Technologisches Arsenal der Molekularbiologie I.

Technologisches Arsenal der Molekularbiologie -I
Technologisches Arsenal der Molekularbiologie I.
Einleitung
Die Molekularbiologie befaβt sich mit der Struktur, Biosynthese und Funktion von DNA und RNA auf
molekularer Ebene, und damit, wie diese untereinander und mit Proteinen interagieren. Das
Forschungsgebiet der Molekularbiologie überlappt dabei immer mehr mit weiteren Feldern der Biologie und
Chemie, insbesondere der Genetik und der Biochemie. Die Grenzen zwischen diesen Fachbereichen sind
dabei oft flieβend. Der Begriff Molekularbiologie wird in zwei Sinnen benutzt. Im einen Sinne ist die
Molekularbiologie ein Wissenschaftsgebiet, welches die Lebenserscheinungen auf einer bestimmten
Hierarchieebene untersucht, konkreterweise die Funktionen von DNA und ihrer Produkte (RNAs und
Proteine) studiert. Molekularbiologie ist also das Wissenschaftsgebiet der Organisierungsebene, welche über
den Atomen (oder einfachen Molekülen) aber unter den Zellen liegt. Im anderen Sinne ist die
Molekularbiologie das technologische Arsenal, welches in nahezu allen Bereichen der biologischen
Grundforschung und der angewandten Forschung verwendet werden kann. Mit diesem Vortrag werden wir
das grundlegende technische Arsenal der Molekularbiologie kennenlernen. Die heute immer noch
fortsetzende Revolution der Molekularbiologie basiert auf Entdeckungen, die nachgewiesen haben, daβ das
genetische Material die DNA ist, und die die Struktur der DNA und die Grundmechanismen ihrer Funktion
aufgeklärt haben. Die Entdeckung von Restriktionsendonukleasen und DNA-Ligasen, und das Ausarbeiten
der Methodik, welche die Transformation von Bakterienzellen mit fremder DNA und die Vervielfältigung
fremder DNA in Bakterienzellen (molekulare Klonierung) möglich gemacht hat, haben grundlegende Rollen
bei der Entwicklung der rekombinanten Gentechnologie gespielt. Die Sequenzierungsmethode von Sanger
brachte einen Durchbruch bei der Analyse der DNA-Struktur. Die Erscheinung von Mikrochip-Techniken
machte die Untersuchung von DNA und Genprodukten auf der genomischen Ebene möglich. Die jetzige
Enwicklungsgeschwindigkeit der Molekularbiologie wird sowohl bei der Grundforschung, als auch bei der
angewandten Forschung mehr von den zur Verfügung stehenden Technologien als von den theoretischen
Kenntnissen bestimmt.
Die Molekulargenetik – ein Teilgebiet der Molekularbiologie – untersucht, wie Gene aufgebaut sind, wie die
in Form von Nukleinsäuren (meist DNA, bei manchen Viren RNA) vorhandene genetische Information zum
Aufbau von Proteinen und anderen funktionellen Genprodukten genutzt wird (Genexpression), wie diese
Information kopiert wird (Replikation) und wie sich molekularbiologische Erkenntnisse für gentechnische
Verfahren nutzen lassen.
Die Technologien der Molekularbiologie werden in der folgenden Aufteilung bearbeitet: in der ersten Hälfte
dieses Vortrags geht es um Techniken, die für (1) die Untersuchung oder Umwandlung von einem
Makromolekül oder wenigen Makromolekülen (DNA, RNA, Protein) geeignet sind; in der zweiten Hälfte
des Vortrags geht es um (2) gleichzeitige Untersuchung von vielen Makromolekülen (Genomik). (3)
Komplexe Techniken, die mehrere Methoden beinhalten (Stammzellentechnik, Knock-out-Technik,
Transgenische Techniken, Gentherapie, Tumortherapie), werden in anderen Vorträgen bearbeitet.
I. MOLEKULARGENETISCHE TECHNIKEN
1. Molekulare Klonierung
Während der molekularen Klonierung wird ein ausgewählter DNA-Abschnitt in lebendigen Zellen
vervielfältigt. In diesem Prozess spielen die Restriktionsendonukleasen, die DNA-Ligasen und die
Plasmidvektoren grundlegende Rollen.
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Restriktionsenzyme (=Restriktionsendonukleasen, REs) sind Bakterien-Enzyme, welche DNA-Abschnitte
mit bestimmten Basensequenzen erkennen und schneiden können. Der Schnitt kann versetzt sein, wobei
überhängende 5’-Enden (z.B. BamHI oder EcoRI) oder 3’ Enden (z.B. KpnI) entstehen, oder nicht versetzt,
wobei gerade Enden (z.B. SmaI) entstehen. Überhängende (klebrige) Enden können leichter ligiert werden.
Die Erkennungssequenzen der Restriktionsendonukleasen bestehen meist aus palindromischen Sequenzen
(wenn in 5’→3’ Richtung gelesen, bekommen wir dieselbe Sequenz an beiden Strängen) von vier, sechs
oder acht Basenpaaren. Die Erkennungssequenz des EcoRI lautet GAATTC. Der Schnitt erfolgt zwischen
dem G und dem A. Die Namen der Restriktionsenzyme geben ihre Herkunft an. Der erste Buchstabe steht
für die Gattung, der zweite und dritte für die Art, erweitert wird es durch Namenszusätze und die
chronologische Abfolge der Entdeckung. Das Enzym EcoRI ist beispielsweise das erste Enzym, das in dem
Stamm Escherichia coli RY13 gefunden wurde. Der Name „Restriktionsenzym“ stammt von dem
bakteriellen Restriktions-Modifikationssystem, das der Abwehr fremder (viraler) DNA dient. Viele
Bakterien besitzen stammspezifische Restriktionsendonukleasen. In der eigenen DNA sind die
entsprechenden Erkennungssequenzen modifiziert (methyliert) und werden daher nicht geschnitten. Wenn
Viren, die sich in den Bakterien vermehren (Bakteriophagen), ihre DNA in die Zellen injizieren, ist diese
nicht methyliert und wird abgebaut. Für ihre grundlegenden Arbeiten zur „Entdeckung der
Restriktionsenzyme und ihre Anwendung in der Molekulargenetik“ bekamen Werner Arber, Daniel Nathans
und Hamilton Othanel Smith 1978 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin. Die Entdeckung der REs
war ein Meilenstein bei der Entwicklung der Molekularbiologie und der teilweise darauf basierenden
rekombinanten Gentechnologie. Sie ermöglichen die gezielte Herstellung von DNA-Fragmenten, die dann
isoliert und zu neuen Konstruktionen zusammengesetzt werden können. Heutzutage verkauft man mehrere
Hunderte von Restriktionsendonukleasen im Handel.
