Aus dem Institut für Sportmedizin und Kreislaufforschung Abteilung für molekulare und zelluläre Sportmedizin der Deutschen Sporthochschule Köln Geschäftsführender Leiter: Herr Univ.- Prof. Dr. med. Wilhelm Bloch Der Einfluss einer Ausdauerinterventionsmaßnahme auf die Proteinexpression des Monocarboxylat- Transporters und CD147 im Erythrozyten und der Skelettmuskulatur bei nicht insulinpflichtigen Diabetes Typ- 2- Patienten von der Deutschen Sporthochschule Köln zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Sportwissenschaft genehmigte Dissertation vorgelegt von David Opitz aus Hannover Köln 2011 Aus dem Institut für Sportmedizin und Kreislaufforschung Abteilung für molekulare und zelluläre Sportmedizin der Deutschen Sporthochschule Köln Geschäftsführender Leiter: Herr Univ.- Prof. Dr. med. Wilhelm Bloch Der Einfluss einer Ausdauerinterventionsmaßnahme auf die Proteinexpression des Monocarboxylat- Transporters und CD147 im Erythrozyten und der Skelettmuskulatur bei nicht insulinpflichtigen Diabetes Typ- 2- Patienten von der Deutschen Sporthochschule Köln zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Sportwissenschaft genehmigte Dissertation vorgelegt von David Opitz aus Hannover Köln 2011 Erste Gutachterin: Frau Prof. Dr. rer. nat. Klara Brixius Zweiter Gutachter: Herr Univ.- Prof. Dr. med. Wilhelm Bloch Vorsitzende des Promotionsausschusses: Univ.-Prof. Dr. phil. Ilse Hartmann- Tews Tag der Disputation: ________________ Eidesstattliche Versicherungen gem. § 7 Abs. 2 Nr. 4 und 5: Hierdurch versichere ich: Ich habe diese Arbeit selbständig und nur unter Benutzung der angegebenen Quellen und technischen Hilfen angefertigt; sie hat noch keiner anderen Stelle zur Prüfung vorgelegen. Wörtlich übernommene Textstellen, auch Einzelsätze oder Teile davon, sind als Zitate kenntlich gemacht worden. Hierdurch erkläre ich, dass ich die „Leitlinien guter wissenschaftlicher Praxis“ der Deutschen Sporthochschule Köln eingehalten habe. Köln, 30.04.2011 ______________ David Opitz Für meine Eltern Elke und Dietmar Opitz Danksagung Danksagung Mit der Fertigstellung meiner Dissertation wird es Zeit denjenigen zu danken, die mich auf dem Weg begleitet und unterstützt haben. Besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. rer. nat. Klara Brixius, die mich in den letzten Jahren bei dieser Arbeit unterstützt und ihre Hilfe zu jeder Zeit angeboten hat. Des Weiteren möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. med. Wilhelm Bloch und allen Angestellten beider Abteilungen des Institutes für Kreislaufforschung und Sportmedizin bedanken. Durch sie erhielt ich die Möglichkeit zu promovieren und die für die Dr.- Arbeit notwendigen wissenschaftlichen Untersuchungen durchzuführen und auszuwerten. Dabei konnte ich mich jederzeit auf ihre Unterstützung verlassen. Nicht vergessen möchte ich das gesamte Team der ‚Diabetes-Typ-2-Studie 2009‘, mit Dario Capin als begleitenden Arzt sowie Dr. med. Thorsten Schiffer als Chirurg und allen Diplomanden/ Diplomandinnen und Doktoranden/ Doktorandinnen ohne die ich eine Studie dieser Größenordnung nicht hätte umsetzen können. Auch bedanke ich mich bei allen Patienten, die mit ihrem Engagement die Basis für diese Studie bildeten. Ebenso möchte ich mich bei meiner Familie und meinen Freunden bedanken, die mich auf dem Weg zum Ziel immer wieder ermutigt und aufgebaut haben. IV Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Titel Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Diabetes Mellitus Seite IX 1 1.1.1. Geschichtlicher Hintergrund 1 1.1.2. Epidemiologie 1 1.1.3. Klassifizierung 2 1.1.4. Pathophysiologie 3 1.1.5. Diagnostik 5 1.2. Laktat 6 1.3. Monocarboxylat- Transporter (MCT) 11 1.4. MCT1 im Erythrozyten 13 1.5. MCT1 und MCT4 in der Skelettmuskulatur 15 1.6. CD147 im Erythrozyten und der Skelettmuskulatur 18 1.7. Diabetes Mellitus und Sport 21 1.8. Fragestellung 25 V Inhaltsverzeichnis 2. Methodik 2.1. Studiendesign 2.1.1. Probandenbeschreibung/ -rekrutierung 2.2. Untersuchungsablauf 27 29 30 2.2.1. Basaluntersuchung 30 2.2.2. Anthropometrische Daten 30 2.2.3. Nüchternblutentnahme und Laborparameter 31 2.2.4. Ruhe- EKG 31 2.2.5. Belastungsuntersuchung 31 2.2.5.1. Fahrradergometer und Spirometrie 31 2.2.5.2. Kardiale Ausbelastung 34 2.2.5.3. Bestimmung der Laktatkonzentration 35 2.2.5.4. Verarbeitung des Belastungsvollblutes 36 2.2.6. Muskelbiopsie 2.3. Immunhistochemischer Nachweis 2.3.1. Immunhistochemische Analyse am 37 38 39 Erythrozyten 2.3.2. Immunhistochemische Analyse am 46 Skelettmuskel 2.4. Durchflusszytometrische Analyse am Erythrozyten 58 Sportwissenschaftliche Methodik 61 2.4.1. Probenaufbereitung 2.5. 59 2.5.1. Kontrollgruppe 62 2.5.2. Ausdauergruppe 63 VI Inhaltsverzeichnis 2.6. Statistik 3. Ergebnisse 66 3.1. Anthropometrische Daten 67 3.2. Ruheblutdruck 68 3.3. Stoffwechselparameter 72 3.4. Leistungsphysiologische Parameter 75 3.5. Muskelfasertypisierung 78 3.6. Muskelfaserdurchmesser 80 3.7. Immunhistochemischer Nachweis des MCT1 und MCT4 im Muskelgewebe des M. vastus lateralis 80 3.8. Immunhistochemischer Nachweis des CD147 im Muskelgewebe des M. vastus lateralis 87 3.9. Immunhistochemischer Nachweis des MCT1 in den Erythrozyten 90 3.10. Durchflusszytometrischer Nachweis der CD147- Dichte in den Erythrozyten 94 VII Inhaltsverzeichnis 4. Diskussion 4.1. Auswirkungen der Interventionsmaßnahme auf die Leistungsfähigkeit und Stoffwechselparameter 97 4.2. Auswirkungen der Interventionsmaßnahme auf den MCT im Skelettmuskel 102 4.3. Auswirkungen der Interventionsmaßnahme auf den MCT1 im Erythrozyten 108 4.4. Auswirkungen der Interventionsmaßnahme auf die CD147- Dichte im Skelettmuskel und im Erythrozyten 113 5. Zusammenfassung 5.1. Zusammenfassung 117 5.2. Abstract 120 Abbildungsverzeichnis XIV Tabellenverzeichnis Literaturverzeichnis Anhang Ergebnisstabelle Lebenslauf XVIII XIX XLV L VIII Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis µππ π¦π¦π¦π¦ ππ π¦π¦π¦π¦π¦π¦ Mikrounit pro Milliliter Umdrehungen pro Minute π¦π¦π¦π¦π¦π¦π¦π¦ Millimol pro Liter π©π©π©π©π©π©π©π© Pikomol pro Liter °C Grad Celsius π₯π₯ π₯π₯ Abb. Abbildung Abs. mem. Absolute membranöse ADA American Diabeties Association AG Ausdauergruppe AMPK Adenosinmonophosphat- Proteinkinase ATP Adenosintriphosphat BEKG Belastungselektrokardiogramm BMI Body- Mass- Index BRD Bundesrepublik Deutschland BSA Bovine Serum Albumin IX Abkürzungsverzeichnis CD Cluster of Differentation DAB Diaminobenzidin DDG Deutschen Diabetes Gesellschaft DDR Deutsche Demokratische Republik dest. destilliert DGPR Deutschen Gesellschaft für Prävention und Rehabilitation DSHS Deutsche Sporthochschule Köln DU Density Unit EKG Elektrokardiogramm et al. und andere FACS Fluorescence Activated Cell Scanning FSC Vorwärtsstreulicht G Zentifugalbeschleunigung GLUT Glukosetransporter H+ Hydrogen-Ion H 2O Wasser