Die Höhe des Filterkuchens ist h.
Die laminare Strömung durch die Poren kann
mit dem Hagen-Poiseuillschen Gesetz beschrieben werden:
Dp p r
V_ ˆ
8l h
4
…25:1†
Hier ist V_ der Volumenstrom des Filtrats und l
die dynamische Viskosität des Mediums. Bei diesem Ansatz ist zu bedenken, dass die Höhe h und
der Druckabfall nicht konstant sind. Der Porenradius r wird sich verringern, wenn der Filterkuchen komprimiert wird. Um die Abweichung der
Poren vom Idealzustand zu beschreiben, wird
der Labyrinthfaktor a ≥ 1 eingeführt. Die Länge
25 Aufreinigung
Abb. 25.8. Strömung des Filtrats durch den Filter
der Poren wird damit a · h und im Filterkuchen
sind Z Poren insgesamt vorhanden. Die Gesamtfläche des Filterkuchens ist mit dem Porositätsfaktor e insgesamt:
A ˆ e Z p r2
…25:2†
Somit ergibt sich mit:
A Dp r2
V_ ˆ
e 8l a h
…25:3†
Bei Einführung der Durchlässigkeitskonstanten k
erhält man die D’Arcy-Filtergleichung
Dp
V_ ˆ A k lh
…25:4†
24.4
Produktaufreinigung
Sobald die Fermentationsproduktlösung partikelfrei vorliegt, kann mit der eigentlichen Produktaufarbeitung begonnen werden. Hierzu gehören
im Allgemeinen:
>
>
>
>
>
Fällung
Extraktion
Chromatographie
Membranadsorber
Filtration
>
>
Kontaminanteninkativierung
Kristallisation
25.4.1
Fällung
Fällungsverfahren und Kristallisationsverfahren
sind in der industriellen Chemie und Pharmazie
weit verbreitet. Bei biotechnologischen Prozessen
werden solche Systeme häufig für die Darstellung
vonAminosäurenausdenProzesslösungenverwendet. Dazu werden im Allgemeinen die produkthaltigen Lösungen bei höheren Temperaturen eingeengt und abgekühlt. Sobald die Löslichkeit der einzelnen Produkte überschritten ist, kristallisiert das
Produkt aus und eine Mutterlauge bleibt zurück.
Auch für die Darstellung von Proteinen in reiner Form werden Fällungsverfahren verwendet.
Über fraktionierte Fällungsmethoden können die
Zielproteine auch von Verunreinigungen abgetrennt werden. Manchmal bietet sich eine Hitzedenaturierung an, um Störkomponenten von
dem Zielprodukt abzutrennen.
Für die Trennung von Proteinen stehen verschiedenste Techniken aus der Proteinbiochemie
zur Verfügung. Beispielsweise kann durch eine
Erhöhung der Salzkonzentration die Hydrathülle
der Proteinmoleküle verringert werden. Die Proteine fallen so aus. Für verschiedenste Fällungsmittel wie Natrium oder Ammoniumsulfat können definierte Grenzwerte für die Fällung einzelner Proteine ermittelt werden.
435
436
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Die Fällung über den pH-Wert in der Proteinlösung wird seltener angewandt. Im Allgemeinen gilt, dass am isoelektrischen Punkt die geringste Löslichkeit der Proteine in polaren wässrigen Medien besteht.
Organische Lösungsmittel wie Alkohole (Ethanol, Methanol, Isopropanol oder Aceton) werden
bei niedrigen Temperaturen eingesetzt. Dabei
wird die Konzentration des Fällungsmittels langsam erhöht bis Verunreinigungen oder das Zielprodukt ausfallen. Auch die für Mehrphasensysteme verwendeten Polymere können prinzipiell für
das Ausfällen von Proteinen verwendet werden,
da können sie die Proteinlöslichkeit beeinflussen.
25.4.2
Extraktion
Flüssigphasen-Extraktionssysteme werden in verschiedenen Bereichen der Biotechnologie eingesetzt. Hier wird das Verteilungsgleichgewicht zwischen einzelnen, nicht mischbaren Phasen (wässrig-organisch, wässrig-wässrig) ausgenutzt. Penicillin wird über Extraktionsprozesse aus der wässrigen Fermentationsbrühe in Butylacetat, Amylacetat oder Methylethylacetat unter Zusatz von
verschiedenen oberflächenaktiven Substanzen extrahiert. Auch die Darstellung von Steroiden, die
Aufarbeitung von Vitaminen und die Isolierung
von Alkaloiden werden mit Flüssigextraktionssystemen durchgeführt.