Video auf Englisch über REs: http://www.answers.com/topic/restriction-enzyme
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Die DNA-Ligasen sind Enzyme, die das Verknüpfen zweier freie DNA-Enden durch eine
Phosphodiesterbindung katalysieren. Sie kommen von den einfachsten Organismen (z.B. Bakteriophagen)
bis zu Säugerzellen vor. In Säugern spielen die DNA-Ligasen eine Rolle bei der DNA-Replikation
(Verknüpfen der Okazaki-Fragmente), bei der Exzisionsreparatur, usw. In der molekularen Klonierung sind
aus Organismen (z.B. aus dem Bakteriophagen T4 oder aus E. coli) isolierte, bzw. rekombinant hergestellte
Ligasen unverzichtbare Werkzeuge für das Verknüpfen von DNA-Enden.
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Plasmidvektoren
(1) Plasmide sind kleine, in der Regel ringförmige, autonom replizierende, doppelsträngige DNA-Moleküle,
die in Bakterien vorkommen können, aber nicht zum Bakterienchromosom zählen, also extrachromosomal
vorliegen. Einige Plasmide haben die Fähigkeit, ins Genom zu integrieren und dann sich auszuschneiden,
andere Plasmide sind dazu nicht fähig. Nach einer alternativen Aufteilung gibt es relativ groβe Plasmide mit
niedriger Kopienzahl und kleine Plasmide mit höher Kopienzahl. Plasmide können mehrere Gene enthalten,
und sie können diese Gene relativ leicht einander oder einem Bakterium von einer anderen Art übergeben.
(1) Fruchtbarkeits-(F-)Plasmide enthalten nur tra-Gene, die den Pilus kodieren, wodurch die Bakterien auf
Konjugation mit anderen Zellen und Transfer ihres Genmaterials fähig sind. (2) Resistenzplasmide enthalten
unterschiedliche Antibiotika-Resistenzgene. (3) Virulenzplasmide machen ein Bakterium zu einem
Krankheitserreger. Jedes Plasmid enthält mindestens eine Sequenz, die als Replikationsursprung (engl.
Origin of Replication, kurz ORI) dient, diese Sequenz wird von der DNA-Polymerase erkannt.
(2) Plasmide sind wichtige Werkzeuge der rekombinanten Gentechnologie. Sie werden dann als
Plasmidvektoren bezeichnet und dazu verwendet, um Gene zu vervielfältigen oder zu exprimieren. Sie
enthalten nur die minimal benötigten DNA-Sequenzen, wie Replikationsursprung, Antibiotika-Resistenzgen
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als Selektionsmarker, multiple Klonierungsstelle (MCS) mit Erkennungssequenzen für eine Vielzahl von
Restriktionsenzymen, und gelegentlich noch andere Sequenzen.
Plasmide die für die Vervielfältigung fremder DNA-Sequenzen dienen, nennen wir Klonierungsvektoren.
Plasmide, die für die Einbringung von DNA-Sequenzen in eukaryotische Zellen dienen, sind die
Transformationsvektoren. Plasmide, welche dafür sorgen, daβ die eingebrachten Gene in großer Menge
exprimiert werden, nennen wir Genexpressionsvektoren. BAC (Bacterial Artificial Chromosome,
künstliches Bakterienchromosom): Vektor mit F-Plasmid basierendem Fertilitätsfaktor und eigenem
Replikationsursprung, die sogar 100-300 kb lange DNA-Fragmente aufnehmen kann. Im
Humangenomprojekt hat man diese Technik für die Herstellung von den Genbibliotheken verwendet. Mit
der Anwendung von BAC-Vektoren kann man das komplette Humangenom in zirka 10000 Hefeklonen
aufbewahren.
Englisches Video über Plasmide: http://www.answers.com/topic/plasmid
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Klonierung mit Restriktion/Ligation ist die bekannteste und am weitesten verbreitete molekulare
Klonierungstechnik, wobei der erste Schritt die Verdauung einer DNA-Probe mit irgendeiner
Restriktionsendonuklease ist. Demnächst wird das gegebene Fragment isoliert. Die Isolierung ist nich immer
möglich, z.B. wenn wir das ganze Genom von einem höheren Lebewesen oder ein Fragment davon in
Plasmidvektoren einbauen möchten. In diesem Fall bauen wir ohne Selektion alles ein (das ist die
sogenannte Shotgun-Technik), und wir identifizieren die beliebigen DNA-Fragmente erst danach. Das
Einbauen des DNA-Fragments erfolgt im Reagenzglas (in vitro) mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen.
