Entwicklung der chemisch-technischen Grundlagen einer

Entwicklung der chemisch-technischen Grundlagen einer
automatisierten Synthese von Molekülbibliotheken und des
intelligenten Screenings von Leitstrukturen
Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina
zu Braunschweig
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
genehmigte
Dissertation
von
Sandra Pilawa
aus Hannover
1. Referent: Prof. Dr. Jürgen Wehland
2. Referent: PD Dr. Ursula Bilitewski
eingereicht am: 18.05.2000
mündliche Prüfung (Disputation) am: 22.11.2000
2001
(Druckjahr)
Vorveröffentlichungen der Dissertation
Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Gemeinsamen
Naturwissenschaftlichen Fakultät, vertreten durch die Mentorin oder den Mentor/die Betreuerin
oder den Betreuer der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht:
Tagungsbeitrag:
Pilawa, S., Zander, N. & Frank, R. (1999):
„Optimized reaction conditions for the direct esterification of protected amino acids to cellulose
membrane supports by the SPOT-technique.“ Poster auf dem sechsten internationalen
Symposium „Solid Phase Synthesis & Combinatorial Chemical Libraries“ in York, England,
vom 31. August bis zum 04. September 1999.
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von September 1996 bis Februar 2000 in der
Arbeitsgruppe Molekulare Erkennung, im Bereich Zell- und Immunbiologie unter der Leitung
von Prof. Dr. Jürgen Wehland, dem Mentor dieser Dissertation, an der Gesellschaft für
Biotechnologische Forschung (GBF) in Braunschweig angefertigt.
Ich bedanke mich bei Herrn Dr. Ronald Frank für die freundliche Aufnahme in seiner
Arbeitsgruppe und die Möglichkeit, in einem faszinierenden, modernen Arbeitsgebiet zu
forschen. Weiterhin möchte ich ihm für die Möglichkeit danken, meine Ergebnisse auf dem
sixth international Symposium „solid phase synthesis & combinatorial chemical libraries“
präsentieren zu können.
Für die vielfältige Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit möchte ich mich bedanken
bei:
Andrea Tiepold für die Anfertigung aller GC-FID Messungen zur Racemisierung, den MALDIMS Messungen sowie eine Einführung in die Spot-Synthese und für viele Diskussionen zu
weiterführenden Themen.
Christiane Kamp für die Ausführung aller GC-MS Messungen zur Racemisierung.
Anke Wassmann und Ester Surges für die Durchführung aller ESI-MS Messungen.
Susanne zur Lage für die Durchführung der T-Zell Analysen und die kompetente Unterweisung
in immunologischen Grundlagen.
Christel Kakoschke und Beate Jaschok-Kentner für die Messung zahlreicher NMR-Proben
sowie Dr. Viktor Wray für Diskussion und Hilfe bei diffizilen NMR-Auswertungen.
Brigitte Kornak für die Synthese von Peptiden als Referenzsubstanzen und viele Kuchen.
Norbert Zander für die Synthese einiger Azolid Derivate.
Yvonne Gräser, mit der ich nicht nur die Laborbank teilte, für einige derivatisierte
Trägermaterialien.
Dr. Klaus-Dieter Aumann für die BRAGI-Graphiken und für die Lösung von Problemen im
EDV-Bereich.
Den Mitarbeitern des HKI Jena für die Einführung in die dünnschichtchromatographische
Bestimmung von Substanzen, die mit DNA wechselwirken.
Allen noch nicht erwähnten Mitarbeitern der Arbeitsgruppe für eine interessante Zeit und für
viele Tips und stete Hilfsbereitschaft.
Ganz besonders herzlich möchte ich „K.-D.“ Aumann danken für viel Verständnis, Hilfe und
Liebe während dieser Zeit und darüber hinaus für unermüdliches Korrekturlesen. Für viele
hilfreiche Diskussionen zum Thema danke ich Herrn Dr. Oliver Schumacher und seinem Weib
Sabine. Meinen Eltern, meinem Bruder und meiner Katze möchte ich für die jahrelage
Unterstützung danken.
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
I Einleitung
1.
Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
2.
Die theoretischen Grundlagen des kombinatorischen Ansatzes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.1 Festphasenpeptidsynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2 Erzeugung von Bibliotheken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2.1 Die parallele Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2.1.1 Synthese an Stäbchen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2.1.2 Die Spot-Methode als Cellulose basierte Methode . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2.2 Die multiple Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2.2.1 Kennzeichnung der Träger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2.2.2 Die Teebeutelsynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2.3 Möglichkeiten und Probleme der Kopplung von Mischungen . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.3 Anforderungen und Einflüsse an Synthesematerialien und Methoden . . . . . . . . . . . . . . 10
2.3.1 Träger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.3.2 Linker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.3.3 Anker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.4 Syntheseprinzipien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.5 Schutzgruppenstrategien (BOC/Fmoc-Chemie) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.6 Aktivierungsmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.6.1 Knüpfung der Peptidbindung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.6.2 Knüpfung einer Esterbindung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.7 Für die Peptidsynthese relevante Nebenreaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.7.1 Aggregation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.7.2 Racemisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.7.3 Diketopiperazinbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.7.4 Unkontrollierte Dipeptidbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.
Theoretische Grundlagen der zellulären Immunität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1 Immunologische Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 MHC Klasse-I Moleküle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1 Die Struktur des MHC Klasse-I Moleküls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2 Die Diversität des MHC-Moleküls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.3 Die intrazelluläre Komplexbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3 MHC Klasse-II Moleküle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.1 Die Struktur des MHC Klasse-II Moleküls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.2 Die Diversität des MHC-Moleküls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.3 Die Prozessierung der Antigen-Peptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4 Antigenerkennung und Auswirkungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5 Untersuchungen zur Lokalisierung eines Epitops . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.
Grundlagen der DNA-Wirkstoff Interaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.1 Aufbau und Struktur der DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.2 Sequenzspezifische DNA-Erkennung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
19
19
20
21
22
22
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23
24
24
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26
Inhaltsverzeichnis
II
II Themenstellung
5.
Themenstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
III Ergebnisse und Diskussion
6.
Versuche zur Verankerung der ersten Aminosäure über eine Esterbrücke . . . . . . . . . . .
6.1 Untersuchung verschiedener Kopplungsreagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.1 Prinzipien der Quantifizierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.2 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit 2,4,6-Mesitylensulfonyl-3-nitro1,2,4-triazol (MSNT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.3 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren als isoliertes symmetrisches Anhydrid . . .
6.1.4 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit DIC und Methylimidazol (MeIm) . . .
6.1.5 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren nach Sieber . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.6 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit Tetramethylfluoroformamidinium-Hexafluorophosphonat (TFFH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.7 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren nach Mitsunobu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.8 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit Azoliden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.8.1 Reaktivität der verschiedenen Azolide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.8.2 Reaktivität der einzelnen Aminosäure durch Azolidaktivierung . . . .
6.1.8.3 Steigerung der Ausbeuten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.8.4 Sättigungseffekte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.8.5 Gleichmäßigkeit der CDI- und CDT-Veresterung . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.9 Zusammenfassende Betrachtung der Quantität der Aktivierungsmethoden . . . .
6.2 Nebenreaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2.1 Racemisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2.1.1 Mechanismen der Racemisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2.1.2 Untersuchungsmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2.1.3 Ergebnisse der Racemisierung bei Aktivierung mit CDI, CDT, ThDI
und ThDT, im Vergleich mit MSNT und symmetrischem Anhydrid .
6.2.1.4 Zusammenfassung der Untersuchung zur Racemisierung . . . . . . . . .
6.2.2 Dipeptidbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2.2.1 Untersuchungen zur Dipeptidbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2.3 Diketopiperazinbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2.3.1 Untersuchung der Diketopiperazinbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.3 Vergleichende Betrachtung der Veresterungsmethoden unter Berücksichtigung der
Ausbeuten und der Nebenreaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.4 Spot-Synthese der Peptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5 Paralleles Abspalten der Peptide vom Träger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5.1 Qualitätskontrolle der abgespaltenen Peptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5.2 Quantitätsprüfung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5.3 Zusammenfassung der Ergebnisse der Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
37
37
37
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40
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60
60
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62
63
63
66
68
Inhaltsverzeichnis
III
7.
69
69
70
70
71
71
8.
Immunologische Untersuchungen der synthetisierten Bibliotheken . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.1 Immunologische Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2 Zelluläre Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2.1 Gewinnung der T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2.2 Gewinnung der antigenpräsentierenden Zellen (APC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2.3 Bestimmung der Interleukin-2 (IL-2) Produktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.3 Beeinflussung der biologischen Testsysteme durch die Chemikalienbehandlung
des Trägermaterials mit Hilfe einer Helfer-T-Zellanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.3.1 Helfer T-Zell Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.3.2 Untersuchung der Zellverträglichkeit und Peptidkonzentration durch eine
Analyse der Proliferation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4 Etablierung eines Testsystems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4.1 Die Proliferationsanalyse (TH-Zellen, MHC Klasse-II) . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4.2 Interleukin-2 Test (TH-Zellen, MHC Klasse-II) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4.3 Zusammenfassung MHC Klasse-II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4.4 Cytotoxische-Analysen (TC-Zellen, MHC Klasse-I) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4.4.1 Spezifische Lyse nach Irp A Immunisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4.4.2 Spezifische Lyse nach Act A Immunisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DNA-Wirkstoffinteraktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.1 Darstellung von Polyamidketten aus verschiedenen aromatischen
Aminocarbonsäurebausteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.2 Wahl der Bausteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.3 Schutzgruppenstrategien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.3.1 BOC-Strategie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.3.1.1 Einführung der BOC-Schutzgruppe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.3.2 Fmoc-Strategie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.3.2.1 Einführung der Fmoc-Schutzgruppe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.3.3 Reduktion von Nitrogruppen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.4 Aktivierungsstrategien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.5 Die Quantifizierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.6 Versuche zur Polyamidbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.6.1 Versuche zur Polyamidbildung auf Amino-PEG Papier . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.6.2 Polyamidbildungsversuche auf Fmoc-Rink-Amid-Linker Amino-PEG Papier .
8.6.3 Einsatz von Mikrowellen zur Aktivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.7 Betrachtung der Reaktivität der Bausteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.7.1 Versuche zur Abschätzung der Reaktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.7.2 Theoretische Betrachtung der Reaktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.8 Abschließende Bewertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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86
86
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89
90
91
94
94
95
96
IV Zusammenfassung und Ausblick
9.
Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
10. Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
Inhaltsverzeichnis
IV
V Material und Methoden
11. Materialien und Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.1 Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.1.1 Rechner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.2 Analytik
......................................................
11.2.1 Chromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.2.1.1 HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.2.1.2 Gaschromatographie (GC-FID) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.2.1.3 GCQ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.2.2 Massenspektrometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.2.2.1 MALDI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.2.2.2 ESI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.2.3 Kernresonanz-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.2.3.1 1H-NMR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.2.3.2 13C-NMR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.2.4 Sonstige Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.3 Peptidsynthese mit Syntheseautomaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.3.1 SPOT-Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.3.1.1 Kettenverlängerungsreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.3.1.2 Veresterung der ersten Aminosäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.3.1.3 Abspalten der Seitenkettenschutzgruppen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.3.1.4 Abspalten vom Träger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4 Methodik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.1 Fmoc-Abspaltung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.1.1 Durchführung der Quantifizierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.1.2 Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.1.3 Abweichung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.1.4 Berechnung der Standardabweichung STABWN . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.2 Darstellung von Aktivierungsreagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.2.1 Synthese von ThDI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.2.2 Synthese von ThDT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.2.3 Synthese von MSNT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.3 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren zur Veresterung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.3.1 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit MSNT . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.3.2 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren als isoliertes
symmetrisches Anhydrid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.3.3 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit DIC und MeIm . . . . . . . . .
11.4.3.4 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren nach Sieber . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.3.5 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit TFFH . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.3.6 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren nach Mitsunobu . . . . . . . . . . .
11.4.3.7 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit Azoliden . . . . . . . . . . . . . .
11.4.3.8 Untersuchung des Niederschlages der Aktivierung von
Fmoc-Prolin mit CDI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.4 Nebenreaktionen - Ester . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.4.1 Diketopiperazinbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.4.2 Stabilität der Fmoc-Aminosäuren gegen CDI/CDT bzw. Im/Ta . . .
11.4.4.3 Durchführung der Racemisierungsuntersuchung . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.5 Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.5.1 Synthese des 11-mers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4.5.2 Qualitätskontrolle mit Hilfe einer Radioaktivitätsanalyse . . . . . . . .
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114
Inhaltsverzeichnis
11.5 T-Zell Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.5.1 Vorbereitung für die Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.5.2 Durchführung der zellulären Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6 Polyamide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6.1 Durchführung des JENA-Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6.1.1 Berechnung des Rf-Wertes für die Dünnschichtchromatographische Untersuchung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6.2 Darstellung von Fmoc-3-Aminopyrazol-4-carbonsäure (349,35 g/mol) . . . . . .
11.6.3 Darstellung von Fmoc-3-Aminobenzoesäure (359,39 g/mol) . . . . . . . . . . . . . .
11.6.4 Darstellung von BOC-2-Aminobenzoesäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6.5 Darstellung von BOC-3-Aminobenzoesäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6.6 Aktivierung für Amidbindung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6.6.1 Aktivierung mit PyBOP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6.6.2 Aktivierung mit TBTU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6.6.3 Aktivierung mit TFFH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6.6.4 Aktivierung mit DIC/HOBt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6.7 Untersuchung der Reaktivität der Bausteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6.7.1 Reaktion mit Essigsäureanhydrid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6.7.2 Reaktion mit Benzoylchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
VI Literatur
VII Anhang
V
115
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119
119
119
Einleitung
1
I Einleitung
1.
Einleitung
In der Vergangenheit stellte die Natur die ausschließliche Quelle pharmakologisch wirksamer
Stoffe dar. Kräuter, Wurzeln und Samen wurden nach überlieferten Traditionen aufbereitet und
gegen Beschwerden und Krankheiten eingesetzt. Dabei sind jedoch oft nur wenige der Inhaltsstoffe pharmakologisch relevant. Durch den Fortschritt in Wissenschaft und Technik ist es
möglich geworden, die Wirkstoffe in den Pflanzenteilen zu identifizieren und sie so einzeln
gezielt einzusetzen. Durch Nutzung dieses natürlichen Wirkstoffreservoirs können Lebensvorgänge und Krankheiten entscheidend beeinflußt werden. Jedoch beschreibt schon das Flos
Medicinae Salernitanum aus dem elften Jahrhundert: „Contra vim mortis non est medicamen in
hortis1“ . So wurden bereits früh die Grenzen der natürlichen Ressourcen wie Pflanzen und
Pflanzenteile als Pharmaka erkannt. Mittlerweile konnten verschiedene Ansätze entwickelt
werden, um zielgesteuert einen Wirkort zu beeinflussen. Dabei richtet sich das rationale Design
auf die optimale Anpassung eines Wirkstoffs an einen Wirkort. Nach der erfolgreichen
dreidimensionalen Strukturaufklärung der Wirkorte wird mit Hilfe des „molecular modeling“
versucht, einen optimalen Wirkstoff am Rechner zu designen, ihn dann im Labor zu
synthetisieren und auf seine Wirkungsweise hin zu untersuchen. Dieses Verfahren stand viele
Jahre im Mittelpunkt pharmakologischer Wirkstoffentwicklung. Ein entscheidender Nachteil
dieser Vorgehensweise ist, daß die Designprogramme die Moleküleigenschaften durch wenige
Parameter zu beschreiben versuchen und somit der dynamische Charakter einer SubstratRezeptor-Wechselwirkung nur unzureichend simuliert werden kann. Die optimale Passform für
die Wechselwirkung kann so nicht immer erreicht werden. Heute ist eine Situation erreicht, in
der neue Rezeptoren und Enzyme sehr schnell als mögliche therapeutische Ziele (Targets)
molekularbiologisch identifiziert werden. Es ist jedoch sehr schwierig, für die Beeinflussung
eines speziellen „biologischen Targets“ den richtigen Wirkstoff zu entwerfen. Zur Lösung
dieses Problems wird versucht, empirische Suchstrategien einzusetzen. Durch gleichzeitige
Untersuchung einer großen Zahl verschiedener Strukturen kann eine mit hoher Affinität
bindende Struktur identifiziert werden, die dann in weiteren Tests verbessert werden kann. Es
können so Wirkstrukturen sehr schnell und mit geringem apparativen Aufwand optimal an die
gewählten Wirkorte angepaßt werden. Ihre Interaktion soll gezielt biologische Abläufe
verändern.
1
Gegen den Tod ist kein Kraut im Garten [Iohannes de Mediolano, 11. Jahrhundert]
Einleitung
2
Die biochemische Grundlage dieser Interaktionen sind reversible Wechselwirkungen. Dabei
gehen Moleküle schwache Bindungen ein, die sich unter physiologischen Bedingungen wieder
lösen lassen. Sie werden als nichtkovalente Bindungen bezeichnet. Zu den wichtigsten nichtkovalenten Bindungstypen gehören die elektrostatischen Bindungen, die Wasserstoffbrückenund van-der-Waals- (hydrophoben) Bindungen. Ohne diese besonderen Wechselwirkungen sind
biochemische Vorgänge nicht denkbar.
So sind zum Beispiel diese Wechselwirkungen essentiell für den reversiblen Zusammenhalt der
doppelsträngigen DNA. Die kodierenden Basen eines Stranges erkennen ihren Partner auf dem
Gegenstrang durch Wasserstoffbrückenbindungen. Der so gebildete DNA-Doppelstrang wird
über hydrophobe Wechselwirkungen stabilisiert (base stacking). Wird die DNA abgelesen und
werden daraus entsprechend ihrer Basenkodierung Proteine synthetisiert oder wird sie repliziert,
muß sie lokal entwunden werden und als Einzelstrang vorliegen. Ist die Synthese beendet,
können die Einzelstränge wie ein Reißverschluß wieder aneinander binden. So ist auch hier den
nichtkovalenten Wechselwirkungen eine Schlüsselrolle zuzuschreiben.
Proteine sind die Universalbausteine des Lebens (Enzyme, Antikörper, Rezeptoren usw.). Sie
gelangen aufgrund dieser Wechselwirkungen zu einer definierten räumlichen Gestalt. Die
Abfolge der Aminosäuren legt eine bestimmte dreidimensionale Faltung fest. Die Ausbildung
von Helices und Faltblättern wird durch Wasserstoffbrückenbindungen des Peptidrückgrats
ermöglicht. Aminosäureseitenketten können durch Ausbildung von zusätzlichen
nichtkovalenten Bindungen die Struktur weiter festigen. So wird durch reversible
Wechselwirkungen eine bestimmte räumliche Struktur festgelegt, an der auch mehrere
Proteinketten beteiligt sein können.
Die Bindung eines Liganden an einen Rezeptor ist ebenfalls reversibel und durch extreme
Spezifität gekennzeichnet. Auch hier stehen nichtkovalente Wechselwirkungen im Mittelpunkt,
die durch spezifische Bindungen einen bestimmten Liganden bevorzugen. Ist erst einmal der
Ligand erkannt und gebunden, werden am Rezeptor durch Konformationsänderungen
Reaktionskaskaden in Gang gesetzt und damit z.B. Signale durch Membranen transportiert. Als
stoffliche Signalauslöser (Liganden) fungieren Hormone, Neurotransmitter, Wachstumsfaktoren,
Pharmaka, Antigene oder Geruchsmoleküle. Das Verständnis dieser Erkennung auf molekularer
Ebene hilft bei der Erklärung und Entdeckung zellbiologischer Mechanismen, deren enorme
Vielfalt und Spezifität noch viele Fragen aufweist.
Einleitung
3
Die Untersuchung der Bindung synthetischer Moleküle an biologische Wirkorte ermöglicht
letztendlich die zukünftige gezielte Entwicklung pharmakologisch relevanter Wirkstoffe. Die in
den letzten 10 bis 20 Jahren entwickelten kombinatorischen Methoden erlauben einen schnellen
Zugang zu neuen Molekülstrukturen. Viele ähnliche Verbindungen können mit diesen
Methoden parallel erzeugt werden. Wo noch vor wenigen Jahren Chemiker im Labor Substanz
für Substanz einzeln synthetisiert haben, stehen jetzt Syntheseautomaten. Diese können eine
umfangreiche Anzahl verschiedener einzelner Substanzen parallel oder unterschiedliche
Verbindungen simultan in Mischungen erzeugen. Die Errungenschaften der Kombinatorischen
Chemie sind: Sie ist schneller, wesentlich effizienter und ökonomischer als herkömmliche
Synthesemethoden. Substanzbibliotheken können sowohl für die Entdeckung neuer
Leitstrukturen für biologische Targets als auch für deren Optimierung zur gezielten Wirkstoffentwicklung genutzt werden. Durch di e fruchtbare Zusammenarbeit vieler
Forschungsrichtungen, wie Molekular-, Zell- und Immunbiologie sowie der Biochemie und
Chemie, ist eine effiziente Selektion von optimalen Wirkstoffkandidaten für beliebige Wirkorte
möglich geworden.
Einleitung
2.
4
Die theoretischen Grundlagen des kombinatorischen
Ansatzes
Die klassische Naturstoffchemie konzentriert sich auf die selektive und effiziente Synthese eines
aus der Natur isolierten Zielproduktes, das gereinigt und charakterisiert wird, um es
anschließend auf seine Wirkung zu untersuchen. Dieses Produkt kann dann durch Abwandlung
der Ausgangsstruktur optimiert werden. Bei der Suche nach Wirkstoffen müssen Tausende
reiner Stoffe oder naturstoffhaltige Rohextrakte systematisch getestet werden, bevor eine neue
erfolgversprechende Leitstruktur gefunden wird. Der Weg zu einem erfolgreichen
Therapeutikum ist aber auch dann noch weit. Die Erfolgsaussichten empirischer Suchstrategien
und Verfahren zur Wirkstoffentwicklung, die sich auf den Naturstoffpool stützen, sinken und es
wird immer schwieriger, die zahlreichen inzwischen zur Verfügung stehenden Testsysteme
effizient zu bedienen.
Kombinatorische Methoden ergänzen die klassische Suche nach Substanzen mit pharmakologischen Eigenschaften. Die Kombinatorische Chemie kann durch unterschiedliche
Kombination von Bausteinen viele Substanzen in Bibliotheken gleichzeitig synthetisieren. Die
Natur ist ein erfolgreiches Beispiel kombinatorischer Synthesen. In DNA, Proteinen oder
Glykosiden werden wenige Bausteine zu immer neuen Molekülen kombiniert. Das zugrundeliegende Prinzip läßt sich an einem Hexapeptid aus Aminosäuren als Bausteinen verdeutlichen.
Jede der 20 natürlichen Aminosäuren kann mit jeder eine Peptidbindung bilden. Die daraus
resultierende Substanzsammlung, auch Bibliothek genannt, hat eine Größe von
206 = 64.000.000 Einzelsubstanzen. Je nach Art der Herstellung kann eine kombinatorisch
erzeugte Substanzbibliothek aus Einzelsubstanzen bestehen oder als definiert zusammengesetzte
Mischung vorliegen. So wird der zur Verfügung stehende Substanzpool erheblich aufgestockt.
Zum Auffinden neuer pharmakologisch relevanter Leitstrukturen in solchen Substanzbibliotheken wird industriell das „high throughtput screening“ angewendet, bei dem eine große
Zahl verschiedener Testsubstanzen vielfältigster Struktur auf ihre Wirkung hin in biologischen
Systemen untersucht werden kann. Aufgrund der großen Fortschritte in der Molekularbiologie
stehen inzwischen biologische Strukturen (Proteine, Enzyme, Rezeptoren, Ionenkanäle) zur
Verfügung, die mit Krankheiten ursächlich in Verbindung stehen. Ihre Strukturaufklärung macht
es möglich, die Ursachen von Krankheiten auf molekularer Ebene zu verstehen. Mit solchen
Targets können effiziente Testsysteme aufgebaut werden, die es erlauben, auch mit geringen
Substanzmengen die In-vitro-Wirksamkeit zuverlässig zu ermitteln. Bei diesen Methoden ist die
Bereitstellung von vielfältigen Testsubstanzen ein möglicher Engpaß, der aber dank der
kombinatorischen Methoden überwindbar ist.
Einleitung
5
Durch den enormen Fortschritt auf dem Gebiet der automatisierten kombinatorischen Festphasensynthese lassen sich mit verschiedenen Techniken auch komplexe Moleküle innerhalb
kurzer Zeit in großen Substanzbibliotheken produzieren.
Die von der Natur seit langem praktizierte Kombinatorische Chemie wurde erstmals in der
Oligonukleotid- und Peptidsynthese im Labor, in Gestalt von „mixed primern“ und
Peptidbibliotheken umgesetzt. Sie ist heute das effizienteste Werkzeug für die Entdeckung und
Entwicklung neuer Wirkstoffe oder Katalysatoren. Überall dort, wo durch ein Screening aus
Vielfalt neue Zielmoleküle zugänglich gemacht werden sollen, finden kombinatorische
Methoden ihr Einsatzgebiet.
Einleitung
2.1
6
Festphasenpeptidsynthese
Für die von Merrifield entwickelte Festphasen-Technik zur Peptidsynthese [Merrifield (1963)]
wurde ihm 1984 der Nobelpreis für Chemie verliehen. Diese Arbeit inspirierte in den folgenden
Jahren die Entwicklung verschiedenster Methoden der multiplen Synthese, speziell auf dem
Gebiet der Peptidsynthese. Die stereotype Aufeinanderfolge gleichartiger Reaktionen macht
diese Techniken für die Automatisierung geeignet.
2.2
Erzeugung von Bibliotheken
Die Erzeugung von Bibliotheken mit Hunderten verschiedenen Substanzen erfordert neue
technische Verfahren zur Kombination der zahlreichen Bausteine. Dabei haben sich zwei
Strategien durchgesetzt: die parallele Synthese zur Generation von Arrays und die multiple
Synthese.
Abb. 2.1:
Prinzip der parallelen (Bild links) und der multiplen (Bild rechts) Synthese
[Frank (1993)]. Im Bild links: individuelle parallele Reaktionsführung in einem
Array von n separaten Reaktoren. Jede Verbindung oder Mixtur der
Verbindungen wird in einem separaten Reaktor synthetisiert, der individuell in
der Synthese angesteuert wird. Im Bild rechts: Multiple Reaktionsführung mit n
Segmentträgern. Die Segmente werden in verschiedene Reaktionsgefäße
aufgeteilt und nach einem Zyklus jeweils wieder neu gruppiert.
Einleitung
2.2.1
7
Die parallele Synthese
Die parallele Synthese läuft meist trägergebunden ab und ist sehr gut automatisierbar. Dabei
werden Arrays fixierter Reaktorräume generiert. Pipettierroboter transportieren die Bausteine zu
diesen Reaktoren, in denen die chemische Reaktion stattfindet. Die parallele Synthese wurde
mit der „Pin“-Methode [Geysen et al. (1984)] entwickelt und wird auch mit der „Spot“-Methode
[Frank (1992)] oder der „light-directed spatially addressable parallel chemical synthesis“
Technik [Fodor et al. (1991)] durchgeführt. Diese Strategie führte zu der Entwicklung paralleler
vollautomatischer Synthesemaschinen. Streng parallele Vorgänge lassen sich apparativ leicht
umsetzen, wie z.B. Lösen, Waschen, Mischen und auch Erwärmen. Der Nachteil dieser
Strategien ist darin zu sehen, daß alle individuellen Arbeitsschritte wie Destillieren oder
Kristallisieren leicht unterschiedlicher Substanzen eine Beschränkung darstellen.
2.2.1.1 Synthese an Stäbchen
Hierbei [Geysen et al. (1984)] werden kleine aminofunktionalisierte Polyethylenstäbchen, die in
einem 96er Mikrotiterplattenraster angeordnet sind, als Träger verwendet. Das Koppeln der
Aminosäuren erfolgt in Mikrotiterplatten, das Waschen in speziellen Wannen. Bei dieser
Methode verbleiben die Peptide am Träger und die Schutzgruppen werden von Schritt zu
Schritt abgespalten. Eine Qualitätskontrolle ist nur nach Abspaltung vom Träger möglich. Bei
Produktmengen von 300 nmol pro Stäbchen sind dazu Methoden der Spurenanalytik erforderlich. Biologische Tests sind aber hervorragend auch an den gebundenen Peptiden durchführbar.
2.2.1.2 Die Spot-Methode als Cellulose basierte Methode
Cellulose ist aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften ein hervorragendes Trägermaterial. Sie
ist auch besonders kompatibel zu biologischen Testverfahren. Sowohl multiple [Frank et al.
(1983) und Frank et al. (1988)] als auch parallele Syntheseverfahren [Frank (1992)] wurden mit
diesem Trägermaterial verwirklicht.
Die ortsgerichtete parallele Synthese - die Spot-Methode - ist eine einfache, effiziente und
flexible Technik zur Herstellung von Bibliotheken auf Membranträgern. Wobei sowohl lösliche
als auch festphasengebundene Peptide synthetisiert werden können, die zu biologischen Tests
herangezogen werden können [Frank (1992) und Tegge et al. (1995)]. Für den Einsatz als
Trägermaterial in der Peptidsynthese wird die Cellulose zur Einteilung in Reaktionsräume nicht
in kleine Stücke geschnitten. Kleine Lösemitteltropfen mit darin gelösten Reagenzien formen
durch ihr kreisförmiges Eintreten in die Cellulose kleine konzentrische, separierte, offene
Reaktionsräume. Hier findet dann die Reaktion statt. Das Verdampfen des Lösemittels limitiert
die Reaktionszeit. Zum Waschen und Abspalten von Seitenkettenschutzgruppen wird der Träger
in eine separate Wanne gegeben und dort weiterbehandelt. Eine große Zahl separater SpotReaktoren läßt sich so auf einer Membran anordnen. Durch manuelle oder automatische
Verteilung der entsprechenden aktivierten Monomerlösungen ist jeder einzelne Spot individuell
Einleitung
8
adressierbar. Die Zuhilfenahme eines Pipettierroboters ermöglicht die Synthese von 96 oder
auch 425 verschiedenen Spots auf der Größe einer Mikrotiterplatte. Die so synthetisierten
Peptide können auf der Cellulose immobilisiert in Bindungs- oder Affinitätstests eingesetzt
werden oder nach Ausstanzen der Spots und einzelner Spaltung in Lösung zu biologischen Tests
verwendet werden.
Die Substanzmengen liegen bei 0,4-1,0 µmol/cm², je nach Tropfen- bzw. Spotgröße:
96er Raster: Volumen = 0,5 µL; Spotdurchmesser = 0,5 cm; Fläche des Spots = 0,196 cm²
mit einer Ausbeute von 100-200 nmol,
425er Raster: Volumen = 0,1 µL; Spotdurchmesser = 0,3 cm; Fläche des Spots = 0,07 cm²
mit einer Ausbeute von 30-70 nmol.
Abb. 2.2:
Aufbau des Spot-Syntheseroboters.
Der Nachteil dieser Methode ist die manuelle Durchführung der Wasch- und Abspaltschritte.
Dieses halbautomatische Verfahren wird in Zukunft durch ein vollautomatisches ersetzbar sein.
Ein Prototyp ist zum Patent angemeldet2. Der mechanische Prototyp ist einerseits ein Pipettierroboter, kann andererseits aber auch Schritte wie Waschen und Abspalten vollautomatisch
durchführen. Diese neue Generation von Spotrobotern erfordert Trägermaterialien mit anderer
Oberflächenbeschaffenheit, auf denen dann im Format einer handelsüblichen CD 40.000
separierte Spots erzeugt werden können. Der Träger in CD-Form besteht aus oberflächenmodifiziertem Polypropylen.
2
Frank, Zander, Melberg: Vorrichtung zur Erzeugung von frei definierbaren Repertoires,
DE 148 18 999.0
Einleitung
2.2.2
9
Die multiple Synthese
Eine andere Variante basiert auf der Aufteilung der Träger in verschiedene Gruppen, die
multiple Synthese. Jede Gruppe wird in einem Reaktionsgefäß mit einem Baustein gekoppelt,
danach wieder neu verteilt und mit einem weiteren Baustein gekoppelt. Diese Methode wird
praktisch genutzt mit separierten Cellulose-Filtern [Frank et al. (1988) und Frank et al. (1983)],
in der „tea-bag“ Methode [Houghten (1985)], der „one bead one compound“ Idee [Lam et al.
(1991)] oder der „mix and split“ Technik [Furka et al. (1991)].
2.2.2.1 Kennzeichnung der Träger
Als Nachteile dieser Strategien ist zu sehen, daß die Träger gekennzeichnet werden müssen, um
nachvollziehen zu können, welchen Weg sie durch die verschiedenen Reaktionsgefäße
genommen haben. Als Methoden stehen dabei verschiedene Kodierungsstrategien zur
Verfügung. Die chemische Kodierung markiert mit Substanzklassen, die eine Analyse im
Spurenbereich zulassen, aber durch ihre Reaktionen die Chemie der zu kodierenden Bibliothek
nicht beeinflussen sollen: Oligonukleotid-tags [Brenner et al. (1992)], Peptid-tags [Kerr et al.
(1993)], molekular-tags [Ohlmeyer et al. (1993)], Isotopenmarkierte Peptid-tags [Geysen et al.
(1996)] oder Farbstoff-tags [Egner et al. (1997)]. Nichtinvasive Kodierungsstrategien umgehen
die chemische Einflußnahme: Laserkodierung [Xiao et al. (1997)], Radiofrequenzkodierung
[Moran et al. (1995)] oder das einfache Beschriften mit einem Stift [Frank et al. (1983)] oder
Laserdrucker [Dittrich et al. (1998)].
2.2.2.2 Die Teebeutelsynthese
In der Teebeutelsynthese [Houghten (1985)] können verschiedene Trägermaterialien verwendet
werden, die in Polypropylennetzbeutel separiert eingeschweißt werden. Die Beutel können
einfach beschriftet werden. Waschen und Abspalten von Schutzgruppen kann in Schraubflaschen durch Schütteln erfolgen. Die so zu synthetisierende Produktmenge kann 30-50 mg
betragen, bei der parallelen Synthese von 150 Peptiden. Qualitätskontrolle ist mit vielfältigen
Methoden möglich. Ein Nachteil dieser Methode ist die Arbeitsintensität der nicht in allen
Schritten automatisierbaren Methode. Eine Variante der Teebeutelsynthese wurde mit Cellulosestreifen durchgeführt, die wesentlich leichter portionierbar sind [Eichler et al. (1991 )].
2.2.3
Möglichkeiten und Probleme der Kopplung von Mischungen
Mit der Synthese „Pin“-gebundener Peptidgemische wurden erstmals Millionen unterschiedlicher Einzelpeptide hergestellt [Geysen et al. (1986)]. Dazu wurden Mischungen der 20
Aminosäuren an das Trägersystem gekoppelt. Das Prinzip der Kopplung von Mischungen
anstelle eines einzelnen Bausteines kann mit beiden technischen Prinzipien, der parallelen wie
der multiplen Synthese, ohne wesentlichen apparativen Mehraufwand durchgeführt werden. Ein
Nachteil in der Peptidsynthese ist hierbei die unterschiedliche Kupplungszeit der einzelnen
Einleitung
10
Aminosäuren, die durch Variation der relativen Konzentrationen gemäß der Kupplungstendenz
teilweise ausgleichbar ist. Ein anderer Nachteil ist, daß es ob der entstehenden großen Substanzvielfalt nur schwer möglich ist, die synthetisierten Sequenzen zu verfolgen.
Zur systematischen Suche aktiver Verbindungen, z.B. eines bindenden Epitops in sehr großen
Bibliotheken, eignet sich besonders die Synthese von Mischungen, die X-Strategie. Dabei
werden neben den reinen Bausteinen auch Bausteingemische (X) zur Reaktion gebracht. So
lassen sich sehr viele verschiedene Sequenzgemische erzeugen. Da die Aminosäuren unterschiedliche Kopplungstendenzen besitzen, abhängig vom Baustein und der wachsenden Kette,
muß dies in der Zusammensetzung der Mischung beachtet werden [Geysen et al. (1986)]. In der
Simultansynthese werden dann verschiedene Raster angelegt, in denen Teilbibliotheken erzeugt
werden. Als Formen sind dabei denkbar: XX12XX (1,2 = nur eine der 20 Aminosäuren, X =
Gemisch aller), das ergibt 400 Peptidgemische. Die daraus resultierende aktivste Verbindungsgruppe ist dann der Ausgangspunkt der nächsten Synthese: X1A1A22X (A1, A2 = feste Aminosäuren) und so weiter [Frank (1995)]. Eine andere Form ist das „positional scanning“ [Dooley
et al. (1993)], wobei mit 120 Teilbibliotheken der Form 1XXXXX, X1XXXX, XX1XXX und
so weiter zunächst die aktivste Aminosäure an der jeweiligen Position bestimmt wird. Dann
werden die Kombinationen der so ermittelten Monomere als Einzelsequenzen hergestellt und
getestet.
2.3
Anforderungen und Einflüsse an Synthesematerialien und Methoden
2.3.1
Träger
Als flächiger Träger bietet sich Cellulose an. Dieses Trägermaterial ist billig, mechanisch
hinreichend stabil, hat eine hohe Porosität und ist durch die vielen Hydroxygruppen an der
Oberfläche leicht zu derivatisieren. Außerdem ist es kompatibel mit den in der Peptidsynthese
gebräuchlichen Chemikalien. Als Trägermaterial ist es leicht zu markieren und auf jede
Arrayform leicht zu konfektionieren. Cellulose ist ein lineares wasserunlösliches Biopolymer,
das aus Cellobiose (4-O- -D-Glucopyranosyl-D-glucose) besteht. Intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den 3-Hydroxy-Gruppen und den Ringsauerstoff-Atomen
benachbarter Glucose-Reste verhindern die freie Rotation der glykosidischen Bindung und
führen so zu einer linearen Versteifung des Moleküls. Diese Ketten haben eine hohe Tendenz
sich zu makromolekularen Strukturen in Form von gedrehten Strängen zusammenzulagern. Es
bilden sich amorphe sowie kristalline Regionen in der Cellulose aus. Ein teilweises Aufquellen
oder Anlösen der Celluloseoberfläche ist eine unerlässliche Voraussetzung für die nachfolgende
kontrollierte Funktionalisierung der Hydroxyfunktionen an der Oberfläche. Besonders ausgeprägt ist das Quellverhalten von Cellulose in Lösemitteln wie DMF, DMSO oder Ethanolamin
[Klemm et al. (1998)].
Einleitung
11
OH
OH
OH
HO
O
OH
O
HO
O
HO
O
O
O
HO
OH
OH
O
OH
OH
n
Cellobiose Einheit
Abb. 2.3:
Die Struktur von Cellulose. Die chemische Struktur wird bestimmt durch
Cellobioseeinheiten, die als linearer Strang angeordnet sind.
Abb. 2.4:
Die schematische Anordnung der Cellulosestränge zu Cellulosefasern mit einem
Ausschnitt einer elektronenmikroskopischen Aufnahme (Maßstab ca. 1000).
Auch Membranen aus Polypropylen sind einsetzbar. Sie sind ebenfalls kompatibel mit den in
der Peptidsynthese gebräuchlichen Chemikalien. Polypropylenmembranen quellen nicht in den
zumeist verwendeten Lösemitteln. Durch ihre poröse Struktur verfügen sie über genügend leicht
zugängliche funktionelle Gruppen.
Einleitung
2.3.2
12
Linker
Linker sind Gruppierungen, die eine labile Spaltstelle aufweisen. Durch Einsatz von Licht,
Basen oder Säuren sind sie nach der Synthese des Produktes spaltbar. Einige zerfallen unter
Freisetzung des Peptids als Säureamid, andere setzen direkt die Carbonsäure frei. Auch bei der
Kopplung der ersten Aminosäure gibt es Unterschiede. Lösliche Säureamide werden über eine
Amidbindung, lösliche freie Säuren werden als Ester an den Träger gebunden.
Tab. 2.1:
Häufig benutzte Anker- und Linkermoleküle
Anker/Linker
Produkt
-Ala -Ala
immobilisiert
O
O
N Peptid
H
N
H
O
Amino-PEG
O
O
O
N
H
H
N Peptid
O
Lys-Pro
20
löslich, C-terminal als Diketopiperazin
O
O
N
O
BOC
H
N Peptid
N
H
Rink-Amid
löslich, C-terminal als Säureamid
HN
OMe
O
Amino PEG
Peptid
OMe
O
HMPA
löslich, C-terminal als freie Carbonsäure
O
O
Amino PEG
O Peptid
Einleitung
2.3.3
13
Anker
Einige Träger bieten ob ihrer Zusammensetzung schon eine einheitlich mit funktionellen
Gruppen belegte Oberfläche an, z.B. Hydroxygruppen auf Cellulose. Andere müssen zur
Synthese der gewünschten Produkte mit den entsprechenden Ankergruppen, an denen die
Synthese stattfinden soll, versehen werden. Die Anker sind Gruppierungen, die fest mit der
Trägeroberfläche verbunden sind und eine reaktionsfähige Gruppe präsentieren. Sie sollen unter
den Synthesebedingungen stabil sein und das Produkt (Peptid) nicht vorzeitig freisetzen. Durch
Modifikation der Cellulose mit Amino-PEG wird eine hydrophile Oberfläche erzeugt, die
Aminogruppen präsentiert.
2.4
Syntheseprinzipien
An dem Prinzip der Peptidsynthese hat sich seit Merrifields Entdeckung 1963 nur wenig
geändert.
Die Synthese eines Peptids an einem festen Träger weist viele Vorteile auf:
- das Entfernen von Reagenzienüberschüssen, Nebenprodukten usw. durch Filtrieren oder
Waschen,
- die sich wiederholenden Arbeitsschritte ermöglichen eine Automation,
- der Einsatz von großen Reagenzienüberschüssen begünstigt einen fast vollständigen Umsatz.
Die Nachteile sind:
- Nebenprodukte durch Abbruchsequenzen bei nicht vollständiger Umsetzung,
- Reaktionskontrolle ist aufwendig oder nur indirekt möglich.