In Laborversuchen kann mit Schütteltrichtern
das Verteilungsgleichgewicht bestimmt werden.
Dazu werden die beiden Phasen miteinander vermischt. Nach erfolgter Entmischung kann in der
Extrakt- und Raffinatphase die Konzentration
des zu extrahierenden Stoffes bestimmt werden.
Das Nernst’sche-Verteilungsgesetz beschreibt die
Verteilung. Für eine effiziente Extraktion ist ein
mehrfacher Kontakt zwischen Extrakt- und Raffinatphase nötig. Hier werden normalerweise Gegenstromsysteme verwendet. Mit Mixer-SettlerSystemen, Gegenstromkolonnen und Extraktionszentrifugen wird das Lösungsmittel und das zu
trennende Gemisch im Gegenstrom gefahren. So
lassen sich kontinuierlich die Extrakte bzw. Raffinatphase erhalten.
Organische Lösungsmittel werden hauptsächlich zur Extraktion niedermolekularer Komponenten wie Antibiotika und Vitamine verwendet. Für die Aufreinigung von Proteinen sind organische Phasen nicht geeignet. Für diesen Zweck
wurden mischbare wässrige 2-Phasensysteme entwickelt. Für biotechnologische Aufgabenstellungen sind wässrige Mehrphasensysteme von Interesse, die aus geeigneten Polymerphasen (beispielsweise Dextranphase und Polyethylenglycolphase) bestehen aus einer Polymerphase (Polyethylenglycol) und einer Hochsalzphase (beispielsweise Phosphat). Die daraus resultierenden
2-Phasensysteme enthalten zwischen 80 und
95% Wasser. Proteine verteilen sich in diesen Phasen unterschiedlich je nach ihren Eigenschaften.
Es ist durchaus möglich, auch Zelltrümmer von
den Proteinen über diese Extraktionstechniken
zu trennen. Besonders häufig werden solche Extraktionssysteme zur Darstellung von industriellen Enzymen verwendet. In einem einfachen
Schritt können die Enzyme von den Zelltrümmern entfernt und später kristallisiert oder ausgefällt werden.
25.4.3
Chromatographische Methoden
Die Chromatographie ist eine Trennmethode, mit
der Gemische aufzutrennen oder einzelne Produkte zu isolieren sind. Sie ist in der Biotechnologie sicher die am weitesten verbreitete Methode,
Chromatographiesysteme lassen sich auf einzelne
Reinigungsprobleme gut anpassen. Im Allgemeinen werden die aus der Adsorption bekannten Effekte verwendet, um Chromatographieprozesse zu
beschreiben. Die verschiedenen Inhaltsstoffe eines Gemisches weisen ein unterschiedliches Adsorptionsverhalten an der festen Phase auf, so
dass es zu einer Aufteilung der Inhaltsstoffe zwischen dem kontinuierlich fließenden Medium
und der Oberfläche des Trenngels kommt. Dieser
Effekt ist exemplarisch in Abb. 25.9 dargestellt.
Die mit dreieckigen Symbolen dargestellten In-
25 Aufreinigung
Adsorptionschromatographie
Polare Adsorbentien wie Silicate, Aluminiumoxide, Hydroxyapatite oder synthetische Polymere
werden hier verwendet. Die Affinität der Inhaltsstoffe des aufzutrennenden Gemisches hängt
stark von den Polaritätsunterschieden der festen
Phase und der mobilen wässrigen Phase ab. Über
die Einstellung der Polarität und ganz allgemein
der Solvenzeigenschaften der mobilen Phase kann
die Auftrennung optimiert werden. Substanzen
mit einer geringen Affinität zur Festphase werden
eher am Ausgang der Aufarbeitungssäule erscheinen als die Substanzen, die eine hohe Affinität haben.
Während des chromatographischen Prozesses
können auch die Solvenzeigenschaften der mobilen Phase auch verändert werden. Verschiedenste
Gradienten lassen sich einstellen, um eine optimale Trennung in kurzen Zeiträumen zu erreichen.
Verteilungschromatographie
Abb. 25.9. Schematische Darstellung der Chromatographie. Nähere Erläuterungen im Text
haltsstoffe haben eine hohe Affinität zum Trennmaterial und bewegen sich deshalb nur langsam
mit dem Medium voran. Die kugelförmig dargestellten Inhaltsstoffe weisen nur eine niedrige
Affinität zum Trenngel auf und erscheinen deshalb zuerst am Ausgang der Trennsäule.
