negativ

Meilensteine in der „Karriere“
eines Arzneimittels
Akute Toxizität
- Am Ganztier
- Aufnahme: oral, inhalativ, dermal
- Bestimmung von: Letalität (LD50)
- Hautreizung, Augenreizung
- Erste Informationen über betroffene
Organe, Wirkmechanismen und
Todesursache
Mutagenität
- Identifikation von Veränderungen
der DNA (vererblich)
- Dadurch: Identifikation eines möglichen
Krebsrisikos
- Zwingend vorgeschrieben sind:
(i) Mutagenitätstest an Bakterien
(ii) Mutagenitätstest an Säugerzellen
in vitro
(iii) Mutagenitätstest an Säugerzellen
in vivo
Pharmakokinetik und
Metabolismus
- Blut- und Gewebekonzentrationen
- Pharmakokinetik 1. versus 2. Ordnung
- Halbwertszeit (Kumulation?)
- Identifikation aller Metabolite
- Identifizierung der Ausscheidungswege:
Harn versus Kot versus Galle
- Im Versuchtier (erst in der Phase 1
klinischen Studie im Menschen)
Toxizität bei wiederholter
Verabreichung
- 28-Tage Test
- 90-Tage Test
- Ableitung eines NOAEL
- Pharmakokinetik 1. versus 2. Ordnung
- Änderung der Wirkungsstärke:
Sensibilisierung?
Toleranz?
Neue Wirkungen?
Reproduktionstoxizität
Zweigenerationenstudie
- Bereits den Elterntieren wird die
Prüfsubstanz verabreicht
- Die Nachkommen werden untersucht
auf die Leistung des Fortpflanzungssystems sowie auf Wachstum und
Entwicklung
- Großer Aufwand; erfordert viele
Versuchstiere
Chronische Toxizität
12 - 18 Monate
- Meist in Ratten und Mäusen
- In der Regel drei Dosierungen
und Kontrollen
- In der Regel 20 Tiere je Gruppe
- Männchen und Weibchen
- Untersucht werden: Allgemeinzustand,
Gewicht, Blut, Urin, alle Organe in
der Histologie
Karzinogenität
2-Jahresstudie
- Meist in Ratten und Mäusen
- Drei Dosisstufen und eine Kontrollgruppe
-Männchen und Weibchen
- Meist 50 Tiere je Gruppe
- Alle Organe und Gewebe, in denen
Krebs entstehen kann, werden
aufgearbeitet
Die klinischen Prüfungen
Das Schema verdeutlicht zugleich den steigenden Zeit- und Mittelaufwand. Die Prüfgänge können je nach Stoffart
(Arzneimittel, Pestizid, Nahrungsmittelzusatz u. a. m.) gewisse Abwandlungen erfahren; auch die Einwirkungsart
(Aufnahmewege, Häufigkeit, Dauer) kann von Einfluss sein. Die toxikologische Prüfung neuer Stoffe beruht fast
ausschließlich auf Untersuchungen an Versuchstieren, aus praktischen Gründen werden meist kleine Nager, wie
Ratte und Maus, verwendet.
Exkurs: Anwendungsorientierte Mutagenitätsprüfung
Standard Testbatterie für Gentoxizität
1. Bakterieller reverser Mutagenitätstest
2. Test mit Säugerzellen auf: a. Chromosomenaberrationen
b. Genmutationen
3. In vivo Mutagenitätstest
Standard Testbatterie für Gentoxizität
1. Bakterieller reverser Mutagenitätstest
2. Test mit Säugerzellen auf: a. Chromosomenaberrationen
b. Genmutationen
3. In vivo Mutagenitätstest
Möglichkeit der Umsetzung
1. Ames Test
2. V79 (HGPRT)-Test
und Test auf Chromosomenaberrationen z.B. In Lymphozyten
oder
Mouse lymphoma tk assay
(inklusive der Größenbestimmung der Kolonien: kleine Kolonien durch strukturelle oder
numerische Chromosomenaberrationen)
3. Micronuklei
Chromosomenabrerrationen
Im Knochenmark von Mäusen
Ames Test
Chemical mutagens
Wild type
bacterium
his G46:
Endogenous
processes
5´-C T C-3´
3´-G AG-5´
(Leucine)
Formation of colonies
on minimal agar
Salmonella
typhimurium
TA 1535
his G46
5´-C C C-3´
3´-G G G-5´
(Proline)
No colony formation on
minimal agar
Ames Test
Preincubation assay
S-9 Mix1
Plate incorporation assay
Bacteria
Test substance
S-9 Mix1
Test substance
Bacteria
Top agar
Incubation for 20-60 min on a shaking water bath
Plating onto petri dishes
immediately after addition
of top agar
Addition of top agar
and plating on petri dishes
Incubation for
48 - 72 h
Growth of colonies: each colony
indicates a reverse mutation
Negative control: only a small
number of colonies can be observed