Nach der Ligation schleusen wir den DNA-haltigen Vektor in Bakterienzellen ein. Diesen Prozess nennen
wir Transformation, was mit der Anwendung von einem elektrischen „Impuls” (Elektroporation) oder
unterschiedlichen chemischen Methoden erfolgen kann. Demnächst lassen wir die Bakterienzellen (E. coli)
in einer optimalen Umgebung (37 ºC, O2-reiches Medium mit intensivem Schütteln) vermehren. Dadurch 3
wird das Plasmid, was originell in einer Kopie in eine einzige Zelle gelangen ist, zusammen mit den
Bakterien multipliziert (kloniert). Das im Plasmid vorhandene Antibiotika-Resistenzgen ermöglicht die
Selektion der Bakterienzellen, die das transformierte Plasmid enthalten. Das von dem Resistenzgen kodierte
Protein inaktiviert nämlich das im Medium vorhandene Antibiotikum, und ermöglicht dadurch die
Multiplizierung und Kolonienbildung der Bakterien (eine Kolonie stammt aus einer einzigen Bakterienzelle).
Rekombinante Plasmide werden durch die DNA-Ligation nur mit einer bestimmten Frequenz erzeugt, viel
öfter wird das Plasmid ohne des Einbaus fremder DNA zirkularisiert. Der zweite Schritt des
Klonierungsprozesses ist deshalb die Differenzierung zwischen Plasmiden die die fremde DNA enthalten
und Plasmiden die es nicht enthalten. Es gibt mehrere Methoden für diese Differezierung, hier wird das am
häufigsten verwendete blau/weiβe Selektionssystem vorgestellt. In dieser Methode wird das lacZ Gen, ein
Gen des lac Operons, benutzt. Für die Detektierung des Produktes von lacZ (β-Galactosidase) benutzen wir
X-Gal, welches ein chromogenes Substrat ist. X-Gal ist ein farbloses Molekül, welches durch den Effekt der
β-Galactosidase ein blaufarbiges Produkt produziert, hat aber keinen Induktionseffekt auf das lac Operon.
Für die Induktion des lacZ Gens verwenden wir anstatt Lactose das sogenannte IPTG, weil dieser Stoff nicht
durch β-Galactosidase abgebaut wird, so es ist im Medium ohne Quantitätsverminderung anwesen. Damit
sind die beiden Funktionen der Lactose unter zwei Molekülen verteilt: (1) X-Gal: Substrat aber kein Inducer;
(2) IPTG: Inducer aber kein Substrat. Interessanterweise kann das lacZ Gen in zwei Fragmente unterteilt
werden (Alpha: ein kurzes Fragment am 5’-Ende, und Omega: die anderen Teile des Gens) auf so einer Art
und Weise, daβ die von den zwei Fragmenten gebildeten Alpha- und Omega-Peptide in der Zelle
zusammenstehen und dadurch ein funktionsfähiges Enzym bilden können. Der Abschnitt, welcher für das
Omega-Peptid kodiert, ist im Bakterienchromosom, der Abschnitt für das Alpha-Peptid ist in den
Plasmidvektor eingebaut. Der Alpha-Abschnitt wurde so ausgestattet, damit es ohne Funktionsverlust
mehrere unikale Restriktionsschnittstellen enthält. Dies wurde so erreicht, daβ Basen in den stummen Stellen
der Aminosäure-kodierenden Triplets ausgetauscht wurden, andererseits solche Triplets wurden inseriert,
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welche keinen Einfluss auf die Funktion des Peptids haben. Wenn wir in diese Region einen fremden DNAAbschnitt einligieren, es inaktiviert die Funktion des Alpha-Peptids, dementsprechend, die
Bakterienkolonien, die das rekombinante Plasmid enthalten, bleiben in der Anwesenheit von X-Gal und
IPTG weiβ, die Bakterienkolonien aber, die das originelle Plasmid ohne Insert enthalten, werden blau.
Anmerkung: Die DNA von dem Bakterium E. coli wurde so mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden
modifiziert, damit es optimale Eigenschaften für die Forschung hat, kann aber nicht pathogen werden.
Englisches Video über molekulare Klonierung: http://www.answers.com/topic/cloning (blau/weiβ Selektion:
nicht dasselbe, was im Vortragsmaterial bearbeitet wird!)
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EXTA ANFORDERUNG Andere Enzyme bei der Klonierung
Als Klenow-Fragment, auch Klenow-Enzym, wird das größere der beiden Proteinfragmente der DNAPolymerase I aus Escherichia coli bezeichnet, nach enzymatischer Spaltung mit Subtilisin. Es besitzt noch
mehrere Funktionen des originellen Enzyms, die durch molekulargenetischen Methoden gesteigert werden
können, daneben können wir auch von bestimmten unerwünschten Eigenschaften loswerden. Bei der
molekularen Klonierung wird das Klenow-Enzym nach Restriktionsverdauungen für das Auffüllen von 5'überstehenden, einzelsträngigen DNA-Sequenzen benutzt, wodurch gerade Enden entstehen. Diese Technik
wird z.B. gebraucht, wenn wir zwei Enden, die von zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen erzeugt
worden sind, zusammenligieren möchten.
Die S1 Nuclease schneidet einzelsträngige DNA. Mit Hilfe von diesem Enzym kann man die von
Restriktionsendonukleasen produzierten überhängenden Enden abschneiden, wodurch gerade Enden
entstehen.
Alkalische Phosphatasen sind Enzyme, die Phosphatgruppen von vielen Arten von Molekülen wie Proteinen 4
und Nukleotiden entfernen (Dephosphorylierung). In der Molekularbiologie wird die alkalische Phosphatase
zur Dephosphorylierung von linearer DNA eingesetzt. Diese Enzyme werden u.a. dafür verwendet, die
Phosphatgruppen von den freien Enden einer mit Restriktionsendonuklease verdauten DNA zu entfernen,
was die Folge hat, daβ die Ligase nicht fähig ist, die beiden DNA-Enden miteinander chemisch zu verbinden.
Somit bekommen wir nach der Transformation nur rekombinante Bakterienkolonien; Bakterien mit
Plasmiden, die ohne Insert zirkularisiert haben, werden nicht vorkommen. Die Plasmidvektore können in
diesem Fall nur dann zirkularisiert werden, wenn eine fremde DNA mit Phosphatgruppen an beiden Enden
in die entsprechende Restriktionsschnittstelle eingebaut wird (Plasmide können nur in einer Ringform
repliziert werden).