Im Folgenden sollen einige Chromatographieverfahren exemplarisch vorgestellt werden:
>
>
>
>
>
Adsorptionschromatographie
Verteilungschromatographie
Ionenaustauschchromatographie
Gelchromatographie
Affinitätschromatographie.
Hier wird die unterschiedliche Verteilung von
Substanzen in zwei flüssigen Phasen für die Auftrennung ausgenutzt. Eine der flüssigen Phasen
befindet sich fixiert auf der festen Phase und ist
dadurch im Prozess immobil. Eine hydrophile stationäre Phase hält eine wässrige Phase fest. Als
mobile Phase wird dann eine organische Phase
eingesetzt.
Die Auftrennung bei der Verteilungschromatographie ist vom Verteilungskoeffizienten abhängig. Er beschreibt das Verteilungsgleichgewicht
der zu trennenden Komponenten zwischen der
stationären Phase und der mobilen Phase. Da sich
für eine optimale Trennung in jedem Bereich der
Chromatographiesäule ein Gleichgewicht einstellen muss, erfolgt die Auftrennung langsam. Die
Temperatur spielt eine wichtige Rolle und auch
hier können Gradientensysteme in der mobilen
Phase eingesetzt werden, um die Auftrennung abzukürzen. Bei der oftmals verwendeten „Reversed-Phase-Chromatographie“ wird auf einem hydrophoben Trägermaterial eine stationäre organische Phase aufgebracht und ein wässriges System
437
438
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als mobile Phase verwendet. Als hydrophobe Phase werden Kohlenwasserstoffketten mit einer Länge von 8–18 Kohlenstoffatome verwendet, die auf
den Trägermaterialien fixiert sind. Ähnlich funktioniert die Hydrophobic-Interaction-Chromatography, bei der eine Hochsalzphase eine Bindung
von Proteinen an schwach hydrophoben Liganden
der stationären Phase fördert, während die Elution durch einen Wechsel in eine Niedersalzphase
hervorgerufen wird. Diese ChromatographieTechnologie wird zunehmend im direkten Anschluss an eine Ionenaustauschchromatographie
eingesetzt.
Ionenaustauschchromatographie
Hier basiert der Trenneffekt auf elektrostatischen
Wechselwirkungen. Die meisten Ionenaustauscherharze basieren auf synthetischen Polymeren
oder es handelt sich um modifizierte Dextrane
und Cellulosematerialien. Auf diesen sind Anionen- oder Kationenaustauschergruppen fixiert.
Anionentauscher tragen kationische Gruppen
wie quartäre oder tertiäre Amine, während Kationenaustauscherharze anionischen Gruppen wie
Sulfonsäuregruppen bzw. Carboxygruppen tragen.
An diese binden die einzelnen geladene Inhaltsstoffe der aufzutrennenden Gemische. Sobald alle
Austauschergruppen beladen sind, ist die Kapazität des Materials erschöpft. Eine Elution erfolgt
über eine Änderung des pH-Wertes oder der Ionenstärke der flüssigen Phase. Besonderes zur
Trennung von Proteinen werden Ionenaustau-
scherharze verwendet, da sich die Ladung der Proteine über den pH-Wert einfach einstellen lässt.
Gelchromatographie
Hier wandern Moleküle durch eine Säule, die mit
einem porösen Material gefüllt ist. Die Trennung
erfolgt auf Grund eines Siebeffektes. Für die Gelchromatographie werden verschiedene Arten von
Materialien verwendet: Quervernetzte Dextrane,
Agarosematerialien, Acrylamide, und Polysterole.
Wie aus Abb. 25.10 zu erkennen, beruht der
Trenneffekt darauf, dass Partikel nach ihrer Größe
in die definierten Poren der festen Phasen diffundieren können. Dadurch ergeben sich verschiedene Aufenthaltszeiten im System. Große Moleküle,
die gar nicht oder nur wenig in die Hohlräume
eindringen können, wandern in der mobilen Phase schneller durch das System als kleine Substanzen, die eine höhere Aufenthaltswahrscheinlichkeit und Aufenthaltszeit in den Hohlräumen des
Gelmaterials haben. Die Trennung erfolgt also
nach Größe der Substanzen in einer wässrigen
Phase. Die Abb. 25.11 zeigt den Gesamtvorgang
schematisch.