that are due to spontaneous mutations
Bacteria incubated
with a mutagen
5-7 days
Liver
Administration of substances
that induce liver enzymes
- Excision of the liver
- Homogenisation
- Centrifugation at 9 000 g
S-9
Sediment
Mechanismen falsch positiver Ergebnisse in Ames Test:
- der (überwiegend) aktivierende Metabolismus (Phase I) ist massiv induziert
- der (überwiegend) inaktivierende Metabolismus (Phase II) ist nicht oder nur
schwächer induziert
- ggf. wird eine Substanz in der Hepatozyte aktiviert aber unmittelbar zum „benachbarten“
inaktivierenden Enzym weitergereicht; der aktive Metabolit verlässt nicht die Hepatozyte
TA98 Revertanten / Platte
Ames Test mit Substanz AS-D20 mit
und ohne Rattenleber S-9 Mix
300
Positive Kontrollen
250
Mit S-9-Mix:
Benzo[a]pyren (10µg/Platte):
2-Aminoanthracen (10 µg/Platte):
200
Mit
S-9 Mix
150
100
Ohne
S-9 Mix
50
0
0
5 15,8 50 158 500 1580 5000
Substanz AS-D20 (µg/Platte)
689 ± 35
4900 ± 168
Ohne S-9-Mix:
Benzo[a]pyren-4,5-oxid (1 µg/Platte) 4200 ± 424
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
(10 µg/Platte):
46 ± 7
TA98 Revertanten / Platte
Mutagenität von Substanz AS-20 im Ames Test mit S-9 Mix (Präinkubation) bei
Zusatz unterschiedlicher Konzentrationen an Glutathion (GSH)
GSH
0 mM
2,5 mM; 5 mM
150
Positive Kontrollen
GSH
Benzo[a]pyren
(10 µg/Platte)
10 mM
100
50
0
0
50
158
500
Substanz AS-20 (µg/Platte)
1580
0 mM
1 mM
2,5 mM
5,0 mM
10 mM
438 ± 38
252 ± 39
264 ± 35
212 ± 46
113 ± 15
2-Aminoanthracen
(10 µg/Platte)
5333 ± 208
5233 ± 153
5200 ± 200
5300 ± 200
5167 ± 58
TA98 Revertanten / Platte
Ames Test (Präinkubation; 1h) mit AS-20 mit 3 aktivierenden Systemen: S-9 Mix,
Hepatozytenhomogenat und intakte Hepatozyten der Ratte
Positive Kontrollen
150
Benzo[a]pyren
(10 µg/Platte)
125
S-9
Mix
100
2-Aminoanthracen
(10 µg/Platte)
S-9 Mix
461 ± 46
4833 ± 153
50
Homogenat
457 ± 27
4150 ± 180
25
Intakte
Hepatozyten
103 ± 4,5
3717 ± 176
Homogenat
75
Intakte Hepatozyten
0
0
15,8 50
158 500 1580 5000
Substanz AS-20 (µg/Platte)
Die Substanz wurde in die Kanzerogenitätsprüfung gegeben;
Ergebnis (2,5 Jahre später nach Investition von
ca. 6 Mio EUR):
- negativ in Mäusen
- negativ in Ratten
Fazit: das war nicht zu 100% vorauszusehen; aber: bei „erklärbar“
positivem Ames Test und sonst negativer Testbatterie ist mit großer
Wahrscheinlichkeit keine Kanzerogenität aufgrund eines gentoxischen
Mechanismus zu befürchten (nicht ausgeschlossen ist selbstverständlich
ein nicht-gentoxischer kanzerogener Mechanismus)
Standard Testbatterie für Gentoxizität
1. Bakterieller reverser Mutagenitätstest
2. Test mit Säugerzellen auf: a. Chromosomenaberrationen
b. Genmutationen
3. In vivo Mutagenitätstest
Möglichkeit der Umsetzung
1. Ames Test
2. V79 (HGPRT)-Test
und Test auf Chromosomenaberrationen z.B. In Lymphozyten
oder
Mouse lymphoma tk assay
(inklusive der Größenbestimmung der Kolonien: kleine Kolonien durch strukturelle oder
numerische Chromosomenaberrationen)
3. Micronuklei
Chromosomenabrerrationen
Im Knochenmark von Mäusen
Anwendungsbeispiele
Test
Ergebnis
1. Ames Test
negativ
2. V79 (HGPRT)-Test
negativ
Test auf Chromosomenaberrationen
in Lymphozyten
3. Chromosomenabrerrationen
im Knochenmark der Maus
→ Weiter mit der Kanzerogenitätsprüfung
negativ
negativ
Anwendungsbeispiele
Test
Ergebnis
1. Ames Test
positiv
2. V79 (HGPRT)-Test
positiv
Test auf Chromosomenaberrationen
in Lymphozyten
3. Chromosomenaberrationen
im Knochenmark der Maus
→ Substanz „beerdigen“
positiv
positiv
Test
Ergebnis
1. Ames Test
positiv
2. V79 (HGPRT)-Test
negativ
Test auf Chromosomenaberrationen
in Lymphozyten
3. Chromosomenaberrationen
im Knochenmark der Maus
negativ
negativ
Ein positiver Ames Test ist nicht zwingend das „Aus“ einer
Substanz; Falls die anderen Prüfungen negativ sind kann die
Substanz ggf. „gerettet“ werden.