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2. Die Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (englisch Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine Methode, um
gegebene DNA-Abschnitte zu vervielfältigen. PCR unterscheidet sich dabei von der molekularen
Klonierung, daβ die gegebene DNA in diesem Fall nicht in lebendigen Zellen (E. coli oder andere
Organismen), sondern in vitro, mit Hilfe des Enzyms DNA-Polymerase amplifiziert wird. Die PolymeraseKettenreaktion wurde 1985 von Kary Mullis erfunden, wofür er 1993 den Nobelpreis für Chemie erhielt.
PCR benötigt die folgenden grundlegenden Komponente: (1) DNA-Template: die Original-DNA, die den zu
vervielfältigenden Abschnitt enthält. (2) DNA-Polymerase, die bei hohen Temperaturen nicht zerstört wird,
um den festgelegten Abschnitt zu replizieren (kopieren) (z.B. Taq-Polymerase). Im Originalverfahren von
Mullis wurde ein Enzym verwendet, was wegen der höhen Temperatur in allen Denaturationszyklen
inaktiviert worden ist. Später hat man dieses Enzym durch eine Polymerase, die sogenannte Taq-Polymerase
versetz, die auch bei hohen Temperaturen funktionieren kann und nicht inaktiviert wird. Taq-Polymerase
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wurde von einem in Hitzequellen lebenden Bakterium (Thermus aquaticus) isoliert, später wurden die
Eigenschaften des Enzyms mit molekulargenetischen Methoden optimiert. Für die PCR-Technik werden
heute auch hitzestabile Polymerasen von anderen Quellen verwendet. (3) Zwei Primer forward (vorne) und
reverse (zurück), welche kurze (18-25 Basen lange) einzelsträngige DNA-Stücke sind, die mit je einem
Abschnitt der zu amplifizierenden DNA komplementär sind. Die Primer starten die Synthese des neuen
DNA-Stranges, wobei die durch Denaturierung einzelsträngig gemachte DNA als Template dient, die DNAPolymerase kann nämlich doppelsträngige DNAs nicht erkennen. (In vivo braucht die DNA-Synthese, also
die Replikation RNA-Primer!). Mit der Auswahl der Primer können wir die beiden Endpunkten der zu
vervielfältigenden DNA bestimmen. (4) Desoxyribonucleosidtriphosphate (dNTPs), die Bausteine für den
von der DNA-Polymerase synthetisierten DNA-Strang. (5) Pufferlösung, die eine für die DNA-Polymerase
geeignete chemische Umgebung sicherstellt. Es enthält Mg2+-Ionen, die für die Funktion der Polymerase
essentiell sind.
Der PCR-Prozess besteht generell aus einer Anzahl von 20–40 Zyklen, die in einem Thermocycler
durchgeführt werden. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten: (1) Denaturierung (Melting, Schmelzen):
Zunächst wird die doppelsträngige DNA auf 94–96 °C erhitzt, um die Stränge voneinander zu trennen. Die
Wasserstoffbrückenbindungen, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, werden aufgebrochen. Im
ersten Zyklus wird die DNA oft für längere Zeit erhitzt (Initialisierung), um sicherzustellen, dass sich
sowohl die Ausgangs-DNA als auch die Primer vollständig voneinander getrennt haben und nur noch
Einzelstränge vorliegen. (2) Primerhybridisierung (Annealing): Die Temperatur wird auf einen niedrigeren
Wert gehalten, die eine spezifische Anlagerung der Primer an den komplementären Abschnitten der DNA
erlaubt. (3) Synthese (Polymerisation, Verlängerung, Amplifikation): Schließlich füllt die DNA-Polymerase
auf einer höheren Temperatur die fehlenden Stränge mit freien Nukleotiden auf. Sie beginnt am 3'-Ende des
angelagerten Primers und folgt dann den DNA-Strang. Der Primer wird nicht wieder abgelöst, er bildet den
Anfang des neuen Einzelstrangs. Die Temperatur hängt vom Arbeitsoptimum der verwendeten DNAPolymerase ab (68–72 °C). Im ersten Zyklus entstehen pro DNA-Ausgangsdoppelstrang 2 DNA-Stränge,
welche im Bereich der Zielsequenz doppelsträngig sind. Nach dem Schmelzen am Anfang des zweiten
Zyklus stehen dadurch die beiden ursprünglichen DNA-Einzelstränge und zwei am 3’-Ende überlange
Einzelstränge zur Verfügung. Dies ist damit zu erklären, daβ lediglich ein Startpunkt (Primer), nicht aber ein
Endpunkt exakt festgelegt ist. Der Abbruch der Strangsynthese erfolgt dabei spätestens durch die
Strangtrennung im folgenden Denaturierungsschritt. Im zweiten Zyklus stehen die eingesetzte DNA sowie
die gerade gebildeten DNA-Stränge zur Verfügung. An Ersterer erfolgt derselbe Prozess wie im ersten
Zyklus. An die neu gebildeten DNA-Einzelstränge, welche an 3’ bereits dort enden wo sie sollen, lagern sich
nun wieder Primer in der 3’-Region an. Die nun gebildeten Stränge haben auch keinen 3’-Überhang, da das
Template am 5' Ende bereits richtig endet (durch erste Syntheserunde und ersten Primer). Am Ende des
zweiten Zyklus stehen damit erstmals unmittelbar Produkte der gewünschten Länge zur Verfügung. In den
folgenden Zyklen vermehren sich die gewünschten Produkte exponentiell (da sie selbst als Matrize für
weitere Strangsynthesen dienen), während die ungewünschten langen Produkte (siehe Produkte des ersten
Zyklus) nur linear ansteigen (nur eingesetzte DNA dient als Matrize).