Affinitätschromatographie
Hier werden auf den Chromatographiematerialien
hoch spezifische und hoch selektive Bindungsgruppen angebracht, die mit der in der Lösung
befindlichen aufzutrennenden Substanz spezifische Bindungen eingehen. Als Liganden kom-
Abb. 25.10. Partikeltrennung mit der Methode der
Gelchromatographie
25 Aufreinigung
Abb. 25.11. Verhältnis von Größe und Aufenthaltszeiten der Partikel IM Trennmedium der Gelchromatographie
men beispielsweise Antikörper, Protein A (zur
Auftrennung von Antikörpern), Concanavalin A
(zur Auftrennung von glykosylierten Proteinen),
Biotin (zur Auftrennung von Streptavidin oder
Streptavidin getagten Proteinen), RNA- oder
DNA-Aptamere (zur Aufreinigung von Plasmiden
oder Proteinen), Farbliganden für verschiedene
Zellmoleküle (z. B. Cibacron Blue für Albumin)
oder Metallgelate von Cu2+ und Ni2+ (zur Aufreinigung von His-getagten Proteinen) zum Einsatz.
Auch hier beladen die aufzutrennenden Substanzen die Liganden bis zur maximalen Kapazität,
um anschließend über eine gezielte Elution (pH-,
Ionenstärke, Pufferzusammensetzung oder Additive) aufgereinigt zu werden.
Bei der Herstellung der Affinitätsmaterialien ist
darauf zu achten, dass die Liganden so an die feste Phase gebunden werden, dass die selektiven
Bindungseinheiten ohne Einschränkung einer sterischen Hinderung für die Bindung zur Verfügung stehen. Hier muss insbesondere die Matrix
und die Koppelungsreaktion zwischen Matrix
und Ligandentsprechend beachtet werden. Die
Elution muss so verlaufen, dass nach einer Equilibrierung das Material für eine erneute Bindung
verwendet werden kann, die Bindung also reversibel ist. Mit Affinitätsmaterialien können höchste
Reinheitsgrade erzielt werden. Die Materialien
sind meist durch die Verwendung der oftmals
schwer zugänglichen Liganden teuer.
Chromatographieverfahren
Normalerweise werden chromatographische Prozesse in Säulenreaktoren durchgeführt. Hier
muss das Chromatographiematerial in einer kanalfreien Schüttung gleichmäßig in der Säule gepackt sein. In einen kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom wird die aufzuarbeitende Probe aufgegeben. Dabei ist es wichtig, dass die Verteilung der
Probe auf das Festbett gleichmäßig erfolgt. Dies
ist speziell in Säulen mit großen Durchmessern
schwierig. Nur wenn die Probe gleichmäßig über
den Querschnitt aufgetragen ist, kann eine opti-
439
440
O.-W. Reif, T. Scheper
male Auftrennung erreicht werden. Bei Scale-up
von Chromatographieprozessen wird nicht die
Länge der Säule sondern der Querschnitt vergrößert, da ansonsten die Verweilzeit im Chromatographiebett verändert und zudem erhebliche
Druckverluste über ein tieferes Chromatographiebett auftreten würden. Als Schlüsselparameter
wird grundsätzlich die Strömungsgeschwindigkeit im Bett (cm/h) konstant gehalten. Dies bedeutet, dass das gleichmäßige Auftragen der Probe noch schwieriger wird und durch komplexe
Strömungsverteiler auf der Oberflache gewährleistet werden muss. Zudem wird das reproduzierbare Packen einer Säule mit zunehmender Oberfläche schwierig und birgt die Gefahren von Inhomogenitäten im Säulenbett. Das Upscaling eines
Chromatographieprozesses vom Labor in den
Produktionsbereich ist technisch aufwendig.
Simulated-Moving-Bed-Chromatographie
In den letzten Jahren hat sich eine interessante
Methode für die Aufarbeitung biotechnologischer
Medien etabliert. Hier ist nicht nur die Trägerflüssigkeit, sondern auch das Chromatographiematerial in Bewegung. Das Prinzip dieser
Technik sei in der Abb. 25.12 verdeutlicht. Dabei
muss bedacht werden, dass in einem 2-Komponentengemisch die beiden Einzelkomponenten
unterschiedliche Affinität zur stationären Phase
haben, d. h. sie würden in einem Festbett unterschiedlich schnell (vA, vB) wandern, und am Ausgang der Säule zu verschiedenen Zeiten ankommen. In Abb. 25.12 sind diese beiden Komponenten als Schildkröte und Hase dargestellt, die mit
dem Feedstrom auf ein Laufband fallen. Das Laufband verdeutlicht die Bewegung des Chromato-
Abb. 25.12. Schildkröte und Hase als Sinnbilder unterschiedlicher Geschwindigkeiten der Komponenten eines
aufzutrennenden Gemischs im Feed-Strom
25 Aufreinigung
graphiematerials mit der Geschwindigkeit vl. Solange die Geschwindigkeit der Schildkröte vA kleiner als vL ist, wird sie sich mit der Zeit nach links
bewegen (auch wenn sie nach rechts läuft) und
die Geschwindigkeit des Hasen mit vB größer als
vl eine effektive Bewegung nach rechts bewirkt.