→ Ggf. Überprüfung der Relevanz des positiven Ames Tests
Test
Ergebnis
1. Ames Test
„schwach positiv“
2. V79 (HGPRT)-Test
negativ
Test auf Chromosomenaberrationen
in Lymphozyten
3. Chromosomenabrerrationen
im Knochenmark der Maus
negativ
negativ
- Der Ames Test zeigte nur eine sehr schwache Erhöhung der Revertanten
nur mit S-9
- Nur mit dem „in Haus“ frisch hergestellten S-9
- Der Anstieg war nicht konzentrationsabhängig, und nur bei den 3 höchsten
Konzentrationen zu beobachten (500, 1580 und 5000 µg/Platte); darunter:
negativ
- Dieser suspekte, „schwach positive“ Befund war allerdings reproduzierbar
→ Was tun??
Die Überprüfung der Reinheit ergab für den getesteten Batch einen
kleinen „Nebenpeak“ von ca. 0,3 % der Gesamtsubstanz
Die „Nebensubstanz“ wurde isoliert und getestet:
Ergebnis:
- positiv im Ames Test
- positiv im V79 Test
→Das Syntheseverfahren wurde optimiert, bis keine „Nebensubstanz“
mehr nachweisbar war. Alle weiteren Gentoxizitätstests waren negativ.
Der Kanzerogenitätsprüfung war ebenfalls negativ.
Test
Ergebnis
1. Ames Test
positiv
2. V79 (HGPRT)-Test
negativ
Test auf Chromosomenaberrationen
in Lymphozyten
3. Chromosomenabrerrationen
im Knochenmark der Maus
positiv
negativ
- Kritische Situation, aber nicht ganz ausgeschlossen, dass die Substanz zu
retten ist.
Vorgehen: - Widerspruch Ames-Test zu V79-Test klären
- Chromosomenaberrationen nur bei toxischen Konzentrationen?
Exkurs: „Toxizitäts-assoziierten
DNA-Schäden“
Problem der Toxizität bei Tests auf Chromosomenaberrationen, Mikronuklei und DNAStrangbrüche („Klastogenität“)
Die Guidelines (z.B. ICH) empfehlen toxische Konzentrationen bis zu maximal 80 % Toxizität zu
testen (daher initial: „range finding test“)
Aber: Apoptose und Endonukleasen-Freisetzung können bei toxischen Konzentrationen zu DNABrüchen führen und somit Chromosomenaberrationen bzw. Mikronuklei induzieren
Diese „Toxizitäts-assoziierten DNA-Schäden“ sind keine Folge von Gentoxizität der
Prüfsubstanz
In Fall der „Toxizitäts-assoziierten DNA-Schäden“ liegt oft ein Schwellenmechanismus vor
Ein „gemeines“ Beispiel
Test
Ergebnis
1. Ames Test
negativ
2. V79 (HGPRT)-Test
negativ
Test auf Chromosomenaberrationen
in Lymphozyten
positiv
3. Chromosomenabrerrationen
im Knochenmark der Maus
positiv
Zusätzlich wurde noch ein Test auf Induktion
von DNA-Addukten durchgeführt:
positiv
Kanzerogenität in Mäusen: positiv
Kanzerogenität in Ratten: positiv
Leber- und Blasentumore, bei sehr
hohen Dosierungen
Würden Sie diese Substanz gegen leichte Kopfschmerzen nehmen?
Die Substanz heißt:
Paracetamol
Indizien, die den toxikologisch gebildeten Chemiker misstrauisch machen:
- hohe, toxische Dosierung
- Lebertumore bei Nagern
nicht zwingend auf den weniger empfindlichen
Menschen übertragbar
- Blasentumore:
Blasensteinbildung bei hohen Dosen?
- Chromosomenaberrationen bei negativem Ames- bzw. V79-Test:
toxische Konzentrationen?
Problem der Schwelle: Gentoxizität nach Überforderung der Glucuronid-Konjugation
Paracetamol
Glucuronidierung
Sulfatierung
Chinonimin
Konjugation mit
Glutathion
DNA-Schädigung