H 2 O2 Wasserstoffperoxid HCL Chlorwasserstoffsäure (Salzsäure) HDL High Density Lipoprotein X Abkürzungsverzeichnis HIF1α Hypoxia-inducible factor 1-alpha HRP Horseradish Peroxidase IFG impaired fasting Glucose Ig Immunglobuline IGT impaired Glucose- Tolerance IHC Immunhistochemische Kontrolle IRS Insulin-Rezeptor-Substratkomplex KG Kontrollgruppe KGW Körpergewicht Km Michaelis-Menten-Konstante La Laktat LDH Laktatdehydrogenase LDL Low Density Lipoprotein M Molarität max. Maximum MCT Monocarboxylat Transporter min. Minimum ml/kg/min Milliliter pro Kilogramm pro Minute M Mol XI Abkürzungsverzeichnis mmHg Millimeter Quecksilbersäule MMP Matrix-Metalloproteasen N Newton n Anzahl n.s. nicht signifikant NAD Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid NGT normale Glukosetoleranz OGTT orale Glukosetoleranztest p Signifikanzniveau PB Phospatebuffer PBS Phosphate buffered saline solution PFA Paraformaldehyd PGC1α Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) coactivator 1α pH-Wert Negativer dekadischer Logarithmus der H+- Ionenkonzentration pK-Wert Negativer Logarithmus der Dissoziationskonstante eines Elektrolyten PTPN1 Protein Tyrosine Phosphatase N1 RPE Received Perception of Exertion SD Standard Deviation XII Abkürzungsverzeichnis Sek. Sekunden SSC Seitwärtsstreulicht Std. Stunde Tab. Tabelle TBS Tris-Buffered Saline TM Transmembrane domain U1 Eingangsuntersuchung U2 Zwischenuntersuchung U3 Ausgangsuntersuchung USA United States of America VO2max maximale Sauerstoffaufnahme W Watt WHO World Health Organisation Wo. Woche XIII Einleitung 1. Einleitung 1.1. Diabetes Mellitus 1.1.1. Geschichtlicher Hintergrund Diabetes Mellitus erfährt schon in der Zeit der Antike ihren nominellen Ursprung. Dieser aus dem Griechischen und dem Lateinischen stammende Begriff bedeutet wörtlich übersetzt ‚honigsüßer Durchfluss‘. Charakteristisch für diese Erkrankung ist der erhöhte Blutzuckerspiegel, welcher mit einer Hyperglukosurie einhergeht, so dass der hieraus resultierende süßliche Geschmack des Urins getestet und als diagnostisches Mittel verwendet wurde. 1.1.2. Epidemiologie Die deutlich steigende Prävalenz der Erkrankung Diabetes Mellitus ist weltweit zu beobachten. Exakte epidemiologische Daten zu erfassen ist problematisch. Die USA ist eines der Länder, die hinreichende Daten bzgl. der Prävalenz erfasst und publiziert haben. Im Vergleich hierzu ist die Datenlage beispielsweise in Deutschland, wie auch in den meisten europäischen Ländern, sehr unvollständig. Grundlage dieser chronologischen Steigerung der Prävalenz und die daraus resultierende gesundheitsökonomische Relevanz für die Bundesrepublik Deutschland (BRD) bilden Untersuchungsergebnisse aus den Jahren 1987 und 1988. Die Daten, welche in der Deutschen Demokratischen Republik (DDR) und der BRD erhobenen wurden, belegen eine Gesamtprävalenz von 4 bis 5 Prozent in „Gesamt-“ Deutschland. Diese prozentualen Angaben entsprechen etwa 3.5 und 4 Millionen erkrankten Personen (Hauner et al., 1992). 1 Einleitung In Form einer anamnestischen Befragung im Bundes- Gesundheitssurvey wurden etwa 10 Jahren später in den Jahren 1997/ 98 weitere Daten von 7124 Personen erhoben. Demnach wiesen zu dieser Zeit 4,7 Prozent der Männer und 5,6 Prozent der Frauen im Alter von 18 bis 79 Jahren die Erkrankung Diabetes Mellitus auf (Thefeld et al., 1999). Im Rahmen dieser Datenerhebung wurde erstmals die Varianz der Prävalenz zwischen der sozialen Schicht und der Erkrankung nachgewiesen. Folglich wies die soziale Unterschicht mit 5,6 Prozent im Vergleich zu der Mittel- und Oberschicht mit 3,5 und 2,5 Prozent die höchste Prävalenz auf (Knopf et al., 1991). Die Gesamtprävalenz der Bevölkerung ist Schätzungen zu Folge doppelt so hoch wie bis dahin statistisch erhoben (Rathmann et al., 2003). Neben den Patienten mit diagnostiziertem Diabetes Mellitus ist noch der Patientenkreis mit einer gestörten Glukosetoleranz (IFG und IGT) zu nennen. Werden diese zu den bekannten und den noch unbekannten Diabetikern hinzugezogen, sind mehr als 40 Prozent der Bevölkerung in dieser Altersgruppe von einer glykämischen Dysbalance betroffen. Eine jährliche Zunahme der Prävalenz an Diabetes in Deutschland um etwa 5 Prozent wird in den kommenden Jahren zu einer erheblichen Kostensteigerung für das Gesundheitssystem führen (Hauner et al., 2003). Pro Jahr und Diabetiker entstehen bisher insgesamt Exzesskosten von etwa 4000 Euro. Wie in der KoDiM- Studie beschrieben, verursachte die Gesamtheit der Diabetiker in Deutschland im Jahr 2001 Kosten in Höhe von 59,8 Milliarden Euro (Hauner, 2006). 1.1.3. Klassifizierung Erstmalig wurde die Krankheit Diabetes Mellitus bereits im Jahr 1965 von der WHO, entsprechend der pathophysiologischen Störung, klassifiziert (WHO, 1965). Die aktuellen Guidelines zu den Diagnoseverfahren und Klassifikationen wurden im Jahr 1997 von der American Diabetes Association (ADA) erarbeitet, 2 Einleitung ein Jahr später von der WHO und im Jahr 2000 von der Deutschen Diabetes Gesellschaft (DDG) im Konsens übernommen. In der heute gültigen Einteilung wird zwischen den Gruppen des Diabetes Mellitus Typ 1 und Typ 2 differenziert. Der hier als „Typ 1“ bezeichnete Krankheitstyp beschreibt die Zerstörung der β – Zellen im Pankreas und den hieraus resultierenden absoluten Insulinmangel. Ätiologisch wird dieser ein weiteres Mal in die idiopathische Form bzw. die immunologisch vermittelte differenziert. Der hier als „Typ 2“ beschriebene Krankheitstyp beginnt vorwiegend mit einer Insulinresistenz und einem relativen Insulinmangel, welcher sukzessive zu einem sekretorischen Defekt der β – Zellen im Pankreas führt. Neben diesen zwei Klassifikationsgruppen sind noch einige weitere spezifische Diabetes- Typen, wie beispielsweise die in Folge von Pankreatitis, Akromegalie, Chushing- Syndrom, u.a. zu nennen (Alberti et al., 1998; ADA, 1997). 