Nach einer gewissen Zeit wird die Schildkröte
links vom Förderband, der Hase rechts vom
Förderband herabfallen. Eine Auftrennung des
Gemisches in zwei reine Fraktionen ist damit gewährleistet. Das ist im unteren Teil der Abb. 25.12
noch einmal dargestellt. Kontinuierlich wird im
Feed das 2-Komponentengemisch A, B zugegeben,
wenn in den Entnahmestellen A bzw. B in reiner
Form abgenommen hat.
Die Entnahmepunkte hängen vom Verhältnis
der einzelnen Geschwindigkeiten zueinander ab.
Bemerkenswert ist, dass eine kontinuierliche Auftrennung in die reinen Substanzen auch dann
möglich ist, wenn die Laufgeschwindigkeiten
nur wenig differieren. Der Nachteil dieser Technik
ist, dass nur zwei Komponentensysteme aufgetrennt werden können. Die technische Realisierung eines solchen Systems, in dem sowohl die
Trägerflüssigkeit a und im Gegenstrom das Chromatographiematerial im Gegenstrom geführt werden, ist extrem schwierig. Verschiedene Verfahrensvorschläge sind gemacht worden, nur eine
soll hier kurz vorgestellt werden.
Bei der Simulated-Moving-Bed-(SME-)Technik
verwendet man eine feste Chromatographiesäule,
die in einzelne Abschnitte unterteilt ist. Diese Abschnitte sind in Abb. 25.13 zu sehen. Jeder Abschnitt hat einen Zu- und Ablauf. An verschiedenen Stellen werden der Trägerstrom und die
Feedlösung zugegeben bzw. die Komponenten A
und B entnommen. Zusätzlich durchströmt das
System der Gesamtträgerstrom wie angegeben.
Nacheinander wandern die Zu- und Entnahmepunkte in gleicher Richtung wie der Gesamtträgerstrom, so dass sich eine scheinbare Bewegung
des Chromatographiematerials in Gegenrichtung
ergibt. Dies ist in der Abb. 25.13 in vier Abschnitten verdeutlicht. Man erkennt, dass die Entnahmepunkte die Auftrennung des Systems von links
nach rechts durch das System wandern, was einer
effektiven Bewegung des Chromatographiematerials entgegen dem Flüssigkeitsstrom entspricht.
Dieser Aufbau ist technisch zu realisieren, auch
wenn eine feine Abstimmung der Zu- und Entnahmepunkte nötig ist.
15.4.4
Membranadsorbertechnik
Eine weitere Aufarbeitungstechnik speziell für die
Aufarbeitung von Proteinen, die in den letzten
Jahren entwickelt wurde, ist die Membranadsorbertechnik. Hier werden nicht poröse Materialien
sondern Mikrofiltrationsmembranen für die Auftrennung verwendet. Auf der Oberfläche der
Membranporen befinden sich die Austauschergruppen, an die einzelne Komponenten der aufzutrennende Medien binden können (Abb. 25.14).
Durch die Vielzahl von Poren in der Filtrationsmembran stehen hohe Kapazitäten zur Verfügung. Vorteilhaft ist, dass das gesamte aufzutrennende Volumen die Poren passieren muss und so
im Gegensatz zu den Chromatographiematerialien ein konvektiver Transport der aufzutrennenden Komponenten zu den Austauschergruppen
erfolgt. In den Chromatographiematerialien erfolgt der Stofftransport zu den Austauschergruppen durch Diffusion und ist damit langsamer. Zudem erlaubt die Membranchromatographie die
Trennung auch von großen Molekülen, wie Viren,
DNA usw., da die Porengröße der Membran im
Gegensatz zu den meisten Medien kein Größenausschlusskriterium bietet.