Anwendung der PCR:
(1) PCR kann eine Alternative der molekularen Klonierung (in vivo Amplifikation) sein, aber die beiden
Techniken können auch kombiniert werden, z.B. wenn wir PCR-Fragmente in Plasmidvektore einbauen.
(2) In eine DNA-Sequenz können Mutationen während des PCR-Prozesses eingefügt werden.
(3) PCR kann auch für diagnostische Zwecken verwendet werden, zB. für die Erkennung von
Erbkrankheiten, Diagnose von Infektionskrankheiten, Identifizierung von Tätern, Vaterschaftstesten, usw.
Englisches Video über PCR: http://www.youtube.com/watch?v=eEcy9k_KsDI
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3. Die Gelelektrophorese ist eine analytische Methode der Molekularbiologie, um verschiedene Arten von
Molekülen (DNA, RNA oder Proteine) zu trennen. Dabei wandert eine Mischung aus zu trennenden
Molekülen unter Einfluss eines elektrischen Felds durch ein Gel, welches in einer ionischen Pufferlösung
liegt. Je nach Größe und Ladung der Moleküle bewegen sich diese unterschiedlich schnell durch das als
Molekularsieb wirkende Gel. Dabei wandern kleinere, negativ geladene Moleküle (wie Nukleinsäuren und
Proteine) schneller in Richtung der positiv geladenen Anode. Die Moleküle des Gels, beispielsweise
Agarose oder polymerisiertes Acrylamid (Polyacrylamid), bilden ein engmaschiges Netz, das die zu
trennenden Moleküle bei ihrer Wanderung im elektrischen Feld behindert. Das für die Auftrennung benutzte
Gel hat eine Matrixstruktur: das Agarosegel besteht sich aus langen, nicht verzweigten Polysacchariden, das
Polyakrilamidgel besteht sich aus durch Kreuzbindungen gekoppelten Acrylamidmolekülen. Die Proteine
und die Nukleinsäuremoleküle mit einem kleinen Molekulargewicht werden auf Polyacrilamidgel, die DNAMoleküle mit einem gröβeren Molekulargewicht auf Agarosegel aufgetrennt. Moleküle gleicher Gröβe
laufen in diskreten Zonen – umgangssprachlich als Banden bezeichnet – durch das Gel. Die Länge der
Nukleinsäuren kann durch einen Vergleich mit einem Molekulargewichtmarker (DNA-Leiter), die DNAFragmente bekannter Größe enthält und parallel zur Probe im Gel mitläuft, bestimmt werden. Die
Auftrennung können wir mit einem analytischen oder einem präparativen Zweck durchführen. Bei der
analytischen Auftrennung gewinnen wir Informationen über das gegebene Molekül (über ihre Anwesenheit,
Molekulargewicht, usw.). Bei der präparativen Auftrennung werden die Moleküle erstmal isoliert, dann für
irgendeinen Zweck verwendet. Die im Gel aufgetrennte DNA- und RNA-Moleküle können mit
unterschiedlichen Farbstoffen sichtbar gemacht werden. Ethidiumbromid bindet die Nukleinsäuren und
fluoresziert im UV-Licht. Dieser Farbstoff ist aber krebserregend, deshalb werden neulich andere
fluoreszente Farbstoffe verwendet, um die DNA- und RNA-Moleküle sichtbar zu machen. Proteine können
wir z.B. mit der blauen Farbe Coomassie blue sichtbar machen. Proteine können in ihrem nativen Zustand,
oder nach Denaturierung mit SDS (Natrium-Dodecyl-Sulphat) im Gel aufgetrennt werden. Neben ihrer
denaturierenden Eigenschaft, SDS bindet die äuβere Oberfläche der Proteine und maskiert ihre eigenen
Ladungen, so wird das ganze Molekül einheitlich negativ geladen. Bei der Anwendung von SDS hängt also
die Laufgeschwindigkeit der Proteine nur von ihrem Molekulargewicht ab, von der Struktur und
Aminosäurezusammensetzung ist es unabhängig (Maskierungseffekt). SDS entfernt auch die
Proteinuntereinheiten voneinander.
Englisches Video über Gelelektrophorese:
http://www.youtube.com/watch?v=QEG8dz7cbnY&feature=related
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4. Detektion von Makromolekülen
Beim Southern Blot handelt es sich um eine 1975 von Edwin Southern entwickelte molekularbiologische
Untersuchungsmethode für DNA. (Die Northern, Western und Eastern Techniken wurden als Allusion nach
anderen Himmelsrichtungen genannt). Sie ermöglicht den Nachweis einer Gensequenz in einem komplexen
DNA–Gemisch (z. B. dem gesamten Genom eines Organismus) innerhalb kurzer Zeit. Die zu untersuchende
DNA wird mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen behandelt und anschlieβend durch
Gelelektrophorese der Größe nach aufgetrennt. Die DNA-Fragmente werden durch Alkalien in Einzelstränge
gespalten und das im Gel entstandene Trennmuster auf eine Membran (meist Nylon oder Nitrocellulose) mit
Hilfe von Kapillarkraft oder einem elektrischen Feld übertragen (Blotten) und dort dauerhaft fixiert. Die
Positionen der DNA-Banden auf der Membran sind mit ihren Positionen im Gel identisch. Anschließend
wird die Membran mit einer radioaktiv markierten DNA (Sonde) behandelt. Diese Sonde besteht aus
einzelsträngiger DNA, welche mit der gesuchten Sequenz komplementär ist. Befindet sich diese Sequenz
irgendwo auf der Membran, so bildet die Sonde Basenpaarungen mit dieser aus, bindet dauerhaft in diesem
Bereich (Hybridisierungsvorgang) und markiert es radioaktiv. Alle unspezifischen Bindungen werden
anschließend abgewaschen. Die radioaktiv markierten DNA-Banden werden mit Autoradiographie*
detektiert, was durch Auflegen der Membran auf einen Röntgenfilm, oder Phospho-Image-Analyzer Platten
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erfolgt. Weil die Arbeit mit radioaktiven Substanzen gefährlich ist, nicht-radioaktive Methoden können auch
verwendet werden (siehe die Methoden für in situ Hybridisierung).