Die Synthese erfolgt vom C- zum N-Terminus. Die funktionellen Seitenketten der Aminosäure
und der N-Terminus werden reversibel geschützt, um Nebenreaktionen zu vermeiden. Zur
Verlängerung der Peptidkette wird dann der in Abb. 2.5 beschriebene Zyklus zur Addition eines
Aminosäurebausteins durchlaufen. Dabei werden die folgenden Zyklen so lange durchlaufen, bis
das Peptid die gewünschte Länge erreicht hat und vollständig aufgebaut ist.
War die Kopplung einer Aminosäure nicht vollständig, können unkontrollierte Mischsequenzen
auftreten. Durch Einführen eines Cappingschrittes mit Essigsäureanhydrid werden die
wachsenden Ketten terminiert und können so nicht weiterreagieren. Eine indirekte quantitative
Reaktionskontrolle wird bei der Festphasensynthese an Cellulose durch pH-abhängiges
Anfärben der N-terminalen Aminogruppe mit Bromphenolblau [Krch¦ák et al. (1988)]
erfolgreich angewendet. Als weiterer Farbtest zur Detektion der freien Aminogruppen in der
Festphasensynthese steht der Test nach Kaiser zur Verfügung [Kaiser et al. (1970)].
Einleitung
14
O
Anker/Linker
H
N
X
Fmoc
X = NH oder O
R = Seitenkette
R1
Abspaltung der N-terminalen Schutzgruppe
O
Anker/Linker
Wiederholung
NH2
X
R2
R1
+
Kupplungsschritt
capping
O
Anker/Linker
O
R1
O
N
H
Fmoc
R2
H
N
X
HO
N
H
Fmoc
Abspalten der Seitenkettenschutzgruppen
eventuell: Abspalten vom Träger, sonst immobilisiert
R3
H2N
R1
n
O
Abb. 2.5:
O
H
N
R2
N
H
HX
je nach Anker/Linker Freisetzung als
Carbonsäure oder Säureamid
O
Reaktionsfolge zur festphasengestützten Darstellung von Peptiden.
Ist das Peptid aufgebaut, erfolgt das Entfernen der Seitenkettenschutzgruppen. Danach kann es
am Träger belassen und für biologische Analysen verwendet werden. Sollen lösliche Peptide
erzeugt werden, kann die Spaltung am Linker initiiert werden.
2.5
Schutzgruppenstrategien (BOC/Fmoc-Chemie)
Zwei Schutzgruppenstrategien haben sich in der Praxis bewährt:
Die BOC/Benzylstrategie geht auf Merrifield zurück. Der N-Terminus der Aminosäure wird
dabei reversibel mit tert-Butyloxycarbonyl (BOC) geschützt und ist mit 20 % bis 50 % TFA
Einleitung
15
spaltbar. Die Seitenketten werden mit Schutzgruppen vom Benzyltyp geschützt, die unter den
zur Abspaltung der BOC-Schutzgruppe verwendeten Bedingungen stabil sind. Die Seitenkettenschutzgruppen können erst mit HF gespalten werden.
Bei der Fmoc/tert-Butylstrategie [Carpino et al. (1970) und Atherton et al. (1978)] handelt es
sich um eine „orthogonale“ Schutzgruppenstrategie. Das heißt, sie beruht statt auf einer
abgestuften Säurelabilität der Schutzgruppen, auf einer Basenlabilität der Fmoc- und Säurelabilität der tert-Butyltyp-Schutzgruppen. Die bei dieser Strategie verwendeten Anker und
Linker müssen somit basenstabil sein. Die Fmoc-Schutzgruppe erlaubt das Quantifizieren der
Kupplungsausbeute nach jedem Verlängerungsschritt. Beim Abspalten mit 20 %-igem Piperidin
in DMF bildet sich ein guter Chromophor, das Dibenzofulven-Piperidin Addukt, dessen Bildung
photometrisch verfolgt werden kann.
H
N
O
H
-
Aminosäure
O
H2N
Aminosäure
O
H2+
N
H
N
-CO2
H
N
O
H
N
H
C N
H2
Aminosäure
Dibenzofulven-Piperidin-Addukt
Abb. 2.6:
Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe mit Piperidin in DMF und Darstellung des
Dibenzofulven-Piperidin-Adduktes.
2.6
Aktivierungsmethoden
2.6.1
Knüpfung der Peptidbindung
Gewöhnliche Carbonsäuren bilden mit Aminen bei Raumtemperatur Salze. Ihre Überführung zu
Amidbindungen würde starkes Erhitzen bedeuten, eine Unvereinbarkeit mit den empfindlichen
Strukturen der Peptide. Die idealen Bedingungen für die Bildung von Amidbindungen nach
Abb. 2.7 sollen eine quantitative Umsetzung unter milden Bedingungen, wenig Nebenprodukte
und den Erhalt der chiralen Zentren ermöglichen. Dafür wird die an sich reaktionsträge
Carboxygruppe in ein reaktionsfähigeres, aktiviertes Derivat überführt. Viele
Kupplungsreagenzien wurden für die Lösung dieses Problems entwickelt.
Einleitung
16
aktivierte Säure
O
O
H
H
N
X
R1
X
R1
O
R1
+
R2
Aminogruppe
NH
- H+
- X-
H N H
R2
R2
Amidbindung
X = Fluchtgruppe
Abb. 2.7:
Darstellung einer Amidbindung aus einer aktivierten Säurefunktion und einer
Aminogruppe.
Eine besondere Bedeutung haben dabei die verschiedenen Carbodiimidverfahren. Carbodiimid
kann zur Bildung von aktivierten Carbonylderivaten, den O-Acylisoharnstoffen, eingesetzt
werden. Die Reaktion einer Fmoc-Aminosäure mit nur 0,5 eq. des Carbodiimids erzeugt das
korrespondierende symmetrische Anhydrid, das ebenfalls ein gutes Aktivierungsreagenz
darstellt. Carbodiimid kann auch unter Verwendung von Zusätzen wie 1-Hydroxybenzotriazol
(HOBt) eingesetzt werden (Abb. 2.8). Die Aktivierung erfolgt hierbei über einen Aktivester.
Dieses Verfahren wird als Standardaktivierung in Syntheserobotern angewandt und ist, wie auch
die anderen hier beschriebenen Aktivierungsreagenzien, kompatibel sowohl zu BOC- als auch
zu Fmoc-Strategien.
HOBt
OH
N
Fmoc
N
O
H
N
OH
R1
+
Fmoc
C
N
O
NH
Fmoc
N
N
H
H
Diisopropylharnstoff
O
N
O N
O
-
Diisopropylcarbodiimid
H
N
N
N
R1
N
+
O
H
N
+
H2N R2
N
Fmoc
OH
R1
N
-
O
H
N
R1
N
H
R2
N
N
Abb. 2.8:
Aktivierung der Fmoc geschützten Aminosäure mit DIC/HOBt über den HOBtAktivester.
Einleitung
17
Phosphoniumsalze stellen ebenfalls gute Kopplungsreagenzien dar, werden jedoch wegen ihrer
Giftigkeit durch Uroniumsalze ersetzt. Die Röntgenstrukturanalyse der beiden Uroniumsalze
HATU und HBTU ergab allerdings, daß diese beiden Reagenzien zumindest im kristallinen
Zustand als Guanidinium N-Oxide vorliegen. In situ oder separat synthetisierte Carbonsäurehalogenide stellen eine weitere Aktivierungsmöglichkeit dar. Eine Kopplung nahezu ohne
Zusätze erlauben die in kristalliner Form stabilen Pentaflourphenylester.
2.6.2
Knüpfung einer Esterbindung
Die Knüpfung von Esterbindungen, z.B. für die Verankerung der ersten Aminosäure an den
Hydroxygruppen des Trägers, ist problematischer als die Knüpfung von Amidbindungen. So
müssen aggressivere Bedingungen angewendet werden, die aber zu unerwünschten Nebenreaktionen führen können. Eine Veresterung bedeutet also einen Balanceakt zwischen
Aktivierung und Schutz vor Nebenreaktionen. Viele Verfahren sind entwickelt worden mit mehr
oder weniger großem Erfolg. Die Esterbindung ist labiler als die Amidbindung. Das ubiquitäre
Wasser bedingt eine unerwünschte Verschiebung des Veresterungsgleichgewichtes zugunsten
der Edukte. Wasser ist in den Lösemitteln, an der Oberfläche von Gefäßen oder in Form von
Kristallwasser in den Aminosäuren enthalten.
O
H
N
Fmoc
Fmoc
OH
R1
Abb. 2.9:
2.7
+
O
H
N
O R2
HO R2
+
H 2O
R1
Veresterung einer Fmoc geschützten Aminosäure mit einer Hydroxygruppen
tragenden Verbindung unter Wasserabspaltung.
Für die Peptidsynthese relevante Nebenreaktionen
2.7.1 Aggregation
Als Aggregation bezeichnet man das Zusammenknäulen der wachsenden Peptidkette. Die
Ketten sind teilweise so miteinander oder ineinander verschlungen, daß ein weiterer Aufbau des
Peptidstranges nicht mehr möglich ist. Dieser Einbruch kann ab fünf Kettengliedern erfolgen.
Die treibende Kraft dieser Nebenreaktion ist die Ausbildung von hydrophoben Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrückenbindungen. Einige Aminosäuren begünstigen diese Nebenreaktion besonders, es sind Alanin, Valin, Isoleucin, Asparagin und Glutamin.
Einleitung
2.7.2
18
Racemisierung
Alle natürlichen -Aminosäuren, mit Ausnahme von Glycin, haben ein chirales Zentrum. Sie
können als D- oder L-Form vorliegen. Proteine bestehen nur aus L-Aminosäuren. Die belebte
Natur ist also auf das Erkennen nur der einen Form geprägt. Das Auftreten von Racemisierungen und damit die Umwandlung in das biologisch nicht relevante Enantiomer ist in der
Synthese strikt zu vermeiden.
H
L
H
H 2N
*
R
COOH
H2 N
H 2N
COOH
R
+H
COOH
R
+
+
H 2N
R
COOH
D
H
Abb. 2.10:
2.7.3
Racemisierung einer -Aminosäure.
Diketopiperazinbildung
Dipeptide können unter Basenkatalyse zu Diketopiperazin zyklisieren. Diese Situation tritt bei
allen Peptiden auf, die über eine Esterbindung an den Träger immobilisiert sind. Nach Kopplung
der zweiten Aminosäure und Abspalten der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppen kann diese
Zyklisierung auftreten. Sie führt zur Spaltung der Esterbindung und damit zum Verlust des
Peptids.
O
O
R1
R1
O
HN
NH2
O
R2
NH
HN
R2
+
HO
O
Diketopiperazin
Abb. 2.11:
2.7.4
Verlust des am Träger veresterten Dipeptids durch Diketopiperazinbildung.
Unkontrollierte Dipeptidbildung
Eine ungewollte Dipeptidbildung kann beim Verlust der N-terminalen Schutzgruppe während
der Synthese auftreten und so das gewünschte Produkt verunreinigen.
Einleitung
3.
Theoretische Grundlagen der zellulären Immunität
3.1
Immunologische Grundlagen
19
Die spezifische Erkennung von Peptid und Rezeptor auf molekularer Ebene ist entscheidend für
immunologische Reaktionen im Organismus. Unsere Umwelt enthält eine große Vielfalt an
infektiösen Keimen. Sie alle können Krankheiten verursachen und sind in der Lage bei
unkontrollierter Vermehrung die Wirtszellen bzw. den gesamten Organismus zu töten. Dem
Immunsystem ist es zu verdanken, daß Infektionen meist nur kurze Zeit dauern und nur geringen
Schaden anrichten. Dabei besteht die wesentliche Leistung des Immunsystems darin, körpereigene von körperfremden Strukturen zu unterscheiden. Die Moleküle der Immunabwehr
erkennen, attackieren und eliminieren deshalb nur körperfremde Strukturen. Immuntoleranzen
verhindern die Vernichtung körpereigener Strukturen, diese werden zwar erkannt, jedoch nicht
vernichtet. Störungen in der Immuntoleranz oder fehlregulierte und überschießende Immunreaktionen führen zu Allergien, chronischen Entzündungen oder Autoimmunkrankheiten.
Nach Eindringen in den Körper werden die Fremdstoffe (Antigene) oder deren Teilstrukturen
von Lymphozyten erkannt. Antigene können unterschiedlichen Substanzgruppen wie Proteinen,
Sacchariden, Lipiden, Glykoproteinen oder Lipoproteinen angehören. Zusammen mit weiteren
Signalen führt die Erkennung der Antigene durch antigenspezifische Rezeptoren auf der
Oberfläche der Lymphozyten zur Aktivierung der Abwehrmechanismen. Anhand der Antigenrezeptoren werden zwei Gruppen unterschieden, die B- und die T-Lymphozyten. Die antigenbindenden Rezeptormoleküle auf der Oberfläche der B-Lymphozyten sind die Immunglobuline
(Ig), die im Extrazellulärraum vorliegende Antigene erkennen und dann ihrerseits Immunglobuline ausschütten. Intrazellulär vorliegende Antigene werden so nicht erkannt. Dafür
verfügt das Immunsystem über einen weiteren Mechanismus, der die Informationen über
intrazelluläre Antigene den im Extrazellulärraum vorliegenden T-Lymphozyten zugänglich
macht. Hierfür wird der Proteinanteil der intrazellulären Antigene durch Proteosomen in
niedermolekulare Peptide zerlegt. Diese Antigenpeptide werden an Trägermoleküle gebunden,
an die Oberfläche der Zelle transportiert und dort den extrazellulären Medien präsentiert. Die
intrazelluläre Bindung und Präsentation der Peptide erfolgt durch MHC-Moleküle (major
histocompatibility complex). Der Komplex aus MHC-Molekül und Antigenpeptid wird von TZellen über den T-Zell Rezeptor (TCR) erkannt. Diese Erkennung ist der erste Schritt bei der
antigenspezifischen Aktivierung von T-Lymphozyten.
Einleitung
3.2
20
MHC Klasse-I Moleküle
MHC Klasse-I Moleküle sind auf allen kernhaltigen Körperzellen und auf Thrombozyten
vorhanden. Es sind Heterodimere, die aus einer glykosydierten schweren Polypeptidkette
(45 kDa), die nicht-kovalent mit 2-Mikroglobulin assoziiert ist, bestehen. Die schwere Kette
besteht aus drei extrazellulären Domänen 1 (N-terminal), 2 und 3, aus einer Transmembranregion und einem zytosolischen Schwanzstück. Die 1- und 2-Domäne bilden eine Basis aus
acht antiparallelen -Faltblättern, auf der sich zwei antiparallele -Helices befinden. Die Kluft
zwischen diesen Helices formt die Bindungstasche [Bjorkman et al. (1987a)].
Abb. 3.1:
Darstellung der -Faltblätter (grün) und der -Helices (magenta) eines humanen
MHC Klasse-I Rezeptors (HLA-A) mit Antigenpeptid (orange) [Garboczi et al.
(1996), PDB-Id: 1QRN].
Einleitung
21
3.2.1 Die Struktur des MHC Klasse-I Moleküls
Kristallographische Untersuchungen an Antigenpeptid / MHC Klasse-I Molekülkomplexen
zeigen, daß das Peptid nicht als gewundene Kette, sondern langgestreckt, bzw. mit einem
kleinen Knick an Position 4, in der Bindungstasche liegt und nur in einer Orientierung gebunden
werden kann [Stern et al. (1994)]. Einige Aminosäurereste des Peptids und einige polare Atome
des Peptidrückgrats sind wichtig für die Bindung an MHC, andere sind wichtig für die Bindung
dieses Komplexes an den TCR. Die N- und C-terminalen Aminosäuren des Peptids sind tief in
der Bindungstasche gebunden und formen Wasserstoffbrückenbindungen zu Tyr- oder TrpGruppen konservierter Regionen des MHC. Diese Bindungen beschränken die Länge des zu
bindenden Peptids auf acht oder neun Aminosäuren [Zhang et al. (1992)]. Dabei ist
entscheidend, daß die Enden des Peptids als freie Säure bzw. als Amin vorliegen [Brown et al.
(1994)].
Abb. 3.2:
Ausschnitt der Conolly-Oberfläche eines humanen MHC Klasse-I Moleküls
(HLA-A). Dargestellt ist das HTLV-1 TAX Peptid (Leu, Leu, Phe, Gly, Tyr, Ala,
Val, Tyr, Val), bestehend aus 9 Aminosäuren, das tief in der an beiden Enden
geschlossenen Bindungstasche liegt. Nur wenige Seitenketten des Antigenpeptids zeigen dabei aus der Tasche heraus und stehen für Wechselwirkungen
mit dem T-Zell Rezeptor zur Verfügung [Garboczi et al. (1996), PDB-Id:
1QRN].
Einleitung
3.2.2
22
Die Diversität des MHC-Moleküls
Die Diversität der MHC-Moleküle wird durch die Seitenketten bestimmt, die die Bindungstasche säumen. Dabei tritt der strukturelle Polymorphismus in definierten Regionen des
Moleküls verstärkt auf. Die Variabilität kommt gehäuft in den -Helices, die die Seiten der
Bindungsspalte formen und in den -Strängen, die den Boden formen vor [Bjorkman et al.
(1987b)]. Wobei aber gerade die Regionen, die die Bindungen zu den Enden des
Antigenpeptides formen, konserviert sind und sich auch bei Mensch und Maus MHC ähneln
[Madden et al. (1992) und Young et al. (1994)].
3.2.3
Die intrazelluläre Komplexbildung
Für die intrazelluläre Komplexbildung mit dem Antigenpeptid ist eine vielschichtige Reaktionsfolge nötig. Im Zytoplasma sorgen Proteosome für den Abbau von Proteinen in Peptide,
besonders bei viralen Proteinen. Es können aber auch Peptide präsentiert werden, die von
Antigenen abstammen, die durch Überwindung der Plasmamembran oder durch Membrandiffusionsvorgänge in das Zytoplasma der Zelle gelangt sind. Diese Peptide werden in das
endoplasmatische Retikulum (ER) der Zelle transportiert. Im ER werden die Antigenpeptide an
frisch synthetisierte passende MHC Klasse-I Moleküle gebunden. Dieser Komplex wird danach
in den Golgi-Apparat umverteilt. Membranvesikel des Golgi-Apparates transportieren die
beladenen MHC-Moleküle an die Zelloberfläche. Das Antigenpeptid trägt dabei zur
Stabilisierung des Komplexes bei. So wird verhindert, daß freie MHC-Moleküle an die Zelloberfläche transportiert werden und dort möglicherweise extrazelluläre Peptide binden können.
Die Antigenpeptide werden schließlich im Komplex mit den MHC-Molekülen an der Zelloberfläche präsentiert [reviewed in Rock et al. (1999)].
Einleitung
3.3
23
MHC Klasse-II Moleküle
MHC Klasse-II Moleküle befinden sich auf antigenpräsentierenden Zellen, Monozyten, Makrophagen und B-Lymphozyten. Unter besonderen Umständen ist auch eine Expression auf
Endothelzellen möglich. MHC Klasse-II Moleküle sind Heterodimere aus zwei im MHCKomplex kodierten Glykoprotein-Ketten: Je eine - und eine -Kette mit einem Molekulargewicht von je 30 kDa. Beide Ketten sind analog der -Kette des MHC Klasse-I Moleküls in
vier Teilbereiche gegliedert, den peptidischen polymorphen 1- und 1-Domänen, zwei
konstanten 2- und 2-Domänen, den Transmembranregionen und dem zytosolischen Anteil.
Auch hier sind - und -Ketten an der Bildung der Bindungstasche und der Peptidbindung
beteiligt.
3.3.1
Die Struktur des MHC Klasse-II Moleküls
Kristallographische Untersuchungen an Peptid-MHC Klasse-II Molekülkomplexen zeigen, daß
längere Peptide (12-24 Aminosäuren) als bei den Antigenpeptid / MHC Klasse-I Komplexen
gebunden werden. Die Bindung erfolgt in einer an beiden Enden offenen Bindungskluft. Dabei
werden die Peptide als ausgestreckte gewundene Ketten gebunden, deren Enden über den
Rezeptor hinaushängen können. Sie haben bislang keine Bedeutung für die Erkennung in der
Bindungskluft oder am TCR. Das Peptid liegt in der Bindungskluft geradlinig gestreckt vor.
Dabei sind die Projektionen der Seitenketten um 130° gegeneinander verdreht und bilden eine
linkshändige Schraube. Einige Seitenketten der Aminosäuren zeigen aus der Kluft heraus und
können mit dem TCR wechselwirken, während andere Seitenketten in Vertiefungen der
Bindungskluft des menschlichen MHC Klasse-II Moleküls hinein zeigen. MHC Klasse-II
Moleküle haben mehr Bindungsstellen als MHC Klasse-I Moleküle [Stern et al. (1994)].
Welche Seitenketten des Peptids in die Bindungstaschen hineinragen, ist je nach MHC Subtyp
unterschiedlich. Es ergibt sich dabei:
•
MHC II (DR 1 und I-Ak) P1, P4, P6 und P9 [Weber et al. (1998), Sant´Angelo et al.
(1996) und Stern et al. (1994)],
•
MHC II (DR 2, DR 3, DR 4 und H-2E) P1, P4, P6, P7 und P9 [Rammensee et al.
(1995)].
Ein verpflichtendes Motiv der Bindung zwischen Antigenpeptid und MHC Klasse-II Molekül
ist aus diesen Beispielen nicht abzuleiten. Die Taschen der Bindungskluft in MHC Klasse-II
Molekülen sind weniger strikt als bei Klasse-I Molekülen. Jedoch scheinen die Seitenketten des
Peptids an den Positionen 4 und 9 in vielen MHC Klasse-II Subtypen wichtig zu sein.
Konservierte Regionen, die bei MHC Klasse-I die Bindungskluft schließen und für die starke
Wechselwirkung mit dem C- und N-Terminus verantwortlich sind, fehlen bei MHC Klasse-II
Molekülen [Brown et al. (1993)].
Einleitung
24
Abb. 3.3:
Ausschnitt der Bindungskluft des humanen MHC Klasse-II Rezeptors (DR 1),
als Conolly-Oberfläche, in dem das Antigenpeptid des Influenzavirus HA (Pro,
Lys, Tyr, Val, Lys, Gln, Asn, Thr, Leu, Lys, Leu, Ala, Thr) geradlinig gestreckt
vorliegt. Die Enden des Peptids hängen über die Bindungsfurche heraus, nur in
der mittleren Region dieses 13mers befinden sich Bindungstaschen, in die die
Seitenketten des Peptids hineinragen [Stern et al. (1994), PDB-Id: 1DLH].
3.3.2
Die Diversität des MHC-Moleküls
Die Diversität des MHC Klasse-II Moleküls zeigt sich vor allem in den Bindungstaschen, die
durch die Seiten ( -Helices) und den Boden ( -Faltblattstränge) der Bindungsfurche gebildet
werden.
3.3.3
Die Prozessierung der Antigen-Peptide
Für die Prozessierung der Antigen-Peptide ist auch bei MHC Klasse-II Molekülen eine
komplexe Abfolge nötig. Dabei werden Antigenpeptide präsentiert, die von Proteinen aus
Einleitung
25
Endosomen stammen. MHC Klasse-II Moleküle werden an membrangebundenen Ribosomen
synthetisiert und in das ER der Zelle geschleust. Die neu gebildeten heterodimeren Moleküle
sind mit einem dritten Molekül, einer nichtpolymorphen invarianten Kette assoziiert. Die
Bindung der invarianten Kette an frisch synthetisierte MHC Klasse-II Moleküle dient der
Faltung einer korrekten Tertiärstruktur und der Ausschleusung aus dem ER. Darüber hinaus
verhindert die invariante Kette, daß das MHC Klasse-II Molekül bereits im ER mit endogenen
Antigenpeptiden beladen wird. Der Komplex aus MHC Klasse-II Molekül und invarianter Kette
wird aus dem ER in das endosomale Kompartiment des Intrazellulärraums umverteilt. Dann
wird die invariante Kette abgebaut. Die so freiwerdende Bindungskluft des MHC Klasse-II wird
nun entweder mit bereits vorliegenden niedermolekularen Peptiden oder mit exponierten
Sequenzen bereits denaturierter aber nur partiell abgebauter Proteinantigene besetzt. Die
letztendlich an der Zelloberfläche exponierten Antigenpeptide entstehen durch Abbau der an
beiden Seiten aus der Bindungsrasche herausragenden Enden des gebundenen Proteins. Die
schließlich mit Peptiden von 12-24 Aminosäuren Länge beladenen MHC Klasse-II Moleküle
werden an die Zelloberfläche umverteilt [reviewed in Rammensee et al. (1995)].
3.4
Antigenerkennung und Auswirkungen
T-Zellen erkennen den Komplex aus Antigenpeptid und MHC-Molekül über den T-Zell
Rezeptor. Für die Erkennung sind variable Schleifen in der T-Zell Rezeptorstruktur nötig. Der
TCR bindet diagonal über das beladene MHC an einer Oberfläche, die in allen bekannten MHC
Klasse-I und Klasse-II Strukturen ähnlich ist [Garboczi et al. (1996) und Sant´Angelo et al.
(1996)] (siehe Abb. 3.4).
Für die Bindung von TCR und dem Komplex aus MHC-Molekül und Antigenpeptid sind noch
weitere Moleküle notwendig: Die Oberflächenmoleküle CD 4 und CD 8, die als Korezeptoren
fungieren. CD 4 steuert die Bindung des T-Zell Rezeptors an MHC Klasse-II Moleküle durch
Interaktion mit der nichtpolymorphen 2-Domäne. CD 8 steuert diese Bindung an MHC Klasse-I
Moleküle durch Interaktion mit der nichtpolymorphen 3-Domäne. Der T-Zell Rezeptor kann
Aktivierungssignale nicht allein ins Innere der T-Zelle vermitteln. Nach der Bindung des TCR
an den Antigenpeptid / MHC-Komplex ist CD 3, ein spezieller Molekülkomplex, für die Signalübertragung in das Zellinnere verantwortlich. Für die vollständige Aktivierung sind weitere
kostimulatorische Signale notwendig. Die Aktivierung bei gleichzeitiger Kostimulation hat zwei
Konsequenzen: Die Teilung und Vermehrung (Proliferation) der Zelle und die Differenzierung
in funktionell aktive Zellen. Sie werden in T-Helferzellen und zytotoxische T-Zellen unterschieden. T-Helferzellen sind CD 4 positiv, schütten Zytokine (z.B. Interleukin-2) aus und sind
MHC Klasse-II assoziiert. Zytotoxische T-Zellen (T-Killerzellen) sind CD 8 positiv, zerstören
Zielzellen und sind MHC Klasse-I assoziiert.
Einleitung
Abb. 3.4:
3.5
26
Darstellung eines humanen MHC Klasse-I Rezeptors (links) mit T-Zell Rezeptor
(rechts) und Antigenpeptid (mitte, in orange). Nur wenige Seitenketten des
Peptids liegen in einer Position, um mit dem T-Zell Rezeptor wechselwirken zu
können [Garboczi et al. (1996), PDB-Id: 1QRN].
Untersuchungen zur Lokalisierung eines Epitops
Die Lokalisierung des Epitops eines bekannten Proteins kann durch die Synthese von kurzen
überlappenden Peptiden erfolgen, die die gesamte Länge des Proteins überspannen. Ist das
Epitop lokalisiert, kann es durch Ersetzen der Aminosäuren an allen Positionen modifiziert
werden, um so herauszufinden, welche Aminosäure an welcher Position besonders wichtig für
die Erkennung ist. Die Erkennung des Epitops, also der biologische Test, kann dann am Träger,
z.B. mit der „Pin“- [Geysen et al. (1984)] oder der „Spot“-Methode [Frank (1992)], erfolgen.
Diese immobilisierten Peptide können zur Untersuchung der Antikörpererkennung von B-Zell
Epitopen eingesetzt werden. Wird die Bindung zwischen Peptid und Träger gespalten, können
die löslichen Peptide zur Untersuchung von T-Zell Epitopen eingesetzt werden.
Einleitung
27
4.
Grundlagen der DNA-Wirkstoff Interaktion
4.1
Aufbau und Struktur der DNA
Die Nukleinsäuren gelten als Schlüsselmoleküle des Lebens, denn sie enthalten die genetischen
Informationen. Chemisch gesehen sind es Polynukleotide, die aus den Basen Adenin und
Guanin (Purinderivate) sowie Cytosin, Thymin und Uracil (Pyrimidinderivate); den Zuckern 2Desoxyribose bzw. Ribose und Phosphorsäure aufgebaut sind. Über Esterbindungen bildet die
Phosphorsäure Brücken zwischen den Zuckerresten. Die von den Nukleinbasen abgeleiteten
Nukleoside (Basen-Zucker Kombinationen) sind Adenosin (A), Guanosin (G), Cytidin (C),
Thymidin (T) und Uridin (U). Die Nukleotide sind die Phosphorsäureester der Nukleoside. Nach
Typ des Kohlenhydrates unterscheidet man in Desoxyribonukleinsäuren (DNA) und
Ribonukleinsäuren (RNA).
Die Raumstruktur der Nukleinsäuren läßt sich durch das Watson-Crick-Modell der Doppelhelix
beschreiben. Die Basen sind im Doppelstrang stets paarweise angeordnet, wobei Thymin mit
Adenin sowie Cytosin mit Guanin durch Wasserstoffbrücken in Wechselwirkung treten. Die
Basenpaarung bedingt, nach dem zentralen Dogma der Molekularbiologie, die identische
Replikation, wobei ein Strang jeweils den anderen eindeutig determiniert. Beide Einzelstränge
haben entgegengesetzte Polarität.
Die beiden DNA-Einzelstränge sind als rechtsgängige Schraube umeinander verdreht. Eine 360°
-Windung enthält 10 Basenpaare. Während die Basen nach innen gekehrt liegen, bilden die
Zuckermoleküle und Phosphatbrücken das Rückgrat der Doppelhelix. Die -Elektronen der zum
Helixstrang senkrecht stehenden Basen können miteinander in Wechselwirkung treten und so
die Konformation stabilisieren (base stacking). Die unter physiologischen Bedingungen stabile
Form der DNA (B-DNA) weist eine Besonderheit auf. Die Zuckermoleküle des Rückgrats
stehen einander nicht diametral gegenüber. Daraus resultiert, daß die Windungen der beiden
Helices zum Teil weiter entfernt sind bzw. näher beieinander liegen und zwei voneinander
verschiedene Furchen entstehen läßt. Sie werden als große und eine kleine Furche bezeichnet.
Jede Furche ist von potentiellen Donor- und Akzeptoratomen für Wasserstoffbrückenbindungen
gesäumt. In der kleinen Furche können das aromatische N-3 von Adenin und Guanin sowie das
O-2 von Thymin und Cytosin als Wasserstoffakzeptoren (an bzw. ao) dienen. Die Aminogruppe
am C-2 von Guanin kann Wasserstoffdonor (d) sein. Damit ergeben sich für die Basen der
kleinen Furche:
C A T als an ao,
C T A als ao an,
C G C als and ao,
C C G als ao dan
Einleitung
28
große Furche
H
A
N H N
N
3
Zucker-Phosphat
2
N
N
O
H
T
CH3
N H O
N
Zucker-Phosphat
kleine Furche
Region für die AT/TA Unterscheidung
große Furche
H
G
N
Zucker-Phosphat
O
N
H N
N H
C
N
3
2
N
N
N H O
Zucker-Phosphat
H
kleine Furche
Abb. 4.1:
Beschreibung der elektronischen Umgebung der großen und der kleinen Furche
der verschiedenen Basenkombinationen AT und GC. Die für eine sequenzspezifische Erkennung der Basenfolge wichtigen Positionen sind durch Pfeile
(Donor- bzw. Akzeptorwechselwirkungen) hervorgehoben.
In der Abfolge der Basenpaare ist die Aminosäuresequenz der Proteine verschlüsselt. Mittlersubstanz zwischen DNA und Protein ist die informationsübertragende RNA. Die RNA-Synthese
an der DNA wird Transkription, die Synthese der Proteine Translation genannt. Als
Genexpression wird die Synthese eines vollständigen, funktionellen Proteins bezeichnet.
4.2
Sequenzspezifische DNA-Erkennung
Durch die Basenpaarung der Nukleinsäuren in der DNA-Doppelhelix ist die Speicherung,
Weitergabe und Expression der genetischen Information in biologischen Systemen garantiert.
Einleitung
29
Für viele biochemische Untersuchungen ist die Hemmung der Proteinbiosynthese wichtig und
damit die sequenzspezifische Erkennung der DNA. So wird die Genexpression in Organismen
durch Proteine kontrolliert, die spezifisch Nukleinsäuresequenzen erkennen und daran reversibel
binden können. Natürliche und künstlich hergestellte Wirkstoffe können ebenfalls mit der DNA
wechselwirken und in genetische Mechanismen eingreifen. Zu den interessanten Derivaten
zählen zum Beispiel die Peptidnukleinsäuren (PNA), die an einzelsträngige DNA sequenzspezifisch mit sehr hoher Affinität binden [Nielsen et al. (1991)]. Einige natürliche Substanzen
binden sequenzspezifisch an doppelsträngige DNA. Die Antibiotika CC-1065 (aus Streptomyces
zelensis), Distamycin (aus Streptomyces distallicus) und Netropsin (aus Streptomyces netropsis)
enthalten über Carboxamidogruppen verbundene Pyrrol- bzw. Pyrrolo-Indol Heterozyklen. All
diese natürlichen Polyamide binden in der kleinen Furche der DNA, an die stark elektronegativen AT-reichen Regionen und verhindern so die Genexpression [Afonina et al. (1997) und
Pelton et al. (1990)].
NH2
N
A
O
OH
H N
O
N
N
N
H
O
N
O
H
OH
O
O
N
O
B
O
H
H
N
N
O
N
N
H
N
H
N
O
H
N
O
C
H
H2N
+
N
NH2
Abb. 4.2:
NH2
+
NH2
N
N
O
N
N
H
H
H
Die natürlichen an DNA-bindenden Antibiotika:
A) CC-1065
B) Distamycin
C) Netropsin
NH2
+
NH2
Einleitung
30
Basierend auf den antibiotisch wirksamen DNA-Bindungsmotiven wurden Polyamide aus den
Bausteinen N-Methylpyrrol- (Py) und N-Methylimidazolaminosäure (Im) entwickelt. Diese
Strukturen wurden besonders von der Arbeitsgruppe um Peter Dervan untersucht. Die
Polyamide lagern sich als antiparallele Doppelstränge in die kleine Furche der DNA ein und
bilden einen 2:1 Komplex [Mrksich et al. (1992)]. Die antiparallele Paarung von Im/Py
Einheiten ermöglicht die selektive Erkennung von GC-Basenpaaren, während umgekehrt
angeordnete Py/Im Einheiten CG-Basenpaare erkennen. Die durch Kombination von zwei
Pyrrol-Einheiten vermittelte Sequenzerkennung ist teilweise degeneriert, sie erlaubt die Bindung
an TA- und an AT-Basenpaaren [Pelton et al. (1990) und Wade et al. (1992)]. Die Unterscheidung zwischen AT- und TA-Basenpaaren konnte erst durch die Einführung einer weiteren
heteroaromatischen Aminosäure, 3-Hydroxy-N-methylpyrrol (Hp) ermöglicht werden. Diese
erkennt eine asymmetrische Spalte zwischen dem O-2 des Thymins und H-2 des Adenins. Mit
der geeigneten Kombination zweier Heteroaromaten auf gegenüberliegenden Seiten des Oligoamidstranges gelingt die spezifische Erkennung aller vier Basenpaare [White et al. (1998),
Kielkopf et al. (1998)]. Der Bindungscode für die Einlagerung in die kleine Furche der DNA
ergibt sich demnach als:
C Im/Py erkennt GC,
C Py/Im erkennt CG, C Hp/Py erkennt TA, C Py/Hp erkennt AT.
H
H
N
N
N
H
OH
Py
Abb. 4.3:
N
N
N
O
N
O
O
Hp
Im
Die Bausteine Py, Hp und Im, durch die eine sequenzspezifische Erkennung der
DNA-Abschnitte ermöglicht wird.
Einleitung
31
Abb. 4.4:
Ausschnitt eines DNA-Doppelstranges (gelb und türkis) mit einem sequenzspezifisch gebundenen, antiparallelen Doppelstrang eines Polypeptides mit den
Bausteinen der Sequenz Im-Py-Hp-Py (blau = Stickstoff, rot = Sauerstoff)
[Kielkopf et al. (2000), NDB-Id: DD0020].
Strengere Sequenzspezifität konnte durch die Einführung eines Haarnadelmotives über Aminobuttersäure erreicht werden, die die beiden antiparallel verlaufenden Polyamidstränge
verbindet. Dadurch überlappen die DNA-Bindungsstellen der beiden antiparallel verlaufenden,
dimeren Untereinheiten, so daß diese relativ zueinander nicht verschoben werden können
[Mrksich et al. (1994)]. Die Modifikation eines Strangendes mit einer positiv geladenen Gruppe
(N,N-Dimethylaminopropylamid (Dp)) verbesserte das Bindungsverhalten und die Löslichkeit.
Durch Aneinanderreihung von fünf Im- oder Py-Ringsystemen können maximal sieben Basenpaare erkannt werden. Eine Verlängerung der Kette und damit die Möglichkeit längere
Sequenzen zu erkennen, ist wegen der abnehmenden Flexibilität der Polyamidkette nicht
möglich. Durch Einführung eines -Alaninlinkers nach vier Ringsystemen konnte die
Anpassung an die Helixkrümmung der DNA verbessert und damit die Erkennung von bis zu 11
Basenpaaren ermöglicht werden [Swalley et al. (1997)].
Einleitung
32
Diese DNA bindenden Motive sind auch durch Festphasensynthese zugänglich. Die Anzahl der
verschiedenen zu untersuchenden Polyamide und deren Komplexität, durch variierende
Kombinationen der Monomerbausteine, konnte gesteigert werden. Verschiedene Synthese- und
Schutzgruppenstrategien wurden entwickelt [Baird et al. (1996), Vázquez et al. (1999)].
Mit entsprechend langen Polyamid-Doppelsträngen kann an die Basenpaarsequenzen der DNA
sequenzspezifisch gebunden werden und damit eine Kontrolle der Genexpression erreicht
werden. Ein Polyamid aus acht heterozyklischen Einheiten kann an einen definierten DNAAbschnitt aus sechs aufeinanderfolgenden Basenpaaren binden und die Transkription des
entsprechenden Gens in einer Zellkultur unterdrücken [Gottesfeld et al. (1997)]. Statistischen
Überlegungen zufolge müssen - abhängig von der Basenzusammensetzung - ungefähr 17
Basenpaare gelesen werden, damit ein Ligand eine unverwechselbare Sequenz im menschlichen
Genom erkennt [Thuong et al. (1993)]. Längere Polyamide ermöglichen also eine noch
gezieltere sequenzspezifischere Erkennung eines Genabschnitts. Allerdings ist die für eine
effiziente Zellpermeation tolerierbare maximale Grösse von Polyamiden nicht bekannt. Zur
Überwindung dieses Problems wurden zwei asymmetrische Polyamide synthetisiert, die sich
nach Membrandurchtritt im Zellplasma kooperativ zu längeren Doppelsträngen zusammenlagern können. Um eine Abstoßung zwischen dem N-terminalen Ende des einen und dem Cterminalen Ende des anderen Liganden im Komplex zu vermeiden, wurde die üblicherweise am
C-Terminus verwendete Dp-Gruppe durch die kürzere, ungeladene (CH2)2OH-Gruppe ersetzt.
Durch Einführung einer kationischen Haarnadel (R)-2,4-Diaminobuttersäure bleibt die positive
Ladung erhalten und die Wasserlöslichkeit gewährleistet [Trauger et al. (1998)].
Haarnadelmotiv
O
H
N
O
N
+
H3N
H
N
N
H
O
N
H
N
N
N
O
β-Alanin
N
O
O
N
N
H H
H
N
N
N
N
N
N
H
OH
H
N
O
C-terminale (CH2)2OH Gruppe
O
O
HO
N
N
O
N
O
N
O
N
H
H H
N
N
O
N
O
N
N
H
H
N
N
N
O
+
NH3
N
H
N
N
H
O
Abb. 4.5:
Kooperatives Dimer, das durch Zusammenlagerung längere DNA-Abschnitte
sequenzspezifisch erkennen kann.
Themenstellung
33
II Themenstellung
5.
Themenstellung
Die Untersuchung der Wechselwirkungen synthetischer Moleküle an biologischen Wirkorten
ermöglicht die gezielte Entwicklung pharmakologisch relevanter Wirkstoffe. Kombinatorische
Methoden sind dabei das erfolgversprechendste Werkzeug. Durch sie werden empirische
Suchstrategien und die schnelle Synthese ganzer Substanzbibliotheken erst ermöglicht. Die
Suche neuer Leitstrukturen in verschiedensten biologischen Fragestellungen ist dabei das Ziel.
Zur gleichzeitigen Herstellung einer Vielzahl unterschiedlicher Peptide hat sich die SpotMethode bewährt. Mit dieser simultanen parallelen Synthesetechnik können große Substanzbibliotheken erstellt werden. Durch die hohe Parallelisierung von Synthese-, Wasch- und
Abspaltungsschritten können in kurzer Zeit viele unterschiedliche Verbindungen erzeugt und für
biologische Tests zur Verfügung gestellt werden. Diese Technik ist etabliert für die Synthese
von Peptiden bei Mengen, je nach Raster, von 30-200 nmol/cm². Substanzbibliotheken
verschiedener PNA´s, Peptide, Peptoide oder Triazine wurden so bereits erfolgreich hergestellt.
Das Ziel der hier vorgestellten Arbeit ist die Anpassung und Anwendung der Spot-Methode zur
Herstellung von Substanzbibliotheken für Untersuchungen an zwei verschiedenen biologischen
Wirkorten:
Bei dem ersten Wirkort stehen T-Zell Epitopanalysen im Mittelpunkt. Für die Analyse MHC
Klasse-I abhängiger T-Zell Epitope sind lösliche Peptide erforderlich, die einen nicht
modifizierten C-Terminus aufweisen müssen. Das Peptid muß also als freie nicht modifizierte
Carbonsäure vom Träger abgespalten vorliegen. Bibliotheken sollen erzeugt werden, die diese
immunogen wirksamen Peptide präsentieren können. Im Zuge der Anpassung der Methodik,
von der Synthese trägergebundener Peptide zu löslichen Peptiden mit freiem Carboxyterminus,
soll die hohe Parallelität der Reaktionsführung beibehalten werden und die Biokompatibilität
des Produktes gewährleistet sein. Als Bausteine für die Peptidsynthese sollen Fmoc geschützte
Aminosäuren verwendet werden. Durch eine milde Veresterung auf einem Hydroxygruppen
präsentierenden Trägermaterial soll die Chiralität der Aminosäure und die N-terminale Schutzgruppe erhalten bleiben. Auch die Bedingungen der Hydrolyse und damit die Spaltung der
Esterbindung zwischen Peptid und Träger sollen dem empfindlichen Charakter der Peptide
angepaßt sein. Eine Veresterung, gerade in einem offenen miniaturisierten Spot-Reaktorsystem,
ist ein problematischer Schritt. Luftfeuchtigkeit und kurze Reaktionszeiten, bedingt durch das
Themenstellung
34
Verdampfen des Lösemittels, behindern die Esterbildung. Mit den bisher bekannten Kopplungsreagenzien konnten noch keine befriedigenden Kopplungsausbeuten erzielt werden. Bessere
Kopplungsreagenzien und Reaktionsbedingungen werden benötigt. Dabei sind die Effizienz und
eine einfache Handhabbarkeit wesentliche Kriterien für die Automatisierbarkeit in der SpotSyntheseapparatur. Nebenreaktionen und Racemisierung dürfen nur in minimalem Maßstab
auftreten. Der Aufbau des weiteren Peptids erfolgt nach einem etablierten Syntheseprotokoll in
parallelen Reaktionsschritten. Die Abspaltung aller in der Bibliothek erzeugten Peptide soll
ebenfalls parallel durchgeführt werden können. Eine praktikable Methode hierfür soll im Zuge
der Arbeit aufgebaut werden. Basierend auf literaturbekannten T-Zell Epitopen wird ein Testsystem etabliert. Mit den aus dem neuen Syntheseverfahren hervorgehenden PeptidBibliotheken sollen dann bisher unbekannte T-Zell Epitope untersucht werden. Dieses Vorhaben
eröffnet eine neue Möglichkeit über die elegante, schnelle und einfach zu handhabende Methode
der Spot-Synthese die Analyse unbekannter T-Zell Epitope zu erleichtern und zu beschleunigen.
Einen anderen Wirkort stellt die DNA dar. Mit ihrer bekannten Struktur, leichten Isolierbarkeit
und etablierten Analysenmethoden ist sie ein idealer Untersuchungsort. Die sequenzspezifische
Erkennung von DNA-Abschnitten z.B. eröffnet Möglichkeiten zur Manipulation der
Genexpression. Die chemischen Möglichkeiten der Spot-Methode sollen, ausgehend von der
Peptidchemie, erweitert werden. Dabei sollen andere Grundbausteine einbezogen und neue
Bibliothekentypen hergestellt werden. Angelehnt an strukturelle Motive der an doppelsträngige
DNA bindenden natürlichen Antibiotika Distamycin und Netropsin sollen aromatische Aminocarbonsäuren zu Polyamiden verknüpft werden. Die neuen Bausteine werden mit geeigneten
Schutzgruppen versehen, um sie in der Spot-Synthese zur Erzeugung von Bibliotheken
einzusetzen. Die Anpassung der Syntheseparameter zielt auf optimale Ausbeuten. Ein
Testsystem soll etabliert werden, um die Komponenten der Bibliothek dann auf ihr sequenzspezifisches Bindungsverhalten an doppelsträngiger DNA zu testen.
Ergebnisse und Diskussion
35
III Ergebnisse und Diskussion
6.
Versuche zur Verankerung der ersten Aminosäure
über eine Esterbrücke
Die Spot-Synthese zur Herstellung geordneter zweidimensionaler Raster von Peptiden auf
kontinuierlichen Membranen ist etabliert. Durch systematisches Screening überlappender
Peptidfragmente ist die Analyse immunologisch relevanter Epitope schnell und einfach möglich.
Dabei kann die Untersuchung mit immobilisierten oder löslichen Peptiden durchgeführt werden.
Für die Untersuchung löslicher Peptide gilt, daß der Linker, von dem das Peptid abgespalten
wird, die C-terminale Modifikation bestimmt. Das Ziel dabei ist, so wenig Modifikationen wie
möglich zu erhalten. Besonders groß ist diese Veränderung am C-Terminus bei Verwendung des
Lys-Pro-Linkers. Beim Spalten des Linkers wird ein Peptid erzeugt, das C-terminal mit einem
Diketopiperazin modifiziert ist. Essentiell ist jedoch die Modifikation des C-Terminus, wenn er
in eine biologische Reaktion mit eingreift. Dies ist z.B. für die Analyse von MHC Klasse-I
abhängigen T-Zell Epitopes der Fall.
Für die biologische Untersuchung MHC Klasse-I abhängiger T-Zell Epitope sind Bibliotheken
löslicher Peptide mit freiem Carboxyterminus erforderlich. Die Peptide sollen dafür derart an
den Träger gebunden werden, daß diese Bindung spaltbar ist und das Peptid C-terminal als
unmodifizierte Säure freigesetzt wird. Eine nachträgliche Modifikation des C-Terminus zu einer
Säure wäre sehr aufwendig und kann zu unerwünschten Reaktionen am restlichen Peptid führen.
Die einfachste Möglichkeit aus einer chemischen Bindung eine Säure freizusetzen, ist die
Hydrolyse einer Esterbindung.
Für die Verankerung der ersten Aminosäure am Träger und für die nachfolgenden Schritte der
Peptidsynthese sollen kommerziell erhältliche, N-terminal Fmoc geschützte
Aminosäurebausteine verwendet werden. Die N-terminale Schutzgruppe verhindert die Bildung
unerwünschter Produkte und kann, da Fmoc einen guten Chromophor darstellt, zur
Quantifizierung der Reaktionsschritte herangezogen werden. In allen Verknüpfungsschritten
darf die chirale Konformation der Aminosäuren nicht angegriffen werden. Durch die
Verwendung der Spot-Methode, zur Synthese der Peptidbindung, sind die Reaktionen in einem
offenen Reaktorsystem durchzuführen und damit den atmosphärischen Bedingungen ausgesetzt.
Luftfeuchtigkeit und kurze Reaktionszeiten beeinflussen die Wahl der Kopplungsmethode ganz
erheblich.
Ergebnisse und Diskussion
36
Die Möglichkeiten eine Esterbindung zu erzeugen sind sehr vielfältig. Häufig angewandte
Verfahren sind dabei:
C
C
C
C
C
die nukleophile Substitution an einem gesättigten Kohlenstoffatom R-CH2-X (X = Hal,
Monoalkylsulfat, Dialkylsulfat, Toluensulfonat). Die Carboxylationen RCOO- sind dabei
die Nukleophile. Zumeist ist eine Temperaturerhöhung notwendig.
die Aktivierung eines Alkohols durch die Bildung eines Alkoxyphosphoniumsalzes, das
im Folgenden eine Säure alkylieren kann (Mitsunobu-Reaktion).
die Alkoholyse von Säurehalogeniden RCOOX (X = F, Cl), gemischten Anhydriden
(sowohl mit organischen wie anorganischen Säuren), symmetrischen Anhydriden,
Aktivestern RCOOR´ oder Säureaziden RCON3.
die direkte Veresterung einer Säure mit einem Alkohol, meist unter Zusatz von wasserentziehenden Mitteln (H2SO4, Wasserabscheider, Ionentauscher, AlCl3 usw.).
die Reaktion von Diazoalkanen mit Säure. Diese Reaktion ist meist an eine längere
thermische Aktivierung gebunden, da einzig Diazomethan bei Raumtemperatur über
eine ausreichende Reaktivität verfügt.
Sollen diese Veresterungsmethoden in der Spot-Synthese einsetzbar sein, müssen sie einige
Randbedingungen erfüllen. Die Reaktion sollte ohne thermische Aktivierung auskommen. Dies
ist apparativ schlecht durchführbar. Da der Spot-Syntheseraum während der Reaktion den
atmosphärischen Bedingungen ausgesetzt ist, sollte die Esterbindung schnell geknüpft werden
können. Das Verdampfen des Lösemittels limitiert die Reaktionszeit. Der Aktivierungs- und
Kopplungsschritt sollte nur eine mittlere Empfindlichkeit gegenüber Luftfeuchtigkeit zeigen.
Eine Schutzgasatmosphäre läßt sich nur unter großem apparativen Aufwand bewerkstelligen
und die halbautomatische Reaktionsführung würde diese Atmosphäre regelmäßig
beeinträchtigen. Eine weitere Einschränkung in der Wahl der Methode ergibt sich durch die
Verwendung der Fmoc geschützten Aminosäurebausteine. Die Verwendung starker Basen birgt
die Gefahr der Racemisierung der Bausteine oder kann vorzeitig die Fmoc-Schutzgruppe
spalten. Die Isolierung der aktivierten Reaktanden soll zugunsten der effizienteren in situ
Aktivierung vermieden werden.
Im folgenden Kapitel werden verschiedene Kopplungsreagenzien zur effizienten Estersynthese
untersucht. Dabei steht zunächst die Optimierung der Ausbeuten unter SpotSynthesebedingungen im Mittelpunkt. Alle individuellen Aminosäuren sollen vergleichbar gute
Ausbeuten erzielen. Als Trägermaterial dient unbehandeltes Whatmann 540 Papier. Es zeichnet
sich durch hervorragende Synthesebeständigkeit und Biokompatibilität aus.
Ergebnisse und Diskussion
37
6.1
Untersuchung verschiedener Kopplungsreagenzien
6.1.1
Prinzipien der Quantifizierung
Die Quantifizierung der Ausbeuten geschieht über die Adsorption des Dibenzofulven-PiperidinAdduktes bei 301 nm im UV. Der spezifische Adsorptionskoeffizient wurde zu g301nm = 7200 mit
einem Fehler von 4 % bestimmt. Der Meßfehler bei der Bestimmung der Fmoc-Werte beträgt
ca. 3 %. Somit beläuft sich der Fehler der Kupplungsausbeuten über das DibenzofulvenPiperidin-Addukt auf ca. 5 %.
6.1.2
Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit 2,4,6-Mesitylensulfonyl-3-nitro-1,2,4triazol (MSNT)
Zunächst soll das Kopplungsreagenz MSNT untersucht werden. Es ist als besonders mild
aktivierend beschrieben und konnte bereits erfolgreich zur Veresterung an Cellulose eingesetzt
werden.
Fmoc
N
O
H
N
+
OH
R
+
+
OH
N
O S O
N
N
N
-
N
Fmoc
H
H
O
H
N
N
+
R
N
+
N
O S O
O2N
O
Abb. 6.1:
+
N
O2N
Veresterung einer Fmoc-Aminosäure mit MSNT.
Ergebnisse und Diskussion
38
MSNT ist eine sehr effiziente und an Nebenprodukten (Racemisierung) arme Kopplungsmethode, die an Cellulosescheiben in Durchflußreaktoren sehr gute Ergebnisse erzielt hat
[Blankemeyer-Menge et al. (1990)]. Die Reaktionszeiten sind mit 30 min angemessen kurz. Der
direkte Übertrag dieses Verfahrens auf die Spot-Methode ist nicht möglich. Im Durchflußreaktor
kann und muß DCM als Lösemittel eingesetzt werden, das wegen seiner großen Flüchtigkeit
(Sdp. 40°C) in einer offenen Syntheseapparatur nicht eingesetzt werden kann. Andere Lösemittel wie z.B. DMF sorgten bei der Reaktion im Durchflußreaktor für einen sprunghaften
Anstieg der Racemisierung. Andere hochsiedende halogenierte Kohlenwasserstoffe als Lösemittel wurden für den Einsatz in der Spot-Methode untersucht.
Tab. 6.1:
Die Löslichkeit der Fmoc geschützten Aminosäuren unter MSNT Aktivierung in
verschiedenen halogenierten Kohlenwasserstoffen wird unter Berücksichtigung
der Veresterungsausbeuten untersucht.
Lösemittel
Siedepunkt Löslichkeit der Fmoc-AA Ausbeuten
[°C]
unter MSNT Aktivierung
Tetrachloroethylen
121
teilweise unlöslich
-*
1,2,3-Trichlorpropan
157
gute Löslichkeit aller
per visueller BPB Färbung nur
Aminosäuren
geringe Umsetzung beobachtbar
Hexachloropropen
209
teilweise unlöslich
-*
1,2,4-Trichlorbenzol
213
unter Zuhilfenahme
per visueller BPB Färbung nur
verschiedener Zusätze
geringe Umsetzung beobachtbar
* wegen der uneinheitlichen Löslichkeit der Aminosäuren wurde keine Veresterungsreaktion in
diesem Lösemittel durchgeführt.
Bei der Untersuchung anderer hochsiedender halogenierter Kohlenwasserstoffe erwies sich
einzig 1,2,3-Trichlorpropan als geeignet, um alle Fmoc geschützten Aminosäuren rückstandslos
unter MSNT Aktivierung zu lösen. Die Fmoc-Aminosäuren sind in Tetrachloroethylen, 1,2,4Trichlorbenzol oder Hexachloropropen nicht gleich gut löslich. Zusätze, wie ein weiterer
Basenanteil oder DMF, gefährden die chirale Konformation der Aminosäuren [BlankemeyerMenge et al. (1990)]. 1,2,3-Trichlorpropan ist schwerflüchtig und ermöglicht so längere
Reaktionszeiten. Es läßt jedoch das Papier nicht genug quellen. Durch die ungenügende
Zugänglichkeit der Hydroxyfunktionen des Trägers sind die erzielten Ausbeuten sehr gering
(5 nmol/cm² bis 15 nmol/cm²). Die Aktivierung mit MSNT in DMF ergibt ebenfalls sehr
geringe Ausbeuten. Trägt man aber die Fmoc-Aminosäuren in DMF auf, läßt sie eintrocknen
und gibt dann die aktivieren Komponenten in 1,2,3-Trichlorpropan gelöst hinzu, sind die
erzielten Ergebnisse durchschnittlich gut. Der Spot als Reaktionsraum bleibt in der Fläche
erhalten und läuft nicht auseinander. Aufgrund der hohen Giftigkeit von 1,2,3-Trichlorpropan
ist dieses Lösemittel nur bei guter Belüftung einzusetzen.
Ergebnisse und Diskussion
39
Ausbeuten der Veresterung mit MSNT
100,0
einmal
[nmol/cm²]
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Fmoc-Aminosäuren
Abb. 6.2:
Veresterungsausbeuten durch Aktivierung individueller Aminosäuren mit MSNT
nach einmaligem Auftragen der Lösung (tabellarische Daten siehe A-1).
Die Aminosäuren Asparaginsäure, Phenylalanin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Serin,
Threonin und Valin weisen hohe Ausbeuten auf, während Asparagin, Glutamin und Arginin
nicht so gut aktiviert werden.
6.1.3
Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren als isoliertes symmetrisches Anhydrid
Die Aktivierung als isoliertes symmetrisches Anhydrid ist sowohl für BOC- als auch für Fmocgeschützte Aminosäuren beschrieben. Diese Methode erzielt an verschiedenen Trägern hohe
Ausbeuten. Sie ist aber durch den katalytisch wirkenden Zusatz DMAP bekannt für die Bildung
von Nebenprodukten (Racemisierung und Dipeptidbildung)[Atherton et al. (1981) und Wang et
al. (1981)]. Die einzelnen Anhydride müssen jeweils durch Aktivierung mit DIC frisch
hergestellt und isoliert werden. Nach Zusatz von DMAP werden sie an den Träger gekoppelt.
Damit ist diese Methode sehr zeit- und arbeitsintensiv.
Ein Nachteil dieser Methode ist der große Bedarf an Fmoc-Aminosäurederivaten zur
Darstellung des symmetrischen Anhydrids. Isolierte gemischte Anhydride werden nur selten
eingesetzt, da die Gefahr der falschen Kopplung besteht [Anderson et al. (1967), Merrifield et
al. (1974)].
Ergebnisse und Diskussion
40
Ausbeuten der Veresterung als symmetrisches Anhydrid
100,0
einmal
[nmol/cm²]
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Fmoc-Aminosäuren
Abb. 6.3:
Veresterungsausbeuten durch Aktivierung individueller Aminosäuren als
symmetrisches Anhydrid nach einmaligem Auftragen der Lösung (tabellarische
Daten siehe A-2).
Die unter Anwendung der Spot-Synthese erzielten Ausbeuten sind gering und uneinheitlich.
Eine gute Reaktion ist bei Histidin, Isoleucin, Lysin und Prolin zu beobachten. Schlechte oder
keine Ausbeuten wurden beim Koppeln von Asparaginsäure, Glutamin oder Tryptophan erzielt.
Trotz der beschriebenen Nachteile, wie geringe uneinheitliche Ausbeuten und hoher
Substanzbedarf, wird diese Methode in der Festphasensynthese eingesetzt und ist für
Spezialfälle, wie der großflächigen Beladung des Cellulose-Trägers mit dem Lys-Pro-Linker,
gut geeignet.
6.1.4
Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit DIC und Methylimidazol (MeIm)
Die Aktivierung mit DIC/MeIm verläuft über das in situ gebildete symmetrische Anhydrid und
ist eine Variante der Aktivierung mit DIC/DMAP. DMAP als Katalysator zugesetzt, bewirkt
eine bessere Aktivierung und höhere Ausbeuten, erhöht aber auch die Menge unerwünschter
Nebenprodukte (D-Isomere durch Racemisierung). Der Einsatz von MeIm im Vergleich zu
DMAP ergibt hohe Ausbeuten und weniger Nebenprodukt [Eichler et al. (1991)]. Die Methode
wurde für Veresterungen an Cellulose erprobt und ist als „Ein-Topf“-Reaktion leicht
handhabbar.
Ergebnisse und Diskussion
41
Ausbeuten der Veresterung mit DIC / MeIm
100,0
einmal
[nmol/cm²]
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Fmoc-Aminosäuren
Abb. 6.4:
Veresterungsausbeuten durch Aktivierung individueller Aminosäuren mit
DIC/MeIm, nach einmaligem Auftragen der Lösung (tabellarische Daten s. A-3).
Die Ausbeuten sind sehr gering und uneinheitlich. Eine sehr gute Reaktion ist bei Histidin,
Isoleucin, Asparagin und Valin zu beobachten, während sie bei Alanin, Cystein, Asparaginsäure, Glutaminsäure und Glutamin zu keiner meßbaren Aktivierung führt.
Insgesamt gesehen ist diese Methode aufgrund der zu geringen und sehr uneinheitlichen
Ausbeuten nicht für den Einsatz mit dem Spot-Roboter geeignet.
6.1.5
Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren nach Sieber
Die Aktivierung nach Sieber wurde speziell für die Veresterung von Fmoc-Aminosäuren an
Hydroxyfunktionen tragenden Harzen entwickelt [Sieber (1987)]. Der Reaktionsmechanismus
verläuft über das gemischte Anhydrid zwischen Fmoc-Aminosäure und 2,6-Dichlorbenzoylchlorid in DMF/Piperidin. Die erzielten Ausbeuten lagen bei 60 %. Reaktionszeiten von 15-20
Stunden werden beschrieben. Die Nebenreaktionen, wie z.B. Racemisierung sind
vernachlässigbar klein (<1%). Im Einsatz mit dem Spot-Roboter beweist die Aktivierung nach
Sieber eine einfache Handhabbarkeit, erzielt aber keine befriedigenden Ausbeuten. Lange
Reaktionszeiten, wie bei Sieber beschrieben, können im offenen System nicht realisiert werden.
Ergebnisse und Diskussion
42
Ausbeuten der Veresterung nach Sieber
100,0
[nmol/cm²]
80,0
einmal
dreimal
60,0
40,0
20,0
0,0
A
C
D E
F
G H
I
K
L M N
P Q R
S
T
V W Y
Fmoc-Aminosäuren
Abb. 6.5:
Veresterungsausbeuten durch Aktivierung individueller Aminosäuren nach
Sieber bei ein-/dreimaligem Auftragen der Lösung (tabellarische Daten s. A-4).
Die Ausbeuten sind gering und stark von der eingesetzten Fmoc-Aminosäure abhängig.
Asparaginsäure, Histidin und Glycin koppeln gut an Papier als Trägermaterial. Alanin,
Asparagin, Cystein, Glutamin und Glutaminsäure lassen sich so nur sehr schlecht aktivieren.
Die in der Literatur beschriebenen langen Reaktionszeiten wurden durch mehrfaches Auftragen
der Lösung simuliert. Aber auch die „Verlängerung“ der Reaktionszeit, von 20 Minuten
(einmaliges Auftragen der aktivierten Lösung) auf 45 Minuten (dreimaliges Auftragen der
Lösung) konnte nur teilweise eine Verbesserung der Ergebnisse bewirken.
Die Gesamtausbeute dieser Methode ist zu gering und für den Einsatz mit dem Spot-Roboter
derzeit nicht geeignet.
6.1.6
Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit Tetramethylfluoroformamidinium-Hexafluorophosphonat (TFFH)
Isolierte Aminosäurechloride sind für hohe Acylierungsausbeuten bekannt [Carpino et al.
(1986)], ihre Darstellung ist jedoch arbeitsintensiv. Die etwas stabileren isolierten Aminosäurefluoride können gute Acylierungsausbeuten bei wenig Nebenprodukten, je nach Basenzusatz,
erzielen [Granitza et al. (1995)]. Die Synthese und Isolierung der einzelnen Aminosäurefluoride
Ergebnisse und Diskussion
43
ist ebenfalls sehr aufwendig. Zur in situ Fluorierung ist TFFH entwickelt worden [Carpino et al.
(1995) und Triolo et al. (1998)], dabei wird auch ein symmetrisches Anhydrid als aktivierte
Verbindung diskutiert. Durch Verwendung eines Überschusses TFFH sollte die Aktivierung
jedoch überwiegend über das Säurefluorid erfolgen.
O
H
N
Fmoc
N + N
OH
+
Fmoc
R
OH
O
H
N
N
O
PF6-
Fmoc
F
Fmoc
N
F
O
H
N
F
N
O
+
N
R
O
H
N
R
Abb. 6.6:
O
H
N
F
R
Fmoc
Base
O
R
Veresterung einer Fmoc-Aminosäure mit TFFH.
Die in situ Fluorierung wurde bislang nur zur Bildung von Amidbindungen eingesetzt. Die
Aktivierungsmethode ist einfach durchzuführen und erlaubt auch DMF als Lösemittel.
Trotzdem sind die erzielten Acylierungsausbeuten sehr gering.
Ausbeuten der Veresterung mit TFFH
100,0
einmal
[nmol/cm²]
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Fmoc-Aminosäuren
Abb. 6.7:
Veresterungsausbeuten durch Aktivierung individueller Aminosäuren mit TFFH
nach einmaligem Auftragen der aktivierten Lösung (tabellarische Daten s. A-5).
Ergebnisse und Diskussion
44
Alanin, Glycin, Leucin und Methionin erzielen minimale Ausbeuten, die anderen Aminosäuren
haben teilweise gar nicht gekoppelt.
6.1.7 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren nach Mitsunobu
Um die Aminosäure nur wenigen Modifikationen auszusetzen, soll in einem weiteren Versuch
die Hydroxyfunktion des Trägers durch Bildung eines Alkoxyphosphoniumsalzes aktiviert
werden, das im folgenden die Säure alkyliert. Viele organische Reaktionsmechanismen, die auf
der Umwandlung von Phosphor(III)- in Phosphor(V)-Verbindungen beruhen, sind in der
Literatur beschrieben. Ein Beispiel ist die Mitsunobu-Reaktion [Mitsunobu (1981)]. Sie konnte
erfolgreich in der Veresterung von Fmoc-Aminosäuren an Hydroxygruppen tragenden Harzen
eingesetzt werden [Barlos et al. (1987), Krch¦ák et al. (1994)].
Die folgenden Azo-Derivate wurden getestet: Diethylaz odicarbox yl at (a),
Azodicarbonyldimorpholid (b), Azodicarbonyldipiperidid (c) und Tetramethylazodicarboxamid
(d) (Abb. 6.8). Die Durchführung der Aktivierung erlaubt eine einfache Handhabung.
O
O
RO
N
N
OR
+
(C6H5)3P
O
N
+
(C6H5)3 P
RO
N
OR
O
R1
H
O
N
RO
H
H
O
N
OR
O
COOH
HO
N
(C6H5)3 P+
RO
N
OR
R1
COO -
O
+
(C6H5)3 P O
R a) = C2H5
R1 COO R b) =
N
R c) =
N
R d) =
N
O
O
R1
+
Abb. 6.8:
O
(C6H5)3PO
Veresterung einer Fmoc-Aminosäure nach Mitsunobu mit verschiedenen DiazoVerbindungen.
Ergebnisse und Diskussion
45
Ausbeuten der Veresterung nach Mitsunobu
100,0
Diethylazodicarboxylat
[nmol/cm²]
80,0
Azodicarbonyldimorpholid
Azodicarbonyldipiperidid
60,0
Tetramethylazodicarboxamid
40,0
20,0
0,0
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Fmoc-Aminosäuren
Abb. 6.9:
Veresterungsausbeuten nach Aktivierung individueller Aminosäuren nach
Mitsunobu nach einmaligem Auftragen der aktivierten Lösung (tabellarische
Daten siehe A-6).
Für Reaktionen nach der Spot-Methode auf Cellulose ergibt die Methode nach Mitsunobu keine
ausreichenden Ergebnisse. Wird Diethylazodicarboxylat als Azo-Komponente eingesetzt,
ergaben die meisten Aminosäuren geringe, aber noch detektierbare Ausbeuten. Dabei konnten
mit Phenylalanin und Arginin die besten Ergebnisse erzielt werden. Glutaminsäure konnte von
keiner Variante aktiviert werden. Die Veresterungen wurden in dem für diese Reaktion
essentiellen Lösemittel THF durchgeführt. Hier könnte das mangelnde Quellverhalten des
Papiers im Lösemittel ein Schlüssel zur Erklärung der geringen Ausbeuten sein.
6.1.8
Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit Azoliden
Azolide sind bekannt für ein großes Spektrum an Reaktionsmöglichkeiten. Ihre
Einsatzmöglichkeit zur Aktivierung von Aminosäuren für eine Veresterung unter den
Bedingungen der Spot-Methode soll untersucht werden. Die Aktivierung mit den verschiedenen
Azoliden kann als „Ein-Topf“-Reaktion durchgeführt werden und ist so leicht handhabbar. Das
gebildete Imidazolid kann aber auch isoliert und dann weiter verwendet werden, was jedoch
einen zusätzlichen Isolierungsschritt nach sich ziehen würde. CDI wird sowohl zur Bildung von
Amid- als auch von Esterbindungen seit 1958 eingesetzt [Anderson et al. (1958)]. Ebenso
verwandt werden CDMeI [Saha et al. (1989) und Gibson et al. (1995)] und ThDI [Wieland et al.
(1961)].
Ergebnisse und Diskussion
46
1. Schritt: Aktivierung
H
N
Fmoc
O
O
O
OH
+
N
N
N
N
N
H
N
N
+
+
R1
R1
H
N
Fmoc
CO2
N
2. Schritt: Alkoholyse
O
N
H
N
N
R1
Abb. 6.10:
O
Fmoc
+
OH
H
N
O
R1
Fmoc
+
H
N
N
Aktivierungsschema: Die Fmoc-Aminosäure reagiert mit CDI unter CO2Freisetzung zum Imidazolid und dann in einem zweiten Schritt mit dem Alkohol
weiter zum Ester.
Azolide - insbesondere CDI - sind bekannt für milde Reaktionsbedingungen und ihre
Lösemittelvariabilität [Staab (1962)]. Die weitaus besten Ergebnisse konnten mit DMF als
Lösemittel erzielt werden. Andere Lösemittel wie THF, Toluol, Dioxan oder DCM ergaben als
Spot auf Papier aufgetragen geringere Ausbeuten. Wird diesen Lösemitteln DMF zugesetzt,
konnten die Acylierungsraten verzehnfacht werden. Als Erklärung wird akzeptiert, daß DMF ein
Quellen des Papiers und so einen besseren Zugang zu den reaktiven Hydroxygruppen der
Cellulose bewirkt [Klemm et al. (1998)].
Die Veresterung wurde mit folgenden Azoliden durchgeführt: Carbonyldiimidazol (CDI),
Carbonylditriazol (CDT), Thionyldiimidazol (ThDI), Thionylditriazol (ThDT), Carbonyldimethylimidazoltriflat3 (CDMeI) und Carbonyldinitrotriazol3 (CDNT).
CDI und CDT sind kommerziell erhältlich und hinreichend lagerstabil. Die aktivierten
Lösungen sind auch an Luft lange reaktiv. Die anderen Azolide wurden entsprechend der
Literatur synthetisiert. Sie sind sehr hydrolyseempfindlich und auch bei sorgfältiger Lagerung
nur wenige Tage stabil. Nach zwei Tagen ist bereits eine Gasentwicklung durch Zersetzung zu
beobachten. Für den Routineeinsatz in der Synthese sind sie weniger geeignet, da sie jeweils
frisch hergestellt werden müssen.
3
Ich danke Herrn Dr. N. Zander für die Synthese dieser Verbindungen.
Ergebnisse und Diskussion
47
O
N
N
N
O
O
N
N
CDI
N
N
N
N
N
N
N
O 2N
CDMeI
Abb. 6.11:
N
N
N
S
N
N
N
ThDT
O
+
N
N
ThDI
CDT
N
S
N
O 2 F C SO 3
3
+
N
N
N
O
N
N
N
N
CDNT
N
NO2
Die eingesetzten Azolide.
6.1.8.1 Reaktivität der verschiedenen Azolide
Alle 20 Fmoc geschützten Aminosäuren werden mit den verschiedenen Azoliden aktiviert und
mit dem Hydroxyfunktionen tragenden Träger verestert. Die Ausbeuten der Veresterung werden
über die Adsorption des Dibenzofulven-Piperidin Adduktes bestimmt. Werden dann die
Veresterungsausbeuten gemittelt und je nach Azolid aufgetragen, ergeben sich deutliche
Unterschiede.
Mittelwerte der Ausbeuten je Azolid
200,0
180,0
160,0
[nmol/cm²]
140,0
120,0
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
CDI
CDT
T hDI
T hDT
CDMeI
CDNiT
Azolid
Abb. 6.12:
Mittelwerte der Ausbeuten der Azolidaktivierung über alle Aminosäuren je
Azolid (tabellarische Daten siehe A-7).
Ergebnisse und Diskussion
48
Die Reaktivitäten der Carbonsäureimidazolide entsprechen denen der Carbonsäurechloride
[Staab (1962)]. In der Abfolge der Reaktivität sollten die Aminosäuretriazolide reaktiver sein als
die Imidazolide. Dies ist begründet in der besseren Fluchtgruppenqualität von Triazol durch
Zunahme der Anzahl der elektronegativeren Stickstoffatome gegenüber den CH-Gruppen. Unter
den hier beschriebenen Bedingungen ist jedoch die genaue Umkehr dieser Abfolge zu
beobachten. Schon beim Aktivieren der Aminosäuren mit CDI - dem ersten Schritt - fällt eine
starke Gasbildung auf, im Gegensatz zu CDT. Die Bildung des Aminosäureimidazolides erfolgt
also prompt. Im Vergleich der Basizitäten zeigt sich: Imidazol hat einen pks = 6,9; Triazol hat
einen pks = 2,4 [Weast (1976)]. Imidazol ist somit die stärkere Base und schlechtere Fluchtgruppe im Vergleich zu Triazol. Als stärkere Base kann es aber die Aminosäuren deprotonieren
und dadurch die weitere Aminosäureimidazolidbildung katalysieren. Ein weiteres Indiz für
diesen Mechanismus ist, daß sich die Reaktion mit CDT durch Zusatz von N-Methylimidazol
um den Faktor acht steigern läßt. Bei der Aktivierung mit CDI ist die Reaktivität der
Aminosäureimidazolide sofort vorhanden und läßt erst nach mehr als vier Stunden deutlich
nach. Bei der Aktivierung mit CDT ist eine mittlere Reaktivität erst nach ca. 60 Minuten
erreicht, sie hält aber dann viele Stunden an. Sollen in einem Veresterungszyklus CDI und CDT
zur Aktivierung eingesetzt werden, ist die längere Voraktivierungszeit der Aminosäuretriazolide
zu beachten.
ThDI und ThDT sollten als Thionyl-Derivate eine größere Reaktivität als die Carbonylderivate
aufweisen. Dies konnte, möglicherweise durch den schnellen Zerfall der Reagenzien wegen der
Luftfeuchtigkeit, hier nicht verifiziert werden. Dasselbe gilt für CDMeI und CDNT, die
aufgrund der modifizierten Azolide ebenfalls höhere Reaktivitäten, aber auch höhere Zerfallsraten aufweisen. Die Aktivierung mit CDMeI und CDNT bleibt hinter den Erwartungen zurück.
CDI und CDT stellen nach dieser quan titativen Untersuchung die besten
Aktivierungsreagenzien dar. Die Aktivierung der Fmoc geschützten Aminosäuren mit diesen
beiden Azoliden soll detailliert untersucht werden.
Ergebnisse und Diskussion
49
6.1.8.2 Reaktivität der einzelnen Aminosäure durch Azolidaktivierung
Werden die Veresterungsausbeuten der Fmoc geschützten Aminosäuren am Hydroxyfunktionen
tragenden Träger mit den Azoliden gemittelt und nach Aminosäure unterschieden, ergeben sich
deutliche Unterschiede im Reaktivitätsprofil der Aminosäuren.
Mittelwerte der Ausbeuten je Aminosäure
120,0
100,0
[nmol/cm²]
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Aminosäuren
Abb. 6.13:
Mittelwerte der Ausbeuten der Azolidaktivierung je Aminosäure (tabellarische
Daten siehe A-7).
Die höchsten Kopplungsausbeuten konnten bei Asparaginsäure, Glycin und Methionin erzielt
werden. Schlußlichter der Aktivierung mit Azoliden sind Alanin, Glutaminsäure, Prolin,
Glutamin, Arginin, Threonin, Tryptophan und Tyrosin. Die unterschiedliche Reaktivität, bzw.
Kupplungsausbeute der Aminosäuren kann durch verschiedene Mechanismen erklärt werden.
Der sterische Anspruch der Seitenketten bzw. der Seitenkettenschutzgruppen spielt bei den
quantitativ herausragenden Ausbeuten von Glycin eine Rolle. Die unterschiedlichen
Aktivierungsgeschwindigkeiten der Aminosäuren untereinander können das schlechte
Abschneiden von Asparagin erklären, das langsamer aktiviert wird. Die bei einer Aktivierung
von Prolin und Tyrosin gebildeten Aminosäureimidazolide sind in DMF schwerlöslich. Bei
ihrer Aktivierung muß auf die entsprechenden Triazole zurückgegriffen werden.
Ergebnisse und Diskussion
Ausbeuten der Veresterung mit Azoliden
400
CDI
CDT
ThDI
ThDT
CDMeI
CDNT
350
300
[nmol/cm²]
250
200
150
100
50
0
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Fmoc-Aminosäuren
Abb. 6.14:
50
Veresterungsausbeuten durch Aktivierung individueller Aminosäuren mit allen Azoliden nach einmaligem Auftragen der
Lösung (tabellarische Daten siehe A-7).
Ergebnisse und Diskussion
51
6.1.8.3 Steigerung der Ausbeuten
Es wird beschrieben, daß die Alkoholyse des Azolids - der zweite Schritt der Aktivierung - bei
Raumtemperatur sehr langsam ist. Sie kann durch Temperaturerhöhung beschleunigt werden
[Staab (1959)]. Zur Temperaturerhöhung in der Spot-Synthese können keine Standardheizverfahren zur Anwendung kommen. Schon während der kontinuierlichen Temperaturerhöhung
durch Heizplatten oder Strahler würden die geringen Lösemittelvolumen der Spots verdampfen,
noch bevor die Reaktionstemperatur erreicht ist. Seit kurzer Zeit werden Mikrowellenverfahren
zum schnellen intensiven Erhitzen in der Festphasensynthese eingesetzt [Caddick (1995) und
Yu et al. (1992)]. Zur Beschleunigung der Veresterung durch Temperaturerhöhung wurde diese
Methode auch in der Spotsynthese getestet. Jedoch konnten die Ausbeuten der Spot-Synthese
auf Papier so nicht gesteigert werden. Versuche mit anderen Trägermaterialien, wie
Polypropylen werden als vielversprechend beschrieben [Scharn et al. (1999)].
Durch wiederholte Spotzyklen mit ein und derselben aktivierten Aminosäure ist eine
hinreichende Ausbeutesteigerung möglich (siehe Abb. 6.15 und Abb. 6.16). Dadurch sind auch
die kinetischen und sterischen Effekt e v e r s chiedener Aktivierungs- oder
Acylierungsgeschwindigkeiten der Aminosäuren angleichbar. Das dreifache Auftragen der
aktivierten Lösungen hat sich als optimale Methode erwiesen. Häufigeres Auftragen führt zu
einem baldigen Sättigungseffekt am Träger und ist zeitlich ineffektiv.
Ausbeutesteigerung durch mehrfaches Auftragen der mit
CDI aktivierten Aminosäurelösung
1600,0
einmal
1400,0
zweimal
[nmol/cm²]
1200,0
dreimal
1000,0
800,0
600,0
400,0
200,0
0,0
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W Y
Fmoc-Aminosäuren
Abb. 6.15:
Ergebnis des mehrfachen Auftragens der mit 3 eq. CDI aktivierten Aminosäurelösung (tabellarische Daten siehe A-8).
Ergebnisse und Diskussion
52
Ausbeutesteigerung durch mehrfaches Auftragen der mit
CDT aktivierten Lösung
300
einmal
zweimal
dreimal
[nmol/cm²]
250
200
150
100
50
0
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Fmoc-Aminosäuren
Abb. 6.16:
Ergebnis des mehrfachen Auftragens der mit 3 eq. CDT aktivierten Aminosäurelösung (tabellarische Daten siehe A-8).
6.1.8.4 Sättigungseffekte
Neben Kristallisationseffekten ist ein möglicher Effekt zur Erklärung der Sättigung die Reaktion
der Hydroxygruppen des Trägers mit dem Azolid zu einem Imidazol-N-carboxylat. Dieser
Effekt kann durch Aktivierung mit einem eq. Azolid, statt eines Überschusses verringert
werden.
Wird die aktivierte Lösung nur einmal aufgetragen (Abb. 6.17), erbringt die Kopplung mit
einem eq. CDI leicht bessere Ausbeuten als mit drei eq. Aktivierungsreagens. Wird die
aktivierte Lösung jedoch dreimal aufgetragen, so sind für die Aktivierung mit einem eq. CDI bei
den Aminosäuren Asparaginsäure, Isoleucin, Asparagin und Serin doppelt so hohe Ausbeuten
im Vergleich zur Aktivierung mit drei eq. zu beobachten. Die bei einer Aktivierung von Prolin
und Tyrosin gebildeten Aminosäureimidazolide sind in DMF schwerlöslich. Bei ihrer
Aktivierung muß auf die entsprechenden Triazole zurückgegriffen werden.
Ergebnisse und Diskussion
53
Auswirkungen der Aktivierung mit 1 bzw. 3 eq. CDI
1200
1 eq. CDI, einmal
1000
[nmol/cm²]
3 eq. CDI, einmal
800
1 eq. CDI, dreimal
600
3 eq. CDI, dreimal
400
200
0
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Fmoc-Aminosäuren
Abb. 6.17:
Auswirkungen der Aktivierung mit 1 bzw. 3 eq. CDI auf die
Veresterungsausbeuten verschiedener Aminosäuren (tabellarische Daten s. A-9).
In der Anwendung mit der automatisierten Spot-Methode konnte dieser Effekt nicht bestätigt
werden. Auf einen Celluloseträger wurden mit dem Spot-Roboter die mit einem eq. CDI
aktivierten Fmoc-Aminosäuren aufgetragen, auf einen anderen Träger wurden die mit drei eq.
aktivierten Fmoc-Aminosäuren aufgetragen. Der optische Vergleich beider Filter nach
Bromphenolblaufärbung zeigt deutlich bessere Ausbeuten der mit drei eq. aktivierten
Monomere [Frank (2000)]. Beim automatisierten Verfahren scheinen störende Einflüsse z.B.
vom Kristallwasser der Aminosäuren oder aus der Luftfeuchtigkeit eine sehr große Rolle zu
spielen. Die Vorratsgefäße mit der aktivierten Lösung stehen beim automatisieren Verfahren
während der Spot-Zyklen offen. Auch sind die aufgetragenen Volumina kleiner, statt 0,5 µL
werden nur 0,2 µL aufgetragen. In der Durchführung mit dem Spot-Roboter sind die aktivierten
Lösungen stärker der Luftfeuchtigkeit ausgesetzt als in der manuellen Ausführung. In den
weiteren Untersuchungen wird ein Überschuß Azolid (CDI, CDT) zur Aktivierung eingesetzt,
um den Einfluß der Luftfeuchtigkeit zu minimieren.
6.1.8.5 Gleichmäßigkeit der CDI- und CDT-Veresterung
Für die Anwendung der Azolid-Aktivierung ist die Reproduzierbarkeit und damit Verläßlichkeit
der Ausbeuten wichtig. Alle manuell erzielten Spot-Ausbeuten wurden zusammengetragen und
ihre Standardabweichung vom Mittelwert ermittelt.