Prinzipiell können in die Membranen alle Arten von Austauschergruppen (schwache, starke
Kationen, Anionenaustauscher und Affinitätsgruppen (Antikörper, Lectine etc.) aufgebracht
werden. Erst wenn alle Bindungsplätze besetzt
sind, erfolgt der Durchbruch und die aufzureinigende Komponente befindet sich zu 100% im
Durchfluss. Die Abb. 25.15 zeigt eine solche
Durchbruchkurve. Hier korreliert die Zeit mit
der durchgesetzten Feedmenge. Dabei wird die
Zielkomponente im Ausgang des Aufarbeitungsmoduls gemessen. Sobald die Konzentration im
Durchfluss eine bestimmte Konzentration über-
441
442
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Abb. 25.13. Chromatographiesäule in der Simulated-Moving-Bed-Technik
25 Aufreinigung
Abb. 25.14. Wirkungsweise der Membranadsorbertechnik. Näheres im Haupttext
Abb. 25.15. Verlauf der Durchbruchkurve in einem Membranadsorbersystem
schreitet, ist der Durchbruch erfolgt, d. h. die Kapazität des Systems ist erschöpft. Die Kapazität
eines solchen Membranadsorbersystem kann –
wie in Abb. 25.14 gezeigt – durch ein Übereinanderstapeln oder auf Rollen von Membranen erfolgen. Ein Scale-up dieser Systeme vom Labormaß-
stab in einen Produktionsmaßstab ist relativ einfach, verglichen mit Chromatographiesystemen,
da nur die Filtrationsfläche vergrößert werden
muss. Für detailliertere Informationen über diese
Systeme sei auf die relevante Literatur verwiesen.
443
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25.4.5
Filtration
In der Aufreinigung von biotechnologischen Produkten werden mit der Ultra- und der Sterilfiltration zwei membranbasierte Methoden generell genutzt. Die Ultrafiltration (UF) ist wie bereits geschildert ein dynamisches Filtrationsverfahren,
bei dem die trennende Membran überströmt
wird. Die UF wird überwiegend bei dem Pufferaustausch (Diafiltration nach Elution von Chromatographiesäulen) oder Aufkonzentrierung des
Produktes genutzt. Die Sterilfiltration wird generell als letzter Filtration vor der Abfüllung des zu
sterilisierenden Produktes durchgeführt und ist
eine klassische Dead-End-Filtration.
Verschiedenste andere Membransysteme wie
Pervaporationssysteme und Elektrodialyse sollen
hier nicht weiter behandelt werden. Einige Einsatzgebiete solcher Membrantrennverfahren bei
biotechnologischen Prozessen sind in Abb. 25.16
gezeigt.
25.4.6
Kontaminanteninaktivierung
Ein wesentlicher Punkt in dem Aufarbeitungsprozess ist neben dem zuvor geschilderten Aufreinigen des Produktes, beziehungsweise dem Entfernen von Kontaminanten auch die chemischphysikalische Inaktivierung derselben. Dies ist
insbesondere unter dem Gesichtspunkt der Virus-
Abb. 25.16. Übersicht über die Einsatzgebiete von Membrantrennverfahren bei biotechnologischen Prozessen
25 Aufreinigung
sicherheit biotechnologischer Produkte relevant.
Neben der chromatographischen und filtrativen
Abtrennung von Viren ist die pH- und Lösungsmittelbasierte Inaktivierung von Viren ein Standardschritt in der modernen Biotechnologie.
Hierfür wird das Produkt über einen definierten
Zeitraum dem Lösungsmittel (Ethanol, etc.) oder
einem extremen pH (z. B. pH 2-3 bei der Antikörperaufreinigung) ausgesetzt. Entscheidend
ist hierbei die Stabilität des Produktes, sowie die
Inaktivierungsrate des Virus. Andere physikalische Methoden sind thermische oder UV und
Ultraschallbasierte Systeme. Auch hierbei ist der
entscheidende Faktor bei der Auswahl der Methoden die Produkttoleranz sowie die Inaktivierungseffienzienz gegenüber Viren.
25.4.7
Kristallisation
Eine neuere Methode zur Aufreinigung von biotechnologischen Produkten ist die Kristallisation.
Hierbei wird das Produkt durch eine gezielte temperatur- oder druckgesteuerte Evaporation des
Lösungsmittels in Reinform kristalliert und von
nicht-kristallierenden Verunreinigungen physikalisch abgetrennt. Diese Verfahren werden zunehmend bei kleinen Molekülen, wie z. B. Vitaminen
eingesetzt und auch für komplexere Systeme wie
Antikörper erprobt.
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