Englisches Video über Southern blot: http://www.youtube.com/watch?v=zYSPnSwT6LQ
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Der Northern Blot ist eine molekularbiologische Methode zur Übertragung (Blotten) der in der
Gelelektrophorese aufgetrennten RNA auf eine Membran. Damit die RNA-Moleküle für DNA-Sonden
zugänglich werden, überträgt (blottet) man das Bandenmuster der fraktionierten RNA auf ein Blatt
Nitrocellulosepapier. Auf der Membran ist die Detektierung von spezifischen RNA-Sequenzen durch die
Hybridisierung mit komplementären DNA-Sonden möglich. Die Membran inkubiert man in einer Lösung,
die eine markierte DNA-Sonde enthält, deren Sequenz einem Abschnitt der RNA entspricht. Die RNAMoleküle, die auf der Membran mit der markierten Sonde hybridisieren, werden nun autoradiographisch
oder chemisch nachgewiesen. Die Gröβe der RNA-Moleküle in jeder Bande kann durch Vergleich mit RNAMolekülen bekannter Gröβe (RNA-Standards), die man parallel zu den experimentellen Proben laufen lässt,
bestimmt werden. Die Arbeit mit RNA benötigt mehr Reinheit und Aufmerksamkeit als die Behandlung der
DNA, weil unsere Haut die Laborinstrumente mit sehr vielen stabilen Ribonukleasemolekülen (RNase)
kontaminieren kann, die dann sehr leicht die RNA-Moleküle degradieren. Die Methode des Northern Blots
wird zum Beispiel verwendet, um die für ein Protein kodierende mRNA eines mutierten Organismus mit der
eines "normalen" Organismus zu vergleichen.
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Western Blot, auch Immunoblot bezeichnet die Übertragung von Proteinen auf eine Trägermembran. Die
Technik wird für die Detektion von spezifischen Proteinen in einer Probe verwendet. Als erster Schritt
trennen wir die nativen oder mit SDS denaturierten Proteinmoleküle mit Gelelektrophorese auf. Nach der
Elektrophorese werden die Proteinmoleküle auf eine Membran übertragen. Dann legen wir diese Membran
in eine Lösung, welche Antikörper gegen das zu untersuchende Protein enthält. Um die Detektion möglich
zu machen, binden wir die spezifischen Antikörper chemisch mit irgendeinem fluoreszenten Farbstoff oder
mit einem Enzym was ein chromogenes (Farbe erzeugendes) Substrat spaltet (über die Markierung von
Antikörpern siehe mehr unter Immunohistochemie).
Die Eastern blot Analyse ist eine Technik fähig für die Detektion von unterschiedlichen posttranslationalen
Modifikationen, meiβtens ist es für die Detektion von proteinengebundenen Kohlenhydraten verwendet.
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5. Gelretardierung
EXTA ANFORDERUNG Gelretardierung: Eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der
Bildung von Protein-DNA Komplexen ist der “electrophoretic mobility shift assay“ (EMSA), im folgenden
Gelretardierung genannt. Hier wird die Eigenschaft ausgenutzt, daβ DNA und Protein sowie der
entsprechende Komplex aufgrund unterschiedlicher Ladung und Größe verschiedene Laufeigenschaften
durch eine Gelmatrix in einem elektrischen Feld zeigen. Mit dieser Technik ist es möglich zu detektieren, ob
irgendeines Protein (meiβtens ein vermutliches Transkriptionsfaktor) zu einem gegebenen DNA-Abschnitt
bindet. Die Grundlage der Methode ist einfach: in demselben Gel lassen wir eine DNA-Probe (z.B. mit
Restriktionsendonukleasen geschnittene Probe), die Proteine enthält, und eine andere DNA-Probe mit
derselben untersuchten Sequenz, aber ohne Proteine. Dann machen wir die untersuchte DNA mit der
Southern-Blot Technik sichtbar. Wenn die Bande, die die untersuchte DNA-Sequenz enthält, mit Proteinen
im Gel langsamer wandert als ohne Proteinen, das heiβt das ein Proteinmolekül zur DNA gebunden ist und
ihren Lauf dadurch langsamer macht. Die langsamer laufende DNA kann von dem Gel isoliert werden, und
demnächst ist es möglich, mit DNA-Sequenzierung zu bestimmen, welche Region für die Bindung des
gegebenen Proteins verantwortlich ist. Wenn wir das DNA-bindende Protein bestimmen möchten, können
wir vor dem Lauf Antikörper gegen das gegebene Protein zum System geben (das ist die sogenannte
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Supershift-Assay). In diesem Fall wird der Lauf der DNA noch langsamer, und auch das DNA-bindende
Faktor kann identifiziert werden.
6. Footprint-Analyse
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EXTA ANFORDERUNG Ähnlich wie die Gelretardationstechnik, die Footprint-Analyse detektiert
ebenfalls DNA-Protein Wechselwirkungen. Die Grundlage der Methode ist, daβ ein bestimmtes DNAbindendes Protein eine bestimmte DNA-Region bindet, und schützt dadurch diese Region von dem Schnitt
des Enzyms Desoxyribonuklease (DNase). In der Kontrollprobe ohne Protein ist die entsprechende Region
aber nicht vor DNase geschützt. Die Enden der DNA-Fragmente werden radioaktiv markiert, partiell mit
DNase verdaut, in einem Gel laufen gelassen, und dann durch Autoradiographie detektiert. Wegen der
partiellen Verdauung produziert die DNase Fragmente unterschiedlicher Gröβe, die dasselbe Ende enthalten.