1.1.4. Pathophysiologie Allgemein betrachtet besteht die Pathophysiologie für die Erkrankung Diabetes Mellitus in einer verminderten Insulinwirkung oder in einer gestörten Insulinsekretion. Insulin stellt ein essentielles Peptidhormon dar, welches in den β – Zellen der Langerhans´schen Inseln des Pankreas produziert und bei einer hyperglykämischen Konzentration im Blut (4 bis 7 (Schmidt et al., 2007). ππππππππ πΏπΏ ) sezerniert wird Da sich die Untersuchungen dieser Arbeit ausschließlich auf Menschen mit Typ 2- Diabetes beziehen, ist im weiteren Verlauf lediglich dessen Pathophysiologie expliziter dargestellt. In Folge der exozytären Freisetzung wird das Hormon Insulin aufgrund seiner hydrophilen Eigenschaften ohne entsprechende Transporter im Blut 3 Einleitung transportiert. Der nun entscheidende Faktor ist der in intrazellulären Vesikeln lokalisierte Glukose- Transporter 4 (GLUT4), welcher aufgrund einer entsprechend hohen Affinität zu Insulin durch Endozytose in die Zellmembran transloziert (Saltiel et al., 2001). Patienten mit Typ 2- Diabetes weisen bezogen auf den pathogenetischen Befund eine reduzierte Insulinaffinität des GLUT4Rezeptors bzw. eine deutlich verminderte Stimulationsfähigkeit auf. Die aus diesem Zusammenhang resultierende Hyperglykämie führt zu einer kompensatorisch gesteigerten Insulinproduktion der β- Zellen, mit dem Ziel die gestörte Insulinaffinität des GLUT4- Rezeptors auszugleichen. Es resultiert eine Hyperinsulinämie mit einem relativen Insulinmangel. Die beschriebene Insulinresistenz spiegelt primär die quantitative Veränderung des Hormons wider. Während das vor allem für die hepatische Glukoseproduktion verantwortliche ‚first phase insulin‘, anfänglich vermehrt sezerniert wird, schließt sich danach das, länger anhaltende und in größeren Mengen die sezernierte, für die Glukoseaufnahme in der Peripherie verantwortliche ‚second phase insulin‘ an. Die Abnahme des ‚first phase insulin‘ korreliert mit der gestörten Glukosetoleranz, während die Sekretion des ‚second phase insulin‘ im Vergleich dazu progressiv steigt. Der zuletzt vorliegende absolute Insulinmangel, welcher sich im weiteren Verlauf der Erkrankung über einen Zeitraum von Jahren einstellt, ist in einer Reduktion dieser kompensatorisch gesteigerten Insulinsekretion begründet. Aus diesen Erkenntnissen lässt sich die Therapie bis zu der Manifestation der Krankheit begründen, die aus Diät, oralen Antidiabetika und körperlicher Bewegung besteht. Eine Insulintherapie wird erst in Folge einer Manifestation und absolutem Insulinmangel durchgeführt (Garber, 2000). In Bezug auf die Ätiologie dieses Krankheitsbildes wurden in den letzten Jahren immer wieder neue Aspekte publiziert. Die genetische Prävalenz ist hierbei nicht außer Acht zu lassen. BENTON et al. haben das Protein Tyrosine Phosphatase N1 (PTPN1) als polygenetische Determinante analysieren können 4 Einleitung (Bento et al., 2004). Des Weiteren konnte an eineiigen Zwillingen eine Konkordanz von fast 90 Prozent festgestellt und belegt werden (Newman et al., 1987). Neben der genetischen Disposition an Diabetes Mellitus zu erkranken, existieren weitere, nicht zu vernachlässigende Manifestationsfaktoren. Primär ist hier die Adipositas mit einer androiden Fettverteilung zu nennen, welche als unabhängiger Risikofaktor beschrieben wird. Weitere Realisationsfaktoren sind beispielsweise mangelnde körperliche Aktivität, falsche Ernährung sowie ein höheres Lebensalter (Carey et al., 1997). 1.1.5. Diagnostik Bei der Diagnose handelt es sich häufig um einen Zufallsbefund, da die Erkrankung insbesondere in den ersten Jahren asymptomatisch verläuft. Die erste Klassifizierung eines Diabetespatienten erfolgt häufig auf der Basis von anamnestischen Angaben zu der familiären Disposition, Body Mass Index (BMI), Alter und Taillenumfang. Symptome wie Gewichtsverlust, Polyurie, Polydipsie, Glukosurie und Ketonurie sind typisch. Die Diagnostik gemäß der WHO und ADA erfolgt in drei Schritten. Ein erstes Diagnosekriterium stellt die venöse Glukose im Plasma bei Gelegenheitsblutabnahmen dar. Ist diese nicht aussagekräftig, wird als zweites Diagnosekriterium die Nüchternglukose im venösen Plasma herangezogen. Sofern auch im Anschluss keine eindeutige Diagnose gestellt werden kann, erfolgt der orale Glucose Toleranztest (OGTT). Häufig werden Patienten ohne manifesten Diabetes Mellitus entsprechend der prädiabetisch charakteristischen Symptome in Folge einer gestörten Glukosehomöostase in die ‚normal glucose tolerance‘ (NGT), die ‚impaired fasting glucose‘ (IFG), die ‚impaired glucose tolerance‘ (IGT) oder aber zum Diabetes Mellitus eingeteilt (s. Tab. 1). Neben den für die Diagnose relevanten Aspekten ist noch der Wert des prozentual glykosylierten Hämoglobins (HbA1c) zu nennen, welcher 5 Einleitung insbesondere zur Kontrolle des manifesten Diabetespatienten geeignet ist (ADA, 2004). ππππ ππππ NGT Nüchtern ( π π π π ) < 100 2h- OGTT ( π π π π ) IFG 100 -125 - < 140 IGT < 126 und 140 – 199 Diabetes Mellitus ≥ 126 und/ ≥ 200 oder Tab. 1: Diagnostische Kriterien des Diabetes Mellitus 1.2. Laktat Laktat stellt ein sehr energiereiches und wichtiges Molekül dar, welches von den Muskelzellen sowohl aufgenommen als auch freigesetzt werden kann. (s. Abb. 1) Die über Jahrzehnte hinweg geltende Meinung, die das Molekül Laktat als Abfallprodukt und als Ursache der zellulären Azidose in den Vordergrund stellte, konnte im Laufe der Zeit durch viele Untersuchungen revidiert werden. Als Laktat werden die Salze bzw. Ester der Milchsäure bezeichnet, nachdem das Wasserstoffion der Karboxylgruppe durch ein organisches Radikal ersetzt wurde (Bruce et al., 2003a). Hierbei wird je nach stöchiometrischer Ausrichtung zwischen L- Laktat und D- Laktat unterschieden. 6 Einleitung Abb. 1: chemische Strukturformel des Moleküls Laktat Das Produkt Laktat entsteht im Rahmen der anaeroben oxidativen Energiebereitstellung im Cytoplasma. Auch wenn durch die aerobe Oxidation die meiste für den menschlichen Organismus benötigte Energie bereitgestellt wird, verlagert sich bei nicht ausreichender aerober Energiebereitstellung der Stoffwechsel zugunsten der anaeroben Oxidation. Diese produziert, genau wie die aerobe Oxidation, die Energie durch die katabolen Prozesse der Glykolyse. In insgesamt zehn Reaktionsschritten wird hier durch unterschiedliche Enzyme der Abbau von Glucose zu Pyruvat katalysiert. Durch eine Steigerung des Energiebedarfs bei körperlicher Tätigkeit erfährt die Glykolyse einen Anstieg und es wird mehr Pyruvat produziert als oxidativ verarbeitet werden kann. Das Resultat ist ein Überschuss des reduzierten ππππππππ + π»π» + , welches im Komplex I der Atmungskette oxidiert werden müsste, um weiter als Wasserstoffakzeptor in der 3- PhosphoglycerinaldehydDehydrogenase- Reaktion fungieren und so die Glykolyse aufrecht halten zu können. Dieser limitierende Oxidationsprozess wird durch das Pyruvat als 7 Einleitung Wasserstoffakzeptor kompensiert. Neben dem Pyruvat und dem benötigten ππππππ + entsteht in der durch die im Cytoplasma vorliegenden Laktatdehydrogenase (LDH) katalysierten Reaktion auch Milchsäure (s. Abb. 2). Ausgehend von dem pK- Wert der Milchsäure (pK=3,86) resultiert eine sofortige und fast vollständige Dissoziation des Protons von der Karboxyl- Gruppe und eine Anlagerung eines Natriumions (Horn et al., 2009). Das entstandene Molekül Pyruvat wird entweder in die Mitochondrien transportiert und dort mit Hilfe von Pyruvat Dehydrogenase oxidiert bzw. über die Pyruvatcarboxylase- und Malatdehydrogease- Reaktion reduziert oder im Zytosol mit Hilfe von LDH zu Laktat reduziert. ππππππππππππππ + ππππππππ + π»π» + πΏπΏπΏπΏπΏπΏ πΏπΏπΏπΏπΏπΏ οΏ½οΏ½ ππππππππβπ π äπ’π’π’π’π’π’ + ππππππ + οΏ½β―οΏ½ [πΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏ −ππππ +] + ππππππ + + π»π» + Abb. 2: LDH- Reaktion Der in Abb. 3 dargestellte und in der überwiegenden Zahl der Lehrbücher publizierte leistungsphysiologische Zusammenhang zwischen der Laktatproduktion und der damit korrelierenden Protonenfreisetzung, welche zumeist als Ursache der metabolischen Azidose beschrieben wird, wird allerdings nicht einheitlich zugestimmt. So sind ROBERGS und AMANN in ihrer Veröffentlichung sicher, „Die ‚sportliche Azidose‘ entsteht anderswo, als bei der Laktat Dehydrogenase Reaktion“ und begründen dieses wie folgt: Die Reduktion von Pyruvat beinhaltet sowohl die Anlagerung von zwei Elektronen und einem Proton vom NADH als auch von einem Proton aus dem Zytosol. „Der C-2 des Pyruvats wird durch das Hinzufügen eines Elektrons und eines Protons von NADH reduziert und bildet somit eine kovalente Bindung mit Wasserstoff. Ein 8 Einleitung weiteres Elektron von NADH und ein Proton aus der Lösung werden zur Entstehung der Carboxylgruppe gebraucht. […] ist kein Proton mit der Carboxylgruppe assoziiert und somit findet weder eine Protonenfreisetzung noch eine Ionisation statt. Im Gegenteil, die LDH Reaktion ‚verarbeitet‘ ein Proton und fungiert daher als ‚Abflussbecken‘ für die im Katabolismus und in der ATP-Hydrolyse freigesetzten Protonen“ (Rogergs, 2003). Abb. 3: Strukturelle Darstellung der Laktat Dehydrogenase Reaktion. Nach ROBERGS und AMANN (Rogergs, 2003) Der Skelettmuskel zeichnet sich nicht nur als größter Produzent, sondern auf Grund der Tatsache, dass Laktat auch ein sehr energiereiches Molekül ist, als der größte Konsument im Körper aus. Zusammengefasst sind mehrere Gründe für die Laktatproduktion zu nennen: Einerseits die Zunahme der glykolytischen Energiebereitstellung, die bei Beginn der körperlichen Arbeit schneller ist als die Zunahme der oxidativen Decarboxylierung. Andererseits wird Laktat bei intensiver sowie sehr lang anhaltender sportlicher Betätigung produziert, da die maximale Kapazität der Glykolyse größer ist als die des oxidativen Weges, so dass das Adenosintriphosphat (ATP) nach unzureichendem oxidativen Stoffwechsel über den glykolytischen Weg produziert wird (Juel et al., 2004b; Gladden et al., 9 Einleitung 1996). Neben der Laktatproduktion unter physiologischen Belastungssituationen ist auch ein physiologischer Ruhelaktatwert von <1,8 ππππππππ πΏπΏ zu nennen (Biedler et al., 1995). Das energiereiche Molekül Laktat wird zum einen als Glycogen über die Glukoneogenese in der Muskulatur, Leber und Niere gespeichert, zum anderen dient dieses auch, unmittelbar nach der Oxidation zu Pyruvat, als Energiequelle für die aerobe ATP- Produktion in Herzmuskel, Gehirn sowie der Skelettmuskulatur. Neben der wichtigen Funktion als Energiequelle dient Laktat auch als zelluläres Signalmolekül. HASHIMOTO et al. ist es gelungen, an Ratten entsprechende Bindungsstellen für die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) nachzuweisen, welche Transkriptionsfaktoren beeinflussen. Somit liegt die Vermutung nahe, dass hier bei körperlicher Belastung ein Zusammenhang mit der mitochondrialen Biogenese im Skelettmuskel besteht sowie der Genexpression des Monocarboxylat- Transporters (MCT1). Der Einfluss auf Faktoren der Wundheilung und der Kollagenbildung sowie eine systemische Wirkung in Form einer Vasodilatation der Blutgefäße und einer Freisetzung der Alpha- und Betarezeptoraktiven Katecholamine konnte belegt werden. Eine negative Auswirkung auf den Glukosetransport unter erhöhtem Ruhelaktat konnte ebenfalls bei Ratten nachgewiesen werden (Hashimoto et al., 2007). Die Bedeutung dieses Energieträgers ist in der aktuellen Literatur unbestritten. Folglich sollte vor allem der Transportweg genauer betrachtet werden. Unter physiologischen Bedingungen ist das Laktat zu über 95 Prozent dissoziiert. Der Anstieg der π»π» + - Konzentration in Korrelation zu der Laktatproduktion könnte keinen Zusammenhang darstellen und eine andere Ursache haben, wie beispielsweise durch die weitere Steigerung der glykolytischen Rate und eine erhöhte Abhängigkeit vom zytosolischen ATP- Umsatz (Rogergs, 2003). DE MAREES beschreibt hierbei aber auch einen möglichen proportionalen 10 Einleitung Zusammenhang (de Marées, 2003). Ein sehr geringer Anteil des Laktats diffundiert in Form von undissoziierter Säure durch das Sarkolemm hindurch, da der intrazelluläre pH-Wert weit über dem pK liegt. Unterschiedliche, von Membranproteinen gebildete, Transportsysteme bilden den größten Teil des Laktatflusses durch das Sarkolemm. Der Transport von Laktat und π»π»+ verläuft immer im Verhältnis 1:1 und elektroneutral gekoppelt sowie stets ohne Energieverbrauch in Richtung des negativen Konzentrationsgradienten (Juel, 1997; Juel et al., 1999). Somit stellt der Transport von Laktat einen essentiellen Mechanismus für den Energiestoffwechsel und die pH- Regulation im Organismus dar (Juel et al., 1999). Der Kotransport von πΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏ − + π»π» + erfolgt durch den als Membranprotein in mehreren Isoformen vorliegenden Monocarboxylat Transporter (MCT). In Folge körperlicher Belastung und einer daraus resultierenden πΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏ −/π»π»+ -Akkumulation werden beide Produkte wie beschrieben durch die Membran und Endothelschicht ins Blut transportiert. 1.3. Monocarboxylat- Transporter (MCT) Jahrelang war lediglich bekannt, dass der Transport von Laktat und π»π» + immer absteigend nach dem Mechanismus der einfachen Diffusion erfolgt und nur von der Richtung des πΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏ −/π»π»+ -Gradienten abhängig ist. Das Gleichgewicht dieses Gradienten kann hierbei mit folgender Formel beschrieben werden: πΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏππππ π»π» +ππππππ = + πΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏππππππ π»π» ππππ Abb. 4: Mechanismus der einfachen Diffusion (Halestrap et Price , 1999) 11 Einleitung Thermodynamisch wirkt diesem Konzentrationsgefälle jedoch das Gesetz nach Haldane entgegen (Halestrap et Price, 1999). Um eine Azidose zu vermeiden, müssen alle lebenden Zellen über ein Transportsystem verfügen, welches das Laktat und somit vor allem die π»π»+ -Ionen nach außen abführt. Seit einigen Jahren ist bekannt, dass neben dem Mechanismus der Diffusion auch noch ein Laktattransportprotein existiert. Dieses Protein, welches Monocarboxylate transportiert, wurde 1994 zunächst im Hamster und später im Mensch beschrieben und als Monocarboxylat- Transporter (MCT) bezeichnet. Von diesem Protein, welches beispielsweise Pyruvat, Ketone und auch Laktat transportiert, konnten bisher 14 Isoformen nachgewiesen werden, welche sich in der C- und N- terminalen Aminosäuresequenz und dem Schleifenradius differenzieren. Allgemein besitzt der MCT zwölf transmembranäre alphahelicale Domänen. Charakteristisch ist neben einem intrazellulären N- und CTerminus auch die neben den kleinen Schleifen existierende große zentral gelegene intrazelluläre Schleife. Entsprechend der zu differenzierenden Isoformen wurden nicht nur eine spezifische Gewebeverteilung, sondern auch unterschiedliche Substrataffinitäten nachgewiesen. Die MCT 1 bis MCT 4, welche die ersten vier Isoformen darstellen, sind aufgrund ihres Vorkommens in der Muskulatur und den Erythrozyten in den letzten Jahren zumeist strukturell und funktionell untersucht und beschrieben worden. Anliegend an die oben beschriebene Formel des Konzentrationsgradienten ist hervorzuheben, dass der MCT sowohl in die Zelle hinein als auch aus der Zelle hinaus Monocarboxylate transportiert. 