Ergebnisse und Diskussion
54
Ausbeuten der Veresterung mit 3 eq. CDI
1500,0
[nmol/cm²]
1250,0
1000,0
750,0
500,0
250,0
0,0
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P*
Q
R
S
T
V
W Y*
Fmoc-Aminosäuren
Abb. 6.18:
Ausbeuten mit Standardabweichungen der Aktivierung mit CDI (* = Die sich
bildenden Imidazolide von Prolin und Tyrosin sind in DMF nicht löslich,
tabellarische Daten siehe A-10).
Ausbeuten der Veresterung mit 3 eq. CDT
1500
[nmol/cm²]
1250
1000
750
500
250
0
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Fmoc-Aminosäuren
Abb. 6.19:
Ausbeuten mit Standardabweichungen der Aktivierung mit CDI (tabellarische
Daten siehe A-10).
Ergebnisse und Diskussion
55
Bei der Betrachtung der Ausbeuten der CDI-Aktivierung fällt eine Aufteilung in drei Klassen
auf. Glycin ist mit einem durchschnittlichen Ergebnis von 1250 nmol/cm² ein Ausreißer nach
oben. In der mittleren Klasse zwischen 400 und 600 nmol/cm² befinden sich die meisten FmocAminosäuren. Die untere Klasse bilden Asparagin, Glutamin, Arginin, Threonin und
Tryptophan. Über etliche Messungen verglichen ergibt sich eine reproduzierbare Veresterungsrate. Die Einführung eines Aktivierungsfaktors kann die Ausbeuten der verschiedenen Aminosäuren angleichen und die Auswertung eines anschließenden Biotests vereinfachen. Die
Aktivierung mit CDT ergibt eine gleichförmigere Verteilung der Ausbeuten. Fast alle Werte
liegen zwischen 150 und 250 nmol/cm².
6.1.9
Zusammenfassende Betrachtung der Quantität der Aktivierungsmethoden
Nach zunächst ausschließlicher Untersuchung der Quantität verschiedener
Aktivierungsmethoden kommen viele etablierte Verfahren für die Durchführung in der SpotSynthese nicht in Frage. Die Veresterung mit MSNT; die Aktivierung mit einem isolierten, wie
auch einem in situ erzeugten Anhydrid; die Aktivierung als gemischtes Anhydrid nach Sieber;
als Säurefluorid oder auch nach Mitsunobu konnte keine hinreichend hohen gleichmäßigen
Ausbeuten erzielen. CDI und CDT, als herausragende Vertreter der Azolide, stellen praktikable
Veresterungsmethoden dar, die sich durch die besten erzielten Veresterungsausbeuten sowie
leichte Handhabbarkeit auszeichnen. Die so erzielbaren Ausbeuten sind reproduzierbar und
vollkommen ausreichend für die biologischen Untersuchungen der T-Zell Epitope.
6.2
Nebenreaktionen
Neben hohen Ausbeuten ist für die Erzeugung der Bibliotheken für biologische Testsysteme
auch die Vermeidung von Nebenprodukten und die Erhaltung der stereochemischen Einheitlichkeit der Peptide wichtig.
6.2.1
Racemisierung
Die Racemisierung ist eine nahezu ausschließlich baseninduzierte Nebenreaktion und spielt nur
bei den Aktivierungs- und Kopplungsschritten eine Rolle.
6.2.1.1 Mechanismen der Racemisierung
Es werden zwei Mechanismen der Racemisierung diskutiert, die beide auf einer Deprotonierung
am -Kohlenstoff begründet sind: Kommt es zur direkten Deprotonierung am -Kohlenstoff der
-Aminocarbonsäure, kann das entstehende Carbanion von beiden Seiten her angegriffen
Ergebnisse und Diskussion
56
werden. Die Racemisierungsgeschwindigkeit hängt von der katalysierenden Base, dem
Lösemittel und der elektronenanziehenden Wirkung der Fluchtgruppe ab. Sie verläuft besonders
schnell bei guten Fluchtgruppen, sterisch nicht gehinderten Basen und in dipolaren aprotischen
Lösemitteln, wie DMF. Ist aber erst einmal die neue Bindung geknüpft, haben diese Faktoren
keinen Einfluß mehr. Lösemittel wie DMSO oder DMF sind für Synthesen mit Papier als
Trägermaterial besonders gut geeignet. In beiden Lösemitteln quillt das Papier und weitere
Hydroxygruppen werden zugänglich für Reaktionen. Außerdem ist DMF ein hervorragendes
Lösemittel für Fmoc-Aminosäuren.
Ein anderer Ablauf wird als Oxazolon-Mechanismus diskutiert. Dabei zyklisieren aktivierte
Acylaminosäuren unter Einwirkung einer Base zu Oxazolonen. Dadurch wird das -Proton
azide und kann in Gegenwart von Basen sehr leicht abstrahiert werden. Das Oxazolon ist
gegenüber einem nukleophilen Angriff, z.B. der Aminolyse aktiv. Dabei ist jedoch die
Geschwindigkeit der Racemisierung des Oxazolons wesentlich größer als die Peptidbildungsgeschwindigkeit. Eine Aktivierung alkoxycarbonylgeschützter Aminosäuren (Z-, BOC- und
Fmoc) führt unter normalen Bedingungen nicht zur Oxazolonbildung und die Abstraktion des
-Protons wird nicht erleichtert.
H
R2
N
O
+
H
R2
R1
+
X
O
H
N
O
H
X
N
R1 R2
O
X
H
N - R1 R2
H
R1 R2
O
O
O
N
R1
H
D,L-Form
O
O
O
R1 = Aminosäureseitenkette
R2 = Acylgruppe oder Peptidkette
Abb. 6.20: Oxazolonmechanismus der Racemisierung.
6.2.1.2 Untersuchungsmethoden
Zur Untersuchung der Racemisierung wird die Aminosäure am Träger verestert. Die Schutzgruppen werden entfernt und die Aminosäure wird vom Träger abgespalten. Das kann über
einen säurelabilen Linker (HMPA) oder durch alkalische Hydrolyse mit Trimethylamin (vgl.
6.5) in der Gasphase direkt vom Träger geschehen. Die abgespaltenen Aminosäuren werden Nterminal trifluoroacetyliert und C-terminal als Ethylester modifiziert. Arginin und Histidin
werden zusätzlich modifiziert, Arginin wird zu Ornithin und Histidin zusätzlich noch mit
Chlorameisensäureethylester umgesetzt. Die so modifizierten Aminosäuren werden über eine
Chirasil-Val GC Säule im GC-MS und GC-FID analysiert4 [Blankemeyer-Menge (1990)].
4
für die Durchführungen der Derivatisierungen und Messungen danke ich Frau Andrea
Tiepold
Ergebnisse und Diskussion
57
Durch teilweise sehr mangelhafte Acylierungsausbeuten konnten nicht alle
Veresterungsmethoden hinsichtlich der Racemisierung eingehend untersucht werden.
Ausreichende Ausbeuten ergaben die Aktivierungen mit CDI, CDT, ThDI, ThDT, MSNT und
als symmetrisches Anhydrid.
6.2.1.3 Ergebnisse der Racemisierung bei Aktivierung mit CDI, CDT, ThDI und ThDT, im
Vergleich mit MSNT und symmetrischem Anhydrid
Die Racemisierung bei der Amidbindungsbildung mit Carbodiimidaktivierung läßt sich durch
HOBt-Zusatz auf deutlich unter 1 % senken [König et al. (1970) und Windridge et al. (1971)].
Bei der Veresterung hingegen ist sie die wichtigste Nebenreaktion. Veresterungen erfordern
stärkere Reaktionsbedingungen als die Amidbildung. Gerade in dem offenen Spot-Reaktor, mit
der ubiquitären Luftfeuchtigkeit und kurzen Reaktionszeit müssen drastische Bedingungen
eingesetzt werden, um überhaupt akzeptable Ergebnisse zu erzielen. Je härter die Aktivierungsbedingungen sind, desto mehr steigt die Gefahr Produkte zu erzielen, die nicht stereochemisch
einheitlich sind.
Tab. 6.2:
Racemisierung nach verschiedenen Veresterungsmethoden in [% D-Isomer].
[% D-Isomer] CDI* CDI** CDT* CDT** MSNT** sym.Anh.** ThDI** ThDT**
AA
A
1,5
1,4
1,3
1
0
nd
nd
nd
C
0
nd
0
nd
nd
nd
nd
nd
D
8,3
3,9
2
0,7
2
20,65
41
33
E
2,3
2,6
2,1
1,2
1,6
nd
26
18
F
2,7
3,5
1,3
2,5
2,25
4,7
18
18
G
H
0,5
0
0,1
0
0
25,7
0
0
I
0
0
0
0
0
nd
0
0
K
0,7
0,8
0,7
0,7
0,3
nd
nd
4
L
1,0
1,9
1
0,5
1,4
24,4
12
16
M
3,1
4,5
1,8
1,9
2,5
34,65
22
26
N
1,0
7,6
2
17,5
27,8
31,4
54
47
P
0
0
0
0
0
nd
0
0
Q
1,4
10,3
0,8
10
11,3
nd
20
19
R
2,4
2,4
1,3
1
nd
47,9
13
15
S
4,7
4,1
0,1
1,5
4,5
9,1
nd
nd
T
0
2,9
0
nd
0
nd
5
nd
V
1,0
1,2
0
0
0,3
nd
0
0
W
2,0
3,1
0,6
0,8
0
13,9
nd
nd
Y
1,3
3,2
1
nd
nd
nd
nd
nd
*
**
**
nd
sauer mit TFA vom HMPA-Linker abgespalten, gemessen mit GC-MS
basisch mit TMA direkt vom Träger abgespalten, aufgrund mangelnder GC-MS
Kapazitäten nur noch mit GC-FID bestimmt
keine Mehrfachbestimmung
nicht bestimmt
Ergebnisse und Diskussion
58
Als weitgehend stabil gegen Racemisierung erweisen sich die Aminosäuren Isoleucin, Lysin,
Prolin, Valin und Tyrosin. Besonders anfällig sind Asparaginsäure, Methionin, Asparagin,
Glutaminsäure, Arginin und Serin. Cystein und auch Histidin zeigen entgegen den Literaturdaten [Colombo et al. (1984)] keine bzw. kaum Racemisierung.
Im Vergleich der verschiedenen Veresterungsmethoden sind deutliche Unterschiede bezüglich
der Racemisierung festzustellen. CDT schneidet dabei als racemisierungsärmste Aktivierung,
mit Werten zwischen 0 und 2,1 % D-Isomer, jeweils in Abhängigkeit der eingesetzten Aminosäure, am besten ab. Zwischen den Ergebnissen der Veresterung am säurespaltbaren Linker oder
nach basischer Spaltung sind, bis auf Asparagin und Glutamin, keine signifikanten Unterschiede
erkennbar. Ob diese Abweichung an der ungleichen Oberflächenmodifikation des Trägers, der
verschiedenen Abspaltungsmethoden oder aber auch der abweichenden Meßmethode liegt,
konnte abschließend nicht genau geklärt werden. Die Veresterung mit CDI mit Werten zwischen
1,0 und 4,7 % D-Isomer, jeweils in Abhängigkeit der eingesetzten Aminosäure, ist die
zweitbeste der getesteten Methoden. Die Thionyl-Derivate der Azolide ergaben hohe Werte für
die Racemisierung, sie liegen zwischen 4 % und 54 % D-Isomer, je nach eingesetzter Aminosäure. Dieser drastische Unterschied im Vergleich der Thioazolide mit den Carbonylazoliden
könnte durch die Instabilität der Thionyl-Derivate erklärt werden. Sie zerfallen schon nach
kurzer Lagerung zu CO2 und Imidazol bzw. Triazol. Die schlechten Ausbeuten der Aktivierung
mit Thionylazoliden und der hohe Anteil D-Isomer bestärken die Annahme eines schnellen
Zerfalls dieser Azolide. Ist der Anteil der durch Zerfall entstandenen Base schon zu Beginn der
Aktivierung sehr hoch, steigt die Racemisierungsrate. Diese Tendenz wurde auch bei der
Veresterung mit teilweise zerfallenem CDI beobachtet. Dabei verdoppelte bis verdreifachte sich
der Anteil des D-Isomers. Die in der Literatur beschriebenen Daten zur Racemisierung der
Azolide weichen stark voneinander ab. Je nach Lösemittel, N-terminaler Schutzgruppe oder
Reaktionstemperatur liegen sie: für CDI bei 0,5 % (-10°C in DMF) bzw. 5 % D-Isomer
(Raumtemperatur in THF) - Synthese von Peptiden [Anderson et al. (1958)], für CDI bei 3050 % (Raumtemperatur in THF) oder 17 % D-Isomer (DMF) [Stelzel (1974)]. Für CDT werden
6,8 % D-Isomer (Raumtemperatur in THF) beschrieben [Weygand et al. (1966)].
Die Veresterung über das isolierte symmetrische Anhydrid führt unter den gewählten
Bedingungen der Spot-Synthese ebenfalls zu sehr hoher Racemisierung zwischen 4,7 % und
47,9 %, je nach eingesetzter Aminosäure, obwohl das in der Literatur beschriebene und
besonders racemisierungsfördernde DMAP [Atherton et al. (1981)] durch N-Methylimidazol
ersetzt wurde.
Die abgewandelte Veresterung mit MSNT weist von der Literatur abweichende Daten zur
Racemisierung auf [Blankemeyer-Menge et al. (1990)]. In der Literatur werden Werte unter
2,1 % D-Isomer beschrieben. Mit Ausnahme von Asparagin und Glutamin liegen die
gemessenen Werte zwischen 0,3 % und 4,5 % D-Isomer, je nach eingesetzter Aminosäure.
Damit sind sie trotz Einsatz von DMF nicht überproportional gestiegen.
Ergebnisse und Diskussion
59
6.2.1.4 Zusammenfassung der Untersuchung zur Racemisierung
Der hohe Anteil D-Isomer bei einer Aktivierung mit MSNT, dem isolierten symmetrischen
Anhydrid, ThDI oder ThDT macht sich für die Spot-Synthese unattraktiv.
6.2.2
Dipeptidbildung
Die Dipeptidbildung tritt auf, wenn unter den Aktivierungs- und Kupplungsbedingungen die Nterminale Schutzgruppe abgespalten wird. Dipeptidbildung verfälscht die synthetisierte Peptidsequenz und erfordert dann komplizierte Reinigungsschritte. Fmoc bleibt unter den etablierten
Kupplungsbedingungen eine stabile Schutzgruppe [Bodanszky et al. (1979)].
6.2.2.1 Untersuchungen zur Dipeptidbildung
Zur Untersuchung der Stabilität der Schutzgruppe unter den Bedingungen der AzolidAktivierung wird Fmoc-Phenylalanin 60 Minuten mit CDI und Imidazol sowie mit CDT und
Triazol behandelt. Nach Quenchen der Reaktion mit TFA/Wasser werden die Ergebnisse über
HPLC Trennung untersucht.
0,6
100
100
7,96
0,6
0,5
0,5
80
0,1
60
0,3
40
0,2
0,1
20
20
%D
0,0
%D
0,0
0,4
0
0
2
4
6
8
10
12
0
14
2
4
Retention Time (min)
8
10
12
14
Dipeptidbildung durch Behandlung von Fmoc-Valin mit einer 20 %igen
Imidazol- bzw. Triazol-Lösung in DMF nach 60 Minuten.
100
0,6
8,00
0,6
0,5
100
8,04
Abb. 6.21:
6
Retention Time (min)
0,5
0,1
20
%D
0,0
0
0
2
4
6
8
Retention Time (min)
Abb. 6.22:
10
12
14
0,4
60
0,3
40
7,21
0,2
8,41
40
0,2
Solvent (%)
60
0,3
Intensity (AU)
80
0,4
8,21
8,47
Intensity (AU)
80
0,1
Solvent (%)
0
Solvent (%)
40
0,2
Intensity (AU)
60
0,3
Solvent (%)
7,96
Intensity (AU)
80
0,4
20
%D
0,0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Retention Time (min)
Dipeptidbildung durch Behandlung von Fmoc-Valin mit jeweils 3 eq. CDI bzw.
CDT nach 60 Minuten.
Ergebnisse und Diskussion
60
In allen vier Chromatogrammen ist nach Behandlung mit Imidazol und Triazol sowie CDI und
CDT lediglich der Eduktpeak zu erkennen, Zerfallsprodukte und Dimerisierung werden nicht
beobachtet. Dies führt zu folgenden Schlußfolgerungen: Zum einen ist nach 60 Minuten die
Fmoc-Schutzgruppe noch fest an der Aminosäure gebunden und zum anderen ist keine
Dipeptidbildung zu erkennen.
6.2.3
Diketopiperazinbildung
Eine andere unerwünschte Nebenreaktion ist die Diketopiperazinbildung [Khosla et al. (1972)].
Dabei zyklisieren die Dipeptidester mit dem freien N-Terminus der wachsenden Peptidkette
durch Basenkatalyse unter Bildung eines Diketopiperazins. Das Resultat ist die Abspaltung des
Dipeptids vom Träger. Diese intramolekulare Aminolyse ist sequenzabhängig. Die Anwesenheit
von Glycin, Prolin, D-Aminosäuren oder N-Methylaminosäuren begünstigt die Diketopiperazinbildung [Fields et al. (1990)]. Die Abspaltung durch diesen Mechanismus kann durch kürzere
Behandlung mit 20 % Piperidin/DMF bei der Fmoc-Abspaltung eingeschränkt werden.
6.2.3.1 Untersuchung der Diketopiperazinbildung
Zur Untersuchung der Diketopiperazinbildung werden drei Zyklen betrachtet. Der erste Zyklus
beschreibt die Ausbeuten der direkten Veresterung von Prolin (CDT-Aktivierung und
Basenzusatz) und Lysin (CDI-Aktivierung) am Papier. Im zweiten Zyklus werden darauf Prolin
bzw. Lysin gekuppelt. Zur Simulation der Diketopiperazinbildung wird jetzt mit 20 %
Piperidin/DMF die Fmoc-Schutzgruppe abgespalten und damit die Zyklisierung und Abspaltung
vom Träger initiiert. Nach unterschiedlichen Zeitabständen wird der Träger aus der Abspaltlösung genommen und gewaschen. Zur Überprüfung der noch am Träger verbliebenen Peptidmenge wird eine dritte Aminosäure (Glycin) gekuppelt.
Tab. 6.3:
Sequenz
Zyklus
1. Zyklus
2. Zyklus
3. Zyklus
*
Auswirkungen unterschiedlicher Fmoc-Abspaltzeiten auf die Diketopiperazinbildung und damit die Abspaltung vom Träger
GPP
GKP
GPK
Zeit der FmocAusbeute
Ausbeute
Ausbeute
Abspaltung nach dem 2. [nmol/cm²] [nmol/cm²] [nmol/cm²]
Zyklus
388
398
592
199*
214*
545*
2 min
128
194
459
5 min
92
153
444
30 min
102
143
443
60 min
107
128
418
gemittelt über 4 Werte
Ergebnisse und Diskussion
61
Beginnt eine Sequenz mit Prolin, wie im oben beschriebenen Experiment, ist ein Verlust von
50 %, in Relation zum ersten Zyklus zu beobachten. Auch beim Beginn mit Lysin werden 10 %
Verlust zum zweiten Zyklus gemessen, dann aber bleiben die Ausbeuten weitgehend konstant,
unabhängig von der Behandlungsdauer mit Piperidin/DMF. Die Halbwertzeit von Dipeptidsequenzen, bei denen Prolin am Träger verestert ist, beträgt in 20 % DMF/Piperidin
10 Sekunden [Pedroso et al. (1986)]. Der Verlust durch Dipeptidbildung vom zweiten zum
dritten Zyklus gemessen am zwei Minuten-Wert beträgt bei: „PPG“ 36 %, „PKG“ 10 % und
„KPG“ 16 %. Für die Sequenz „PPG“ variiert der Wert der abgespaltenen Sequenz für 5, 30 und
60 Minuten Abspaltzeit um 50 %. Auch für die Sequenz „KPG“ pendelt sich nach 60 Minuten
der Wert auf etwa 20 % Verlust ein. Einzig bei der Sequenz „PKG“ ist bis hin zum 60 Minuten
Wert eine kontinuierlich steigende Verlustrate zu beobachten. Die Halbwertszeit der
Diketopiperazinbildung beträgt für an Cellulose veresterte Dipeptide durch Abspaltung mit
20 % Piperidin in DMF mehr als 60 Minuten.
Die Diketopiperazinbildung kann bei Sequenzen deren erste Aminosäure am Träger verestert ist
nur durch Kupplung eines Dipeptids im zweiten bzw. dritten Zyklus sicher vermieden werden.
Dies bedeutet aber für die gewählte Synthesemethode die separate Synthese von bis zu
425 Dipeptiden, inklusive Reinigung und anschließender Kopplung. Um die
Diketopiperazinbildung so klein wie möglich zu halten, wird die Abspaltzeit nach dem zweiten
Zyklus auf 3 min beschränkt. Kürzere Zeiten wären noch effektiver bei der Vermeidung der
Zyklisierung. Die sehr schnelle Fmoc-Abspaltung in 20 % Piperidin/DMF [Atherton et al.
(1978)] würde ein kürzeres Zeitintervall erlauben, aber Diffusion und Verteilung der
Abspaltungsreagenzien im Trägermaterial sind hier die limitierenden Faktoren. Einen positiven
Effekt kann die Diketopiperazinbildung auf die Eliminierung von D-Aminosäuren haben, die
bei der Veresterung entstanden sind. Die Kombination von D- und L-Aminosäuren begünstigt
die Zyklisierung und damit die Abspaltung [Gisin et al. (1972)]. Zur Bestätigung dieses Effekts
können Untersuchungen an Tripeptiden durchgeführt werden.
Die Diketopiperazinbildung verursacht insgesamt eine geringe Verlustrate der am Träger
veresterten Aminosäuren und ist damit als Nebenreaktion vernachlässigbar.
Ergebnisse und Diskussion
6.3
62
Vergleichende Betrachtung der Veresterungsmethoden unter
Berücksichtigung der Ausbeuten und der Nebenreaktionen
Die Wahl des Kupplungsreagenz wird besonders durch die zu erzielenden Ausbeuten bestimmt.
Durch die Wahl des Trägermaterials Cellulose ist das Lösemittel DMF für die Reaktionen
prädestiniert. DMF ist ein ausgezeichnetes Lösemittel für Fmoc-Aminosäuren, es ist
ausreichend schwer flüchtig und begünstigt die Quellfähigkeit von Papier. Nachteilig ist der
polare aprotische Charakter, der die Racemisierung ermöglicht. Eine Veresterung gerade in dem
offenen Spot-Reaktor System ist problematisch. Die Anwesenheit von Luftfeuchtigkeit
behindert eine Veresterung und durch schnelles Verdampfen des Lösemittels bei kleinen Spots
ist die Reaktionszeit auf wenige Minuten limitiert. So werden schnelle feuchtigkeitstolerante
Reaktionen benötigt. Diese Bedingungen können aber Nebenreaktionen begünstigen. Die Wahl
des Kupplungsreagenzes stellt also einen Kompromiß dar. Weiterhin zu berücksichtigen ist eine
einfache und effiziente Durchführung. Bei der Herstellung vieler Substanzbibliotheken soll die
partiell automatische Synthese nicht durch weitere manuelle Schritte verlängert werden.
Das häufig eingesetzte symmetrische Anhydrid schneidet bezüglich der Ausbeuten und der
Racemisierung sehr schlecht ab. Die hohe Racemisierung und die geringen Ausbeuten machen
dieses Verfahren absolut untauglich für den Einsatz im Spot-Syntheseautomaten. Die Variante
der MSNT-Aktivierung ist die drittbeste Wahl unter Berücksichtigung der Ausbeuten und
Racemisierung. Ihre Durchführung in Anpassung an die Spot-Synthese würde einen weiteren
manuellen Schritt in der Syntheseführung erforderlich machen.
Die Entscheidung für ein optimales Kopplungsreagenz fällt zugunsten von CDI. Es erzielt die
höchsten Ausbeuten und ist auch bezüglich der Racemisierung nach CDT die zweitbeste Wahl.
Dipeptidbildung und Verlust eines veresterten Dipeptids durch Diketopiperazinbildung sind
vernachlässigbar. CDI ist kommerziell erhältlich und in der Spot-Synthese einfach handhabbar.
CDT soll auch weiter berücksichtigt werden, es erzielt zwar geringere Ausbeuten, weist dafür
aber eine sehr geringe Racemisierungsrate auf. Auch hierbei sind Dipeptidbildung und
Diketopiperazinbildung vernachlässigbar.
6.4
Spot-Synthese der Peptide
Nachdem nun die erste Aminosäure über eine Esterbrücke an den Träger verankert ist, kann
durch Kettenverlängerung das Peptid aufgebaut werden. Mit Hilfe der ortsgerichteten parallelen
Spot-Synthese (vgl. 2.2.1.2) werden die in NMP gelösten und mit DIC/HOBt aktivierten Fmoc
geschützten Bausteine (vgl. 2.6.1) einzeln, mit Hilfe des Syntheseroboters ihrem Reaktionsraum
zugewiesen. Jeweils 0,2 µL der aktivierten Lösung formen dort durch ihr kreisrundes Eintreten
Ergebnisse und Diskussion
63
in die Cellulose die Reaktionsräume. Hier findet dann die Reaktion zur Kettenverlängerung
statt. Nach vollständigem Peptidaufbau werden die Seitenkettenschutzgruppen abgespalten. Das
Peptid soll jetzt vom Träger abgespalten und als gelöste Verbindung zur Untersuchung von TZell Epitopen verwendet werden.
6.5
Paralleles Abspalten der Peptide vom Träger
Die höchstmögliche Parallelität der Reaktionsführung zur Synthese löslicher Peptidbibliotheken
soll auch bei der Abspaltung der Peptide vom Träger beibehalten werden. Die Verfahren, die
sich dafür anbieten, verwenden keine Lösemittel. In Frage kommen: alkalische oder saure
Hydrolyse in der Gasphase, der Einsatz photolabiler Linker oder thermische Spaltverfahren. Die
Spaltung von Esterbindungen mit Ammoniak-Gas stellt eine etablierte Technik dar [Atherton
et al. (1989)]. Die dabei abgespaltenen Peptide liegen dann jedoch überwiegend als Amide vor.
Für die parallele Abspaltung wurde eine auf diesem Prinzip beruhende milde Methode
entwickelt. Sie erlaubt die Behandlung der gesamten auf dem Träger synthetisierten Bibliothek
simultan, ohne sie zerteilen zu müssen. Der Träger wird dabei über eine 45 %ige wäßrige
Trimethylamin-Lösung (w/v) in die gesättigte Gasatmosphäre plaziert und dort für 18 Stunden
inkubiert. Erst danach werden die Spots separiert und in eine Mikrotiterplatte gegeben. Die nun
abgespaltenen aber noch am Träger haftenden Peptide können mit jedem biologisch
verträglichen Puffer und vielen anderen Lösemittelgemischen abgewaschen werden und so dann
direkt der biologischen Anwendung zugeführt werden. Die hohe Parallelität und einfache
Handhabbarkeit auch großer Bibliotheken bleibt gewährleistet. Dem Puffer oder
Lösemittelgemisch sind 20 % DMSO zuzufügen, um das Papier besser quellen zu lassen und ein
vollständiges Herauslösen der synthetisierten Peptide zu ermöglichen. Die so freigesetzten
Peptide werden über HPLC und MALDI-MS quantitativ begutachtet.
6.5.1
Qualitätskontrolle der abgespaltenen Peptide
Zur Qualitätskontrolle werden die Peptide chromatographisch mit Hilfe der HPLC und
massenspektroskopisch untersucht. Dafür wird die Esterbindung zwischen Peptid und Träger
mit Trimethylamin und Ammoniak (basische Hydrolyse) gespalten und die Peptide dann mit
10 % DMSO und PBS-Puffer eluiert. Die abgespaltenen Peptide werden massenspektroskopisch
und chromatographisch untersucht. Sie weisen eine hohe Reinheit auf. Sowohl
Abbruchsequenzen aus den Syntheseschritten, als auch Fragmentierung durch die alkalische
Hydrolyse der Esterbindung, können nicht nachgewiesen werden.
Ergebnisse und Diskussion
64
Intens.
x104
2,5
1427,8
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
800
Abb. 6.23:
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
m/z
MALDI-MS eines Peptids verestert mit CDI auf Cellulose, abgespalten in einer
Ammoniak-Gasatmosphäre Sequenz: NH 2 -SFERFEIFPKE-CONH 2 .
M = 1427,8 m/z.
100
5,47
0,6
0,5
60
0,3
40
0,2
0,1
Solvent (%)
0,4
5,75
5,81
Intensity (AU)
80
20
%D
0,0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Retention Time (min)
Abb. 6.24:
Reinheitskontrolle: HPLC eines Peptids verestert mit CDI auf Cellulose,
abgespalten in einer Ammoniak-Gasatmosphäre Sequenz: NH2-SFERFEIFPKECONH2.
Ergebnisse und Diskussion
65
Intens.
x104
1428,8
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
800
Abb. 6.25:
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
MALDI-MS eines Peptids verestert mit CDI auf Cellulose, abgespalten in einer
Trimethylamin-Gasatmosphäre Sequenz: NH 2 -SFERFEIFPKE-COOH
M = 1428,8 m/z.
100
5,55
0,6
0,5
80
0,4
60
0,3
40
0
2
4
6
8
10
20
11,68
0,0
9,60
9,70
9,73
9,81
10,08
10,14
10,50
0,1
8,10
8,38
0,2
5,49
5,84
6,05
6,08
6,30
6,37
Intensity (AU)
m/z
Solvent (%)
0,0
12
%D
0
14
Retention Time (min)
Abb. 6.26:
Reinheitskontrolle: HPLC eines Peptids verestert mit CDI auf Cellulose,
abgespalten in einer Trimethylamin-Gasatmosphäre Sequenz: NH 2 SFERFEIFPKE-COOH.
Ergebnisse und Diskussion
6.5.2
66
Quantitätsprüfung
Zur Untersuchung der vom Träger abgespaltenen Peptidmengen existieren verschiedene
Methoden. Für die Quantifizierung geringer löslicher Peptidmengen eignet sich hervorragend
die Aminosäureanalytik. Zur Quantifizierung der nach der Abspaltung am Träger verbleibenden
Peptidmenge dient die Bromphenolblaufärbung der freien Aminofunktionen. Sie ist jedoch von
geringer Genauigkeit und kann so nur einen groben Anhaltspunkt über die verbleibende Peptidmenge geben. Die Kopplungsausbeuten der jeweiligen Synthesestufen werden im Routinebetrieb durch die Quantifizierung der Adsorption des Dibenzofulven-Piperidin Adduktes
durchgeführt. Sollen nun aber die Mengen der am Träger synthetisierten Peptide, sowie der
Anteil des abgespaltenen und am Träger verbliebenen Peptids verglichen werden, ist es
vorteilhaft, diese unterschiedlichen physikalischen Meßverfahren zu vereinheitlichen. Dafür
werden hier kurze Peptide von 15 Aminosäuren Länge N-terminal durch 14C radioaktiv
markiertes Biotin finalisiert. Mit Hilfe eines Szintillationszählers ist nun die Bestimmung der
Peptidmenge (Peptid), der abgespaltenen Peptidmenge (löslich) und der verbleibenden
Peptidmenge (Rückstand) durchgebend mit einer physikalischen Methode möglich.
Quantifizierung der Abspaltung über 14 C gelabeltes Biotin. Die erzielten cpm
des Peptids am Träger, nach Abspaltung in Lösung vorliegend und der
Rückstand am Träger sind aufgeführt. Die Summe aus löslichem Peptid und
Rückstand dient als Kontrolle.
Peptid lösl. Peptid Rückstand Summe % abgespalten Sequenz
[cpm]
[cpm]
[cpm]
[cpm]
1924
1564
725
2289
81
ELREQLSSVSSFERF
1911
1283
655
1938
67
2217
1357
758
2116
61
EQLSSVSSFERFEIF
2282
1154
834
1987
51
2397
1944
975
2919
81
SSVSSFERFEIFPKE
2680
1600
922
2521
60
2590
2046
895
2941
79
SSFERFEIFPKESSW
2790
2128
956
3084
76
3520
3283
945
4227
93
ERFEIFPKESSWPNH
3421
3309
862
4171
97
1449
1270
527
1797
88
EIFPKESSWPNHNTT
1296
1154
589
1743
89
2104
992
1237
2229
47
PKESSWPNHNTTKGV
2070
935
1100
2034
45
22
29
22
Tab. 6.4:
No.
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
blind
Als Blindprobe wird ein Quadratzentimeter Papierträger ohne Peptid im Szintillationszähler
vermessen.
Ergebnisse und Diskussion
67
Es wurden sieben verschiedene Sequenzen eines Epitops synthetisiert. Aus den
Doppelbestimmungen ergibt sich eine Messungenauigkeit von 10 %.
Die Abspaltung scheint von der am Träger veresterten Aminosäure abhängig zu sein. Die mit
Valin beginnende Sequenz wird mit 46 % am schlechtesten abgespalten. Die anderen Sequenzen
zeigen im Rahmen der Messungenauigkeiten eine Abspaltung um 80 %.
Um zu überprüfen, ob die Peptide während der Abspaltung auf dem Träger ineinander
diffundieren, werden verschieden behandelte Filter vor und nach der Trimethylaminbehandlung
im Phosphorimager betrachtet.
Doppelbestimmung
a)
Filter 1: ohne Behandlung
b)
Filter 2: angefeuchtet und mit
TMA behandelt
Filter 3: mit TMA zur Spaltung
der Esterbindungen behandelt
Peptid No.: 7
Abb. 6.27:
6
5
4
3
2
1
Filter mit radioaktiv gelabelten Peptiden als Spots (Doppelbestimmung) nach
bzw. ohne TMA Behandlung.
Zur Simulation einer ganzflächig auf einem Filter synthetisierten Bibliothek wurden jeweils
Doppelreihen der Peptidspots zur Betrachtung herangezogen. Filter 1 zeigt den Träger vor der
Trimethylaminbehandlung, Filter 2 wurde zuvor angefeuchtet, um die baseninduzierte
Abspaltung zu beschleunigen und Filter 3 zeigt den Träger nach der Behandlung mit
Trimethylamin. Filter 1 zeigt klar separierte Spots. Durch die ungenaue manuelle Syntheseführung sind sie nicht exakt kreisförmig. Das Anfeuchten des Trägers (Filter 2) läßt die Peptide
ineinander und über den ganzen Filter verlaufen. Diese Methode hat keine Ausbeuteverbesserung erbracht und obendrein die Produkte verunreinigt. Sie wird für die Abspaltung der
Peptide vom Träger nicht weiter eingesetzt. Filter 3 zeigt die Peptidspots nach der Trimethylaminbehandlung zur Spaltung der Esterbindungen. Die einzelnen Spots erscheinen etwas
verwischt, aber noch vollständig separiert. Für die folgenden biologischen Untersuchungen der
löslichen Peptide werden diese Spots einzeln in Mikrotiterplatten separiert und mit DMSO und
PBS-Puffer eluiert.
Ergebnisse und Diskussion
6.5.3
68
Zusammenfassung der Ergebnisse der Qualitätskontrolle
Die Behandlung der auf Filterpapierträgern immobilisierten Bibliotheken parallel in einer
Trimethylamin Gasatmosphäre erbringt eine 80 %ige Abspaltung reiner Produkte. Sie können
so für die Untersuchungen der T-Zell Epitope eingesetzt werden. Durch massenspektroskopische und chromatographische Methoden kann eine hohe Reinheit der Peptide
bestätigt werden. Zur Untersuchung der Biokompatibilität der Peptide müssen zelluläre
Analysen durchgeführt werden.
Ergebnisse und Diskussion
69
7.
Immunologische Untersuchungen der synthetisierten
Bibliotheken
7.1
Immunologische Analyse
Die Antigenerkennung der adaptiven Immunantwort wird durch den antigenspezifischen
Rezeptor der Lymphozyten vermittelt (vgl. 3.1). T-Zellen können dabei die Anwesenheit
intrazellulärer Krankheitserreger auf der Zelloberfläche erkennen. Infizierte Zellen präsentieren
mit Hilfe von Molekülen des MHC auf ihrer Oberfläche Peptidfragmente, die aus teillysierten
Proteinen der Krankheitserreger stammen. Dabei gibt es zwei unterschiedliche Moleküle des
MHC, die jeweils verschiedene Untergruppen der T-Zellen aktivieren. Peptide, die an MHC
Klasse-I gebunden werden, aktivieren CD 8 T-Killerzellen (TC). Diese T-Zellen töten die
infizierten Zellen. Peptide die an MHC Klasse-II gebunden werden, aktivieren CD 4 T-Helferzellen (TH). Diese T-Zellen können durch Zytokinausschüttung andere Zellen des Immunsystems zur Vermehrung und Differenzierung anregen. Für das Verständnis immunologischer
Vorgänge ist es unerläßlich, das individuelle, eine bestimmte Immun- bzw. T-Zell Reaktion
auslösende Epitop (Antigen-Peptid) zu kennen. Dieses geschieht normalerweise durch
systematische Analyse der für eine Immunstimulation in Frage kommenden Proteinsequenz.
Dafür wird eine Serie überlappender Peptide synthetisiert, die kurzen Abschnitten der Proteinsequenz entsprechen. Aus der Gesamtheit der hergestellten Peptide wirken nur einzelne
stimulierend auf die T-Zellen, wodurch auf das eigentliche Epitop zurückgeschlossen werden
kann. Dieses Wissen um bindende Epitope kann z.B. zur Darstellung synthetischer Vaccine
dienen.
Die Spot-Methode stellt ein ideales Werkzeug zur Synthese großer Peptidbibliotheken dar. Da
für die Durchführung von T-Zell Analysen zur Ermittlung der Epitope die Peptide in löslicher
Form vorliegen müssen, ist die Freisetzung der Peptide von der Synthesematrix notwendig. Zur
Abspaltung vom Träger wird normalerweise der Lys-Pro-Linker verwendet [Maeji et al.
(1990)]. Diese Methode liefert jedoch Peptide mit einem Diketopiperazinrest am C-Terminus.
Solche Peptide werden erfolgreich zur Untersuchung von MHC Klasse-II abhängigen TH-Zell
Reaktionen eingesetzt [Adler et al. (1994)]. Für MHC Klasse-I abhängige TC-Zell Reaktionen
können sie aufgrund des modifizierten C-Terminus allerdings nicht verwendet werden, da die
MHC Klasse-I Moleküle nur definierte Peptidlängen binden und der C-Terminus des Peptids
zur Bindungsaktivität beiträgt.
Ergebnisse und Diskussion
70
In dieser Arbeit soll eine Methode der Peptidsynthese erarbeitet werden, bei der Peptide mit
unmodifiziertem C-Terminus durch Abspaltung vom Träger freigesetzt werden können. Es soll
gezeigt werden, daß die Spot-Methode auch mit den neu entwickelten Modifikationen geeignet
ist, Peptidbibliotheken von ausreichender Qualität und Quantität herzustellen. Die SpotMethode stellt dabei ein hoch parallelisiertes Verfahren zur schnellen und einfachen Synthese
von Peptidbibliotheken dar. Die generelle Einsatzmöglichkeit in sämtlichen T-Zellanalysen soll
dabei uneingeschränkt möglich sein.
Für die Untersuchung der biologischen Zellverträglichkeit und ausreichenden Quantität der
Peptide werden zunächst MHC Klasse-II Analysen durchgeführt. Der Test ist mit den
bestehenden biologischen Möglichkeiten einfach auszuführen. Spezifische T-Zellinien sind
vorhanden und können stabil kultiviert und vermehrt werden. Für diese Analysen sind Peptide
mit freiem Carboxyterminus allerdings nicht zwingend erforderlich. Nach erfolgreichem
Abschluß dieser Tests wird die Methodik auf MHC Klasse-I TC-Zell Epitopanalysen übertragen.
Als Antigen wird der listerielle Virulenzfaktor Act A gewählt, da dieses Protein bereits zum Teil
immunologisch charakterisiert ist und deshalb mit relativ geringer Peptidzahl analysiert werden
kann. Da zur Zeit keine spezifischen CD 8 TC-Zellinien vorhanden sind, wird der Umweg über
die direkte Immunisierung von Mäusen mit rekombinantem Antigen-Protein beschritten. Die
spezifischen T-Zellen werden dann angereichert und aufbereitet für die TC-Zell Analysen
eingesetzt.
7.2
Zelluläre Analysen5
Die zellulären Analysen wurden nach etablierten Protokollen durchgeführt: die
Proliferationsanalyse nach [Darji et al. (1998)] und die Zytotoxizitätsanalysen nach [Matzinger
(1991)], falls nicht anders erwähnt in der Maus des Inzuchtstammes BALB/c.
7.2.1
Gewinnung der T-Zellen
CD 8 TC-Zellen: Nach in vivo Immunisierung einer Maus mit dem jeweiligen isolierten
rekombinanten Proteinantigen werden Makrophagen, B-Zellen und CD 4 T-Zellen mit Hilfe von
Dynabeads im Bestand reduziert und die CD 8 T-Zellen angereichert.
CD 4 TH-Zellen: Die TH-Zellinie entstammt einer transgenen Maus (TCR/HA), die spezifisch
Hemagglutinin HA 1 des Influenzavirus PR 8 erkennt [Caton et al. (1982)].
5
für die Durchführung der zellulären Analysen danke ich Frau Susanne zur Lage
Ergebnisse und Diskussion
7.2.2
71
Gewinnung der antigenpräsentierenden Zellen (APC)
MHC I: Als APCs werden Zellen der murinen Mastozytomzellinie P815, ATCC TIB 64
verwendet. Sie stammten aus BDA/2 Mäusen und exprimierten MHC Klasse-I Moleküle vom
H-2d Haplotyp.
MHC II: Diese APCs werden aus der Milz von BALB/c Mäusen gewonnen. Viele dieser
Milzzellen tragen neben Klasse-I auch Klasse-II Moleküle. Für die untersuchte T-Zellinie war
das I-Ed Molekül essentiell. Die APCs werden bestrahlt, um die Zellteilung einzuschränken. So
können nur die proliferierenden T-Zellen radioaktiv markiertes 3H Thymidin aus dem Medium
einbauen.