Wir können nur die Sequenzen detektieren, die die ursprünglichen Enden der DNA enthalten, weil nur diese
radioaktiv markiert sind. Die durch die Bindung des Proteins geschützte Region wird frei von Radioaktivität
sein, was den Eindruck von einem Fuβabdruck hat, daher kommt der Name der Methode. Die geschützten
DNA-Fragmente können wir aus dem Gel isolieren, und dann durch Sequenzierung bestimmen, welche
Sequenz für die Bindung des Transkriptionsfaktors verantwortlich ist.
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7. Immunhistochemie
Immunhistochemie (IHC) wird in der Molekularbiologie verwendet, um Proteine mit Hilfe von markierten
Antikörpern (IgG) sichtbar zu machen. Damit kann beispielsweise in Gewebeschnitten bestimmt werden, in
welchem Gewebe das Protein vorhanden ist und auch, in welchem Kompartiment der Zelle es lokalisiert ist.
Wenn wir die Methode an kultivierten Zellen oder Zellsuspensionen anwenden, sprechen wir über
Immuncytochemie. Der Nachweis beruht auf der Affinität von Antikörpern zu einer bestimmten
Gewebeeigenschaft (Epitop*) als Antigen-Antikörper-Reaktion. Im Idealfall kommt es zu einer spezifischen
und starken Bindung zwischen Antikörper und Epitop. Der Antikörper ist mit einem Detektionssystem
gekoppelt, das sein Vorhandensein im Präparat sichtbar macht. Mittels verschiedener Detektionssysteme
können schon geringe Mengen an Epitop verstärkt dargestellt werden. Das Ziel ist es, ein Signal am Ort des
Epitops (und nur dort) in ausreichender Stärke zu erkennen. Beispielsweise können Transkriptionsfaktoren,
die im Zellkern lokalisiert sind, nur im Zellkern angefärbt werden, membranständige Proteine nur in Teilen
der Zellmembran usw. Als Detektionssystem können wir fluoreszente Farbstoffe zu den Antikörpern binden
(Immunfluoreszenz), oder unterschiedliche Enzyme, die ein farbiges Produkt aus chromogenen (Farbe
erzeugenden) Substraten bilden. Im Fall von Immunfluoreszenz werden die durch Antikörper markierten
Strukturen mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Wenn das zum Antikörper gebundene Enzym die
Peroxidase ist, nennen wir die Technik Immunoperoxidasefärbung (im Allgemeinen werden die Methoden,
die auf Enzyme basieren, Immunoenzym-Methoden genannt). In der Anwesenheit von Wasserstoff-Peroxid
oxidiert die Peroxidase das Diaminobenzidin-Substrat zu einem braunfarbigen Produkt, welches in der
Umgebung der Enzymreaktion die genaue subzelluläre Lokalisation des untersuchten Proteins markiert. Die
Intensität der Markierung kann mit der Zugabe von NiSO4 gesteigert werden. Wenn der markierte
Antikörper direkt zum untersuchten Protein bindet, sprechen wir über eine direkte immunhistochemische
Methode. Mehr sensitiv ist aber die indirekte Methode, wenn zu dem am Protein direkt bindenden
Primärantikörper ein markierter Sekundärantikörper gebunden wird, weil in diesem Fall der markierte
Antikörper zu mehreren Epitopen binden kann, was zur Signalverstärkung führt. Der Sekundärantikörper ist
ein, gegen den Primärantikörper in einer anderen Art produziertes IgG-Molekül (z.B. Anwendung von in
Hase produzierten Antikörpern gegen Antikörper aus Ziege).
EXTRA ANFORDERUNG Bei der Immunhistochemie benutzt man oft Biotin- und Avidinmoleküle.
Heutzutage ist diese Färbemethode die am meisten eingesetzte. Biotin ist der andere Name für Vitamin B7.
Avidin ist ein Proteinmolekül welches im Eiweiβ der Vögel vorkommt und für die Bindung von Biotin
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verantwortlich ist. Anstatt von Avidin benutzt man oft Streptavidin aus dem Bakterium Streptomyces
avidinii, welches ebenfalls Biotin bindet. Streptavidin und Avidin besitzen jeweils vier Bindungsstellen für
Biotin. Biotin kann zu den Antikörpern gebunden werden, und es wird vom mit Peroxidase konjugierten
(gebundenen) Avidin erkannt. Die sogenannte ABC-(Avidin-Biotin-Complex)-Technik ist noch sensitiver.
Im Fall dieser Methode binden wir Biotin zum Antikörper, und auch Peroxidase wird zu den freien
Biotinmolekülen gebunden (siehe Abbildung). Die Verwendung des Enzyms alkalische Phosphatase ist eine
alternative Methode bei IHC. Dieses Enzym können wir direkt zu Sekundärantikörpern binden, oder zu
Antikörpern die gegen Digoxigenin (DIG) produziert worden sind. Im letzteren Fall DIG wird zum
Primärantikörper – oder viel öfter zum Sekundärantikörper – gebunden. DIG wird vom mit Enzym
gekoppelten anti-DIG Antikörper erkannt, und in der Anwesenheit des entsprechenden Substrats produziert
das Enzym alkalische Phosphatase ein farbiges Produkt. Die hier beschriebenen Methoden können frei
miteinander kombiniert werden: z.B. das auf DIG basierende System kann auch mit dem Enzym Peroxidase
verwendet werden.
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8. In-situ-Hybridisierung
EXTA ANFORDERUNG Die In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine molekularbiologische Methode, um
Nukleinsäuren, also RNA oder DNA, in Geweben, einzelnen Zellen oder auf Metaphase-Chromosomen
nachzuweisen. Dabei wird eine künstlich hergestellte, radioaktiv oder fluoreszent markierte DNA- oder
RNA-Sonde eingesetzt, die über Basenpaarungen an die nachzuweisende Nukleinsäure hybridisiert. Die
Bezeichnung „in situ“ wird verwendet, da der Nachweis direkt in der jeweiligen Struktur durchgeführt wird,
und nicht etwa biochemisch im Reagenzglas. Weite Verbreitung hat die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
(FISH) für den Nachweis von DNA oder RNA in Zellkernen einzelner Zellen, die Bestimmung der Position
von unterschiedlichen Genen auf Metaphase-Chromosomen sowie die Untersuchung der Verteilung von
mRNA, wobei radioaktive Proben verwendet werden, um eine gröβere Sensitivität zu ermöglichen.