12 Einleitung 1.4. MCT1 im Erythrozyten Im Laufe der Erythropoese werden Zellkern und andere Zellorganellen ausgestoßen, so dass der erythozytäre Energiebedarf ausschließlich anaerob abgedeckt werden kann. Aufgrund der unter anderem in Ruhe entstehenden Laktatkonzentration erfolgt ein Ausstrom in das Blutplasma. Unter körperlicher Belastung hingegen erfährt der bestehende Gradient zwischen Erythrozyt und Plasma einen Wechsel, so dass dieser zu einem Laktateinstrom in den Erythrozyten führt. Seit vielen Jahren ist bekannt, dass Erythrozyten über Transportsysteme für Laktat verfügen. Diese sind zum einen die mit 4,5 Prozent beteiligte nicht- ionische Diffusion sowie das mit 6,5 Prozent beteiligte Band-3Protein und zum anderen der mit 89 Prozent überwiegende MCT1 (Skelton et al., 1998) (s. Abb. 5). Dieser erythrozytäre Monocarboxylat- Transporter stellt die bisher einzige, im Erythrozyten nachgewiesene Isoform dar und transportiert ebenfalls, wie oben beschrieben, L-Laktat und π»π» + - Ionen im Verhältnis 1:1 (Juel et al., 2003). In unabhängig voneinander durchgeführten Untersuchungen an Tieren konnten eine artspezifische Charakteristik des Monocarboxylat- Transporters sowie dessen Bindungsaffinitäten nachgewiesen werden. Demzufolge weisen Schafe, Rentiere und Ziegen im Vergleich zu Menschen, Hunden oder Pferden eine geringere Laktattransportkapazität auf und kompensieren dies überwiegend durch das Band-3-System sowie die nichtionische Diffusion (Skelton et al., 1995). 13 Einleitung Abb. 5: Darstellung des MCT1 nach HALESTRAP und PRICE (modifiziert Nach Halestrap et Price, 1999) Dass sich die erythrozytäre Laktattransportkapazität durch einen guten Trainingszustand positiv beeinflussen lässt, konnte sowohl in Tierversuchen als auch in humanen Studien nachgewiesen werden. So ist die einströmende Laktatrate in den Erythrozyten bei Trainierten höher als bei Untrainierten (Koho et al., 2002; Skelton et al., 1995; Connes et al., 2004a). In weiteren Untersuchungen an unterschiedlichen Pferderassen konnte so ein enger Zusammenhang zwischen der Leistungsfähigkeit und der MCT- Dichte nachgewiesen werden (Väihkönen et al., 2001). Die maximale Laktataufnahmekapazität in den Erythrozyten ist durch die Ionenverteilung und das Donnen- Gleichgewicht limitiert (Böning et al., 2007). Die Proteinexpression des MCT1 und die damit verbundene gesteigerte Laktataufnahmerate werden durch unterschiedliche Mechanismen beeinflusst. In Folge eines dreiwöchigen Schwimmtrainings wurde so eine Steigerung der 14 Einleitung erythrozytären MCT1- Expression um 18 Prozent bei Ratten nachgewiesen (Aoi et al., 2004). In einer weiteren humanen Studie führten hypoxische Bedingungen zu einer vermehrten Proteinexpression und somit zu einer gesteigerten Laktattransportkapazität (Juel et al., 2003). Im Gegensatz dazu konnte auch der negative Einfluss von Inaktivität auf den erythrozytären Laktattransport festgestellt werden (Skelton et al., 1998). Eine weitere Möglichkeit einer signifikanten positiven Beeinflussung der Lakatattransportkapazität am Menschen wurde durch eine Injektion des Glycoprotein- Hormons Erythropoietin, welches die Erythropoese steigert, nachgewiesen (Connes et al., 2004a). 1.5. MCT1 und MCT4 in der Skelettmuskulatur Neben dem oben beschriebenen, in Erythrozyten vorkommenden, MCT1 wird in der Muskulatur mit dem MCT4 (s. Abb. 7; Seite 18) eine weitere Isoform des Monocarboxylat- Transporters coexprimiert (Halestrap et al., 2004; Juel et al., 1997). Vergleichbar mit dem schon beschriebenen System Erythrozyt ist mit dem Laktat- und π»π» + - Cotransport auch in der Muskulatur die Kontinuität eines physiologischen pH- Wertes essentiell für den Organismus. Dessen Produktion und die damit verbundene pH- Verschiebung kann sowohl in Ruhe als auch bei geringer körperlicher Belastung über Ionenpufferungssysteme wie dem ππππ ⁄π»π»π»π»π»π»3− und ππππ ⁄π»π»+ - Austauscher (s. Abb. 6) kompensiert werden (Juel et al., 1998a). Unter erhöhter körperlicher Belastung ist ein schneller Transport von Laktat und π»π» + erforderlich, um der Reduktion des pH- Wertes durch die Zunahme der π»π» + - Konzentration entgegen zu wirken. Dieser erfolgt in Abhängigkeit von dem Konzentrationsgradienten. Insbesondere bei intensiver 15 Einleitung physiologischer Beanspruchung konnte in der Regenerationszeit die Korrelation zwischen dem MCT1/ MCT4 und der π»π» + - / Laktatkonzentration nachgewiesen werden (Juel et al., 1998b; Halestrape et al., 1999). Abb. 6: Darstellung pH- Regulation Bereits 1996 wurde eine muskelfaserspezifische Verteilungsdichte des MCT beschrieben. In den oxidativen Typ 1- Muskelfasern ist die MCT1Proteinexpression und in den glykolytischen Typ 2- Muskelfasern die MCT4Proteinexpression erhöht (Mc Cullagh et al., 1996; Mc Cullagh et al., 1997; Bonen et al., 2000a; Bonen et al., 2001). Neben diesem gewebespezifischen Verteilungsmuster konnte eine deutliche Differenz der L-Laktataffinität nachgewiesen werden. Die Michaelis- Menten- Konstante des MCT1 bei 5mM ist die Ursache für dessen hohen Wirkungsgrad bei geringen Laktatkonzentrationen im Vergleich zum MCT4, dessen Michaelis- MentenKonstante bei 20-30mM liegt (Dimmer et al., 2000; Juel et al., 1999). Aus diesen Erkenntnissen könnte geschlussfolgert werden, dass der MCT1 vornehmlich den Laktateinstrom und der MCT4 den Laktatausstrom der Zellen unterstützt (Bonen et al., 2000b; McCullagh et al., 1996). Folglich hat eine erhöhte MCTDichte auf den Transport von Laktat und dessen Verstoffwechselung unter 16 Einleitung Belastung und in der Regeneration des Organismus einen positiven Einfluss (Mc Cullagh et al., 1996; Bonen et al., 1998; Dubouchaud et al., 2000). Eine positive Korrelation, zwischen einem gesteigerten Metabolismus der Muskulatur in Folge einer sportlichen Intervention und dessen gesteigerte MCTExpression (Pilegaard et al., 1994; Mc Cullagh et al., 1997; Bonen et al., 2000b; Dubouchaud et al., 2000; Juel et al., 2004a; Juel et al., 2004b), konnte ebenso wie die positive Korrelation zwischen einer reduzierten MCT- Dichte infolge körperlicher Inaktivität (Pilegaard et al., 1998) sowohl in Tierstudien als auch in humanen Studien nachgewiesen werden. Die Proteinexpression erfolgt hierbei nach dem Schema der posttranslationalen Modifikation (Bonen et al., 2000a; Coles et al., 2004). Die Trainingsintensität zeigte hier aber einen nicht zu vernachlässigenden Einfluss auf die differenzierten Expressionsraten des MCTs. Die MCT1- Proteinexpression wird demnach bereits bei sehr moderaten Belastungsintensitäten angeregt, die des MCT4 hingegen erst in Folge submaximaler Belastungen (Juel et al., 2006). Neben der trainingsbedingt gesteigerten Proteinexpression konnte auch in akuten Belastungssituationen eine temporäre Dichtezunahme der MCT- Proteine nachgewiesen werden (Coles et al., 2004; Green et al., 2002). Dieser Sachverhalt lässt den Vergleich mit dem Glukose-4-Transporter zu, bei welchem eine belastungsinduzierte Membrantranslokation nachgewiesen werden konnte (Richter et al., 1998; Phillips et al., 1996). 