7.2.3
Bestimmung der Interleukin-2 (IL-2) Produktion
Zur Messung von IL-2 Induktion werden IL-2 abhängige Zellen der Zellinie CTL/L verwendet.
7.3
Beeinflussung der biologischen Testsysteme durch die Chemikalienbehandlung des Trägermaterials mit Hilfe einer Helfer-T-Zellanalyse
Die Peptide werden an Cellulose als Träger synthetisiert. Im Verlauf dieser Synthese wird der
Träger verschiedenen Chemikalien ausgesetzt. Reste dieser Chemikalien, sowie Bruchstücke der
verschiedenen Schutzgruppen können als Rückstände am Trägermaterial adsorbiert vorliegen.
Werden nun die Peptide mit 10 % DMSO in PBS-Puffer vom Träger eluiert, können diese
Chemikalienreste mit ausgewaschen werden. Zellen können sehr empfindlich auf diese
biologisch unverträglichen Verunreinigungen reagieren und eventuell absterben. Zunächst sollen
deshalb Eluate der Celluloseproben aus allen Synthesestufen, aber ohne das eigentliche Peptid,
auf ihre Zellverträglichkeit getestet werden.
Es werden Eluate der Celluloseproben getestet, die
a) noch keine Synthesestufen (Papier),
b) alle Syntheseschritte, wie Waschen, Kuppeln, Cappen, Abspalten der Seitenkette,
durchlaufen haben, ohne das auf ihnen ein Peptid synthetisiert wurde (Synthese),
c) alle Syntheseschritte wie in b) inklusive der Abspaltung mit TMA (TMA),
d) alle Syntheseschritte wie in b), Abspaltung mit TMA und Neutralisation in
Essigsäureatmosphäre (HAc)
durchlaufen haben.
Diese Celluloseproben aus den verschiedenen Kontrollstufen werden mit dem Elutionsgemisch
bestehend aus 10 % DMSO und PBS-Puffer pH = 7 behandelt.
Ergebnisse und Diskussion
7.3.1
72
Helfer T-Zell Analysen
TH-Zellen erkennen mit Hilfe ihres Rezeptors spezifische Antigenepitope, die von MHC KlasseII Molekülen der APCs präsentiert werden. Das Erkennen führt je nach Testsystem zur
Ausschüttung von IL-2 oder zur Proliferation von T-Zellen. Durch Quantifizieren der
Proliferation direkt (vergl. 7.4.1), oder indirekt über die IL-2 Ausschüttung (7.4.2), ist die
spezifische Erkennung von „APC-Peptid-T-Zelle“ detektierbar.
7.3.2
Untersuchung der Zellverträglichkeit und Peptidkonzentration durch eine Analyse
der Proliferation
Zu den Eluaten der verschiedenen Celluloseproben werden abgestufte Konzentrationen eines
Testpeptides des immunogenen Epitops vom Hemagglutinin (HA 1 des Influenzavirus PR 8)
gegeben [Caton et al. (1982)]. Zur Titration dieses Testpeptids werden: 10 µg/mL, 3 µg/mL,
1 µg/mL, 0,3 µg/mL und 0,1 µg/mL verwendet. Der Test wurde folgendermaßen durchgeführt:
Zum Eluat-Peptid-Gemisch werden antigenpräsentierende Zellen gegeben. Danach werden die
für das Testpeptid spezifisch reagierenden TH-Zellen hinzugefügt. Die Zugabe von radioaktiv
markiertem Thymidin (3H) ermöglicht eine anschließende Quantifizierung der durch das
Antigen stimulierten Zellteilung und somit der Vermehrung der TH-Zellen (Proliferation). Zur
Bestimmung des radioaktiven Hintergrundes wird eine Probe, die nur das Gemisch aus
Milzzellen und T-Zellen enthält, untersucht. Als Positivkontrolle dient eine Probe ohne
Celluloseeluat, aber mit Peptid, antigenpräsentierenden Zellen und TH-Zellen.
Ergebnisse und Diskussion
73
Proliferation der T-Helfer Zellen nach Präsentation des HAEpitops in verschiedenen Celluloseeluat-Titrationen
160000
[cpm]
140000
120000
Kontrolle
100000
a) Papier
80000
b) Synthese
60000
c) TMA
40000
d) HAc
20000
0
0,1
0,3
1
3
10
Konzentration des Peptids [µg/mL]
Abb. 7.1:
Proliferation der TH-Zellen nach Präsentation des HA-Epitops (Antigen) aus
verschiedenen Celluloseeluat-Titrationen, der Hintergrund wurde von allen
Meßwerten abgezogen (tabellarische Daten siehe A-11).
Bei gleicher Konzentration des als Antigen zugesetzten Peptids fällt auf, daß die Eluate der
Celluloseproben verschiedener Synthesestufen (Papier, Synthese, TMA und HAc) eine stark
unterschiedliche Tendenz bei der Stimulation der T-Zellen zur Proliferation bzw.
Zellverträglichkeit aufweisen. Ab einer Peptidkonzentration von ca. 1 µg/mL ist ein Plateaueffekt, also eine Sättigung zu beobachten. Je niedriger dieses Plateau ist, desto gravierender ist
die Beeinflussung der T-Zellen durch Verunreinigungen der Synthesestufen. Die Reaktivität der
T-Zellen mit dem Eluat der mit Essigsäure behandelten Cellulose ist etwa auf 50 % verringert,
während die Werte der anderen Proben vergleichbar sind. In den folgenden T-Zell Epitopanalysen wurde deshalb auf den Neutralisationsschritt verzichtet. Um Meßwerte zu erzielen, die
sich deutlich vom Hintergrund absetzen, sollte die Konzentration des eingesetzten Peptids
mindestens 1 µg/mL betragen.
7.4
Etablierung eines Testsystems
Nachdem die Zellverträglichkeit der Eluate verschieden behandelter Celluloseträger geprüft
wurde, soll nun die Qualität und Verträglichkeit der mit der Spot-Methode synthetisierten
Bibliothek geprüft werden. Das aus der Literatur bekannte Epitop von Hemagglutinin HA 1
[Caton et al. (1982)] soll dabei evaluiert werden. Die Proteinsequenz wird hierfür in Peptide von
Ergebnisse und Diskussion
74
je 15 Aminosäuren geteilt, die jeweils um 3 Aminosäuren versetzt sind. Daraus ergibt sich eine
Bibliothek von 96 einzelnen Peptiden, die sich über die gesamte Länge der Hemagglutininsequenz erstrecken.
$$$$'$'7,&,*<+$1167'79'79/(.19797+691//('6+1*./&5/.*,
$'$'7,&,*<+$116
'7,&,*<+$1167'7
&,*<+$1167'79'7
<+$1167'79'79/(
1167'79'79/(.19
7'79'79/(.19797
9'79/(.19797+69
9/(.19797+691//
.19797+691//('6
797+691//('6+1*
+691//('6+1*./&
1//('6+1*./&5/.
('6+1*./&5/.*,
+1*./&5/.*,
Abb. 7.2:
Beispiele der Proteinsequenz mit jeweils um 12 Aminosäuren überlappenden
Peptiden einer Länge von 15 Aminosäuren.
Die Bibliothek wird mit der Spot-Methode auf Cellulose als Träger synthetisiert. Dabei wird die
erste Aminosäure durch Aktivierung mit CDI auf den Hydroxygruppen des Trägers verestert.
Der Aufbau der Peptidkette erfolgt nach dem etablierten Protokoll durch DIC/HOBt
Aktivierung. Nach Abspalten der Seitenkettenschutzgruppen wird die Bibliothek mit TMA in
der Gasphase behandelt. Dadurch werden die Esterbindungen zwischen Peptid und Träger
gespalten. Durch Auseinanderschneiden der Spots können die Peptide der Bibliothek in
Mikrotiterplatten separiert werden. Danach werden die Peptide einzeln mit 10 % DMSO in
PBS-Puffer pH = 7 eluiert.
7.4.1
Die Proliferationsanalyse (TH-Zellen, MHC Klasse-II)
Die Aktivierung von TH-Zellen über den Komplex „APC-Antigen T-Zell Rezeptor“, bei
gleichzeitiger Costimulation über CD 4, hat die Teilung und Vermehrung der TH-Zellen zur
Folge. In Gegenwart von 3H Thymidin wird dieses während der Replikation in die DNA der THZellen eingebaut. Über die Bestimmung des radioaktiven Zerfalls kann auf die Proliferation
geschlossen werden. Je höher der gemessene radioaktive Zerfall ist, desto stärker proliferieren
die TH-Zellen in Gegenwart des Antigens.
Ergebnisse und Diskussion
75
Für eine Proliferationsanalyse werden in vitro zu den Hemagglutinin HA spezifischen TH-Zellen
bestrahlte antigenpräsentierende Zellen und die einzelnen Peptide der Bibliothek gegeben. Nach
vier Tagen Inkubation wird radioaktiv markiertes Thymidin zugesetzt. Werden die TH-Zellen
selektiv stimuliert, teilen sie sich und bauen das radioaktiv markierte Thymidin in die DNA ein.
Nach 18 Stunden wird die DNA auf Filtermatten geerntet und im -Szintillationszähler
ausgewertet. Der gemessene radioaktive Zerfall ist proportional zu der Proliferation der THZellen.
Proliferationsamalyse mit HA spezifischen T-Helfer-Zellen
70000
60000
[cpm]
50000
40000
30000
20000
10000
0
1
5
9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 89 93
Peptid
Abb. 7.3:
Ergebnisse der Proliferation nach Inkubation von HA 1 spezifischen TH-Zellen
mit antigenpräsentierenden Zellen und den Peptiden der Bibliothek (tabellarische
Daten siehe A-12).
Die Proliferationsanalyse zeigt bei Peptid 38 den stärksten radioaktiven Zerfall (100 %). Hier
wurde eindeutig am meisten radioaktiv markiertes Thymidin in die DNA eingebaut. Das Peptid
zeigt also die stärkste antigene Wirkung und bewirkt damit die größte Stimulation der T-Zellen
zur Proliferation. Peptid 39, die nachfolgende überlappende Sequenz, stimuliert mit 32 %
wesentlich geringer. Die Sequenzen 13, 63 und 64 liegen oberhalb des Hintergrundrauschens
von 1400 cpm. Peptid 13 stimuliert nur zu 13 %, Peptid 63 stimuliert nur zu 15 % die TH-Zelle
zur Proliferation im Vergleich zu Peptid 38.
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 7.1:
Peptid Nr.
13
38
39
63
64
76
Sequenzdaten der Peptide, die eine starke Proliferation stimulieren.
Proliferation [cpm]
Sequenz
NLLEDSHNGKLCRLK
7891
SSVSSFERFEIFPKE
60533
SSFERFEIFPKESSW
19488
HPSNSKDQQNIYQNE
9322
NSKDQQNIYQNENAY
9152
Im Vergleich der Sequenzen ergibt sich:
Peptid 38 und Peptid 39 sind aufeinander folgende Sequenzen aus der Bibliothek, die um drei
Aminosäuren verschoben sind. Die Homologie ist hoch und damit auch die Stimulation der
Proliferation. Das aus der Literatur bekannte Epitop von Hemagglutinin HA 1 [Caton et al.
(1982)] der Sequenz SSFERFEIFPK ist in beiden Peptiden zu finden. In Peptid 39, im
Vergleich zu Peptid 38, liegt diese Sequenz jedoch am N-terminalen Ende des Peptids.
Um die obigen Ergebnisse zu bestätigen wird ein Interleukin-2 Test durchgeführt.
7.4.2
Interleukin-2 Test (TH-Zellen, MHC Klasse-II)
In einem Interleukin-2 Test wird die Produktion des die Zellteilung anregenden Wachstumsfaktors IL-2 gemessen, der bei selektiver Erkennung von „APC-Peptid T-Zelle“ ausgeschüttet
wird.
Für einen IL-2 Test werden zu den Hemagglutinin HA spezifischen TH-Zellen antigenpräsentierende Zellen gegeben. Die einzelnen Peptide der Bibliothek werden zugesetzt und 24
Stunden inkubiert, so wie bereits für die Proliferationsanalyse beschrieben. Danach wird ein Teil
des Überstandes mit IL-2 abhängigen Zellen versetzt. Nach 36 stündiger Inkubation wird
radioaktiv markiertes Thymidin zugesetzt und für weitere 18 Stunden inkubiert. Die Zellen
werden dann auf Filtermatten geerntet und im -Szintillationszähler ausgewertet. Der
gemessene radioaktive Zerfall ist proportional zur Proliferation der IL-2 abhängigen Zellen.
Ergebnisse und Diskussion
77
IL-2 Analyse-HA spezifische T-Helfer-Zellen
200000
180000
160000
[cpm]
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
1
5
9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 89 93
Peptide
Abb. 7.4:
Ergebnisse des IL-2 Tests nach Inkubation von HA spezifischen TH-Zellen,
APC und den Peptiden der Bibliothek, Messung der Proliferation nach Zugabe
von Interleukin-2 abhängigen Zellen (tabellarische Daten siehe A-12).
Auch im Interleukin-2 Test wird die antigen wirkende Sequenz SSFERFEIFPK in den Peptiden
38 und 39 erkannt. Peptid 13 zeigt in dieser Untersuchung keine Stimulation, die Peptide 63 und
64 werden auch in diesem Interleukin-2 Test erkannt. Da Peptid 13 hier keine Proliferation
stimuliert, soll es als Artefakt betrachtet und nicht weiter untersucht werden.
Für MHC Klasse-II Moleküle ist kein generelles Bindungsmuster bekannt. Dennoch sollen die
Ähnlichkeiten der Peptidsequenzen, die eine Proliferation stimulieren, beschrieben werden.
38
39
63
64
S S V S
S
H P S N
N
S
S
S
S
F
F
K
K
E
E
D
D
R
R
Q
Q
F
F
Q
Q
E
E
N
N
I
I
I
I
F
F
Y
Y
P
P
Q
Q
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
K
K
N
N
Abb. 7.5:
E
E S S W
E
E N A Y
12
n = Position
Alignment der Sequenzen, die eine Proliferation der TH-Zelle auslösen.
Ergebnisse und Diskussion
78
Die Enden des Peptids binden nicht an das MHC Klasse-II Molekül. Das Peptid liegt statt
dessen in gestreckter Konformation längs in der MHC Klasse-II Bindungsfurche. Dort wird es
auf zweifache Weise fixiert. Das Peptidrückgrat wird von Seitengruppen konservierter Regionen
des MHC gebunden. Außerdem ragen einige Aminosäureseitenketten tief in Taschen hinein, die
je nach MHC Molekül unterschiedlich ausgestattet sind. Beim Alignment der Peptide stehen die
hydrophoben Aminosäuren an Position 9 (Y, F). Die Positionen 12, 8 und 2 zeigen konkrete
Übereinstimmungen (E, I und S). An Position 4 ist bei allen Peptiden eine negativ geladene
Aminosäure (D, E) zu erkennen. Die Positionen 7, 6, 5, 3 und 1 zeigen nicht so deutliche
Übereinstimmungen.
7.4.3
Zusammenfassung MHC Klasse-II
Die Zellverträglichkeit der synthetisierten Peptidsequenzen der Bibliothek konnte bestätigt
werden. Die Modifikationen wie Veresterung am C-Terminus und Abspaltung in TMAAtmosphäre haben keinen wesentlichen Einfluß auf die gute Qualität der mit der Spot-Synthese
hergestellten Peptide. Das aus der Literatur bekannte Epitop von Hemagglutinin HA 1 [Caton
et al. (1982)] der Sequenz SSFERFEIFPK kann sowohl durch Proliferations- als auch
Interleukin-2 Analyse der synthetisierten Peptide bestätigt werden. Somit stellt die hier
entwickelte parallele Methode eine Alternative zu konventionellen Methoden dar [Maeji et al.
(1990) und Adler et al. (1994)].
Bei MHC Klasse-II abhängigen TH-Zell Epitopen spielen die Enden der Peptide keine Rolle. Sie
hängen über den Rezeptor hinaus und greifen nicht wesentlich in das Bindungsverhalten ein.
Bisher konnte gezeigt werden, daß die synthetisierten Peptide von biologisch gut verträglicher
Qualität sind. Die Analysen zeigten nicht, ob die C-terminalen Enden des Peptidstranges auch
als freie Säuren vorliegen und auch als solche erkannt werden.
7.4.4
Cytotoxische-Analysen (TC-Zellen, MHC Klasse-I)
Für MHC Klasse-I abhängige TC-Zellen spielt die Erkennung der nicht modifizierten C- und NTermini eine wichtige Rolle. Sie trägt wesentlich zur spezifischen Erkennung der Epitope und
der Bindung am Rezeptor der antigenpräsentierenden Zelle bei.
Zellen, die mit Viren oder im Cytosol lebenden Bakterien infiziert sind, werden durch
cytotoxische T-Zellen vernichtet. Die Antigen-Peptide werden durch MHC Klasse-I Moleküle
auf der Oberfläche von APCs präsentiert und von dem Rezeptor der cytotoxischen T-Zellen
(TCR) erkannt. Die Antigenerkennung induziert in den T-Zellen Signale, die dazu führen, daß
die T-Zellen ihr cytotoxisches Potential gegen die Zielzellen einsetzen. Die DNA der Zielzelle
Ergebnisse und Diskussion
79
ist radioaktiv markiert. Nach dem Angriff durch eine cytotoxische T-Zelle wird die DNA der
Zielzelle durch Apoptose schnell fragmentiert. Die entstandenen DNA-Fragmente werden beim
Ernten der Zellen nicht mehr von einem Filter zurückgehalten. Je effizienter die Zielzellen
getötet werden, desto niedriger ist die verbleibende radioaktive Aktivität auf den Filtermatten.
Als Vergleich dient eine Positivkontrolle, bei der nur die radioaktiv markierten Zielzellen und
die cytotoxischen T-Zellen ohne Peptid vermessen werden.
Das bindende Epitop des Irp A Proteins (internalin-related Protein aus Listeria monocytogenes)
ist bekannt [Darji et al. (2000) pers. Mitteilung]. Es ist ein Octamer der Sequenzpositionen 271278. Das bindende Epitop des Act A Proteins (aus Listeria monocytogenes) ist bisher
unbekannt. Als Test für cytotoxische Aktivität wurde der „JAM Assay“ nach Matzinger
verwendet [Matzinger (1991)].
7.4.4.1 Spezifische Lyse nach Irp A Immunisierung
Erster Versuch zu Irp A
Zur Darstellung spezifischer T-Zellen wird eine Maus durch intraperitoneale Injektion mit dem
Irp A Protein immunisiert. Als Zusätze werden Listeriolysin (LLO), das die Zellwände perforiert
und dadurch das Protein in den MHC Klasse-I Prozessierungsweg eingeschleust, und
incomplete Freund´s Adjuvant, ein Depotstoff, der verstärkend auf die Immunantwort wirken
soll, dem Protein beigemischt. Aus der Milz der Maus werden mit Hilfe von Dynabeads nach
neun Tagen die spezifischen CD 8 TC-Zellen angereichert. Die antigenpräsentierenden Zellen
werden mit den Peptiden der Bibliothek für 30 min inkubiert. Danach werden die spezifischen
TC-Zellen dazugegeben und vier Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen werden dann auf
Filtermatten geerntet. Als Kontrolle werden die radioaktiv markierten antigenpräsentierenden
Zellen mit den T-Zellen ohne Peptid inkubiert. Der radioaktive Zerfall des 3H Thymidins der
Kontrolle und der auf Filtermatten geernteten Bibliothek werden gemessen. Die Kontrolle
(Positivkontrolle) dient als Referenzwert ohne Lyse. Die prozentuelle Relation von Positivkontrolle und Meßwerten der Bibliothek wird als % Lyse angegeben.
Es konnten keine spezifischen T C-Zellen gewonnen werden. Auch nach Zugabe des
immunogenen Irp A Peptids fand keine Lyse statt.
Zweiter Versuch zu Irp A
Einer Maus wird die Milz entnommen. Zu den bestrahlten Zellen wird das bekannte
immunogene Irp A Peptid gemischt. Nach vier Stunden Inkubation werden die Zellen
gewaschen und in eine zweite Maus injiziert. Nach neun Tagen wird deren Milz entnommen
und daraus mit Hilfe von Dynabeads die spezifischen CD 8 TC-Zellen angereichert. Die 3H
Thymidin markierten Zielzellen werden mit den Peptiden der Bibliothek für 30 min inkubiert.
Danach werden die spezifischen TC-Zellen zugefügt und vier Stunden bei 37°C inkubiert. Die
Zellen werden dann auf Filtermatten geerntet. Die Bestimmung der % Lyse erfolgt wie in
Versuch 1.
Ergebnisse und Diskussion
80
Auch aus diesem Versuch konnten keine spezifischen TC-Zellen gewonnen werden. Die
Bestätigung des bekannten bindenden Epitops durch Synthese der Peptide mit der Spot-Methode
wird in zukünftigen Versuchen durchgeführt.
7.4.4.2 Spezifische Lyse nach Act A Immunisierung
Das Act A Protein wird mit LLO und incomplete Freund´s Adjuvant in eine Maus injiziert.
Nach neun Tagen wird die Milz entnommen und mit Dynabeads die spezifischen CD 8 TCZellen angereichert. Die 3H Thymidin markierten Zielzellen werden mit den Peptiden der
Bibliothek für 30 min inkubiert. Danach werden die spezifischen TC-Zellen dazugegeben und
vier Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen werden dann auf Filtermatten geerntet und die
prozentuelle Lyse wird wie für Irp A beschrieben bestimmt.
Cytotoxische Analyse mit Act A Peptiden
45
spezifische Lyse [%]
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1
8
15
22
29
36
43
50
57
64
71
78
85
92
99 106 113 120 127 134
Peptide
Abb. 7.6:
Cytotoxische Analyse mit Act A Peptiden der durch die Spot-Methode erzeugten
Bibliothek (tabellarische Daten siehe A-13).
Durch die Immunisierung mit dem Act A Protein konnten keine monoklonalen TC-Zellen
erzeugt werden. Wie aus dem bereichsweise gehäuften Auftreten von Lyse an den Positionen
86-96 bzw. 127-132 zu sehen ist, handelt es sich vermutlich um polyklonale TC-Zellen, die im
wesentlichen den C-terminalen Bereich des Proteins erkennen. Das zur Immunisierung
verwendete Protein weist möglicherweise viele Epitope auf. Weitere Versuche sind für die
Zukunft geplant.
Ergebnisse und Diskussion
81
8.
DNA-Wirkstoffinteraktion
8.1
Darstellung von Polyamidketten aus verschiedenen aromatischen
Aminocarbonsäurebausteinen
Zur Darstellung großer Peptidbibliotheken stellt die Spot-Methode ein etabliertes Verfahren dar
(vgl. 2.2.1.2). Die Synthese von Amidbindungen zwischen -Aminocarbonsäuren gelingt auch
unter den besonderen Bedingungen des offenen Reaktorsystems der Spot-Methode problemlos.
Die bislang synthetisierten Bibliotheken basierten alle auf der Substanzklasse der Peptide. Diese
können immobilisiert oder als lösliche Peptide mit verschiedenen biologischen Targets
untersucht werden. Um das Repertoire der mit der Spot-Methode synthetisierbaren Bibliotheken
auf andere Stoffklassen auszudehnen, werden neue Grundbausteine in das Syntheseprinzip
einbezogen.
Die Knüpfung von Amidbindungen stellt unter den Bedingungen der Spot-Synthese ein
etabliertes Verfahren dar. Trotz des Einflusses der Luftfeuchtigkeit und der kurzen Reaktionszeiten lassen sich sehr gute Ausbeuten erzielen. Eine Amidbindung ist stabil und läßt sich mit
vielen in situ Aktivierungsreagenzien auch in kurzer Zeit knüpfen. Eine große Anzahl
verschiedener Aktivierungsreagenzien wurde zur Initiierung dieser Bindung, hauptsächlich für
die Peptidsynthese, hergestellt. Darauf abgestimmte Schutzgruppenstrategien des N-Terminus
und der Seitenketten wurden entwickelt. Zur Erweiterung des Bibliothekenrepertoires und der
Einbeziehung neuer Bausteine wird eine Stoffklasse artifizieller Aminocarbonsäuren untersucht,
die ebenfalls über Amidbindungen verknüpft werden kann. Mit der Erweiterung der SpotSynthese auf andere Stoffklassen kann so der Zugang zu neuen biologischen Targets ermöglicht
werden.
Die natürlichen Antibiotika Distamycin und Netropsin binden an doppelsträngige DNA
(vgl. 4.2). Ihre Wirkung ist antiviral und zytostatisch. Sie stellen eine einfache Substanzklasse
dar, bei der aromatische Aminocarbonsäuren über Amidbindungen verknüpft sind. Im
Gegensatz zu den natürlichen Aminosäuren sind es keine aliphatischen -Aminosäuren, sondern
aromatische bzw. heteroaromatische Aminocarbonsäuren. Die Reaktivität und Stabilität der
Amino- und der Carboxyfunktion sind nicht so groß wie bei aliphatischen Aminen. Bei der
Untersuchung doppelsträngiger DNA als Target steht die Entwicklung sequenzspezifischer
Binder im Mittelpunkt. Ihre Anwendung liegt im Bereich der Therapeutikaentwicklung, bietet
aber auch die Möglichkeit zur Entwicklung von neuen Screening-Methoden zur DNAErkennung.
Ergebnisse und Diskussion
8.2
82
Wahl der Bausteine
Angelehnt an die strukturellen Motive von Distamycin und Netropsin werden verschiedene
Bausteine mit der Fähigkeit an DNA zu binden untersucht. Die Wahl der Bausteine wird
motiviert von der Ähnlichkeit zu Motiven der natürlichen DNA-bindenden Wirkstoffe und
davon, daß sie als Ausgangssubstanzen für die Polyamidsynthesen kommerziell erhältlich sind.
Ausgewählt wurden:
- 2-Amino-4-thiazolessigsäure (1)
- 3-Aminopyrazol-4-carbonsäure (2)
- 3-Aminopyrazin-2-carbonsäure (3)
- 2-Aminobenzoesäure (4-2)
- 3-Aminobenzoesäure (4-3)
- 4-Aminobenzoesäure (4-4)
- 3-Amino-1H-124-triazol-5-carbonsäure (5)
- 2-Aminonicotinsäure (6-2)
- 6-Aminonicotinsäure (6-6)
- Methyl-5-amino-2-furoat (7)
- 3-Aminothiophen-2-carbonsäuremethylester (8)
- Ethyl-5-amino-1-methylpyrazol-4-carboxylat (9)
- (S)-Indolin-2-carbonsäure (10)
- 2-Amino-6-fluorbenzoesäure (11)
- Ethyl-2-amino-4-phenyl-thiazol-5-carboxylat (12)
- 1,2,3,4-Tetrahydro-3-isochinolincarbonsäure (13)
Die Bausteine 4-Amino-1-methylpyrrol-2-carbonsäure (Py) und 4-Amino-N-methylimidazol-2carbonsäure (Im) (vgl. Abb. 4.3), aus denen die natürlichen DNA-bindenden Antibiotika
Netropsin und Distamycin aufgebaut sind, sind nicht kommerziell erhältlich.
Ergebnisse und Diskussion
83
O
HO
N
HO
NH2
N
O
1
O
NH2
N
N
HO
HO
N
N
N
N
H
S
HO
O
HO
O
NH2
H2N
N
3
2
O
NH2
4
NH2
5
6
O
OMe
OMe
NH2
O
S
O
O
EtO
NH2
H2N
N
O
7
9
8
N
OH
N
H
CH3
F
OH
NH2
O
10
11
O
OH
N
NH
EtO
S
O
Abb. 8.1:
NH2
12
13
Die verschiedenen Bausteine.
Zur Vorselektion von Bausteinen, die mit DNA interagieren, wird die „dünnschichtchromatographische Detektionsmethode für DNA-Ligand Wechselwirkungen“, entwickelt am
Hans-Knöll-Institut Jena [Maul (1997)], eingesetzt. Die DNA-Baustein Interaktion wird dabei
unter physiologischen Bedingungen untersucht. So können schon monomere Bausteine erkannt
werden, die zu einer Interaktion mit der DNA in der Lage sind. Sie stellen besonders
interessante Bausteine für die anschließende gezielte Polyamidbildung dar.
Auf einer wasserbenetzbaren Kieselgelplatte werden an zwei horizontal auf einer Linie
liegenden punktförmigen Startflecken die in Methanol gelösten Monomere aufgetragen.
Oberhalb der einen Probe wird homogenisierte Lachssperma-DNA appliziert. Die DNA liegt
dabei in kleine Fragmente zerteilt, aber noch immer als Doppelstrang vor. In einem
Laufmittelgemisch aus Methanol und wäßriger Ammoniumacetat-Lösung (1M) im Verhältnis
4:1 wird die Dünnschichtkarte entwickelt. Über den Rf-Wert (retention factor) werden die
Wanderungsgeschwindigkeiten der Substanzen nach bzw. ohne das Passieren der DNA
verglichen. Die DNA bleibt beim Entwickeln der Dünnschichtkarte mit dem beschriebenen
Laufmittelgemisch lokal fixiert. Ändert sich der Rf-Wert der Probe, deutet dies auf eine
Interaktion mit der DNA hin. Die Interaktion, die in den meisten Fällen nur eine temporäre
Bindung des wandernden Bausteines bewirkt, kann verschiedener Art sein: Anlagerung in die
kleine oder große Furche, „Outside“-Komplexe am Phosphatrückgrat, oder Interkalation
zwischen zwei Basenpaare.
Ergebnisse und Diskussion
Vergleich der Rf-Werte der monomeren Bausteine.
ohne DNA
mit DNA
Rf-Wert
Baustein
Rf-Wert
0,70
0,70
2-Amino-4-thiazolessigsäure (1)
0,98
0,98
3-Aminopyrazol-4-carbonsäure (2)
0,61
0,61
3-Aminopyrazin-2-carbonsäure (3)
0,78
0,76
2-Aminobenzoesäure (4-2)
0,85
0,85
3-Aminobenzoesäure (4-3)
0,87
0,87
4-Aminobenzoesäure (4-4)
0,54
0,48
3-Amino-1H-124-triazol-5-carbonsäure (5)
0,67
0,65
2-Aminonicotinsäure (6-2)
0,70
0,70
6-Aminonicotinsäure (6-6)
0,87
0,87
Methyl-5-amino-2-furoat (7)
0,76
0,76
3-Aminothiophen-2-carbonsäuremethylester (8)
0,87
0,87
Ethyl-5-amino-1-methylpyrazol-4-carboxylat (9)
0,76
0,76
(S)-Indolin-2-carbonsäure (10)
0,85
0,85
2-Amino-6-fluorbenzoesäure (11)
0,67
0,69
Ethyl-2-amino-4-phenyl-thiazol-5-carboxylat (12)
0,70
0,70
1,2,3,4-Tetrahydro-3-isochinolincarbonsäure (13)
84
Tab. 8.1:
Rf-Wert
0,02
0,06
0,02
-
Bei drei Bausteinen hat sich der Rf-Wert durch Wechselwirkungen mit der DNA verringert.
Auch eine solche geringe Änderung des Rf-Wertes ist signifikant [Maul (1997)]. Interaktionen
mit der DNA zeigen die Bausteine 2-Aminobenzoesäure (4-2), 3-Amino-1H-1,2,4-triazol-5carbonsäure (5) und 2-Aminonicotinsäure (6-2). Da diese Bausteine bereits als Monomere
Wechselwirkungen mit der DNA zeigen, stellen sie für die Synthese der Polyamide besonders
interessante Kandidaten dar.
8.3
Schutzgruppenstrategien
Zur definierten kombinatorischen Festphasensynthese werden die Bausteine mit Schutzgruppen
versehen. Für die Synthese von Peptidbindungen sind mehrere Schutzgruppenstrategien
entwickelt worden. In der routinemäßigen Anwendung werden hautsächlich BOC und Fmoc als
N-terminale Schutzgruppen eingesetzt. Diese Schutzgruppen sind mit beinahe allen
Aktivierungsmethoden kompatibel. BOC-Schutzgruppen können nur durch starke Säuren
gespalten werden. Um die DNA-bindenden Polyamide keinem Hydrolyserisiko auszusetzen,
wird die Fmoc-Schutzgruppenstrategie bevorzugt. Sie erlaubt eine mild basische Entschützung
und ermöglicht die direkte photometrische Quantifizierung nach jedem Verknüpfungsschritt
über die abgespaltene Schutzgruppe als Diketopiperazin-Addukt bei 301 nm. Diese
Schutzgruppenstrategie konnte erfolgreich in der Spot-Methode zur Synthese von Peptiden
eingesetzt werden.
Ergebnisse und Diskussion
8.3.1
85
BOC-Strategie
Für die Festphasensynthese von Pyrrol- und Imidazol-Polyamiden werden in der Literatur drei
Schutzgruppenstrategien beschrieben. Die Aminocarbonsäuren von N-Methylpyrrol (Py) und NMethylimidazol (Im) sind durch Festphasensynthese zu Polyamiden verknüpfbar [Baird et al.
(1996)]. Dabei werden die Bausteine als BOC-Derivate geschützt.
O
Cl
N
CCl3
HNO3
HCl
H2N
O2N
O2N
CCl3 NaOMe/MeOH
N
N
O
O
BOCHN
Na2CO3,
OMe BOC-Anhydride
N
O
Abb. 8.2:
OMe
NaOH, MeOH, Wasser
H2, Pd/C
HCl
BOCHN
OH DCC/HOBt
N
O
DMF
OBt
N
O
Synthese des geschützten Bausteins BOC-Py.
Die Kupplung der Monomere erfolgt in einer geschlossenen Syntheseapparatur durch
DCC/HOBt-Aktivierung in DMF bzw. DCM. In der automatisierten Synthese werden
Kopplungszyklen von bis zu 180 Minuten durchgeführt. Dabei ist für die Verknüpfung von
Pyrrol- auf Imidazolaminocarbonsäuren der Zusatz von DMAP als Katalysator notwendig. In
der automatischen Synthese wird zur Vervollständigung der Reaktion der Synthesezyklus
nochmals ausgeführt.
Eine kombinatorische Darstellung von Substanzen, die an doppelsträngige DNA in der kleinen
Furche binden, wurde auch auf der Basis von Aminomethylbenzoesäuren oder
Aminomethylnicotinsäuren entwickelt [Behrens et al. (1998)]. Auch hier werden die Bausteine
BOC geschützt. Die beschriebenen Reaktionszeiten betragen 30 Minuten bis 40 Minuten, bei
Kopplung der Bausteine als Aktivester unter Basenkatalyse. Bei dieser Synthesestrategie werden
jedoch keine aromatischen Aminocarbonsäuren, sondern vorwiegend
Aminomethylbenzoesäuren und ähnliche Verbindungen eingesetzt.
Ergebnisse und Diskussion
86
8.3.1.1 Einführung der BOC-Schutzgruppe
Zusätzlich zu den Fmoc geschützten Derivaten werden BOC geschützte Derivate hergestellt, um
sterisch anspruchslosere geschützte Verbindungen zur Verfügung zu haben. Die BOC-Schutzgruppe wird als BOC-Anhydrid unter Basenzusatz in Dioxan eingeführt. Erfolgreich geschützt
werden konnten: 2-Aminobenzoesäure (4-2), 3-Aminobenzoesäure (4-3). Die Ausbeuten
betrugen durchschnittlich 80 %.
8.3.2 Fmoc-Strategie
Der Fmoc geschützte Baustein Fmoc-Py wurde zur festphasengestützten Synthese von kleinen
Py-Trimeren genutzt [Vázquez et al. (1999)]. Die Darstellung des Bausteins erfolgte dabei von
N-Methylpyrrolcarbonsäure durch Nitrierung, Reduktion und anschließendem Schutz der
Aminofunktion mit Fmoc. Die Kopplung der Fmoc geschützten Bausteine erfolgte nach
Aktivierung durch HBTU/HOBt/DIEA in NMP innerhalb von drei Stunden. Es wird eine
Wiederfindungsrate von 46 % beschrieben.
8.3.2.1 Einführung der Fmoc-Schutzgruppe
Die Fmoc-Schutzgruppe läßt die Überprüfung jedes Reaktionsschrittes durch Quantifizierung
des Dibenzofulven-Piperidin Adduktes zu. Sie wird als 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid
(Fmoc-Cl) unter Basenkatalyse in Dioxan als Lösemittel eingeführt. Dabei konnten die Aminocarbonsäuren: 3-Aminopyrazol-4-carbonsäure (2) und 3-Aminobenzoesäure (4-3) erfolgreich
geschützt werden. Die Ausbeuten der Reaktionen waren gering und betrugen zwischen 40 %
und 50 %.
Bei 3-Aminopyrazol-4-carbonsäure (2) kann die Position der Fmoc-Schutzgruppe mit Hilfe von
NMR Untersuchungen nicht mit eindeutiger Sicherheit bestimmt werden. Es sind zwei
Positionen denkbar: am Stickstoffatom des aromatischen Pyrazolringes oder am 3-Aminosubstituenten. Die Überprüfung der “long range” Korrelation 13C-1H ergab kein Signal. Die
Untersuchung der chemischen Verschiebung des aromatischen CH Protons deutet tendenziell
eher darauf hin, daß sich die Schutzgruppe nicht am Stickstoff des 3-Aminosubstituenten
befindet. Eine Verschiebung von 0,7 ppm zum tieferen Feld kann durch den Einfluß einer
Carbonylfunktion in ortho-Stellung bedingt sein. Als Vergleich wurde hier jedoch das
Inkrementsystem zur Abschätzung der chemischen Verschiebung von Benzol-Protonen
herangezogen. Eine eindeutige Übertragung auf Fünfringheterozyklen ist jedoch nicht möglich.
Die aus dem dünnschichtchromatographischen Wechselwirkungstest hervorgegangenen
Bausteine 2-Aminobenzoesäure (4-2), 3-Amino-1H-1,2,4-triazol-5-carbonsäure (5) und 2Aminonicotinsäure (6-2) konnten unter diesen Bedingungen nicht erfolgreich geschützt werden.
Ergebnisse und Diskussion
8.3.3
87
Reduktion von Nitrogruppen
Eine andere einfache Strategie zur gezielten Verknüpfung der Monomere kann ganz auf Schutzgruppenstrategien verzichten. Hierbei werden die Bausteine als Nitrocarbonsäuren eingesetzt
[König et al. (1998)]. Zur Darstellung der Bausteine sind weniger Syntheseschritte notwendig
als zur Darstellung von BOC-Py bzw Fmoc-Py. Die Nitrogruppe kann nicht mit der Carboxylgruppe reagieren, daher ist kein Schutz der funktionellen Gruppen notwendig. Nach Kopplung
des Bausteins kann durch Reduktion der Nitrogruppe mit Palladium und Ammoniumacetat die
Aminogruppe erzeugt werden. Sie steht so für die weitere Verknüpfung zu Polyamiden zur
Verfügung. Die Kopplungszeiten der heterozyklischen Aminocarbonsäuren in DMF in einem
geschlossenen Reaktor betragen 12 Stunden bei Aktivierung mit DCC/HOBt.
Die Strategie der Verknüpfung von Nitrocarbonsäuren soll auf Cellulose übertragen werden.
Dabei werden die Nitrocarbonsäuren an den aminofunktionalisierten bzw. Hydroxygruppen
tragenden Träger gebunden. Danach wird elementares Palladium an der Oberfläche des Trägers
abgeschieden. Durch Zusatz von Ammoniumformiat soll die Nitrogruppe reduziert werden.
Jedoch konnte die Reduktion der Nitrobenzoesäure an Cellulose nach dieser Methode bislang
nicht erfolgreich durchgeführt werden. Es ist fraglich, ob die bei König beschriebenen langen
Kopplungszeiten durch andere Aktivierungsreagenzien oder -maßnahmen an die Bedingungen
der Spot-Methode angepaßt werden können [König et al. (1998)].
8.4 Aktivierungsstrategien
Durch das schnelle Verdampfen des Lösemittels liegt die durchschnittliche Reaktionszeit der
Spot-Methode für DMF als Lösemittel bei ca. 20 Minuten. Um bessere Kopplungsausbeuten
erzielen zu können, wird die Reaktionszeit durch dreifaches Auftragen der aktivierten
Substanzen auf ca. 45 Minuten gesteigert. Das Prinzip der dreifachen Auftragung wird in allen
folgenden Experimenten angewandt.
Die Veresterung der Bausteine direkt an den Hydroxygruppen der Cellulose kann, durch
Aktivierung mit CDI nach etabliertem Protokoll, in guten Ausbeuten von ca. 600 nmol/cm²
durchgeführt werden.
Zur Bildung der Amidbindungen zwischen den geschützten Bausteinen und anderen Aminofunktionen werden die Aktivierungsreagenzien PyBOP/DIEA, TBTU/DIEA, TFFH/DIEA oder
DIC/HOBt eingesetzt. Die Reaktivität der Aktivierung nimmt dabei in der Reihenfolge von
TFFH > TBTU > PyBOP > DIC/HOBt ab [Chan et al. (2000)]. TFFH reagiert als in situ
Fluorierungsreagenz, die anderen Aktivierungsreagenzien formen Aktivester.
Ergebnisse und Diskussion
88
OH
N
N
N
N
N
DIC / HO Bt
O
N
+
BF 4 -
N
N
O
N
C
OH
+
N
N
+
O
NH 2
FmocNH
H
N
T BT U / DIEA
N
PF 6 -
P
O
+
N
N
N
FmocNH
N
N
N
PyBO P / DIEA
N
F
N
+
BF 4 -
N
T FFH / DIEA
Abb. 8.3:
8.5
Aktivierungsmethoden zur Bildung der Amidbindung.
Die Quantifizierung
Die Quantifizierung der Kopplungsausbeuten wird photometrisch über die Adsorption des
Dibenzofulven-Piperidin Adduktes in 20 % Piperidin in DMF (vgl. 2.5) bei 301 nm bestimmt.