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9. FRET
EXTA ANFORDERUNG. Der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (engl. Fluorescence resonance
energy transfer, kurz FRET) ist ein physikalischer Prozess, bei dem Energie eines angeregten
Fluoreszenzfarbstoffs (Donor-Fluorophor) strahlungsfrei auf einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff (AkzeptorFluorophor) übertragen werden kann. FRET kann somit über eine Abnahme der Donor-Fluoreszenz oder
eine Zunahme der Akzeptorfluoreszenz detektiert werden. Die Intensität des FRET hängt unter anderem
vom Abstand dieser beiden Fluorophore ab: Donor und Akzeptor sollten nur wenige Nanometer voneinander
entfernt sein. FRET kann zwischen zwei Farbstoffen, die zur Fluoreszenz befähigt sind, beobachtet werden.
Um eine Energieübertragung zu ermöglichen, muβ das Emissionsspektrum des Donors mit dem
Absorptionsspektrum des Akzeptors überlappen. Dieses Kriterium wird besonders gut von dem
Fluorophorenpaar zyan fluoreszierendes Protein (CFP) – gelb fluoreszierendes Protein (YFP) erfüllt. FRET
kann als Werkzeug in der Molekularbiologie verwendet werden um Interaktionen zwischen zwei Proteinen
nachzuweisen. Hierzu wird an das erste Protein ein Donorfluorophor (z.B. CFP) und an das zweite Protein
ein Akzeptorfluorophor (z.B. GFP) gebunden. Wenn die beiden proteine miteinander in Wechselwirkung
stehen, sind die Grundvoraussetzungen für einen Energietransfer erfüllt, und man kann nach UVBestrahlung gelbe Fluoreszenz beobachten. Je näher die Moleküle zueinander liegen, desto höher ist die
FRET-Effizienz. Ein Anwendungsbeispiel für FRET ist bei der Aufklärung von Signaltransduktionswegen.
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10. Durchflusszytometrie
EXTA ANFORDERUNG Der Begriff Durchflusszytometrie beschreibt ein Verfahren, das in der Biologie
und in der Medizin zur Anwendung kommt. Das Prinzip der Untersuchung beruht auf der Emission von
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optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen monochromatischen Laserstrahl passiert. Hierbei
werden die in einer Lösung befindlichen Zellen durch eine Kapillare gesaugt und passieren im Sensormodul
einzeln einen Laserstrahl. Die Zellen streuen einen Teil des Lichts, welches mittels Detektoren
nachgewiesen wird. Die Menge des gestreuten Lichts korreliert mit der Größe der Zelle und mit ihrer
Komplexität. Zugleich mit dem gestreuten Licht kann man im Durchflusszytometer Fluoreszenzfarben
messen. Man verwendet fluoreszente Farbstoffe, die an bestimmte Bestandteile der Zellen binden. Auch
Antikörper, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, können verwendet werden. Die Antikörper sind
meist gegen bestimmte Oberflächenproteine gerichtet. Nach Markierung kann dann auch die Sortierung nach
diesen Merkmalen erfolgen. Durch Einsatz von verschiedenfarbigen Lasern und vor allem Filtern kann die
Anzahl der einsetzbaren Farbstoffe und damit die Informationsdichte erhöht werden. Das
Durchflusszytometer besteht aus: (1) Durchflusszelle, durch welche die Zellsuspension in einem sehr dünnen
Strahl geleitet wird. Hier findet die Messung statt. (2) Lichtquelle, meist mehrere Laser, aber auch Xenonoder Argonlampen können verwendet werden. (3) Filter zur Auftrennung der Fluoreszenzsignale auf
verschiedene Detektoren. (4) Detektore. In der Regel werden Photomultiplier verwendet, um die
eingehenden Signale zu verstärken. (5) Computer. Die Durchflusszytometrie wird in der Klinik für die
Routinediagnostik unter anderem in der Hämatologie (z.B. für die Diagnose von Läukemie), Infektologie
und Immunologie eingesetzt. Ein weiteres groβes Einsatzgebiet der Durchflusszytometrie stellt die
medizinische und zellbiologische Grundlagenforschung dar. Auβerdem wird dieses Verfahren auch in der
Biotechnologie verwendet, z.B. um Spermazellen mit dem Geschlechtschromosom X und solche mit dem
Chromosom Y voneinander zu trennen.
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11. FACS
EXTA ANFORDERUNG FACS (Fluorescence-activated cell sorting; Fluoreszenz-aktivierte
Zellsortierung) FACS ist eine Variante der Durchflusszytometrie für die Auftrennung von biologisch
heterogenen Zellpopulationen. In der FACS-Maschine gibt es eine Einheit, die die Zellen sortieren kann.
Wörterbuch
Autoradiographie bezeichnet die Sichtbarmachung einer chemischen Komponente durch radioaktive
Isotope durch Schwärzung eines Röntgenfilmes. Die dabei erhaltene Aufnahme wird Autoradiogramm
genannt.
Epitop (anders Antigendeterminant) ist der Teil der Makromolekülen, welches von dem Immunsystem
erkannt wird.
Hierarchieebenen und die sich damit beschäftigenden Wissenschaften: Ökosystem, Populationen:
Ökologie; Organismus, Organen, Geweben: Physiologie; Zellen: Zellbiologie; Makromoleküle: molekulare
Biologie, Moleküle: Chemie; Atome, subatomische Partikel: Kvantumphysik.
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