17 Einleitung Abb. 7: Darstellung des Laktattransportes im untrainierten Zustand; Vergleich trainierter Zustand Abb. 48, Seite 108 1.6. CD147 im Erythrozyten und der Skelettmuskulatur Das Glycoprotein CD147 wird in anderen Organismen auch als EMMPRIN, OX47, CE9, gp42, TH7, 5A11, Basigin oder Hab18G bezeichnet (Altruda et al., 1989; Seulberger et al., 1990; Schlosshauer et al., 1990; Miyauchi et al., 1990; Fossum et al., 1991; Kasinrerk et al., 1992; Nehme et al., 1993; Fadool et al., 1993; Jiang et al., 2001). Hierbei handelt es sich um ein zu den Immunglobulinen 18 Einleitung gehörendes, in sehr vielen physiologischen und pathologischen Prozessen exprimiertes, Membranprotein (s. Abb. 5, Seite 14). Unter physiologischen Gesichtspunkten fungiert die lg- Domäne als Adhäsionsmolekül, die zytosolische Domäne hingegen induziert die Expression von Matrix- Metalloproteasen (MMP) und wird folglich mit der Angiogenese und der Apoptose in Zusammenhang gebracht (Jiang et al., 2007; Gallgher et al., 2009). Unter pathologischen Aspekten ist CD147 mit der Entstehung von Arteriosklerose (Choi et al., 2002) und Tumorzellen (Biswas et al., 1995; Gallgher et al., 2007; Baba et al., 2008; Su et al., 2009) assoziiert. Der größte Teil dieses transmembranösen Proteins befindet sich extrazellulär und besteht aus zwei Ig- Domainen, einer kurzen transmembranösen- und zytoplasmatischen Domäne sowie einem katalytisch wirksamen N- terminalen Ende (Fossum et al., 1991). Außerdem besteht dieses Protein aus einem Glutaminsäurerest, welcher an der Plasmamembran beteiligt sein könnte. Diese Struktur lässt die Vermutung zu, dass CD147 andere Proteine sowohl intra- als auch extrazellulär binden kann und in viele Interaktionen involviert ist (Jiang, et al., 2007). Sowohl in der Muskulatur als auch im Erythrozyten scheint das Membranprotein CD147 eine essentielle Funktion für den Laktattransport durch den MCT zu übernehmen. In einer Tierstudie an Herzmuskelgewebe konnte neben der Kolokalisation von MCT1 und MCT4 auch CD147 detektiert werden (Kirk et al., 2000). Die Kolokalisation von MCT1 und CD147 konnte neben dem Herz- und Skelettmuskel außerdem bereits im Gewebe von Leber, Niere, Hoden und Darm nachgewiesen werden (Nakai et al., 2006). Unter der Kolokalisation mit CD147 stellte sich eine erhöhte Laktattransportrate des MCT1 dar (Kirk et al., 2000). Diese Erkenntnisse lassen den Schluss zu, dass CD147 als Chaperon für die beiden MCT- Isoformen 1 und 4 fungiert und für die Translokation in die 19 Einleitung Plasmamembran essentiell ist (Kirk et al., 2000; Wilson et al., 2005; Jiang et al., 2007). In einer weiteren Studie, in der Erythrozyten von Pferden untersucht wurden, konnte eine positive Korrelation zwischen der CD147- Dichte, dem Trainingszustand und der Rate des Laktattransportes nachgewiesen werden. Dies lässt den Schluss zu, dass das Protein CD147 nicht nur im Muskelgewebe, sondern auch im Erythrozyten als Chaperon des MCT1 anzusehen ist (Koho et al., 2002; Koho et al., 2006). Die Expression und Translokation von MCT1 und MCT4 in der Plasmamembran beruht auf einer Konformationsänderung des Membranproteins CD147, welches so die Aktivität reguliert (Wilson et al., 2005). In Tierversuchen mit CD147- knockout- Mäusen wurde ein dem Normlevel entsprechendes MCT1-, MCT3- und MCT4- mRNA, aber eine deutlich reduzierte Proteinmenge analysiert (Philp et al., 2003a; Nakai et al., 2006). Diese Ergebnisse könnten darauf hinweisen, dass CD147 eine Chaperonfunktion bzgl. der Translokation erfüllt, nicht aber an der Proteinexpression beteiligt ist. In Tumoren liegt eine vermehrte MCT1- Expression vor, welche mit der CD147Expressionssteigerung in Korrelation gebracht werden kann (Froberg et al., 2001; Nabeshima et al., 2006a; Nabeshima et al., 2006b; Zhang et al., 2006). Auch die bei einem Mammakarzinom vorliegende vermehrte Expression von CD147 konnte mit der gestiegenen MCT4 Expression in Zusammenhang gebracht werden. Folglich konnte festgestellt werden, dass der MCT-/ CD147Komplex nicht nur einen Einfluss auf die Matrix- Metalloproteasen (MMP), sondern auch auf den Laktattransport nimmt (Gallagher et al., 2007). Untersuchungen von PINHEIRO et al. konnten in Bezug auf die Koexpression von MCT und CD147 eine klinisch pathologische Signifikanz in unterschiedlichen Tumoren nachweisen. Eine vermehrte MCT1-/ CD147- Dichte wurde sowohl bei dem Magenkarzinom als auch bei Tumoren im Ovar festgestellt. Die MCT4-/ 20 Einleitung CD147- Koexpression hingegen war im Fall eines Mamma- und Bronchialkarzinoms signifikant erhöht (Pinheiro et al., 2009a; Pinheiro et al., 2010). Insbesondere auf den pathologischen Metabolismus bei Tumorerkrankungen bezogen scheint das Protein CD147 eine essentielle Rolle bei der Lokalisation des MCT einzunehmen. Aufgrund der hypoxischen Bedingungen sind Tumorzellen auf den glykolytischen Stoffwechsel angewiesen. So stellt die erhöhte Expression von CD147 einen ungünstigen Prognosefaktor dar und könnte durch eine Reduzierung, in Folge sportlicher Interventionsmaßnahmen, auch mögliche neue Therapieansätze darstellen (Baba et al. 2008; Pinheiro et al., 2009b; Su et al., 2009). 1.7. Diabetes Mellitus und Sport Die Umstellung des eigenen Lebensstils in Bezug auf die Ernährung und die körperliche Aktivität stellt sowohl in der Behandlung als auch in der Prävention von Diabetes- Typ- 2- Patienten einen essentiellen Ansatz der kausalen Therapie dar. Folgen eines ungesunden Lebensstils sind gemeinsam mit der daraus resultierenden Adipositas und einer genetischen Disposition die primären Risikofaktoren des metabolischen Syndroms und des Entstehens einer pathologischen Glukosetoleranz (IGT) bis hin zu der Entwicklung eines Diabetes Mellitus- Typ- 2 (Sigal et al., 2004; Halle et al., 2008). Folglich reduzieren Lebensstilinterventionen das Risiko für die Inzidenz eines Diabetes- Typ- 2 um 58 Prozent und die Manifestation einer IGT. Dies konnte in randomisierten Studien wie beispielsweise in dem „U.S. Diabetes Prevention Program“, der „Finish Diabetes Prevention Study“ und der „Inter99 Study“ gezeigt werden (Toumilehto et al., 2001; Lindstrom et al., 2006; Engberg et al., 2010). 