Zur Überprüfung der vollständigen Entschützung unter den gewählten Bedingungen wird eine
Abspaltkinetik aufgenommen. Dabei konnte festgestellt werden, daß die Halbwertszeit der
Fmoc-Schutzgruppe von Fmoc-3-Aminobenzoesäure in 20 % Piperidin in DMF ca.
20 Sekunden beträgt. Die Entschützung sollte innerhalb der gewählten Bedingungen vollständig
sein, damit die Proportionalität von Kopplungsausbeute und Adsorption des DibenzofulvenPiperidin Adduktes gegeben ist.
Ergebnisse und Diskussion
89
8.6
Versuche zur Polyamidbildung
8.6.1
Versuche zur Polyamidbildung auf Amino-PEG Papier
Zur Polyamidbildung wurden zunächst zwei verschiedene Aminocarbonsäuren gewählt. Der
eine Baustein ist Fmoc-3-Aminobenzoesäure (4), der andere ist ein aromatischer Heterozyklus
(Fmoc-3-Aminopyrazol-4-carbonsäure (2)). Als Träger diente Amino-PEG-Papier mit einer
durchschnittlichen Grundbelegung mit Aminofunktionen von einem µmol/cm².
Tab. 8.2:
Ausbeuten zweier aromatischer Aminocarbonsäuren, die durch vier verschiedene
Aktivierungsmethoden, im ersten Zyklus direkt auf die aliphatischen Aminofunktionen des Trägers, im zweiten Zyklus auf die aromatische Aminofunktion
der ersten Aminocarbonsäure gekoppelt werden.
Aminocarbonsäure
Fmoc-3-Aminopyrazol-4-carbonsäure
Fmoc-3-Aminobenzoesäure
aktiviert mit
PyBOP/DIEA
TBTU/DIEA
TFFH/DIEA
DIC/HOBt
PyBOP/DIEA
TBTU/DIEA
TFFH/DIEA
DIC/HOBt
1. Zyklus 2. Zyklus Ausbeute
[nmol/cm²] [nmol/cm²]
[%]
367,6
141,1
38
522,1
87,5
17
318,9
136,9
43
555,9
409,9
74
1046,9
143,2
14
1204,3
204,6
17
937,6
194,7
21
855,7
146,7
17
Im Vergleich der Belegung des ersten mit dem zweiten Zyklus, sinkt bei Fmoc-3-Aminopyrazol4-carbonsäure die Ausbeute auf durchschnittlich 44 % im Vergleich zur Ausbeute des ersten
Zyklus (100 % Wert). Bei Fmoc-3-Aminobenzoesäure ist eine drastische Ausbeuteverminderung auf durchschnittlich nur 20 % im Vergleich zur Ausbeute des ersten Zyklus zu
beobachten. Beide Aminocarbonsäuren zeigen eine unterschiedliche Reaktivität des
Carboxyterminus, wie an den Belegungen des ersten Zyklus zu sehen ist. Aufgrund der
Schwierigkeiten einer eindeutigen Zuordnung der Position der Fmoc-Schutzgruppe an der 3Aminopyrazol-4-carbonsäure (2) wird es in den folgenden systematischen Untersuchungen nicht
mehr verwendet (vgl. 8.3.2.1).
Zur Abschätzung der Reaktivität des Amino- und des Carboxyterminus soll eine einheitliche
Oberflächenbeladung des Trägers vorgegeben sein. Als Träger wird Amino-PEG-Cellulose
eingesetzt, auf der ein Fmoc-Rink-Amid-Linker eine einheitliche maximale Oberflächenbeladung von 960 nmol/cm² vorgibt.
Ergebnisse und Diskussion
8.6.2
90
Polyamidbildungsversuche auf Fmoc-Rink-Amid-Linker Amino-PEG Papier
Die Kopplung der ersten Aminosäure an die mit Rink-Linker aminofunktionalisierte Cellulose
ergibt eine fast einheitliche Beladung. Der Baustein Fmoc-3-Aminobenzoesäure wurde mit
DIC/HOBt und TBTU/DIEA aktiviert.
Ausbeuten der Amidbindungen
1200,0
1000,0
[nmol/cm²]
800,0
600,0
400,0
200,0
Fmoc-3-A minobenzoes äure
aktivert mit DIC/HOBt
Fmoc-3-A minobenzoes äure
aktivert mit TBTU/DIEA
0,0
Grundbeladung
Abb. 8.4:
1. Zyklus
2. Zyklus
Ausbeuten der Amidbindungen eines geschützten Bausteins mit zwei
unterschiedlichen Aktivierungsreagenzien nach einem und zwei Zyklen
gegenüber einer Grundbeladung mit Rink-Linker (tabellarische Daten s. A-14).
Die Verknüpfung am Träger durch den in situ erzeugten Aktivester konnte dabei in fast
vollständiger Ausbeute durchgeführt werden. Im zweiten Zyklus wird ein weiterer Baustein
gekoppelt. Dabei reagieren die Bausteine statt mit aliphatischen Aminogruppen mit den
aromatischen Aminofunktionen der ersten Bausteine. Die Ausbeuten sind mit durchschnittlich
20 % wesentlich geringer als im ersten Zyklus, unabhängig von der Art der Aktivierung. Dies ist
eine Bestätigung des vorherigen Experimentes auf Amino-PEG Papier.
Ergebnisse und Diskussion
91
Für weitere Synthesezyklen sind diese Ausbeuten zu gering. Bei einer Kopplungsrate von 20 %
und einer Ausgangsbeladung von 900 nmol/cm² ergibt sich z.B. nach vier Synthesezyklen eine
Beladung von sieben nmol/cm² mit exponentiell abnehmender Tendenz. Die Abbruchrate ist
damit wesentlich zu hoch für die Fortführung der Synthese.
Der Versuch BOC geschützte Bausteine zu verwenden, erbrachte keine Verbesserung der
Kopplungsausbeuten. Eine prinzipielle Schwierigkeit besteht darin, daß die erfolgten
Verknüpfungen der BOC-Derivate nur indirekt, z.B. durch weitere Kopplung einer Fmoc
geschützten Aminosäure hinsichtlich ihrer Kopplungsausbeuten quantifiziert werden können.
Diese zusätzliche Kopplung bereitet jedoch prinzipielle Probleme, aufgrund der geringen
Reaktivität des Aminosubstituenten. Der Wechsel zu anderen Lösemitteln erbrachte aufgrund
der unvollständigen Löslichkeit der geschützten Bausteine keine Verbesserung.
8.6.3
Einsatz von Mikrowellen zur Aktivierung
Seit einiger Zeit werden Mikrowellenverfahren zum schnellen intensiven Erhitzen in der
Festphasensynthese erprobt [Caddick (1995) und Yu et al. (1992)]. Zur Beschleunigung der
Amidbindungsbildung durch Temperaturerhöhung wurde diese Methode auch in der SpotSynthese eingesetzt. Hierbei wurde versucht Fmoc-3-Aminobenzoesäure mit DIC/HOBt zu
aktivieren und auf Amino-PEG Papier zu koppeln. In einem Versuch wurde Mikrowellenbestrahlung zur Beschleunigung der Reaktion eingesetzt, im Kontrollexperiment wurde keine
Aktivierung verwendet. Der Einsatz von Mikrowellenbestrahlung konnte bei Cellulose als
Trägermaterial keine Ausbeutesteigerung erzielen.
Wird das Verfahren der Mikrowellenbestrahlung bei Reaktionen an Polypropylenträgern
eingesetzt, ist eine Verbesserung der Ausbeuten zu beobachten. Dafür wurde eine mit RinkLinker und Lysin-Phenylalanin Spacer versehene Polypropylenmenbran6 zur Darstellung eines
Dimers und Trimers mit Fmoc-3-Aminobenzoesäure umgesetzt. Zur Aktivierung wurde
DIC/HOBt eingesetzt. In einem Versuch wurde Mikrowellenbestrahlung zur Beschleunigung
der Reaktion eingesetzt, im Kontrollexperiment wurde keine zusätzliche Aktivierung
verwendet.
6
Für die freundliche Bereitstellung des Trägers danke ich Frau Yvonne Gräser
Ergebnisse und Diskussion
92
Ausbeuten der Aktivierung mit DIC/HOBt unter Einfluß von
Mikrowellenbestrahlung (600 W)
1600
ohne Bestrahlung
1400
mit Bestrahlung
[nmol/cm²]
1200
1000
800
600
400
200
0
Grundbeladung von
Rink-Lys-Phe
Abb. 8.5:
1. Zyklus: Fmoc-3Aminobenzoesäure
2. Zyklus: Fmoc-3Aminobenzoesäure
3. Zyklus: Fmoc-3Aminobenzoesäure
Einfluß der Mikrowellenbestrahlung auf die Ausbeuten der Polyamidsynthese
von Fmoc-3-Aminobenzoesäure auf einem Polyamidträger mit Rink-Linker und
Lys-Phe-Spacer (tabellarische Daten siehe A-15).
Durch Mikrowellenbestrahlung konnten die Ausbeuteverluste bei der Kopplung mit
aromatischen Aminen verringert werden. Die Ausbeute der Reaktionsschritte ohne zusätzliche
Mikrowellenbestrahlung beträgt ca. 54 %. Durch zusätzliche Mikrowellenbestrahlung jedes
Kopplungsschrittes konnte bei gleicher Reaktionszeit die Ausbeute auf ca. 80 % gesteigert
werden. Damit sind die Ausbeuten der Kopplungsschritte zur kombinatorischen Darstellung von
spezifisch DNA-bindenden Polyamiden noch immer zu gering. Weitere Verbesserungen dieser
problematischen Kopplungen mit Hilfe der Mikrowellenbestrahlung auf Polypropylenmembranen als Träger scheinen aussichtsreich. Die so dargestellten Produkte weisen zwar
Abbruchsequenzen auf, zeigen aber sonst keine Zerfallsprodukte durch die Bestrahlung.
Ergebnisse und Diskussion
93
753.3
6248b#1 RT: 0.22 AV: 1 NL: 5.43E7
T: + p ESI Full ms [ 500.00-1499.99]
100
NH2
90
80
N
H
O
70
Relative Abundance
O
H
N
O
O
H
N
O
N
H
CH2
NH2
O
60
50
40
30
531.3
20
10
0
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
1050
m/z
100
7,62
0,6
0,5
60
0,3
40
%D
0,0
14,70
10,33
7,30
0,1
7,75
8,06 7,94
8,30
0,2
Solvent (%)
0,4
4,714,81
4,99
5,31
Intensity (AU)
80
20
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Retention Time (min)
Abb. 8.6:
ESI-MS und HPLC eines abgespaltenen Dimers von Fmoc-(3Aminobenzoesäure)2 von einem Lysin-Phenylalanin-Spacer, M = 752,9 m/z.
Ergebnisse und Diskussion
8.7
94
Betrachtung der Reaktivität der Bausteine
Schon in den Versuchen, die verschiedenen Bausteine mit BOC oder Fmoc zu schützen, fiel die
geringe Reaktivität des N-Terminus auf. Die Ausbeuten waren gering und einige Bausteine
zeigten keine Reaktion. Es soll nun untersucht werden, welche Bausteine eine hinreichende
Reaktivität aufweisen und so für die kombinatorische Festphasensynthese geeignet sind.
8.7.1
Versuche zur Abschätzung der Reaktivität
Als Kriterium wurde eine milde Acetylierungsreaktion gewählt. Essigsäureanhydrid ist sterisch
wenig anspruchsvoll und zeichnet sich durch gute Reaktivität auch bei Raumtemperatur aus. In
der Spot-Synthese wird es routinemäßig zum Cappen freier Hydroxy- oder Aminofunktionen
verwendet. Diese Reaktion ist schon nach kurzer Zeit vollständig. Die Acylierung durch
Benzoylchlorid wird ebenfalls untersucht. Als Säurechlorid zeichnet es sich durch höhere
Reaktivität aus.
Die Bausteine wurden beiden Acylierungsreagenzien für drei Stunden bei Raumtemperatur
ausgesetzt und danach mit der HPLC untersucht. Auf eine mögliche Acylierung wurde durch
Abnahme des Eduktpeaks und das Auftreten neuer Peaks geschlossen.
Tab. 8.3:
Acylierung der Bausteine mit Essigsäureanhydrid und Benzoylchlorid zur
Untersuchung der Reaktivität der funktionellen Gruppen.
Baustein
Essigsäureanhydrid Benzoylchlorid
keine Reaktion
keine Reaktion
2-Amino-4-thiazolessigsäure (1)
reagiert
reagiert
3-Aminopyrazol-4-carbonsäure (2)
keine
Reaktion
keine
Reaktion
3-Aminopyrazin-2-carbonsäure (3)
reagiert
reagiert
2-Aminobenzoesäure (4-2)
reagiert
reagiert
3-Aminobenzoesäure (4-3)
reagiert
reagiert
4-Aminobenzoesäure (4-4)
keine Reaktion
keine Reaktion
3-Amino-1H-124-triazol-5-carbonsäure (5)
reagiert
reagiert
2-Aminonicotinsäure (6-2)
keine Reaktion
keine Reaktion
6-Aminonicotinsäure (6-6)
reagiert
reagiert
Methyl-5-amino-2-furoat (7)
keine Reaktion
reagiert
3-Aminothiophen-2-carbonsäuremethylester (8)
keine Reaktion
reagiert
Ethyl-5-amino-1-methylpyrazol-4-carboxylat (9)
keine
Reaktion
reagiert
(S)-Indolin-2-carbonsäure (10)
reagiert
reagiert
2-Amino-6-fluorbenzoesäure (11)
keine Reaktion
keine Reaktion
Ethyl-2-amino-4-phenyl-thiazol-5-carboxylat (12)
keine Reaktion
keine Reaktion
1,2,3,4-Tetrahydro-3-isochinolincarbonsäure (13)
Ergebnisse und Diskussion
95
Die Untersuchung der Reaktivität der Bausteine gegenüber Acylierungsreaktionen zeigt, daß
eine Abstufung besteht. Mit Essigsäureanhydrid konnten nur 3-Aminopyrazol-4-carbonsäure
(2), Aminobenzoesäure (4), 2-Aminonicotinsäure (6-2), Methyl-5-amino-2-furoat (7) und 2Amino-6-fluorbenzoesäure (11) umgesetzt werden, während mit Benzoylchlorid dann
zusätzlich auch 3-Aminothiophen-2-carbonsäuremethylester (8), Ethyl-5-amino-1methylpyrazol-4-carboxylat (9) und (S)-Indolin-2-carbonsäure (10) reagierten. Nur bei (2), (4)
und (11) konnte nach drei Stunden eine nahezu vollständige Reaktion des Eduktes beobachtet
werden.
Dieser Versuch zeigt, daß die aromatischen Aminogruppen der Bausteine nicht in allen Fällen
eine gleich gute bzw. teilweise sogar überhaupt keine Reaktivität aufweisen. Damit sind diese
Bausteine für einen kombinatorischen Ansatz zur Darstellung von Polyamiden mit der SpotMethode nicht geeignet.
8.7.2
Theoretische Betrachtung der Reaktivität
Die aromatischen Aminocarbonsäuren lassen sich trotz ausgefeilter Aktivierungsstrategien nicht
in ausreichenden Ausbeuten koppeln. Sie koppeln mit der Carboxylgruppe in befriedigenden
Ausbeuten auf Trägern, die aliphatische Aminogruppen präsentieren, wie Amino-PEG
Cellulose oder Rink-Amin Linker. Die Reaktion mit aromatischen Aminogruppen ist jedoch
problematisch.
Zur Abschätzung und Beurteilung der Reaktivität soll die Nukleophilie der Aminofunktionen
tragenden Verbindungen herangezogen werden. Ein Maß für die Nukleophilie ist die Basizität
einer Verbindung, meßbar als pKs-Wert. Die in den vergleichenden Betrachtungen
herangezogenen pKs-Werte entstammen [Weast (1976) und Sykes (1988)]. Es gilt: je basischer
ein vergleichbares System ist, d. h. je größer der pKs-Wert der funktionellen Gruppe ist, desto
höher ist ihre Nukleophilie.
Aromatische Amine gelten als elektronenarme Verbindungen. Die Basizität von Anilin
(pKs = 4,6) ist sehr gering im Vergleich zum aliphatischen Cyclohexylamin (pKs = 10,9).
Benzylamin (pKs = 9,3), weist jedoch aufgrund des pKs-Wertes eher den Charakter eines
aliphatischen Amins auf. Wie auch die Literatur bestätigt, konnten Bausteine wie Benzylaminen
von [Behrens et al. (1998)] in kurzen Reaktionszeiten mit guten Ausbeuten gekoppelt werden.
Aromatische und aliphatische Carbonsäuren zeigen keinen großen Unterschied in der
Säurestärke. Benzoesäure (pKs = 4,2) ist nur wenig saurer als Cyclohexancarbonsäure
(pKs = 4,9).
Ergebnisse und Diskussion
96
Für die Betrachtung disubstituierter aromatischer Systeme wie für 4-Aminobenzoesäure ergibt
sich der pKs-Wert der Carboxylgruppe zu 2,5; der pKs-Wert der Aminofunktion zu 4,9.
Im Vergleich dazu besitzen die natürlichen Aminosäuren eine eindeutig saure und basische
funktionelle Gruppe. Der pKs-Wert der Säurefunktion liegt bei durchschnittlich 2,4 und der pKsWert der Aminofunktion liegt bei durchschnittlich 9,6. Damit weist ihr Aminoterminus eine
wesentlich höhere Basizität auf. So sollte auch ihre Nukleophilie größer sein als bei
aromatischen Aminosäuren. Dies zeigte sich auch in der Spot-Synthese. Hier reagieren sie mit
fast vollständigen Ausbeuten zu Amidbindungen.
8.8
Abschließende Bewertung
Die Darstellung von Polyamiden aus aromatischen Aminocarbonsäuren konnte mit der SpotMethode an Cellulose als Träger nicht mit hinreichen Ausbeuten durchgeführt werden. Auch die
zusätzliche Aktivierung durch Mikrowellenbestrahlung blieb hinter den erwarteten Ergebnissen
zurück, bietet aber Potential für weitere Entwicklungen. Durch die geringe Reaktivität
acetylierbarer Valenzen sind die untersuchten, kommerziell erhältlichen, aromatischen
Aminocarbonsäuren für eine kombinatorische Darstellung von Polyamiden nicht geeignet. So
konnten deshalb die Bibliotheken der DNA-bindenden Polyamide nicht dargestellt und
untersucht werden.
Zusammenfassung und Ausblick
97
IV Zusammenfassung und Ausblick
9.
Zusammenfassung
Die Spot-Methode erlaubt die schnelle und einfache Darstellung von Substanzbibliotheken für
ein effizientes biologisches Screening. Sie zeichnet sich durch hohe Parallelität in der
Reaktionsführung, einfache Handhabbarkeit und Miniaturisierbarkeit aus. Ziel dieser Arbeit war
die Erschließung von zwei neuen Reaktionstypen für die Spot-Methode zur Herstellung von
Substanzbibliotheken zur gezielten Untersuchung zweier biologischer Wirkorte. Die Vorzüge
der Spot-Methode - einfache Handhabbarkeit und hohe Parallelität in der Reaktionsführung sollten dabei erhalten bleiben.
Für die biologische Untersuchung MHC Klasse-I abhängiger T-Zell Epitope sind Bibliotheken
löslicher Peptide mit freiem Carboxyterminus essentiell. Die Peptide wurden dafür derart an den
Träger gebunden, daß durch basische Hydrolyse diese Bindung unter Beibehaltung des SpotSyntheserasters gespalten werden kann. Dazu wurde die Veresterung als Reaktionstyp für die
Spot-Synthese etabliert. Eine Veresterung, gerade in einem offenen miniaturisierten
Reaktorsystem wie dem der Spot-Synthese, ist ein problematischer Schritt. Luftfeuchtigkeit und
kurze Reaktionszeiten beeinflussen die Ergebnisse negativ. Verschiedene Veresterungsmethoden wurden auf ihre Eignung für die Spot-Synthese untersucht. Die Veresterungen der
Fmoc geschützten Aminosäuren mit 2,6-Dichlorbenzoylchlorid/Pyridin; mit DIC/MeIm; als
symmetrisches Anhydrid; mit MSNT; mit TFFH oder mit Triphenylphosphin/Diazo-Derivaten
konnten nur mit unzureichenden Ausbeuten durchgeführt werden. Die Veresterungen mit
verschiedenen kommerziell erhältlichen und synthetisierten Azoliden wie CDI, CDT, ThDI,
ThDT, CDMeI oder CDNT erbrachten ausreichend hohe und einheitliche Belegungen. Die
Ausbeuten nach Aktivierung mit drei eq. CDI waren mit 400-600 nmol/cm² die höchsten, die im
Vergleich aller Veresterungsmethoden erzielt werden konnten. Eine Aktivierung mit Azoliden
stellt eine einfach zu handhabende Methode dar, die in der Spot-Methode effizient einsetzbar
ist.
Zusammenfassung und Ausblick
98
Nebenreaktionen wie Racemisierung, Diketopiperazinbildung oder Dipeptidbildung wurden
quantitativ bestimmt. Racemisierung ist gerade bei einer Veresterung eine relevante
Nebenreaktion. Bei der Veresterung mit CDI betrug sie zwischen 0 % und 8 % D-Isomer bzw.
bei CDT zwischen 0 % und 2 % D-Isomer, jeweils in Abhängigkeit von der eingesetzten
Aminosäure. Dipeptidbildung, hervorgerufen durch Verlust der N-terminalen Schutzgruppe
durch die Aktivierung mit CDI oder CDT, trat nicht auf. Wenn Prolin am Träger verankert ist,
kann auf der Stufe des Dipeptids, durch Diketopiperazinbildung, die wachsende Peptidkette
abgespalten werden.
Zur Abspaltung der durch Veresterung gebundenen Peptide wurde eine weitgehend parallel
durchführbare Methode etabliert. Sie erlaubte die direkte Spaltung aller synthetisierten Peptide
vom Träger unter Beibehaltung des Syntheserasters in einer Trimethylamin-Gasatmosphäre. Die
mit Hilfe einer Radioaktivitätsanalyse bestimmte Abspaltungsrate einschließlich des Eluierens
vom Träger betrug 80 %.
Für den Einsatz so hergestellter Peptide in T-Zell Assays wurden die Spots in Mikrotiterplatten
separiert und mit einem wäßrigen Puffer eluiert. Trotz der Behandlung des Trägers und der
Peptide während der Synthese mit zelltoxischen Chemikalien konnte der Biotest zunächst an
einem etablierten MHC Klasse-II System erfolgreich durchgeführt werden. Durch eine Serie
überlappender Peptide konnte das bindende Epitop von Hemagglutinin HA 1 des Influenzavirus
PR 8 eindeutig bestätigt werden. Bei der Untersuchung nicht literaturbekannter T-Zell Epitope
eines MHC Klasse-I Systems konnte eine polyklonale Immunantwort gegen den C-Terminus
des Proteins erhalten werden.
Die Spot-Synthesemethode konnte somit erfolgreich für T-Zell Epitopanalysen angepaßt
werden.
Basierend auf Bausteinmotiven der natürlichen Antibiotika Distamycin und Netropsin wurden
neue, kommerziell erhältliche aromatische Aminocarbonsäuren als Bausteine untersucht. Zur
Vorselektion wurde ein auf dünnschichtchromatographischen Verfahren basierendes Testsystem
eingesetzt. Die Bausteine 2-Aminobenzoesäure (4-2), 3-Amino-1H-1,2,4-triazol-5-carbonsäure
(5) und 2-Aminonicotinsäure (6-2) zeigten dabei Interaktionen mit doppelsträngiger DNA. Zur
gezielten kombinatorischen Synthese der Polyamide wurden die Bausteine am Aminoterminus
geschützt. Die bevorzugte Schutzgruppe dabei ist Fmoc. Sie erlaubt das direkte Quantifizieren
der Kopplungsausbeuten nach jedem Schritt. Erfolgreich Fmoc-geschützt werden konnten 3Aminopyrazol-4-carbonsäure (2) und 3-Aminobenzoesäure (4-3). Die nicht optimierten
Ausbeuten dieser Reaktionen betrugen zwischen 40 % und 50 %. Als weitere, sterisch
anspruchslosere Schutzgruppe wurde BOC eingesetzt. Erfolgreich geschützt werden konnten
Zusammenfassung und Ausblick
99
2-Aminobenzoesäure (4-2) und 3-Aminobenzoesäure (4-3). Die dabei erzielten Ausbeuten
betrugen durchschnittlich 80 %. Für die Synthese der Polyamidbindungen wurden verschiedene
Kopplungsreagenzien zur Aktivierung der Säurefunktionen eingesetzt. Unabhängig von der Art
der Aktivierung betrugen die Ausbeuten der Kettenverlängerungsschritte 20 % bis 40 %. Der
Einsatz von aminofunktionalisierten Polypropylenmembranen unter Zuhilfenahme von
Mikrowellenbestrahlung erbrachte ohne Optimierung eine Ausbeutesteigerung auf 80 % je
Kettenverlängerungsschritt.
Aufgrund der experimentellen Erfahrungen ist es schwierig Bausteine zu finden, die für ein
kombinatorisches Screening geeignet sind. Bedingt durch die geringen Ausbeuten wurde die
Synthese der DNA-bindenden Polyamide nicht weiter verfolgt. Bislang wenig erfolgreich war
die Adaption der Spot-Methode zur Synthese DNA-bindender aromatischer Polyamide.
Zusammenfassung und Ausblick
100
10. Ausblick
Im Rahmen der Arbeit wurden zwei für die Durchführung im Spot-Verfahren problematische
Reaktionstypen untersucht. Die Veresterung, gerade in einem offenen miniaturisierten SpotReaktorsystem, stellt eine Gratwanderung zwischen hohen Kopplungsausbeuten und den bei
einer starken Aktivierung auftretenden Nebenreaktionen wie z.B. Racemisierung dar. Die
erzielten Ausbeuten durch die Aktivierung mit CDI oder CDT sind ausreichend gut. Dadurch,
daß bei der Aktivierung mit Azoliden jeweils ein equivalent Base frei wird, tritt Racemisierung
auf. Als Verbesserung dieser Methode sollte ein Zusatz gefunden werden, der die freiwerdende
Base abfängt und somit die Racemisierung unterdrückt.
In der Synthese der löslichen carboxylfunktionalisierten Peptide für die Analyse von T-Zell
Epitopen kann eine weitere Erhöhung der Parallelität angestrebt werden. Bislang werden die
Spots für den biologischen Assay einzeln per Hand in Mikrotiterplatten separiert, mit Puffer
eluiert, umpipettiert und mit den Zellen gemischt. In einer weiteren Entwicklung könnten
zwischen Trägermaterial und Peptid spezielle Linker eingesetzt werden, die unter
physiologischen Bedingungen spaltbar sind. Solche Linker sind bereits patentiert7. Auch hier
erfolgt die Verankerung der Aminosäure über eine Esterbindung. Durch Aufbau eines
Sandwichkomplexes aus einem immobilisierten Zellrasensystem und dem Träger mit den
speziell gebundenen Peptiden könnte dann der biologische Assay im Verbund durchgeführt
werden. Die Peptide könnten mit einem physiologischen Puffer vom Linker gespalten und durch
langsame Diffusion in den Zellrasen transportiert werden, wo sie eine biologische Reaktion
auslösen sollten.
Eine Verbesserung der Kopplungsausbeuten der Synthese von Oligomeren aus aromatischen
Aminosäuren kann, wie bereits in dieser Arbeit angedeutet, durch den Einsatz andere
Materialien wie z.B. der Polypropylen-Membran erreicht werden. Auch der Einsatz von
Mikrowellen zur Verbesserung dieser problematischen Kopplungen scheint erfolgversprechend
für weitere Optimierungsversuche.
Die Spot-Methode, eine einfache parallele Synthesetechnik zur Darstellung von Substanzbibliotheken, kann weitreichend eingesetzt werden. Die Einsatzgebiete reichen von der Synthese
immobilisierter sowie löslicher Peptidbibliotheken bis hin zur Synthese von Peptiden zur
Untersuchung von T-Zell Epitopen. Cellulose stellt dabei ein ideales Trägermaterial dar.
7
Frank, Hoffmann: Schutz- bzw. Ankergruppen und deren Verwendung, USA (5,756,758),
Australien (696 426)
Zusammenfassung und Ausblick
101
Durch die Einführung anderer Trägermaterialien, wie z.B. speziell modifizierte Polypropylenmembranen, können die Synthesemöglichkeiten ausgebaut werden. Der Einsatz anderer
Lösemittel, z.B. halogenierter Kohlenwasserstoffe, kann das Repertoire der Verknüpfungsreaktionen zwischen den Bausteinen bereichern. Der Einsatz physikalischer Methoden, wie
Bestrahlung mit IR- und UV-Strahlen oder das schnelle Erhitzen durch Mikrowellenbestrahlung
kann ebenfalls das Repertoire der chemischen Methoden erweitern. So könnten hinausgehend
über die Bildung von Amid- und Esterbindungen weitere Verknüpfungen oder
Synthesemöglichkeiten eröffnet werden. Der Zugang zu neuen Substanzbibliotheken wird so
ermöglicht.
Materialien und Methoden
102
V Materialien und Methoden
11. Materialien und Methoden
11.1 Materialien
Fmoc-Aminosäuren:
Trägermaterialien:
Lösemittel:
weitere Chemikalien:
Fmoc-Ala, Fmoc-Cys(Acm), Fmoc-Cys(Buthio), FmocAsp(OtBu), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Gly, Fmoc-His,
Fmoc-Ile, Fmoc-Lys(BOC), Fmoc-Leu, Fmoc-Met, FmocAsn(Trt), Fmoc-Pro, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Arg(Pbf), FmocSer(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Trp(BOC), FmocTyr(tBu) der Fa. Alexis und Novabiochem
getrocknete (60°C, über Nacht bei 13,3 Pa) unbehandelte
Whatman 540 Cellulose (Maidstone, England), Amino-PEG
Papier, Polypropylenmembran (AIMS/Braunschweig)
DMF-Perseptive, aminfrei; NMP-Aldrich, aminfrei über saures
Aluminiumoxid Typ 504 C (Fluka); 1,2,3-TrichlorpropanAldrich, destilliert; alle anderen Lösemittel p.A. Qualität und
wasserfrei von Fluka
(S)-Indolin-2-carbonsäure (Aldrich); 1,2,3,4-Tetrahydro-3isochinolincarbonsäure (Lancaster); 2,6-Dichlorbenzoylchlorid
(Fluka); 2-Amino-4-thiazolessigsäure (Aldrich); 2-Amino-6fluorbenzoesäure (Aldrich); 2-Aminobenzoesäure (Aldrich);
2-Aminonicotinsäure (Lancaster); 3-Amino-1H-1,2,4-triazol-5carbonsäure (Lancaster); 3-Aminobenzoesäure (Aldrich);
3-Aminopyrazin-2-carbonsäure (Fluka); 3-Aminopyrazol-4carbonsäure (Aldrich); 3-Aminothiophen-2carbonsäuremethylester (Aldrich); 3-Nitrotriazol (Aldrich);
4-Aminobenzoesäure (Aldrich); 6-Aminonicotinsäure
( L a n c a s t e r ) ; A z o d i c a r b o n yl d i m o r p h o l i d ( F l u k a ) ;
Azodicarbonyldipiperidid (Fluka); d[carbonyl-14C] Biotin, 2,11
GBq/mmol (Amersham Life Science); BOC-Anhydrid=Di-tertbutyldicarbonat (Fluka); BPB (Aldrich); Carbonyldiimidazol
(Fluka, Lancaster); Carbonylditriazol (Aldrich); DIC (Fluka);
Dicyclohexylcarbodiimide (Aldrich); Diethylazodicarboxylat
(Fluka); Eisessig (Fluka); Essigsäureanhydrid (Fluka); Ethyl-2amino-4-phenyl-thiazol-5-carboxylat (Lancaster);
Materialien und Methoden
Szintillationslösung:
Puffer:
NMR-Lösemittel:
BromphenolblauStammlösung:
Mikrowelle:
HPTLC-Platten:
103
Ethyl-5-amino-1-methylpyrazol-4-carboxylat (Lancaster); FmocCl (Fluka); HOBt (Aldrich); Lachssperma-DNA (wurde vom
HKI Jena zur Verfügung gestellt); Mesitylensulfonylchlorid
(Aldrich); Methyl-5-amino-2-furoat (Lancaster);
N-Methylimidazol (Fluka); Piperidin(Fluka); PyBOP
(Novabiochem); Rink-Linker = 4-[(2,4-Dimethoxyphenyl)(Fmocamino)methyl)]phenoxyessigsäure (Novabiochem); Salze
(Fluka); Salzsäure (MERK); Sulfonylchlorid (Fluka); TBTU
(PerSeptive Biosystems); Tetramethylazodicarboxamid (Fluka);
TFA, über Schwefelsäure destilliert; TFFH (PerSeptive
Biosystems); TIBS (Aldrich); Triethylamin (Aldrich);
Trimethylamin (45 %ig, v/v, Aldrich); Trimethylsilylimidazol
(Fluka); Trimethylsilyltriazol (Fluka); Triphenylphosphin (Fluka)
Quicksafe A (Zinsser Analytic)
PBS
8 g NaCl
0,2 g KCl
1,43 g Na2HPO4
0,2 g KH2PO4 (10mM Phosphat)
mit Wasser auf 1 L auffüllen
mit Salzsäure (HCl) pH = 7.0 einstellen und autoklavieren
Probenpuffer (6x)
0,25 % Bromphenolblau
0,25 % Xylen cyanol
30 % Glycin
69,5 % 50 mM EDTA
Laufpuffer (TBE)
5,4 g Tris Base
2,75 g Borsäure
2 mL 0,5 M EDTA
mit Wasser auf 1 L auffüllen
pH = 8 einstellen und autoklavieren
Pyridin d5-MERK; CDCl3 mit TMS-Aldrich; DMSO d6-Aldrich
10 mg Bromphenolblau gelöst 1 mL DMF, für die Färbung 1:100
mit DMF verdünnt
Haushaltsmikrowelle von Siemens, regulierbare Wattzahl
wasserbenetzbare Kieselgel-RP-18-HPTLC-Fertigplatten mit
Fluoreszenzindikator WF254 S, Fa. Merck, Auswertung unter UVLicht bei 254 nm
Materialien und Methoden
104
11.1.1 Rechner
Hardware:
Betriebssystem:
Schreibprogramm:
Tabellenkalkulation und
Graphiken:
Zeichenprogramm für
chemische Formeln:
Bildbearbeitung:
Molekülbilder:
Pentium II 400
Windows NT 4.0
Corel WordPerfect 8
Microsoft Excel 97
ISIS Draw Version 2.1.2
Paint Shop Pro Version 5.01
BRAGI [Schomburg et al. (1988)]
11.2 Analytik
11.2.1 Chromatographie
11.2.1.1 HPLC
Die Untersuchungen zur Qualität wurden an einer MERK Hitatchi LaChrom HPLC-Anlage
durchgeführt.
Detektor:
Dioden Array Detektor
Säule (S1):
reversed phase C18, 50 mm x 2 mm ID, Fa. LUNA Phenomenex
Säule (S2):
reversed phase C18, 250 mm x 2 mm ID, Fa. Macherey-Nagel,
Düren
Injektionsvolumen (S1):
5 oder 10 µL
Injektionsvolumen (S2):
zwischen 50 und 100 µL
Flußrate (S1):
0,8 mL / min
Flußrate (S2):
0,250 mL / min
Fließmittel:
Wasser in Millipore-Qualität, mit Zusatz von 0,1 % TFA;
Fließmittel C
Acetonitril, HPLC-Qualität; mit Zusatz von 0,1 % TFA;
Fließmittel D
Gradient (S1):
Time [min]: 0,0
0,1
0,2
11
12
13
15
% D:
5,0
5,0
5,0
95,0 95,0 5,0
5,0
Gradient (S2):
Time [min]: 0,0
10
12
32
40
50
51
% D:
0,0
0,0
25
70
100
100
0,0
Materialien und Methoden
105
11.2.1.2 Gaschromatographie (GC-FID)
Die Untersuchungen zur Racemisierung wurden an einem Gaschromatographen der Fa. Carlo
Erba mega series über einen FID-Detektor durchgeführt.
Injektionsart:
on column
Injektionsvolumen:
1 µL
Detektortemperatur:
250°C
Kapillarsäule:
Permabound-L-Chirasil-Val von Macherey-Nagel 25 m x
0,25 mm ID
Temperaturprogramm:
80 °C (5min), mit 10 Grad / Minute bis 210 °C, 210 °C (15 min)
Trägergas:
Wasserstoff, 125 kPa
Zur Auswertung stehen institutseigene Referenzsubstanzen und
-chromatogramme zur Verfügung.
11.2.1.3 GCQ
Die Untersuchungen zur Racemisierung wurden am GCQ Fa. Finnigan durchgeführt.
Gaschromatograph gekoppelt mit Quadrupol-Ion-Trap.
Kapillarsäule:
Permabound-L-Chirasil-Val von Macherey-Nagel 25 m x
0,25 mm ID
Trägergas:
Helium
Ionisierungsenergie:
pos. Elektronenstrom vom Hairpin Filament, 70 eV
Temperaturprogramm:
60 °C (5 min), mit 10 Grad / Minute bis 220 °C, 220 °C (10 min)
Temperatur der Ionenquelle: 175 °C
Temperatur des Interface:
200 °C
Injektionsart:
split/splittless
Injektionsvolumen:
1 µL
Massenbereich:
50-500
Zur Auswertung stehen institutseigene Referenzsubstanzen und
-daten zur Verfügung.
11.2.2 Massenspektrometrie
11.2.2.1 MALDI
MALDI Reflex II Fa. Bruker. Das Meßverfahren ist MALDI-TOF im Delayed Extraktion
Positiv Ionen Reflektron Modus. Die Ionisierung erfolgt mit einem Laser 337 nm. Als Matrix
dient -Cyano-4-hydroxyzimtsäure in Acetonitril mit 0,1 % TFA 4:6. Die Kalibrierung erfolgt
in einem Massenbereich von 1046,542 Da bis 2465,199 Da.
11.2.2.2 ESI
TSQ 700 von Finnigan MAT (Triple Stage Quadrupol). Die Messung wird in mit Gold
beschichteten Kapillarnadeln durchgeführt. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes an die
Nadel wird die Lösung versprüht. Dabei werden einfach und mehrfach geladene Ionen erzeugt.
Materialien und Methoden
106
11.2.3 Kernresonanz-Spektroskopie
11.2.3.1 1H-NMR-Spektroskopie
Die Spektren wurden mit den Geräten DPX-300 (300 MHz), ARX-400 (400 MHz) und DMX600 (600 MHz) der Fa. Bruker aufgenommen. Als Referenzsignal zur Fixierung des
Nullpunktes der -Skala dient Tetramethylsilan (TMS) oder die Signale der deuterierten
Lösemittel. Die Verschiebungen sind in ppm angegeben, die Multiplizität der Signale wurde
durch s = Singulett, d = Duplett, t = Triplett, m = Multiplett gekennzeichnet.
11.2.3.2 13C-NMR-Spektroskopie
Die Spektren wurden mit den Geräten DPX-300 (75 MHz) und ARX-400 (100 MHz) der Fa.
Bruker aufgenommen. Als Referenzsignal zur Fixierung des Nullpunktes der -Skala dient
Tetramethylsilan (TMS) oder die Signale der deuterierten Lösemittel. Die Verschiebungen sind
in ppm angegeben. Die Anzahl der am Kohlenstoff gebundenen Protonen wurde durch DEPTSpektren bestimmt.
11.2.4 Sonstige Geräte
Photometer:
Pharmacia Biotech Ultraspec UV/Visable Spektrometer
Szintillationszähler: WIN Spectral 1414 Liquid Scintillation Counter (Wallace) mit Software:
WinSpectral (Wallace) Version 1.0
Phosphorimager:
Fuji Film BAS 2500 Reader mit Fuji Bildplatten
11.3 Peptidsynthese mit Syntheseautomaten
Die Synthese gelöster Peptide als Referenzsubstanzen wurde an den Geräten 9050 der Fa.
Milligen bzw. AMS 422 der Fa. Abimed, Langenfeld durchgeführt. Alle Peptide wurden nach
der Fmoc/tBu-Taktik und Standardsyntheseprotokollen hergestellt.
Die Synthese der Bibliotheken an Cellulose als Träger wurde am ASP 222 Auto-Spot Roboter
der Fa. Abimed durchgeführt.
Materialien und Methoden
107
11.3.1 SPOT-Synthese
Die beschriebenen Parameter der Spot-Synthese werden manuell durchgeführt und in der
automatisierten Spot-Synthese eingesetzt. Aminosäuren mit folgenden Schutzgruppen werden
eingesetzt: Fmoc-Ala, Fmoc-Cys(Acm), Fmoc-Cys(Buthio), Fmoc-Asp(OtBu), FmocGlu(OtBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Gly, Fmoc-His, Fmoc-Ile, Fmoc-Lys(BOC), Fmoc-Leu, FmocMet, Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Pro, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Ser(tBu), FmocThr(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Trp(BOC), Fmoc-Tyr(tBu). Fmoc-Cys(Buthio) wird aufgrund der
permanenten Seitenkettenschutzgruppe nur für die Versuche zur Racemisierung gewählt.
11.3.1.1 Kettenverlängerungsreaktion
Die Fmoc-Aminosäuren (0,4 mmol) werden mit 1,5 eq. HOBt (94 mg; 0,6 mmol) versetzt und
in 2 mL aminfreiem NMP gelöst. Als Stammlösungen können sie als 2 mL Aliquots in
flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C gelagert werden.
Für die Synthese werden die Stammlösungen aufgetaut und die benötigten Mengen können
jeweils frisch entnommen werden. Zu jeder zu aktivierenden Aminosäurestammlösung werden
4 µL DIC (1,7 eq.; 0,033 mmol) je 100 µL Ansatz gegeben. Nach 30 min Aktivierungszeit
können diese Aliquots für die Synthese eingesetzt werden.