21 Einleitung Die Steigerung der körperlichen Aktivität durch Kraftausdauertraining und insbesondere durch aerobes Ausdauertraining wurde von der American Diabetes Association (ADA) mit dem Evidenzgrad A eingestuft. Hierbei wird eine Intensität von 40-60 Prozent der ππππ2 ππππππ bei einem Umfang von mindestens 150 Minuten pro Woche oder mindestens 90 Minuten pro Woche bei der Intensität von >60 Prozent der ππππ2 ππππππ an mindestens 3 Tagen pro Woche mit weniger als 2 konsekutiven Tagen ohne Training angenommen (König et al., 2006; Sigal et al., 2006). Neben der ADA empfiehlt auch die Deutsche Diabetes Gesellschaft (DDG) die sporttherapeutische Intervention als primäre Therapiemaßnahme im Rahmen der Sekundärprävention von Typ-2 Diabetespatienten (Halle et al., 2008). Metaanalysen belegen den Therapieeffekt mit zahlreichen kontrollierten Studien, die eine durchschnittliche Reduktion des HbA1c von 0.7 bis 0.8 Prozent darstellen konnten (Snowling et al., 2006; Boule et al., 2001; Boule et al., 2003). Des Weiteren wird empfohlen die Alltagsaktivitäten und die Belastungsintervalle auf 30-60 Minuten an 3-4 Tagen pro Woche zu steigern, um einen nachhaltigen Effekt zu erzielen. (Kemmer et al., 2009). Die Deutsche Gesellschaft für Prävention und Rehabilitation (DGPR) empfiehlt in der publizierten ‚Leitlinie körperliche Aktivität zur Sekundärprävention und Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen‘ die Belastung mit einer Intensität von 40-80 Prozent der ππππ2 ππππππππ oder einen Laktatwert von 2.0 – 2.5 (Bjarnason-Wehrens, 2009). ππππππππ πΏπΏ Neben der Art der Belastung werden in aktuellen Studien vor allem auch die Intensität und der Umfang einer sporttherapeutischen Intervention kontrovers diskutiert. In einer von CAUZA et al. publizierten Studie werden im Vergleich zu einem Ausdauertraining die Insulinsensitivität und positiven die Effekte eines Krafttrainings Blutglukosekonzentration sowie auf die die Lipid- stoffwechselparameter dargestellt (Cauza et al., 2005). 22 Einleitung Dass Ausdauertraining zu einer verstärkten insulinaktivierten Glykogensynthese führt, der Glukosestoffwechsel auf Ausdauer- bzw. Krafttraining jedoch nicht differenziert reagiert, konnte von FERRARA et al. an adipösen männlichen Patienten nachgewiesen werden (Ferrara et al., 2006). Die Kombination aus einem Ausdauer- und Krafttraining bewirkt einen größeren Effekt als das jeweilige separate Trainingsprogramm. Der Trainingsumfang ist in der von SIGAL et al. durchgeführten randomisierten Studie allerdings additiv zu betrachten (Sigal et al., 2007). Die Auswirkungen einer Kraft- und Ausdauerintervention sind vergleichbar. Eine Kombination stellt allerdings einen zusätzlich positiven Effekt bzgl. der glykämischen Stoffwechselsituation dar (Zanuso et al., 2010). Wie bereits dargestellt, werden neben der Interventionsart auch die Intensität und der Umfang diskutiert. So wird bei einer höheren Intensität bzw. einem größeren Umfang möglicherweise ein größerer Effekt erzielt (Houmard et al., 2004; Sigal et al., 2004; Boule et al., 2003). In einer Studie von MANDERS et al. werden moderate Belastungen im Vergleich zu höheren Intensitäten als effektiver beschrieben (Manders et al., 2010). Dieser Effekt ist nicht nur nach akuter Belastung, sondern auch in Folge einer Trainingsintervention zu beobachten (Venables et al., 2008). In der Publikation von HANSEN et al. werden bei konstantem Energieverbrauch keine Differenzen zwischen den Belastungsintensitäten festgestellt (Hansen et al., 2009). Eine Korrelation zwischen der ππππ2 ππππππ , der Insulinsensitivität, dem HbA1c und der Belastungsintensität im Rahmen eines Ausdauertrainings konnte von ZANUSO et al. festgestellt werden (Zanuso et al., 2010). Mit dem Ziel, nachhaltige Effekte in der Therapie zu erzielen, ist es unabdingbar, primär die Belastbarkeit und motivationalen Aspekte des Patienten im Fokus zu haben. Die Interventionsmaßnahme sollte darauf abgestimmt werden, um negative Einflüsse auf die Compliance zu vermeiden. Das ist u. a. auch der Grund für das häufig in Studien untersuchte moderate Ausdauertraining. Die 23 Einleitung optimalen Möglichkeiten der individuellen Intensitätssteuerung und der stetigen EKG- Kontrolle sind zwei entscheidende Argumente, die das Ergometertraining befürworten (Bjarnason-Wehrens, 2009). Insbesondere ein regelmäßig durchgeführtes aerob orientiertes Ausdauertraining führt zu einer Senkung des HbA1c, des Blutdrucks sowie einer Reduzierung der Triglyceride und einer Steigerung der HDL- Konzentration und der Insulinsensitivität. Ein weiterer Aspekt ist die Gewichtsreduktion, welche der Adipositas und somit dem metabolischen Syndrom entgegenwirkt (Ross et al., 2001; Hauner et al., 2005). Außerdem führt diese Reduktion des visceralen Fettgewebes bei konstantem Muskelaufbau zu einer Optimierung der mitochondrialen Fettsäureoxidation und Insulinsensitivität (Boule et al., 2005; Bruce et al., 2006; Ross et al., 2009). BRUCE et al. konnten in Folge zellulärer Analysen eine Steigerung der mitochondrialen oxidativen Enzymkapazität sowie der transmembranösen bzw. intrazellulären Lipid- Transportproteine nachweisen. Die Konsequenzem sind, bezogen auf die Triglyceride, die Optimierung kataboler Prozesse und eine allgemeine Verbesserung des Lipidprofils (Bruce et al., 2003b; Bruce et al., 2004). Des Weiteren resultiert aus einer erhöhten intramuskulären Konzentration an Triglyceriden die Hemmung der Insulinsignalkaskade beginnend mit dem Insulin- Rezeptor- Substratkomplex (IRS) und der konsekutiv verminderten GLUT4-Translokation. Körperliche Aktivität bewirkt eine Zunahme des Glukosetransporters (GLUT) und kann so diesem Prozess entgegenwirken. Die währenddessen außerdem vorliegende Reduktion des ATP/ AMP- Quotienten führt zu einer verstärkten Aktivität der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) und somit zu einer vermehrten Translokation von GLUT4 in die Membran (Jessen et Goodyear, 2005; König et al., 2006). 