Parameter für die Synthese am Abimed-Spotroboter, Amidbindungen, Zyklus 2 bis n (n= Anz.):
•
Teflonnadel;
•
0,2 µL Spotvolumen;
•
3 Wiederholungen;
•
zwischen den Wiederholungen 2 min Reaktionszeit;
•
nach der letzten Wiederholung Auflegen von Glasplatten für 45 min (Inkubationszeit).
Nach jedem Zyklus (1 bis (n-1)):
Die Schritte werden mit jeweils 20 mL des beschriebenen Lösemittels pro Filter in einer
verschließbaren Wanne durchgeführt.
capping:
2 % Essigsäureanhydrid in DMF (v/v) für 30 sec, 2min,
waschen:
DMF für 30 sec, 2 min, 2min,
FmocAbspaltung: 20 % Piperidin in DMF (v/v) für 5 min (nach 2. Zyklus nur 3 min),
waschen:
DMF für 30 sec, 2 min, 2min ,
BPB:
Färben mit BPB in DMF mit ca. 20 mL je Filter einer 1:100 Verdünnung der
Stammlösung für 10 min (bis blaue Spots auf weißem Papier zu erkennen sind),
waschen:
Ethanol, techn. für 30 sec, 2 min, 2 min,
trocknen:
trocknen mit warmer Luft zwischen zwei Filterpapieren.
Nach dem letzten Zyklus (n) wird kein Cappingschritt durchgeführt, um ein unmodifiziertes
Aminoende zu erhalten.
Materialien und Methoden
108
11.3.1.2 Veresterung der ersten Aminosäure
Die Fmoc-Aminosäuren werden als 0,6 M Stammlösungen in DMF bei -20°C gelagert. Für die
Synthese werden sie aufgetaut und die jeweils benötigte Menge frisch entnommen.
Zur Aktivierung werden 50 µL (0,03 mmol) Stammlösung mit 14,6 mg Carbonyldiimidazol
bzw. 14,8 mg Carbonylditriazol (0,09 mmol) in 50 µL DMF gemischt. Nach 30 min
Aktivierungszeit können die Aliquots für die Synthese eingesetzt werden.
Parameter für die Synthese am Abimed-Spotroboter, Zyklus 1:
•
Stahlnadel;
•
0,1 µL Spotvolumen;
•
3 Wiederholungen;
•
zwischen den Wiederholungen 2 min Reaktionszeit;
•
nach der letzten Wiederholung Auflegen von Glasplatten für 45 min (Inkubationszeit).
Wasch und Cappingschritte s.o.
11.3.1.3 Abspalten der Seitenkettenschutzgruppen
Jeder Filter wird einzeln, jeweils für zweimal 60 min mit 20 mL Abspaltlösung, in einem gut
schließenden Gefäß behandelt. Nach 60 min wird die Lösung erneuert:
0,6 µL TIBS (3 %)
0,4 µL Wasser (2 %)
19 mL TFA (95%)
Die folgenden Schritte werden mit jeweils 20 mL Waschlösemittel pro Filter in einer
verschließbaren Wanne durchgeführt.
waschen:
DCM für 30 sek, 2 min, 2min, 2min,
DMF für 30 sek, 2 min, 2min,
Ethanol für 30 sek, 2 min,
1 M Essigsäure für 10 min, 10 min, 10 min,
Ethanol für 30 sek, 2 min, 2 min,
trocknen:
trocknen mit warmer Luft zwischen zwei Filterpapieren.
11.3.1.4 Abspalten vom Träger
Der Filter wird für ca. 18 Stunden über einer 45 %igen Trimethylamin-Lösung (v/v), in einem
gut schließenden Gefäß inkubiert. Dann wird der Filter für 60 min in einem Stickstoffstrom
entgast.
Die Spots werden ausgeschnitten und für 30 min in 20 µL DMSO eingeweicht. Je nach
anschließendem Test wird mit 180 µL PBS-Puffer pH = 7 oder 180 µL einer Wasser/Methanol
1:1 (v/v) Mischung das Peptid oder die Aminosäure eluiert.
Materialien und Methoden
109
11.4 Methodik
11.4.1 Fmoc-Abspaltung
11.4.1.1 Durchführung der Quantifizierung
Jeweils ein Spot zu 0,196 cm² bzw. 0,07 cm² werden in 1 mL 20 % Piperidin/DMF für 10 min
abgespalten. Diese Lösung wird dann in einer Quarzglasküvette gegen pures 20 %
Piperidin/DMF im Photometer bei 301 nm vermessen. Zur Berechnung der Konzentration dient
folgende Formel:
E ⋅ V[ mL] ⋅ 106
c[ nmol / Spot ] =
ε [ mL / ( mol ⋅ cm) ] ⋅ d[ cm]
(1)
mit V = 1 mL , g = 7231 und d = 1
Ist Papier als Träger eingesetzt gilt
für die Umrechnung der Spotgröße :
96-Raster
= 0,5 µL
= 0,196 cm²
425-Raster
= 0,2 µL
= 0,07 cm²
Ist die Polypropylenmembran das Trägermaterial ergibt sich für die Umrechnung der Spotgröße:
= 0,5 µL
= 0,07 cm²
11.4.1.2 Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten
Die Adsorptionen bei 301 nm verschieden konzentrierter Lösungen von Fmoc-Glycin in 20 %
Piperidin/DMF wurden bestimmt. Daraus ergibt sich mit:
c [mol/cm³]
6,7*10-5
6,7*10-6
E301 nm1,
0,477
0,050
E301 nm2,
0,469
0,054
E301 nmMittelwert
0,473
0,051
g
7000
7462
ein gemittelter Extinktionskoeffizient von 7200 mit einem Fehler von ca. 4 %. In den folgenden
Berechnungen wird dieser Adsorptionskoeffizient verwendet.
11.4.1.3 Abweichung
Fmoc-Glu(OtBu) wird mit 3 eq. CDI aktiviert und dreimal je 0,5 µL auf acht Spots verteilt.
Fmoc wird abgespalten und nach (1) quantifiziert.
Spot
1
nmol/cm² 346,4
2
328,1
3
340,8
4
322,5
Daraus ergibt sich ein Fehler von 3 %.
5
338,7
6
348,6
7
341,5
8
318,9
Materialien und Methoden
110
Für die Berechnung der Ausbeuten der Kopplungen mit Hilfe der Adsorption des
Dibenzofulven-Piperidin-Adduktes ergibt sich ein Gesamtfehler von ca. 5 %.
11.4.1.4 Berechnung der Standardabweichung STABWN
STABWN =
n∑ x 2 −
( ∑ x)
2
(2)
n2
mit n = asymptotisch erwartungstreue Schätzung und x = Zahl
11.4.2 Darstellung von Aktivierungsreagenzien
11.4.2.1 Synthese von ThDI
[Birkofer et al. (1961)]
In einem 100 mL Rundkolben werden 2,9 mL Trimethylsilylimidazol (0,02 mol) in 50 mL abs.
Toluol unter Stickstoffatmosphäre gelöst. Das Gemisch wird im Eis/Wasserbad auf 0°C gekühlt.
Aus einer Spritze werden tropfenweise 0,73 mL SOCl2 (0,01 mol) sehr langsam zugegeben.
Nach 30 Minuten wird das Eisbad entfernt. Unter reduziertem Druck wird das Lösemittel am
Rotationsverdampfer abgezogen und im Ölpumpenvakuum getrocknet.
1
O
1
N
N
S
N
3
2
H-NMR (Pyridin-d5, 400 MHz): = 8,52 [s, 1 H, C-1]; 7,35-7,65 [breit,
2 H, C-2/C-3].
13
N C-NMR (Pyridin-d5, 100 MHz): = 135,98 [C, C-1]; 131,61 [C, C-3];
116,32 [C, C-2].
11.4.2.2 Synthese von ThDT
In einem 100 mL Rundkolben werden 1,9 mL Trimethylsilyltriazol (0,01 mol) in 30 mL abs.
Toluol unter Stickstoffatmosphäre gelöst. Das Gemisch wird im Eis/Wasserbad auf 0°C gekühlt.
Aus einer Spritze werden tropfenweise 1,0 mL SOCl2 (0,01 mol) sehr langsam zugegeben. Nach
30 Minuten wird das Eisbad entfernt. Unter reduziertem Druck wird das Lösemittel am
Rotationsverdampfer abgezogen und im Ölpumpenvakuum getrocknet.
O
1
N
N
N
2
S
1
N
N
H-NMR (Pyridin-d5, 300 MHz): = 9,66 [s, 1 H, C-1]; 8,50 [s, 1 H, C-2].
13
N C-NMR (Pyridin-d5, 75 MHz): = 154,58 [C, C-1]; 145,52 [C, C-2].
Materialien und Methoden
111
11.4.2.3 Synthese von MSNT
[Jones et al. (1980)]
In einen 250 mL Rundkolben mit Trockenrohr werden 16,5 g 2-Mesitylensulfonylchlorid
(75 mmol) und 8,7 g 3-Nitro-1,2,4-triazol (75 mmol) eingewogen und in 100 mL THF unter
Rühren suspendiert. Unter Eiskühlung werden 12,7 mL Triethylamin (82,5 mmol) zugegeben.
Nach 2,5 Stunden wird das Eisbad entfernt. Wenn das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur
gekommen ist, wird über eine Glasfritte das ausgefallene Triethylammoniumchlorid filtriert und
das Lösemittel am Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck bis zur Trockene destilliert.
Das Rohprodukt wird in DCM aufgenommen und schnell dreimal mit Wasser ausgeschüttelt.
Die organische Phase wird mit Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel am Rotationsverdampfer
unter reduziertem Druck destilliert. Das Produkt wird aus Toluol zweimal umkristallisiert.
Ausbeute 12 g (55 %) weißes Produkt.
11.4.3 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren zur Veresterung
Die Fmoc-Aminosäuren werden nach der jeweiligen Vorschrift in einem Ansatz von 100 µL
aktiviert. Nach n min Aktivierungsdauer werden sie manuell aufgetragen. Dazu werden mit
einer Eppendorf-Pipette 0,5 µL punktförmig auf den Träger (Whatman 540 Cellulose)
aufgetragen. Je nach Zykluszahl wird dieser Vorgang nach 2 min Reaktionszeit wiederholt.
Nach Ende des Zyklus wird der Träger mit einer Glasplatte abgedeckt 30 min inkubiert.
11.4.3.1 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit MSNT
Es werden 0,5 µL einer 0,6 M Fmoc-Aminosäure Lösung (0,3 µmol) auf den Träger aufgetragen
und getrocknet.
Parallel dazu werden 6 mg (0,02 mmol) MSNT in 100µL 1,2,3-Trichlorpropan suspendiert, mit
1,6 µL (0,015 mmol) N-Methylimidazol versetzt und gut durchmischt. Das MSNT löst sich
dabei vollständig auf. Dann werden 0,5 µL diese Lösung auf die eingetrockneten FmocAminosäure Spots aufgetragen.
a) 1,2,3-Trichlorpropan
b) verschiedene Lösemittel
11.4.3.2 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren als isoliertes symmetrisches Anhydrid
Es werden 0,64 mmol Fmoc-Aminosäure in je 5 mL DCM gelöst und mit jeweils 45 µL N,N´Dicyclohexylcarbodiimid (0,20 mmol) versetzt und gut durchmischt. Nach einer Stunde wird
das Lösemittel am Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck destilliert. Der Niederschlag
wird in 6 mL DMF aufgenommen, mit 25 µL MeIm (0,32 mmol) versetzt und wieder gut
durchmischt. Nach 20 min Aktivierungszeit werden ein- bis dreimal alle 2 min 0,5 µL auf den
Träger aufgetragen.
Materialien und Methoden
112
11.4.3.3 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit DIC und MeIm
Es werden 0,03 mmol Fmoc-Aminosäure in 100 µL DMF gelöst und mit 4,6 µL DIC
(0,03 mmol) versetzt. Nach 10 min werden 2,4 µL MeIm (0,06 mmol) zugegeben und gut
durchmischt. Nach 20 min Aktivierungszeit werden ein- bis dreimal alle 2 min 0,5 µL auf den
Träger aufgetragen.
11.4.3.4 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren nach Sieber
Es werden 0,03 mmol Fmoc-Aminosäure in 100 µL DMF gelöst und mit 9 µL Pyridin
(0,099 mmol) versetzt. Nach 15 min werden 9 µL 2,6-Dichlorbenzoylchlorid (0,06 mmol)
dazugegeben und gut durchmischt. Nach 20 min Aktivierungszeit werden ein- bis dreimal alle
2 min 0,5 µL auf den Träger aufgetragen.
11.4.3.5 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit TFFH
Es werden 0,03 mmol Fmoc-Aminosäure in 100 µL DMF gelöst und mit 24 mg TFFH
(0,09 mmol) sowie 15 µL DIEA (0,09 mmol) versetzt und gut durchmischt. Nach 20 min
Aktivierungszeit werden ein- bis dreimal alle 2 min 0,5 µL auf den Träger aufgetragen.
11.4.3.6 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren nach Mitsunobu
Es werden 0,02 mmol Fmoc-Aminosäure in 100 µL THF gelöst und mit 0,02 mmol DiazoDerivat sowie 5,24 mg Triphenylphosphin (0,04 mmol) versetzt und gut durchmischt. Nach 20
min Aktivierungszeit werden ein- bis dreimal alle 2 min 0,5 µL auf den Träger aufgetragen.
Diazo-Derivate:
a) 3,5 µL Diethylazodicarboxylat
b) 5,1 mg Azodicarbonyldimorpholid
c) 5 mg Azodicarbonyldipiperidid
d) 3,4 mg Tetramethylazodicarboxamid.
11.4.3.7 Aktivierung der Fmoc-Aminosäuren mit Azoliden
Es werden 0,03 mmol Fmoc-Aminosäure in 100 µL DMF gelöst und mit 0,09 mmol des
entsprechenden Azolids versetzt und gut durchmischt. Nach 30 min Aktivierungszeit (für
Triazolide ca. 60 Minuten) werden ein- bis dreimal alle 2 min 0,5 µL Lösung auf den Träger
auftragen.
Varianten:
a) mit nur 0,03 mmol Azolid aktiviert
b) Zusatz von 0,015 mmol N-Methylimidazol
c) zwischen zwei Glasscheiben gepresst für 2 bzw. 5 min mikrowellenbestrahlt bei 600 W, bei
der Polypropylenmembran zusätzlich Papier zwischenlegen.
Materialien und Methoden
113
11.4.3.8 Untersuchung des Niederschlages der Aktivierung von Fmoc-Prolin mit CDI8
2
N
3
N
1
H-NMR (CDCl3, 600 MHz): = 8,22 [s, 1 H, C-1]; 7,6 [dttd, 4 H,
C-13/C-16]; 7,49 [d, 1 H, C-2]; 7,48 [dttd, 2 H, C-14]; 7,42 [dttd, 2
H, C-15]; 7,11 [d, 1 H, C-3]; 4,70 [ddd, 1 H, C-5]; 4,35 [tm, 1 H, C11]; 4,33 [ddt, 2 H, C-10]; 3,60 [dd, 2 H, C-8]; 2,14 [dd, 2 H, C-6];
1,99 [d, 2 H, C-7]
1
6
7
O
5 O
N
9
O
8
14
17
15
16
11.4.4 Nebenreaktionen - Ester
11.4.4.1 Diketopiperazinbildung
Im ersten Zyklus wird Fmoc-Prolin nach Vorschrift mit 1 eq. CDT und MeIm aktiviert und
Fmoc-Lysin mit 1 eq. CDI aktiviert und dreimal 0,5 µL auf Papier aufgetragen. Nach
Beendigung der Reaktionszeit wird Fmoc nach Vorschrift abgespalten, der Träger gewaschen
und für den nächsten Zyklus vorbereitet. Die Kupplung wird nach dem Syntheseprotokoll
ausgeführt. Die Fmoc-Abspaltung wird für 2, 5, 30 und 60 min durchgeführt. Der Träger wird
danach wieder gewaschen und für den letzten Zyklus vorbereitet. Im letzten Zyklus wird Glycin
auf alle Spots gegeben. Nach Vorschrift wird inkubiert und Fmoc wieder abgespalten.
11.4.4.2 Stabilität der Fmoc-Aminosäuren gegen CDI/CDT bzw. Im/Ta
10 µL einer 0,6 M Fmoc-Phenylalanin Lösung werden zu einer 20 %igen Lösung aus Imidazol
oder Triazol bzw CDI oder CDT in DMF gegeben. Nach 2, 5, 15 und 60 min werden 100 µL
abgenommen und in 900 µL TFA/Wasser 1:1 zum Abstoppen der Reaktion gegeben. Mit Hilfe
der HPLC wird die Stabilität der Fmoc-Aminosäure in Abhängigkeit der Zeit untersucht.
11.4.4.3 Durchführung der Racemisierungsuntersuchung
Die Peptide werden nach den jeweiligen Vorschriften auf Papier verestert, die N-terminale und
die Seitenkettenschutzgruppe werden abgespalten und danach werden die Esterbindungen in der
Trimethylamingasatmosphäre gespalten. Die Aminosäure wird jeweils mit Wasser/Methanol 1:1
eluiert. Unter reduziertem Druck werden die Proben bis zur Trockene eingeengt und nach
8
Für die Hilfe bei der Analyse des 1H-COSY-NMR bedanke ich mich bei Dr. V. Wray.
Materialien und Methoden
114
[Blankemeyer-Menge (1990)] derivatisiert. Dann liegen sie C-terminal als Ethylester und Nterminal trifluoracetyliert vor. Arginin wird zuvor zu Ornitin und Histidin anschließend mit
Ethylchlorformiat versetzt.
11.4.5 Qualitätskontrolle
11.4.5.1 Synthese des 11-mers
Die Synthese vonSFERFEIFPKE wird Fmoc-Lysin nach etablierter Methode mit CDI aktiviert
und 0,5 µL manuell auf unbehandelte Cellulose aufgetragen. Die Aktivierung und Behandlung
der weiteren Zyklen wird nach dem Standardprotokoll durchgeführt. Die Abspaltung vom
Träger wird in einem gut schließenden Gefäß in einer Trimethylamin bzw. AmmoniakAtmosphäre 18 Stunden inkubiert. Danach wird das Peptid mit 10 % DMSO in PBS-Puffer
eluiert. Die Qualitätskontrolle wird mit Hilfe der HPLC durchgeführt.
11.4.5.2 Qualitätskontrolle mit Hilfe einer Radioaktivitätsanalyse
Es werden sieben verschiedene Peptide (ELREQLSSVSSFERF, EQLSSVSSFERFEIF,
SSVSSFERFEIFPKE, SSFERFEIFPKESSW, ERFEIFPKESSWPNH, EIFPKESSWPNHNTT,
PKESSWPNHNTTKGV) einer Länge von 15 Aminosäuren manuell nach etabliertem Protokoll
synthetisiert. Zuletzt wird 13C-radioaktiv markiertes Biotin mit DIC/HOBt aktiviert und
gekoppelt. Die Peptide werden dann nach dem etablierten Protokoll von den Seitenketten befreit
und die Esterbindungen zum Träger mit Trimethylamin gespalten.
Die Proben werden wie folgt in einem Probenröhrchen mit jeweils 5 mL Szintillationslösung
inkubiert:
•
•
•
jeweils alle sieben Peptide ohne Abspaltung,
jeweils alle sieben Peptide nach Abspaltung und nach Elution mit 10 % DMSO in PBSPuffer,
jeweils die sieben Elutionslösungen mit den abgespaltenen Peptiden.
Nach 10 Minuten Inkubation werden die Probenröhrchen in den Szintillationszähler gestellt und
jeweils eine Minute vermessen. Die sich daraus ergebenden Werte sind in cpm angegeben und
werden miteinander verglichen, um die prozentuale Abspaltung zu ermitteln.
Materialien und Methoden
115
11.5 T-Zell Analysen
11.5.1 Vorbereitung für die Analysen
Die Peptidsynthese wird nach der Spot-Methode durchgeführt. Die erste Aminosäure wird durch
CDI-Aktivierung am Celluloseträger verestert, der weitere Kettenaufbau erfolgt nach
etabliertem Protokoll. Danach werden die Peptide in einer Trimethylaminlösung abgespalten.
Nachdem der Filter in einem Stickstoffstrom entgast wurde, werden die Spots mit den einzelnen
Peptiden in Mikrotiterplatten separiert. Pro Spot werden 20 µL DMSO und nach 30 Minuten
180 µL PBS-Puffer zugegeben und über Nacht so die Peptide eluiert. Für den biologischen Test
werden jeweils kleine Aliquots entnommen.
11.5.2 Durchführung der zellulären Analysen
Die zellulären Analysen wurden nach etablierten Protokollen durchgeführt: die
Proliferationsanalyse nach [Darji et al. (1998)] und die Zytotoxizitätsanalysen nach [Matzinger
(1991)], falls nicht anders erwähnt in der Maus des Inzuchtstammes BALB/c.
11.6 Polyamide
11.6.1 Durchführung des JENA-Tests
Zur Darstellung der homogenisierten Lachssperma-DNA werden 40 mg DNA in bidest. Wasser
gelöst und im Ultraschallbad unter Eiskühlung zerkleinert. Die Größe der DNA-Stränge wird
mit einer Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung des DNA-Längenstandards VII mit
Fragmentlängen von 8000 bis 370 Basenpaaren bestimmt. Für die Bestimmung wird ein
0,8 %iges Gel gegossen. Der Laufpuffer ist TBE. Zum Auftragen in die eingegossenen Taschen
werden 5 µL der Markerlösung mit 1 µL Probenpuffer versetzt bzw. 2 µL DNA werden mit
3 µL Laufpuffer und 1 µL Probenpuffer versetzt. Die Elektrophorese wird bei 5 V/cm
durchgeführt. Die DNA Detektion wird mit Hilfe von Ethidiumbromid durchgeführt. Die
homogenisierte DNA weist Fragmente der Länge 3500 bis ca. 100 Basenpaaren auf.
Die Bausteine werden jeweils in einer Konzentration von 1 mg/mL in Methanol gelöst. Auf
einer wasserbenetzbare Kieselgel-RP-18-HPTLC-Platten mit Fluoreszenzindikator werden
nebeneinander im Abstand von 1 cm auf einer horizontalen Startlinie jeweils 5 µL gelöste
Substanz aufgetragen. Einen Zentimeter oberhalb des einen Flecks werden 5 µL der gelösten,
homogenisierten Lachssperma-DNA (Konzentration 2 mg/mL) aufgetragen. In einer
Dünnschichtkammer in einem Laufmittelgemisch 1 M Ammoniumacetat/Methanol 1:4 (v/v)
wird die Karte entwickelt. Unter UV-Licht können die unterschiedlichen Laufverhalten
ausgewertet werden [Maul (1997)].
Materialien und Methoden
116
11.6.1.1 Berechnung des Rf-Wertes für die Dünnschichtchromatographische Untersuchung
Xcomp.[ cm]
Rf =
mit:
(3)
X Laufm.[ cm]
Rf
Xcomp.
XLaufm.
= Retentionsfaktor
= zurückgelegte Laufstrecke der Substanz ab Startlinie
= zurückgelegte Laufstrecke des Lösemittels ab Startlinie
11.6.2 Darstellung von Fmoc-3-Aminopyrazol-4-carbonsäure (349,35 g/mol)
In einem 100 mL Rundkolben werden unter Stickstoffatmosphäre 254 mg 3-Aminopyrazol-4carbonsäure (2) (2 mmol) unter Zusatz von 1 mL DMF in 40 mL DCM gelöst. Unter Rühren
werden 685 µL DIEA und 621 mg 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (2,4 mmol) zugegeben.
Danach werden 40 mL Diethylether zugegeben und mit 2 %iger NaHCO3 gewaschen. Die
wäßrige Phase wird noch zweimal mit Ether extrahiert. Die organischen Phasen werden vereint
und dreimal mit Wasser gewaschen. Die wäßrige Phase wird mit 1M Salzsäure angesäuert. Bei
pH=2 fällt ein Niederschlag aus. Werden die wäßrige Phase und der Niederschlag mit Essigester
extrahiert löst er sich wieder auf. Die organische Phase wird mit MgSO4 getrocknet. Das
Lösemittel wird am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck destilliert.
Es wurden 295 mg (42 %) glänzend weiße Blättchen erhalten.
H2N
HO 1
1
3 N
O
N
2
5
4
6
O
O
7
9
8
10
11
ESI-MS: M = 349,1
13
12
H-NMR (DMSO-d6; 300 MHz): = 8,24 [s, 1 H, C-4];
7,92 [d, 1 H, C-12]; 7,73 [d, 1 H, C-9]; 7,44 [t/m, 2 H, C11]; 7,35 [t/m, 2 H, C-10]; 5,88 [s, 1 H, NH]; 4,69 [d, 2
H, C-6]; 4,45 [t, 1 H, C-7].
13
C-NMR (DMSO-d6; 75 MHz): = 164,28 [C, C-5];
157,46 [C, C-1]; 150,63 [C, C-3]; 143,14 [C, C-8]; 140,75
[C, C-13]; 134,58 [C, C-4]; 127,88 [CH, C-11]; 127,25
[CH, C-10]; 125,14 [CH, C-9]; 120,22 [CH, C-12];
105,37 [CH, C-2]; 68,96 [CH2,C-6]; 46,13 [CH, C-7].
Materialien und Methoden
117
11.6.3 Darstellung von Fmoc-3-Aminobenzoesäure (359,39 g/mol)
75 mg 3-Aminobenzoesäure (0,55 mmol, 1 eq.) (4-3) werden in 10 mL abs. Dioxan in einem
50 mL Rundkolben mit Trockenrohr gerührt. 100 mg 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid
(0,39 mmol, 0,7 eq.) und 125 µL DIEA (1 mmol, 1,7 eq.) werden in 5 mL Dioxan gelöst und
dazugegeben. Erst jetzt tritt vollständiges Lösen der Komponenten ein. Es wird über Nacht bei
Raumtemperatur gerührt.
Danach werden 10 mL Diethylether zugegeben und mit 2 %iger NaHCO3 gewaschen. Die
wäßrige Phase wird noch zweimal mit Ether extrahiert. Die organischen Phasen werden vereint
und dreimal mit Wasser gewaschen. Die wäßrige Phase wird mit 1M Salzsäure angesäuert. Bei
pH=2 fällt ein Niederschlag aus. Wird die wäßrige Phase und der Niederschlag mit Essigester
extrahiert, löst er sich wieder auf. Die organische Phase wird mit MgSO4 getrocknet. Das
Lösemittel wird am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck destilliert.
Es wurden 95 mg (48 %) eines leicht rosafarbenden Pulvers erhalten.
1
H-NMR (DMSO-d6; 300 MHz): = 8,12 [s, 1 H,
C-3]; 7,91[d, 2 H, C-15]; 7,76[d, 2 H, C-12]; 7,67
O
H
3
[d, 1 H, C-5]; 7,57 [d/m, 1 H, C-7]; 7,43-7,35 [m, 4
O 8 N 4
2
10
1 OH H, C-14, C-13]; 7,38 [m, 1 H, C-6]; 4,49 [d, 2 H, C9
16
11
O
9]; 4,31 [t, 1 H, C-10].
7
5
12
15
13
6
C-NMR (DMSO-d6; 75 MHz): = 143,70 [C, C359,39 g/mol
14 13
16]; 140,78 [C, C-11]; 139,28 [C, C-4]; 131,42 [C,
C-2]; 128,94 [CH, C-3]; 127,67 [CH, C-14]; 127,10 [CH, C-13]; 125,10 [CH, C-12]; 123,29
[CH, C-5]; 122,32 [CH, C-6]; 120,16 [CH, C-15]; 118,97 [CH, C-7]; 65,66 [CH2, C-9]; 46,57
[CH, C-10].
11.6.4 Darstellung von BOC-2-Aminobenzoesäure
In einen trockenen 50 mL Rundkolben werden 2,7 g 2-Aminobenzoesäure (0,02 mol) in 15 mL
Dioxan und 10 mL 2 N Natronlauge unter Rühren gelöst. Bei 0°C werden 4,8 g BOC-Anhydrid
(0,022 mol) gelöst in 5 mL Dioxan zugetropft. Nach 18 Stunden ist ein hellgelber Niederschlag
ausgefallen. Das Lösemittel wird unter reduziertem Druck am Rotationsverdampfer abgezogen.
Der Rückstand wird mit gesättigter NaHSO4 aufgenommen und mit Essigester dreimal
extrahiert. Die organische Phase wird mit MgSO4 getrocknet und das Lösemittel am
Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck destilliert.
Es werden 3,9 mg zitronengelbes Produkt (88 %) isoliert.
Materialien und Methoden
118
1
H-NMR (DMSO-d6; 300 MHz): = 8,28 [d, 1 H, C-7]; 7,95 [dd,
1 H, C-4]; 7,56 [dt, 1 H, C-6]; 7,07 [t, 1 H, C-5]; 1,48 [s, 9 H, C-10,
H
2
O
N 3
11, 12].
7 13
8
C-NMR (DMSO-d6; 75 MHz): = 169,54 [C, C-8]; 151,96 [C, C11
4
6 1]; 141,45 [C, C-3]; 134,27 [CH, C-4]; 131,23 [CH, C-7]; 121,46
12 9 10
5
[CH, C-5]; 118,00 [CH, C-6]; 115,03 [C, C-2]; 80,15 [C, C-9]; 27,91
[CH3, C-10, 11, 12].
221,26 g/mol
HO 1 O
11.6.5 Darstellung von BOC-3-Aminobenzoesäure
In einen trockenen 50 mL Rundkolben werden 2,7 g 3-Aminobenzoesäure (0,02 mol) in 15 mL
Dioxan und 10 mL 2 N Natronlauge unter Rühren gelöst. Bei 0°C werden 4,8 g BOC-Anhydrid
(0,022 mol) gelöst in 5 mL Dioxan zugetropft. Nach 18 Stunden ist ein hellgelber Niederschlag
ausgefallen. Das Lösemittel wird unter reduziertem Druck am Rotationsverdampfer abgezogen.
Der Rückstand wird mit gesättigter NaHSO4 aufgenommen und mit Essigester dreimal
extrahiert. Die organische Phase wird mit MgSO4 getrocknet und das Lösemittel am
Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck destilliert.
Es werden 3,2 mg hellrosa Produkt (72 %) isoliert.
1
H-NMR (DMSO-d6; 300 MHz): = 8,15 [s, 1 H, C-3]; 7,61
[d, 1 H, C-5]; 7,53 [dd, 1 H, C-7]; 7,36 [t, 1 H, C-6]; 1,48 [s, 9
O
2
1 OH H, C-10, 11, 12].
8
11
13
5
C-NMR (DMSO-d6; 75 MHz): = 167,21 [C, C-8]; 152,72
7
9
12
[C, C-1]; 139,73 [C, C-4]; 131,18 [C, C-2]; 128,81 [CH, C-3];
10
6
122,90 [CH, C-5]; 122,24 [CH, C-6]; 118,72 [CH, C-7]; 79,33
221,26 g/mol
[C, C-9]; 28,08 [CH3, C-10, 11, 12].
H
3
N 4
O
11.6.6 Aktivierung für Amidbindung
11.6.6.1 Aktivierung mit PyBOP
Es werden 0,02 mmol des geschützten Bausteins mit 10,4 mg PyBOP (0,02 mmol) gemischt und
in 100 µ L DMF gelöst. Dann werden 6,8 µ L DIEA zugegeben und nach 30 min
Aktivierungszeit manuell dreimal alle 2 min 0,5 µL auf den Träger aufgetragen.
Materialien und Methoden
119
11.6.6.2 Aktivierung mit TBTU
Es werden 0,02 mmol des geschützten Bausteins mit 6,4 mg TBTU (0,02 mmol) gemischt und
in 100 µL DMF gelöst. Dann werden 6,8 µL DIEA (0,04 mmol) zugegeben und nach 30 min
Aktivierungszeit manuell dreimal alle 2 min 0,5 µL auf den Träger aufgetragen.
11.6.6.3 Aktivierung mit TFFH
Es werden 0,02 mmol des geschützten Bausteins mit 5,3 mg TFFH (0,02 mmol) gemischt und
in 100 µL DMF gelöst. Dann werden 6,8 µL DIEA (0,04 mmol) zugegeben und nach 30 min
Aktivierungszeit manuell dreimal alle 2 min 0,5 µL auf den Träger aufgetragen.
11.6.6.4 Aktivierung mit DIC/HOBt
Es werden 0,02 mmol des geschützten Bausteins mit 4,7 mg HOBt (0,035 mmol) gemischt und
in 100 µL DMF gelöst. Dann werden 4 µL DIEA (0,026 mmol) zugegeben und nach 30 min
Aktivierungszeit manuell dreimal alle 2 min 0,5 µL auf den Träger aufgetragen. Variante:
zwischen zwei Glasplatten gepresst für 2 bzw. 5 min mikrowellenbestrahlt bei 600 W, bei der
Polypropylenmembran zusätzlich Papier zwischenlegen.
11.6.7 Untersuchung der Reaktivität der Bausteine
11.6.7.1 Reaktion mit Essigsäureanhydrid
Es werden 0,2 mmol der individuellen Bausteine in 500 mL DMF gelöst. Dann werden 500 mL
Essigsäureanhydrid zugegeben und gut durchmischt. Nach 3 Stunden werden 5 µL entnommen
und mit 100 µL Acetonitril verdünnt. Mit der HPLC (S2) wird das entstandene Produkt
untersucht.
11.6.7.2 Reaktion mit Benzoylchlorid
Es werden 0,2 mmol der individuellen Bausteine in 700 mL DMF gelöst und mit 100 µL Pyridin
sowie 100 µL Benzoylchlorid versetzt. Die Probe wird gut durchmischt. Nach 3 Stunden werden
5 µL entnommen und mit 100 µL Acetonitril verdünnt. Mit der HPLC (S2) wird das entstandene
Produkt untersucht.
Literatur
120
VI Literatur
Adler, S., Frank, R., Lanzavecchia, A. & Weiss, S. (1994).
T cell epitope analysis with peptides simultaneously synthesized on cellulose membranes: fine
mapping of two DQ dependent epitopes. FEBS Letters 352, 167-170.
Afonina, I., Zivarts, M., Kutyavin, I., Lukhtanov, E., Gamper, H. & Meyer, R.B. (1997).
Efficient priming of PCR with short oligonucleotides conjugated to a minor groove binder.
Nucleic Acids Research 25, 2657-2660.
Anderson, G.W., Zimmerman, J.E. & Callahan, F. M. (1967).
A reinvestigation of the mixed carbonic anhydride method of peptide synthesis. J. Am. Chem.
Soc. 89, 5012-5017.
Anderson, G.W. & Paul, R. (1958).
N,N´-Carbonyldiimidazole, a new reagent for peptide synthesis. J. Am. Chem. Soc. 80, 4423.
Atherton, E. & Sheppard, R. C. (1989).
„Resin cleavage and purification“. In: Solid phase peptide synthesis, a practical approach, pp.
149-161. Eds. D. Rickwood & B. D. Hames. IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
ISBN 0-19-963067-4.
Atherton, E., Benoiton, N.L., Brown, E., Sheppard, R.C. & Williams, B.J. (1981).
Racemisation of activated, urethane-protected amino-acids by p-dimethylaminopyridine.
Significance in solid-phase peptide synthesis. J. Chem. Soc., Chem. Comm. 336-337.
Atherton, E., Fox, H., Harkiss, D., Logan, C.J., Sheppard, R.C. & Williams, B.J. (1978).
A mild procedure for solid phase peptide synthesis: Use of fluorenylmethoxycarbonylaminoacids. J. Chem. Soc., Chem. Comm. 537-539.
Baird, E.E., & Dervan, P.B. (1996).
Solid phase synthesis of polyamides containing imidazole and pyrrole amino acids. J. Am.
Chem. Soc. 118, 6141-6146.
Barlos, K., Gatos, D., Kallitsis, J., Papaioannou, D., Sotiriou, P. & Schäfer, W. (1987).
Verknüpfung von Aminosäuren mit Hydroxygruppen enthaltenden Harzen und ihre Anwendung
zur Synthese von Peptiden mit N-Tritylaminosäure-(1-benzotriazolylestern). Liebigs Ann.
Chem., 1031-1035.
Literatur
121
Behrens, C. & Nielsen P.E. (1998).
A combinatorial approach to new DNA minor groove binders. Comb. Chem. High Throughput
1, 127-134.
Birkofer, L., Gilgenberg, W. & Ritter, A. (1961).
Reaktionen von N-Trimethylsilyl-imidazol mit Chloriden des Phosphors und Schwefels. Angew.
Chem. 73, 143.
Bjorkman, P.J., Saper, M.A., Samraoui, B., Bennett, W.S., Strominger, J.L. & Wiley, D.C.
(1987a).
Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature 329, 506-512.
Bjorkman, P.J., Saper, M.A., Samaraoui, B., Bennett, W.S., Strominger, J.L. & Wiley, D.C.
(1987b).
The foreign antigen binding site and T cell recognition regions of class I histocompatibility
antigens. Nature 329, 512-518.
Blankemeyer-Menge, B. (1990).
„Entwicklung einer segmentträgergestützten Synthesestrategie für die Darstellung längerer
Peptide durch Fragmentkopplung“. Dissertation, Technische Universität Carlo-Wilhelmina zu
Braunschweig.
Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M. & Frank, R. (1990).
An efficient method for anchoring Fmoc-amino acids to hydroxyl-functionalised solid supports.
Tetrahedron Lett. 31, 1701-1704.
Bodanszky, M., Deshmane, S.S. & Martinez, J. (1979).
Side reactions in peptide synthesis. 11.1 Possible removal of the 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl
group by the amino components during coupling. J. Org. Chem. 44, 1622-1625.
Brenner, S. & Lerner, R.A. (1992).
Encoded combinatorial chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5381-5383.
Brown, E.L., Wooters, J.L., Ferenz, C.R., O´Brien, C.M., Hewick, R.M.. & Herrmann, S.H.
(1994).
Characterization of peptide binding to the murine MHC class I H-2Kk molecule. J. Immunol.
153, 3079-3092.
Literatur
122
Brown, J.H., Jardetzky, T.S., Gorga, J.C., Stern, L.J., Urban, R.G., Strominger, J.L. & Wiley,
D.C. (1993).
Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA-DR1. Nature
364, 33-39.
Caddick, S. (1995).
Microwave assisted organic reactions. Tetrahedron 51, 10403-10432.
Carpino, L.A. & El-Faham, A. (1995).
Tetramethylfluoroformamidinium hexafluorophosphate: A rapid-acting peptide coupling reagent
for solution and solid phase peptide synthesis. J. Am. Chem. Soc. 117, 5401-5402
Carpino, L.A., Cohen, B.J., Stephens, K.E. Jr., Sadat-Aalaee, S.Y., Tien, J.-H., Langridge, D.C.
(1986).
((9-Fluorenylmethyl)oxy)carbonyl (Fmoc) amino acid chlorides. Synthesis, characterization, and
applicaton to the rapid synthesis of short peptide segments. J. Org. Chem. 51, 3732-3734.
Carpino, L.A. & Han, G.Y. (1970).
The 9-flourenylmethoxycarbonyl function, a new base-sensitive amino-protecting group. J. Am.
Chem. Soc. 92, 5748-5749.
Caton, A.J. & Brownlee, G.G. (1982).
The antigenic structure of the influenza virus A/PR/8/34 hemagglutinin (H1 subtype). Cell 31,
417-427.
Chan, W.C. & White, P.D. (eds.) (2000).
„Fmoc solide phase peptide synthesis: a practical approach“. In: The practical approach series;
222, p.253. Oxford University Press Inc., New York, ISBN 0-19-963724-5.
Colombo, R., Colombo, F. & Jones, J.H. (1984).
Acid-labile histidin side-chain protection: the N( )-t-butoxymethyl group. J. Chem. Soc., Chem.
Commun. 292-293.
Darji, A. et al.(2000).
Persönliche Mitteilung.
Darji, A., Bruder, D., zur Lage, S., Gerstel, B., Chakraborty, T., Wehland, J. & Weiss, S. (1998).
The role of the bacterial membrane protein Act A in immunity and protection against Listeria
monocytogenes. J. Immunol. 161, 2414-2420.
Literatur
123
Dittrich, F., Tegge, W. & Frank, R. (1998).
„Cut and combine“: An easy membrane-supported combinatorial synthesis technique. Bioorg.
Med. Chem. Lett. 8, 2351-2356.
Dooley, C.T. & Houghten, R.A. (1993).
The use of positional scanning synthetic peptide combinatorial libraries for the rapid
determination of opioid receptor ligands. Life Sci. 52, 1509-1517.
Egner, B.J., Rana, S., Smith, H., Bouloc, N., Frey, J.G., Brocklesby, W.S. & Bradley, M. (1997).
Tagging in combinatorial chemistry: the use of coloured and fluorescent beads. Chem. Commun.
8, 735-736.
Eichler, J., Bienert, M., Stierandova, A. & Lebl, M. (1991).
Evaluation of cotton as a carrier for solid-phase peptide synthesis. Peptide Res. 4, 296-307.
Fields, G.B. & Noble, R.L. (1990).
Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids. Int. J. Peptide
Protein Res. 35, 161-214.
Fodor, S.P.A., Read, J.L., Pirrung, M.C., Stryer, L., Lu, A.T. & Solas, D. (1991).
Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 251, 767-773.
Frank, R. (2000).
Persönliche Mitteilung.
Frank, R. (1995).
Simultaneous and combinatorial chemical synthesis techniques for the generation and screening
of molecular diversity. J. Biotechnol. 41, 259-272.
Frank, R. (1993).
Strategies and techniques in simultaneous solid phase synthesis based on the segmentation of
membrane type supports. Bioorg. Med. Chem. Lett. 3, 425-430.
Frank, R. (1992).
Spot-synthesis: An easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis
on a membrane support. Tetrahedron 48, 9217-9232.
Frank, R. & Döring, R. (1988).
Simultaneous multiple peptide synthesis under continuous flow conditions on cellulose paper
discs as segmental solid supports. Tetrahedron 44, 6031-6040.
Literatur
124
Frank, R., Heikens, W., Heisterberg-Moutsis, G. & Blöcker, H. (1983).
A new general approach for the simultaneous chemical synthesis of large numbers of
oligonucleotides: segmental solid supports. Nucleic Acids Res. 11, 4365-4377.
Furka, Á., Sebestyén, F., Asgedom, M. & Dibó, G. (1991).
General method for rapid synthesis of multicomponent peptide mixtures. Int. J. Peptide Protein
Res. 37, 487-493.
Garboczi, D.N., Ghosh, P., Utz, U., Fan, Q.R., Biddison, W.E. & Wiley, D.C. (1996).
Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2. Nature
384, 134-141.
Geysen, H.M., Wagner, C.D., Bodnar, W.M., Markworth, C.J., Parke, G.J., Schoenen, F.J.,
Wagner, D.S. & Kinder, D.S. (1996).
Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology 3, 679-688.
Geysen, H.M., Rodda, S.J. & Mason, T.J. (1986).
A priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant. Mol.
Immunol. 23, 709-715.
Geysen, H.M., Meloen, R.H. & Barteling, S.J. (1984).
Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino
acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3998-4002.
Gibson, F.S. & Rapoport, H. (1995).
Carboxy terminus coupling using 1,1´-carbonylbis(3-methylimidazoliumtriflate) (CBMIT) in the
presence of Cu(II) salts. J. Org. Chem. 60, 2615-2617.
Gisin, B.F. & Merrifield, R.B. (1972).
Carboxyl-catalyzed intramolecular aminolysis. A side reaction in solid-phase peptide synthesis.
J. Am. Chem. Soc. 94, 3102-3106.
Gottesfeld, J.M., Neely, L., Trauger, J.W., Baird, E.E. & Dervan, P.B. (1997).
Regulation of gene expression by small molecules. Nature 387, 202-205.
Granitza, D., Beyermann, M., Wenschuh, H., Haber, H., Carpino, L.A., Truran, G.A. & Bienert,
M. (1995).
Efficient acylation of hydroxy functions by means of Fmoc amino acid fluorides. J. Chem. Soc.,
Chem. Commun., 2223-2224.
Literatur
125
Houghten, R.A. (1985).
General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: Specificity of
antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82, 5131-5135.
Jones, S. S., Rayner, B., Reese, C. B., Ubasawa, A. & Ubasawa, M. (1980).
Synthesis of the 3´-terminal decaribonucleoside nonaphosphate of yeast alanine transfer
ribonucleic acid. Tetrahedron 36, 3075-3085.
Kaiser, E., Colescott, R.L., Bossinger, C.D. & Cook, P.I. (1970).
Color test for detection fo free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.
Anal. Biochem. 34, 595-598.
Kerr, J. M., Banville, S.C. & Zuckermann, R N. (1993).
Encoded combinatorial peptide libraries containing non-natural amino acids. J. Am. Chem. Soc.
115, 2529-2531.
Khosla, M.C., Smeby, R.R. & Bumpus, F.M. (1972).
Failure sequence in solid-phase peptide synthesis due to the presence of an N-alkylamino acid.
J. Am. Chem. Soc. 94, 4721-4724.
Kielkopf, C. L., Bremer, R. E., White, S., Szewczyk, J. W., Turner, J. M., Baird, E. E., Dervan,
P. B. & Rees, D. C. (2000).
Structural effects of DNA sequence on T•A recognition by hydroxypyrrole/pyrrole pairs in the
minor groove. J. Mol. Biol. 295, 557-567.
Kielkopf, C.L., White, S., Szewczyk, J.W., Turner, J.M., Baird, E.E., Dervan, P.B. & Rees, D.C.
(1998).
A structural basis for recognition of A•T and T•A base pairs in the minor groove of B-DNA.
Science 282, 111-114.
Klemm. D., Philipp, B., Heinze, T., Heinze, U. & Wagenknecht, W. (1998).
„Swelling and dissolution of cellulose“. In: Comprehensive Cellulose Chemistry, Volume 1,
Fundamentals and Analytical Methods, pp. 43-60. Wiley-VCH, Weinheim, Germany. ISBN 3527-29413-9.
König, B. & Rödel, M. (1998).
Synthesis of DNA-binding heteroaromatic oligoamides on liquid support. Chem. Commun. 605606.
Literatur
126
König, W. & Geiger, R. (1970).
Eine neue Methode zur Synthese von Peptiden: Aktivierung der Carboxylgruppe mit
Dicyclohexylcarbodiimid unter Zusatz von 1-Hydroxy-benzotriazolen. Chem. Ber. 103, 788798.
Krch¦ák, V., Cabel, D., Weichsel, A. & Flegelová, Z. (1994).
Esterification of polymer-supported hydroxyl groups using the Mitsunobu reaction. Letters in
Peptide Science 1, 277-282.
Krch¦ák, V., Vágner, J. & Lebl, M. (1988).
Noninvasive continuous monitoring of solid-phase peptide synthesis by acid-base indicator. Int.
J. Peptide Protein Res. 32, 415-416.
Lam, K.S., Salmon, S.E., Hersh, E.M., Hruby, V.J., Kazmierski, W.M. & Knapp, R.J. (1991).
A new type of synthetic peptide library for identifying ligand-binding activity. Nature 354, 8284.
Madden, D.R., Gorga, J.C., Strominger, J.L. & Wiley, D.C. (1992).
The three-dimensional structure of HLA-B27 at 2.1 Å resolution suggests a general mechanism
for tight peptide binding to MHC. Cell 70, 1035-1048.
Maeji, N.J., Bray, A.M. & Geysen, H.M. (1990).
Multi-pin peptide synthesis strategy for T cell determinant analysis. J. Immunol. Meth. 134, 2333.
Matzinger, P. (1991).
The JAM test. A simple assay for DNA fragmentation and cell death. J. Immunol. Meth. 145,
185-192.
Maul, C. (1997).
„Biomolekular-Chemisches Screening: Etablierung einer neuartigen Strategie für die
Wirkstoffsuche sowie Isolierung und Strukturaufklärung neuer Naturstoffe“. Dissertation,
Friedrich-Schiller-Universität Jena.
Merrifield, R.B., Mitchell, A.R. & Clarke, J.E. (1974).
Detection and prevention of urethane acylation during solid-phase peptide synthesis by
anhydride methods. J. Org. Chem. 39, 660-668.
Merrifield, R.B. (1963).
Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 21492154.
Literatur
127
Mitsunobu, O. (1981).
The use of diethyl azodicarboxylate and triphenylphosphine in synthesis and transformation of
natural products. Synthesis, 1-28.
Moran, E.J., Sarshar S., Cargill, J.F., Shahbaz, M.M., Lio, A., Mjalli, A.M.M. & Armstrong,
R.W., (1995).
Radio frequency tag encoded combinatorial library method for the discovery of tripeptidesubstituted cinnamic acid inhibitors of the protein tyrosine phosphatase PTP1B. J. Am. Chem.
Soc. 117, 10787-10788.
Mrksich, M., Parks, M.E. & Dervan, P.B. (1994).
Hairpin peptide motif. A new class of oligopeptides for sequence-specific recognition in the
minor groove of double-helical DNA. J. Am. Chem. Soc. 116, 7983-7988.
Mrksich, M., Wade, W.S., Dwyer, T.J., Geierstanger, B.H., Wemmer, D.E. & Dervan, P.B.
(1992).
Antiparallel side-by-side dimeric motif for sequence-specific recognition in the minor groove of
DNA by the designed peptide 1-methylimidazole-2-carboxamide netropsin. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89, 7586-7590.
Nielsen, P.E., Egholm, M., Berg, R.H. & Buchardt, O. (1991).
Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted
polyamide. Science 254, 1497-1500.
Ohlmeyer, M.H.J., Swanson, R.N., Dillard, L.W., Reader, J.C., Asouline, G., Kobayashi, R.,
Wigler, M. & Still, W.C. (1993).
Complex synthetic chemical libraries indexed with molecular tags. Proc. Natl. Acad. Sci. 90,
10922-10926.
Pedroso, E., Grandas, A., de las Heras, X., Eritja, R. & Giralt, E. (1986).
Diketopiperazine formation in solide phase peptide synthesis using p-alkoxybenzyl ester resins
and Fmoc-amino acids. Tetrahedron Lett. 27, 743-746.
Pelton, J.G. & Wemmer, D.E. (1990).
Binding modes of Distamycin A with d(CGCAAATTTGCG)2 determined by two-dimensional
NMR. J. Am.Chem. Soc. 112, 1393-1399.
Rammensee, H.-G., Friede, T. & Stevanoviì, S. (1995).
MHC ligands and peptide motifs: first listing. Immunogenetics 41, 178-228.
Literatur
128
Rock, K.L. & Goldberg, A.L. (1999).
Degradation of cell proteins and the generation of MHC class I-presented peptides. Annu. Rev.
Immunol. 17, 739-779.
Saha, A K., Schultz, P. & Rapoport, H. (1989).
1,1´-Carbonylbis(3-methylimidazolium) triflate: An efficient reagent for aminoacylations. J.
Am. Chem. Soc. 111, 4856-4859.
Sant`Angelo, D.B., Waterbury, G., Preston-Hurlburt, P., Yoon, S.T., Medzhitov, R., Hong, S.-C.
& Janeway, C.A. Jr. (1996).
The specificity and orientation of a TCR to ist peptide-MHC class II ligands. Immunity 4, 367376.
Scharn, D., Wenschuh, H., Schneider-Mergener, J., Germeroth, L. (2000).
„Efficient parallel synthesis of 1,3,5-triazines on continous surfaces“. In: Solid phase synthesis
& combinatorial libraries, 6th int. Symposium. In press.
Schomburg, D. & Reichelt, J. (1988).
BRAGI: A comprehensive protein modeling program system. J. Mol. Graphics 6, 161-165.
Sieber, P. (1987).
An improved method for anchoring of 9-fluorenylmethoxycarbonyl-amino acids to 4-alkoxybenzyl alcohol resins. Tetrahedron Lett. 28, 6147-6150.
Staab, H.A. (1962).
Synthesen mit heterocyclischen Amiden (Azoliden). Angew. Chem. 74, 407-423.
Staab, H. A. (1959).
Neuer Weg zur Darstellung von Carbonsäureestern. Angew. Chem. 71, 194-195.
Stelzel, P. (1974).
„N-acyl-azole“. In: Houben-Weyl. Methoden der organischen Chemie, Band 15/2, Synthese von
Peptiden, 4. Auflage, pp. 326-331. Hrsg. E. Müller und E. Wünsch. Georg Thieme Verlag,
Stuttgart. ISBN 3-132163-04-X.
Stern, L.J., Brown, J.H., Jardetzky, T.S., Gorga, J.C., Urban, R.G., Strominger, J.L. & Wiley,
D.C. (1994).
Crystal structure of the human class II MHC protein HLA-DR1 complexed with an influenza
virus peptide. Nature 368, 215-221.
Literatur
129
Swalley, S.E., Baird, E.E. & Dervan, P.B. (1997).
A pyrrole-imidazole polyamide motif for recognition of eleven base pair sequences in the minor
groove of DNA. Chem. Eur. J. 3, 1600-1607.
Sykes, P. (1988).
„Die Stärke von Säuren und Basen“. In: Reaktionsmechanismen der Organischen Chemie, 9.
überarbeitete Auflage, pp. 61-88. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim. ISBN 3-527-26872-3.
Tegge, W., Frank, R., Hofmann, F., Dostmann, W.R.G. (1995).
Determination of cyclic nucleotide-dependent protein kinase substrate specificity by the use of
peptide libraries on cellulose paper. Biochemistry 34, 10569-10577.
Thuong, N.T. & Hélène, C. (1993).
Sequenzspezifische Erkennung und Modifikation von Doppelhelix-DNA durch Oligonucleotide.
Angew. Chem. 105, 697-723.
Trauger, J.W., Baird, E.E. & Dervan, P.B. (1998).
Kooperative Haarnadel-Dimere für die Erkennung von DNA durch Pyrrol/Imidazol-Polyamide.
Angew. Chem. 110, 1489-1492.
Triolo, S.A., Ionescu, D., Wenschuh, H., Solé, N.A., El-Faham, A., Carpino, L.A. & Kates, S.A.
(1998).
„Recent aspects of the use of tetramethylfluoroformamidinium hexafluorophosphate (TFFH) as
a convenient peptide coupling reagent“. In: Peptides 1996, pp. 839-840. Eds. R. Ramage and R.
Epton. Mayflower Scientific Ltd., Birmingham. ISBN 0-9527011-2-X.
Vázquez, E., Caamaño, A.M., Castedo, L. & Mascareñas, J.L. (1999).
An Fmoc solid-phase approach to linear polypyrrole-peptide conjugates. Tetrahedron Lett. 40,
3621-3624.
Wade, W.S., Mrksich, M. & Dervan, P.B. (1992).
Design of peptides that bind in the minor groove of DNA at 5´-(A,T)G(A,T)C(A,T)-3´
sequences by a dimeric side-by-side motif. J. Am. Chem. Soc. 114, 8783-8794.
Wang, S.S., Tam, J.P., Wang, B.S.H. & Merrifield, R.B. (1981).
Enhancement of peptide coupling reactions by 4-dimethylaminopyridine. Int. J. Peptide Protein
Res. 18, 459-467.
Weast, R.C. (ed.) (1976-1977). „CRC Handbook of chemistry and physics“, 57th Edition, part D,
pp. 147-151. CRC press Inc., Boca-Raton, Florida. ISBN 0-87819-456-8.
Literatur
130
Weber, P., Raynaud, I., Ettouati, L., Trescol-Biémont, M.-C., Carrupt, P.-A., Paris, J.,
Rabourdin-Combe, C., Gerlier, D. & Testa, B. (1998).
Molecular modeling of hen egg lysozyme HEL[52-61] peptide binding to I-Ak MHC class II
molecule. Int. Immunol. 10,1753-1764.
Weygand, F., Prox, A. & König, W. (1966).
Racemisierung bei Peptidsynthesen. Chem. Ber. 99, 1451-1460.
White, S., Szewczyk, J.W., Turner, J.M., Baird, E.E. & Dervan, P.B. (1998).
Recognition of the four Watson-Crick base pairs in the DNA minor groove by synthetic ligands.
Nature 391, 468-471.
Wieland, T. & Vogeler, K. (1961).
Verwendung von Thionyl-di-imidazol zur Peptidsynthese. Angew. Chem. 73, 435.
Windridge, G.C. & Jorgensen, E.C. (1971).
1-Hydroxybenzotriazole as a racemization-suppressing reagent for the incorporation of imbenzyl-L-histidine into peptides. J. Am. Chem. Soc. 93, 23-24.
Xiao, X.-Y., Zhao, C., Potash, H. & Nova, M.P. (1997).
Lasercodierung in der kombinatorischen Chemie. Angew. Chem. 109, 799-801.
Young, A.C.M., Zhang, W., Sacchettini, J.C. & Nathenson, S.G. (1994).
The three-dimensional structure of H-2Db at 2.4 Å resolution: Implications for antigendeterminant selection. Cell 76, 39-50.
Yu, H.-M., Chen, S.-T. & Wang, K.-T. (1992).
Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation. J. Org.
Chem. 57, 4781-4784.
Zhang, W., Young, A.C.M., Imarai, M., Nathenson, S.G. & Sacchettini, J.C. (1992).
Crystal structure of the major histocompatibility complex class I H-2Kb molecule containing a
single viral peptide: Implications for peptide binding and T-cell receptor recognition. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89, 8403-8407.
Anhang
A1
VII Anhang
Abkürzungen
In der nachfolgenden Liste werden die in dieser Arbeit verwendeten Abkürzungen und
Akronyme in alphabetischer Reihenfolge aufgeführt.
AA
A
Abb
abs
Acm
An
APC
BOC
BPB
Butthio
C
CD4
CD8
CDI
CDMeI
CDNT
CDT
cpm
DCC
DCM
DIC
DIEA
DMAP
DMF
DMSO
DNA
Dp
eq
ER
ESI
Fa
Fmoc
Aminosäure
Adenosin
Abbildung
absolutiert
Acetamidomethyl
festgelegte Aminosäure
antigen presenting cell
tert. Butoxycarbonyl
Bromphenolblau
tert. Butylthio
Cytidin
Korezeptor für MHC- Klasse II
Korezeptor für MHC- Klasse I
Carbonyldiimidazol
Carbonyldimethylimidazoltriflat
Carbonyldinitrotriazol
Carbonylditriazol
counts per minute
Dicyclohexylcarbodiimid
Dichlormethan
Diisoproylcabodiimid
Diisopropylethylamin, Hünigs Base
4-(Dimethylamino)pyridin
N,N-Dimethylformamid
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonucleinsäure
N, N-Dimethylaminopropylamid
equivalent
Endoplasmatisches Retikulum
electron spray ionisation
Firma
9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Anhang
G
GC-FID
GC-MS
HATU
HBTU
HMPA
HOBt
Hp
HPLC
ID
Ig
IL
Im
M.
Mr
MALDI
MeIm
MHC
MS
MSNT
nd
NMP
OtBu
PBS
PEG
pKs
PNA
Py
PyBOP
Rf
Rink-Amid
RNA
Sdp
T
TC
TH
Tab
TBTU
tBu
TCR
TFA
TFFH
A2
Guanosin
Gaschromatograph gekoppelt an einen Flammenionisationsdetektor
Gaschromatograph gekoppelt an ein Massenspektrometer
N, N, N´, N´-Tetramethyl-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)uroniumhexafluorphosphat
N, N, N´, N´-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uroniumhexafluorphosphat
4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure
1-Hydroxybenzotriazol
3-Hydroxy-N-methylpyrrol
high pressure liquid chromatography
Innendurchmesser
Immunglobulin
Interleucin
4-Amino-N-methylimidazol-2-carbonsäure
Mittelwert
Molgewicht
matrix assisted laser desorption ionisation
N-Methylimidazol
major histocompatibility complex
Massenspektrometer
2,4,6-Mesitylensulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazol
nicht bestimmt
1-Methyl-2-pyrrolidon
tert. Butylester
phosphate-buffert-saline
Polyethylenglykol
Gleichgewichtsexponent der Säure
Peptidnucleinsäure
4-Amino-1-methylpyrrol-2-carbonsäure
(Benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium Hexafluorophosphat
Retentionsfaktor
4-[(2,4-Dimethoxyphenyl)(Fmoc-amino)methyl]phenoxyessigsäure
Ribonucleinsäure
Siedepunkt
Thymidin
T-Killerzellen
T-Helferzellen
Tabelle
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N´,N ´-tetramethyluronium Tetraflouroborat
tert. Butylester
T cell receptor
Trifluoressigsäure
Tetramethylfluoroformamidinium Hexafluorophosphat
Anhang
ThDI
ThDT
THF
TIBS
TMA
TMS
Trt
U
X
Z
A3
Thionyldiimidazol
Thionylditriazol
Tetrahydrofuran
Triisobutylsilan
Trimethylamin
Trimethylsilan
Trityl
Uracil
Gemisch aller Aminosäuren
Benzyloxycarbonyl
Verzeichnis der Aminosäuren
Ein-Buchstaben Drei-Buchstaben Name
Code
Code
A
Ala
Alanin
C
Cys
Cystein
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Asp
Glu
Phe
Gly
His
Ile
Lys
Leu
Met
Asn
Pro
Gln
Arg
Ser
Thr
Val
Trp
Tyr
Asparaginsäure
Glutaminsäure
Phenylalanin
Glycin
Histidin
Isoleucin
Lysin
Leucin
Methionin
Asparagin
Prolin
Glutamin
Arginin
Serin
Threonin
Valin
Tryptophan
Tyrosin
Fmoc-Derivat
Mr [g/mol]
Fmoc-Ala
329,3
F m o c - C y s ( A c m ) , 414,6
Fmoc-Cys(Buthio) 431,6
Fmoc-Asp(OtBu)
411,5
Fmoc-Glu(OtBu)
443,5
Fmoc-Phe
387,4
Fmoc-Gly
297,3
Fmoc-His
477,5
Fmoc-Ile
353,4
Fmoc-Lys(BOC)
468,5
Fmoc-Leu
353,4
Fmoc-Met
371,5
Fmoc-Asn(Trt)
614,7
Fmoc-Pro
337,4
Fmoc-Gln(Trt)
610,7
Fmoc-Arg(Pbf)
648,7
Fmoc-Ser(tBu)
383,4
Fmoc-Thr(tBu)
397,5
Fmoc-Val
339,4
Fmoc-Trp(BOC)
526,2
459,6
Fmoc-Tyr(tBu)
Anhang
A-1:
Veresterungsausbeuten durch Aktivierung aller Aminosäuren mit MSNT nach einmaligem
Auftragen der Lösung.
AA
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
A-2
A4
[nmol/cm²]
36,7
35,3
44,5
26,8
44,5
78,3
21,2
60,0
26,1
43,7
43,7
5,6
31,0
8,5
11,3
40,2
41,6
50,8
19,1
27,5
Veresterungsausbeuten durch Aktivierung aller Aminosäuren als symmetrisches Anhydrid nach
einmaligem Auftragen der Lösung.
AA
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
[nmol/cm²]
1,4
8,5
0
5,6
2,8
4,2
21,9
36,7
22,6
6,4
7,8
14,8
21,2
0
3,5
10,6
17,6
12,0
0,7
2,8
Anhang
A-3:
Veresterungsausbeuten durch Aktivierung aller Aminosäuren mit DIC/MeIm nach einmaligem
Auftragen der Lösung.
AA
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
A-4:
A5
[nmol/cm²]
0
0
0
0
4,2
7,8
50,8
26,1
2,1
8,5
2,1
27,5
6,4
0
0,7
3,5
9,2
18,3
2,8
7,1
Veresterungsausbeuten durch Aktivierung aller Aminosäuren nach Sieber durch mehrmaliges
Auftragen der Lösung.
AA \ Methode
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
einfach [nmol/cm²]
0,7
2,8
31,0
3,5
9,9
16,9
36,7
12,0
1,4
4,2
2,1
2,1
7,1
2,8
3,5
8,5
15,5
18,3
6,4
12,7
dreifach [nmol/cm²]
1,4
2,1
99,5
2,1
19,0
34,6
65,6
14,8
5,7
7,0
5,7
2,9
7,8
1,4
0
10,7
14,2
27,0
5,0
14,2
Anhang
A-5:
Veresterungsausbeuten durch Aktivierung aller Aminosäuren mit TFFH nach einmaligem
Auftragen der aktivierten Lösung.
AA
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
A-6:
A6
[nmol/cm²]
6,4
1,4
1,4
0
1,4
12,0
0,7
0
0
9,2
12,7
0
0
0
0
0
0
0
0
2,8
Veresterungsausbeuten nach Aktivierung aller Aminosäuren nach Mitsunobu nach einmaligem
Auftragen der aktivierten Lösung.
AA \ Methode
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
a) [nmol/cm²]
2,1
2,8
3,5
0
18,3
0,7
3,5
1,4
2,1
4,2
0
5,7
0
6,3
14,8
9,2
7,0
7,8
6,3
7,0
b) [nmol/cm²]
3,5
4,9
2,8
0
3,5
2,8
2,8
1,4
0
1,4
4,9
0
0
0
0
0
0
0,7
0
0
c) [nmol/cm²]
9,8
16,8
14,8
0
14,8
3,5
14,1
5,6
9,2
8,5
12,0
1,4
4,9
7,0
5,7
0
0
0
0
0
d) [nmol/cm²]
0
0
0
0
0
0
1,5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0,7
0
0
0
Anhang
A-7:
Veresterungsausbeuten durch Aktivierung der Aminosäuren mit allen Azoliden nach einmaligem
Auftragen der Lösung.
AA \
CDI*
CDT**
ThDI
ThDT
CDMeI
[nmol/cm²]
[nmol/cm²]
[nmol/cm²]
[nmol/cm²]
[nmol/cm²]
Azolid
A
291,9
54,0
83,2
26,8
5,6
C
221,6
57,9
87,8
24,7
5,6
D
292,6
106,2
72,4
60,0
33,7
E
266,0
50,4
79,6
24,7
2,6
F
240,4
77,6
60,2
45,2
5,6
G
388,1
145,0
94,9
95,2
20,9
H
192,9
67,4
77,0
28,2
93,4
I
147,9
55,4
232,1
32,5
42,3
K
222,5
78,0
91,8
24,7
10,7
L
238,0
79,7
103,6
32,5
8,2
M
342,4
115,4
135,7
97,4
7,1
N
155,0
56,4
42,3
35,3
6,1
P
-x
19,8
-x
31,0
-x
Q
148,9
46,6
65,8
24,0
4,6
R
118,8
43,7
0,0
13,4
3,6
S
244,8
82,6
116,3
52,2
6,1
T
96,0
37,7
174,5
27,5
16,3
V
199,2
79,7
245,9
49,4
29,1
W
134,8
36,3
46,4
12,0
5,6
47,3
-x
33,9
-x
Y
-x
Mittelw.
185,7
68,4
92,2
38,5
16,7
*
Mittelwert aus 3 Messungen
**
Mittelwert aus 2 Messungen
x
Die sich bildenden Imidazolide von Prolin und Tyrosin sind in DMF nicht löslich.
A-8:
A7
CDNiT
[nmol/cm²]
7,1
8,2
5,1
4,6
5,6
11,7
35,2
43,4
5,6
9,7
9,2
4,1
14,8
4,6
4,1
4,6
24,0
24,5
3,6
6,6
11,8
M.
36,2
40,2
79,0
34,6
53,8
104,0
52,9
42,8
53,6
55,0
85,1
41,2
14,1
34,8
32,0
61,9
30,3
60,0
24,9
35,5
Ergebnis des mehrfachen Auftragens der mit 3 eq. CDI oder CDT aktivierten Aminosäurelösung
in [nmol/cm²].
AA \
Aktivierung mit 3 eq. CDI
Aktivierung mit 3 eq. CDT
Methode
einmal
zweimal
dreimal
einmal
zweimal
dreimal
A
308,3
592,7
807,2
75,5
122,1
159,5
C
251,2
491,8
575,1
56,4
102,3
128,4
D
333,0
585,6
673,1
105,1
155,9
213,8
E
275,2
432,5
516,5
69,9
137,6
170,0
F
286,5
499,6
623,0
63,5
116,4
138,3
G
623,7
1159,3
1491,6
124,9
281,5
273,1
H
265,3
452,3
593,4
69,9
117,1
151,0
I
268,1
515,8
697,1
84,7
184,9
239,2
K
292,1
498,1
573,6
91,7
146,8
151,0
L
281,5
532,0
661,1
67,7
129,1
163,7
M
547,5
556,0
735,9
77,6
149,6
185,6
N
187,7
316,1
374,0
49,4
93,8
64,9
P
77,6
188,4
215,0
31,8
84,7
110,1
Q
159,5
276,6
369,7
45,2
104,4
95,3
R
172,2
287,9
311,9
45,2
80,4
78,3
S
306,9
622,3
759,9
74,1
175,7
196,2
T
220,8
397,9
501,0
55,0
112,9
128,4
V
336,6
647,7
812,8
86,1
191,9
233,5
W
170,0
259,7
351,4
38,1
69,9
107,2
Y
119,9
205,3
230,7
50,8
105,8
218,7
Anhang
A-9:
Auswirkungen der Aktivierung mit einem bzw. drei eq. CDI auf die Veresterungsausbeuten der
verschiedenen Aminosäuren.
AA \
Methode
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
A-10:
A8
1 eq. CDI
einmal [nmol/cm²]
265
159
279
186
206
382
216
135
134
153
170
97
0
73
78
189
87
134
88
0
3 eq. CDI
einmal [nmol/cm²]
243
180
200
197
145
315
184
99
146
182
183
92
0
57
80
174
34
143
102
0
1 eq. CDI
dreimal [nmol/cm²]
588
285
859
439
529
1056
461
480
409
404
461
513
0
231
294
718
336
509
267
0
3 eq. CDI
dreimal [nmol/cm²]
630
364
449
450
418
897
454
270
401
377
446
222
0
243
222
476
222
412
253
0
Ausbeuten mit Standardabweichungen der Aktivierung mit CDI und CDT in [nmol/cm²].
AA
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P*
Q
R
S
T
V
W
Y*
CDI-3 Messungen
Mittelwert
STABWN
793,8
128,5
510,2
103,5
661,3
169,0
553,7
103,1
559,5
100,4
1242,8
252,4
553,9
71,4
389,5
219,4
530,4
92,8
560,9
129,9
661,6
155,0
313,3
66,0
0,0
0,0
292,1
55,5
309,1
69,7
677,1
142,7
269,1
173,2
516,5
212,5
359,1
89,7
0,0
0,0
CDT-6 Messungen
Mittelwert
STABWN
133,8
46,6
174,0
73,1
275,6
79,7
205,4
97,2
181,4
59,4
406,3
126,1
195,8
58,6
212,4
81,5
182,7
64,0
205,4
69,6
231,4
78,2
152,6
54,6
120,2
32,1
157,9
40,2
112,6
37,6
234,8
72,0
174,4
66,7
237,9
75,5
115,4
33,0
196,1
41,7
Anhang
A-11:
A9
Proliferation [cpm] der TH-Zellen nach Präsentation des HA-Epitops (Antigen) aus verschiedenen
Celluloseeluat-Titrationen, der Hintergrund wurde von allen Meßwerten abgezogen.
Synth.stufe\Konz. [µg/mL]
Kontrolle
Papier
Synthese
TMA
HAc
0,1
65805
62832
53804
29269
0
0,3
99619
105150
94100
77749
39509
1
145066
134325
123666
118133
73436
3
145596
142122
129534
118548
87774
10
139620
146803
128317
121637
86940
Ergebnisse der Proliferation nach Inkubation von HA 1 spezifischen TH-Zellen mit
antigenpräsentierenden Zellen und den Peptiden der Bibliothek und Ergebnisse des IL-2 Tests
nach Inkubation von HA spezifischen TH-Zellen, APC und den Peptiden der Bibiothek, Messung
der Proliferation nach Zugabe von IL-2 abhängigen Zellen.
Peptid Nr.
Proliferation [cpm]
IL-2 [cpm]
Sequenz
AAAADADTICIGYHA
1
999
1466,5
ADADTICIGYHANNS
2
1012,5
1440
DTICIGYHANNSTDT
3
1135
1082,5
CIGYHANNSTDTVDT
4
684
1014,5
YHANNSTDTVDTVLE
5
461,5
810,5
NNSTDTVDTVLEKNV
6
447,5
1017,5
TDTVDTVLEKNVTVT
7
2126,5
1570,5
VDTVLEKNVTVTHSV
8
1868,5
1147
VLEKNVTVTHSVNLL
9
1012,5
1397,5
KNVTVTHSVNLLEDS
10
1353
1048,5
TVTHSVNLLEDSHNG
11
2261
2062
HSVNLLEDSHNGKLC
12
2640,5
1101
NLLEDSHNGKLCRLK
13
7891
13327
EDSHNGKLCRLKGIA
14
4142,5
3502,5
HNGKLCRLKGIAPLQ
15
1492
1068
KLCRLKGIAPLQLGK
16
813,5
922,5
RLKGIAPLQLGKCNI
17
893
804,5
GIAPLQLGKCNIAGW
18
849
905
PLQLGKCNIAGWLLG
19
324
1840
LGKCNIAGWLLGNPE
20
757
1460
CNIAGWLLGNPECDP
21
878
1252,5
AGWLLGNPECDPLLP
22
746
932
LLGNPECDPLLPVRS
23
1144
970,5
NPECDPLLPVRSWSY
24
1928,5
1010
CDPLLPVRSWSYIVE
25
2335,5
1638,5
LLPVRSWSYIVETPN
26
2179,5
6634
VRSWSYIVETPNSEN
27
1279,5
7781,5
WSYIVETPNSENGIC
28
1533,5
1097,5
IVETPNSENGICYPG
29
1400,5
643,5
TPNSENGICYPGDFI
30
1219
812,5
SENGICYPGDFIDYE
31
471,5
1393
GICYPGDFIDYEELR
32
1871
1788,5
YPGDFIDYEELREQL
33
1922,5
1115
DFIDYEELREQLSSV
34
1352
1177
DYEELREQLSSVSSF
35
1679,5
1023
ELREQLSSVSSFERF
36
1808,5
868,5
EQLSSVSSFERFEIF
37
7165
3119,5
SSVSSFERFEIFPKE
38
60533
179739,5
SSFERFEIFPKESSW
39
19487,5
161973,5
A-12:
Anhang
Peptid Nr.
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
A10
Proliferation [cpm]
3805,5
1699,5
1311
1620,5
1491
1853
1267,5
2051
2276,5
1837,5
2547,5
1946
2337
1796,5
1926
2677
956,5
1560
1257,5
1843,5
1530,5
1816,5
1943
9321,5
9152
1725,5
1467
596
428,5
902
916
1121
964,5
1495,5
2104,5
1993
1879,5
1312
1312
249
1050
607,5
807
648,5
1365
967
1813,5
2076
1367
1241
635
89
190
374,5
334
380,5
3503,5
IL-2 [cpm]
5990,5
682,5
872,5
2059
1003,5
1178,5
1244
1199,5
984,5
1398,5
1301,5
5777
4320
821,5
884
1237
960,5
1137,5
1157,5
916,5
1194
1057
1176,5
111549,5
66291
948,5
967
1576,5
1064
876
818,5
852
2867,5
1327,5
933
1495
2113
765
791
1584
1011,5
668,5
645
705
9433
1139
1096
994,5
1022,5
919,5
988
2855
2611,5
2025,5
2048
1647,5
1662
Sequenz
ERFEIFPKESSWPNH
EIFPKESSWPNHNTT
PKESSWPNHNTTKGV
SSWPNHNTTKGVTAA
PNHNTTKGVTAACSH
NTTKGVTAACSHAGK
KGVTAACSHAGKSSF
TAACSHAGKSSFYRN
CSHAGKSSFYRNLLW
AGKSSFYRNLLWLTE
SSFYRNLLWLTEKEG
YRNLLWLTEKEGSYP
LLWLTEKEGSYPKLK
LTEKEGSYPKLKNSY
KEGSYPKLKNSYVNK
SYPKLKNSYVNKKGK
KLKNSYVNKKGKEVL
NSYVNKKGKEVLVLW
VNKKGKEVLVLWGIH
KGKEVLVLWGIHHPS
EVLVLWGIHHPSNSK
VLWGIHHPSNSKDQQ
GIHHPSNSKDQQNIY
HPSNSKDQQNIYQNE
NSKDQQNIYQNENAY
DQQNIYQNENAYVSV
NIYQNENAYVSVVTS
QNENAYVSVVTSNYN
NAYVSVVTSNYNRRF
VSVVTSNYNRRFTPE
VTSNYNRRFTPEIAE
NYNRRFTPEIAERPK
RRFTPEIAERPKVRD
TPEIAERPKVRDQAG
IAERPKVRDQAGRMN
RPKVRDQAGRMNYYW
VRDQAGRMNYYWTLL
QAGRMNYYWTLLKPG
RMNYYWTLLKPGDTI
YYWTLLKPGDTIIFE
TLLKPGDTIIFEANG
KPGDTIIFEANGNLI
DTIIFEANGNLIAPR
IFEANGNLIAPRYAF
ANGNLIAPRYAFALS
NLIAPRYAFALSRGF
APRYAFALSRGFGSG
YAFALSRGFGSGIIT
ALSRGFGSGIITSNA
RGFGSGIITSNASMH
GSGIITSNASMHECN
IITSNASMHECNTKC
SNASMHECNTKCQTP
SMHECNTKCQTPLGA
ECNTKCQTPLGAINS
TKCQTPLGAINSSLP
QTPLGAINSSLPFQN
Anhang
A-13:
A11
Cytotoxische Analyse mit Act A Peptiden der durch die Spot-Methode erzeugten Bibliothek.
Peptid Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
Lyse [%]
1
1
1
1
1
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
6
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
5
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Sequenz
KSEEVNASD
SEEVNASDF
EEVNASDFP
EVNASDFPP
VNASDFPPP
NASDFPPPP
ASDFPPPPT
SDFPPPPTD
DFPPPPTDE
FPPPPTDEE
PPPPTDEEL
PPPTDEELR
PPTDEELRL
PTDEELRLA
TDEELRLAL
DEELRLALP
EELRLALPE
ELRLALPET
LRLALPETP
RLALPETPM
LALPETPML
ALPETPMLL
LPETPMLLG
PETPMLLGF
ETPMLLGFN
TPMLLGFNA
PMLLGFNAP
MLLGFNAPA
LLGFNAPAT
LGFNAPATS
GFNAPATSE
FNAPATSEP
NAPATSEPS
APATSEPSS
PATSEPSSF
ATSEPSSFE
TSEPSSFEF
SEPSSFEFP
EPSSFEFPP
PSSFEFPPP
SSFEFPPPP
SFEFPPPPT
FEFPPPPTD
EFPPPPTDE
FPPPPTDEE
PPPPTDEEL
PPPTDEELR
PPTDEELRL
PTDEELRLA
TDEELRLAL
DEELRLALP
EELRLALPE
ELRLALPET
LRLALPETP
Anhang
Peptid Nr.
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
A12
Lyse [%]
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
5
1
1
1
0
1
1
13
24
17
36
34
40
20
22
15
20
20
1
1
1
1
1
2
1
11
1
1
6
6
1
1
Sequenz
RLALPETPM
LALPETPML
ALPETPMLL
LPETPMLLG
PETPMLLGF
ETPMLLGFN
TPMLLGFNA
PMLLGFNAP
MLLGFNAPA
LLGFNAPAT
LGFNAPATS
GFNAPATSE
FNAPATSEP
NAPATSEPS
APATSEPSS
PATSEPSSF
ATSEPSSFE
TSEPSSFEF
SEPSSFEFP
EPSSFEFPP
PSSFEFPPP
SSFEFPPPP
SFEFPPPPT
FEFPPPPTE
EFPPPPTED
FPPPPTEDE
PPPPTEDEL
PPPTEDELE
PPTEDELEI
PTEDELEII
TEDELEIIR
EDELEIIRE
DELEIIRET
ELEIIRETA
LEIIRETAS
EIIRETASS
IIRETASSL
IRETASSLD
RETASSLDS
ETASSLDSS
TASSLDSSF
ASSLDSSFT
SSLDSSFTR
SLDSSFTRG
LDSSFTRGD
DSSFTRGDL
SSFTRGDLA
SFTRGDLAS
FTRGDLASL
TRGDLASLR
RGDLASLRN
GDLASLRNA
DLASLRNAI
LASLRNAIN
ASLRNAINR
SLRNAINRH
Anhang
Peptid Nr.
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
A-14:
Lyse [%]
1
1
1
2
1
1
5
4
11
14
1
1
2
1
4
4
12
9
11
15
19
21
1
1
1
Sequenz
LRNAINRHS
RNAINRHSQ
NAINRHSQN
AINRHSQNF
INRHSQNFS
NRHSQNFSD
RHSQNFSDF
HSQNFSDFP
SQNFSDFPP
QNFSDFPPI
NFSDFPPIP
FSDFPPIPT
SDFPPIPTE
DFPPIPTEE
FPPIPTEEE
PPIPTEEEL
PIPTEEELN
IPTEEELNG
PTEEELNGR
TEEELNGRG
EEELNGRGG
EELNGRGGR
ELNGRGGRP
LNGRGGRPT
NGRGGRPTS
Ausbeuten der Amidbindungen eines geschützten Bausteins mit zwei unterschiedlichen
Aktivierungsreagenzien, nach einem und zwei Zyklen gegenüber einer Grundbeladung mit
Rink-Linker.
Grundbeladung
1. Zyklus
2. Zyklus
A-15:
A13
Fmoc-3-Aminobenzoesäure aktivert mit
DIC/HOBt [nmol/cm²]
961,5
1039,5
254,7
Fmoc-3-Aminobenzoesäure aktivert mit
TBTU/DIEA [nmol/cm²]
961,5
961,5
478,2
Einfluß der Mikrowellenbestrahlung auf die Ausbeuten der Polyamidsynthese von Fmoc-3Aminobenzoesäure auf einem Polyamidträger mit Rink-Linker und Lys-Phe-Spacer.
Grundbeladung von Rink-Lys-Phe
1. Zyklus: Fmoc-3-Aminobenzoesäure
2. Zyklus: Fmoc-3-Aminobenzoesäure
3. Zyklus: Fmoc-3-Aminobenzoesäure
Beladung [nmol/cm²]
ohne Bestrahlung
1510
798,6
257,1
200
Beladung [nmol/cm²]
mit Bestrahlung
1510
1208,6
881,4
771,4
Lebenslauf
Persönliche Daten:
Pilawa, Sandra
geb. 04. August 1970 in Hannover
ledig
Schulausbildung:
1977 bis 1981
1981 bis 1983
1983 bis 1990
05/1990
Grundschule in Hannover
Orientierungsstufe in Hannover
Georg-Büchner-Gymnasium in Seelze bei Hannover
Abschluß: Abitur
Hochschulausbildung:
10/1990
09/1992
06/1995
06/1995 bis 01/1996
01/1996
Beginn des Studiums der Fachrichtung Chemie-Diplom an der
Universität Hannover
Diplom-Chemiker Vorprüfung
Diplom-Chemiker Hauptprüfung
Diplomarbeit am Institut für Lebensmittelchemie der
Universität Hannover unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Dr.
R. G. Berger
Thema: Vergleich von Aromaprofilen ausgewählter Früchte in
Abhängigkeit von der Aufarbeitung
Abschluß als Diplom-Chemiker
Berufstätigkeit:
02/1996 bis 07/1996
09/1996 bis 02/2000
seit 06/2000
Studentische Hilfskraft am Institut für Lebensmittelchemie der
Universität Hannover
Wissenschaftliche Mitarbeiterin an der GBF, Braunschweig
Anfertigung der Dissertation unter der Leitung von Herrn Dr.
R. Frank, AG MERK
Thema: Entwicklung der chemisch-technischen Grundlagen
einer automatisierten Synthese von Molekülbibliotheken und
des intelligenten Screenings von Leitstrukturen
Wissenschaftliche Mitarbeiterin an der TU Braunschweig in der
Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Dr. L. Flohé