24 Einleitung 1.8. Fragestellung Die aktuelle Studienlage beinhaltet nur wenige Arbeiten, die Effekte und Regulationsmechanismen von körperlicher Belastung auf den Laktattransport bei Diabetes-Typ-2- Patienten untersucht haben. KREUTZ konnte bereits im Vergleich von Kraft- und Ausdauertraining einen langfristigen Einfluss auf den MCT nachweisen (Kreutz, 2010). Gegenstand dieser Arbeit ist es, einerseits die langfristige, trainingsbedingte Adaptation des MCT im Erythrozyten und der Skelettmuskulatur zu analysieren, andererseits aber insbesondere die kurzfristigen, engmaschige belastungsbedingten Analyse der Veränderungen Erythrozyten durch eine herauszustellen. zeitlich Sowohl Trainingsintensität als auch –umfang sind im Vergleich zu der zuvor angesprochenen Studie deutlich erhöht und werden im Vergleich zu einer Kontrollgruppe betrachtet. Im Zusammenhang mit dem MCT- Protein und den zugrundeliegenden Regulationsmechanismen wird in aktuellen Publikationen das Protein CD147 als Chaperon diskutiert. Regulationsmechanismus Um darstellen einen zu möglichen können, wird gemeinsamen dieses in die Untersuchungen der Studie mit eingeschlossen. Aus diesen Zusammenhängen wurden folgende Fragestellungen abgeleitet: 1. In welchem Umfang kann die sportliche Trainingsintervention die diabetisch relevanten Stoffwechselparameter und die körperliche Leistungsfähigkeit positiv beeinflussen? 2. Führt ein sportwissenschaftlich angeleitetes Interventionsprogramm zu einem langfristigen, trainingsbedingten Anstieg der MCT1 und MCT4 Proteinexpression in der Skelettmuskulatur? 25 Einleitung 3. Kann die MCT1- Dichte in Erythrozyten durch ein viermal wöchentlich stattfindendes Ausdauertraining positiv beeinflusst und gesteigert werden? 4. Lassen sich in Bezug auf den MCT1 im Erythrozyten kurzfristige, belastungsbedingte Veränderungen in der Proteindichte nachweisen? 5. Besteht sowohl in der Skelettmuskulatur als auch in den Erythrozyten ein Zusammenhang zwischen den Regulationsmechanismen der MCTund CD147- Proteinexpression? 26 Methodik 2. Methodik 2.1. Studiendesign Die im Verlauf dieser Studie durchgeführten Untersuchungen fanden für jeden Probanden der Ausdauer- und Kontrollgruppe dreimal statt. Der erste Untersuchungszeitpunkt (U1) diente der Analyse der Basalwerte, bevor eine sechswöchige Trainingsinterventionsphase folgte. Nach diesen sechs Wochen fand eine weitere Untersuchung (U2) statt, welche als Zwischenuntersuchung den bisherigen Trainingserfolg und Studienverlauf darstellt. In dessen Folge startete dann die zweite Hälfte des insgesamt 12-wöchigen sportlichen Interventionsprogrammes, welches mit der letzten Untersuchung (U3) den Abschluss fand (s. Abb. 8). Das Trainingsprogramm bestand sowohl in der Ausdauergruppe als auch in der Kontrollgruppe jeweils in der ersten Hälfte aus drei beaufsichtigten und einer in Eigenverantwortung zu Hause durchgeführten Trainingseinheit pro Woche und in der zweiten Hälfte aus zwei beaufsichtigten und zwei in Eigenverantwortung zu Hause durchgeführten Trainingseinheiten pro Woche. Jede der Untersuchungen erstreckte sich über drei Tage. Der Erste bestand aus einer Nüchternblutentnahme, der zweite Untersuchungstag diente der Erhebung aller weiteren Parameter (s. Tab. 2) und der dritte Untersuchungstag diente der Muskelbiopsie. Neben der Erfassung von persönlichen Daten in der ärztlichen Anamnese wurden außerdem sämtliche morphometrische Daten erfasst, ein Ruhe- EKG sowie ein Belastungs- EKG mit Spiroergometrie durchgeführt. 27 Methodik Abb. 8: graphische Darstellung des Studienablaufs Nüchternblutabnahme Cholesterin Triglyceride HDL LDL Blutzucker HbA1c Anthropometrische Parameter Lebensalter Körpergröße Körpergewicht Body-Mass-Index Belastungsparameter Blutdruck Herzfrequenz Max. Leistung Laktat ππππ2ππππππππ RQ Tab. 2: Tabellarische Darstellung der erhobenen Parameter 28 Methodik 2.1.1. Probandenbeschreibung/ -rekrutierung In Vorbereitung auf die Ausdauer- und Kontrollgruppe erfolgte die Rekrutierung der Probanden jeweils zum einen mit Hilfe zweier in den regionalen Tageszeitungen veröffentlichten Anzeigen, zum anderen mittels Informationsbriefen an lokal tätige diabetologisch orientierte Fachärzte. Die angesprochene Zielgruppe waren übergewichtige, männliche, nicht- insulinpflichtige Typ- 2- Diabetiker im Alter von über 30 Jahren. In Folge dieser Akquise fand für alle Interessenten ein Informationsabend in den Räumlichkeiten der Deutsche Sporthochschule Köln statt. Aus allen Bewerbern wurden nun randomisiert 27 Studienteilnehmer für die Ausdauergruppe und 25 Studienteilnehmer für die Kontrollgruppe ausgewählt. Von zunächst 52 Probanden musste einer das Ausdauerinterventionsprogramm und drei weitere das Kontrollinterventionsprogramm auf Grund gesundheitlicher und/ oder privater Probleme abbrechen. Zudem war für die erfolgreiche Teilnahme eine 90 prozentige Anwesenheit verpflichtend angesetzt, so dass auch dieses Kriterium dazu führte, dass fünf weitere Probanden von der Datenauswertung in der Ausdauer- und Kontrollgruppe ausgeschlossen werden mussten. Nach dem Start wurde die Studie mit 24 Teilnehmern in der Ausdauergruppe und 19 Teilnehmern in der Kontrollgruppe beendet. Zu Beginn der Studie betrug das durchschnittliche Alter der Teilnehmer 59.7 ±9.9 Jahre und das mittlere Gewicht 99.0 ±14.6 kg. Der hieraus ermittelte durchschnittliche BMI war 31.8 ±4.0 kg m2 . Im Folgenden sind die anthropometrischen Daten der Ausdauer- und Kontrollgruppe gegenübergestellt (s. Tab. 3). Das durchschnittliche Alter der Ausdauergruppe betrug 60.7 ±9.1 Jahre und das der Kontrollgruppe 58.6 ±10.6 Jahre. Das mittlere Gewicht lag in der Ausdauergruppe bei 99.9 ±14.0 kg und in der Kontrollgruppe bei 98.0 ±15.7 kg. Die Ausdauergruppe hatte demzufolge 29 Methodik einen durchschnittlichen BMI von 31.2 ±3.5 32.6 ±4.6 kg m2 . und die Kontrollgruppe von Ausdauergruppe Kontrollgruppe Alter (Jahren) Größe (cm) Gewicht (kg) π€π€π€π€ BMI (π¦π¦ππ ) kg m2 Gesamtkollektiv 60.7 ±9.1 58.6 ±10.6 59,9 ±9,9 178,7 ±7,1 173,3 ±8,0 176,0 ±7,6 99.9 ±14.0 98.0 ±15.7 99,0 ±14,6 31.2 ±3.5 32.6 ±4.6 31,8 ±4,0 Tab. 3: tabellarische Darstellung der anthropometrischen Parameter im Gruppenvergleich 2.2. Untersuchungsablauf 2.2.1. Basaluntersuchung Die Basaluntersuchung fand einen Tag vor der Belastungsuntersuchung statt und diente der Erfassung anthropometrischer Daten sowie der Nüchternblutentnahme und der Aufzeichnung des Ruhe- EKGs. 2.2.2. Anthropometrischen Daten • Kalendarisches Alter, Körpergröße und Körpergewicht Das kalendarische Alter wurde zu Beginn der U1 errechnet und im weiteren Studienverlauf nicht verändert. Der Erfassung der Körpergröße diente ein geeichtes Massband Typ Seca 225 (Fa. Vogel & Halke, Hamburg, D), welches an einer senkrechten Wand installiert war. Die Probanden befanden sich hierbei ohne Schuhe in aufrechter Haltung. Grundlage der Analyse des Köpergewichtes waren die standardisierten Bedingungen der IDIS (Laaser et al., 1989). Der Proband befand sich hierbei nüchtern ohne Schuhe und in leichter Kleidung auf der Standwaage Typ Seca761 (Fa. Vogel & Halke, Hamburg, D). 30 Methodik 2.2.3. Nüchternblutentnahme und Laborparameter Die venöse Blutentnahme erfolgte nüchtern in den Morgenstunden aus einer Armvene mittels einer Butterfly- Nadel in einen EDTA- Vacutainer (Fa. Becton Dichinson Vacutainer Systems, Heidelberg, D) und einen Serum- Vacutainer (Fa. Becton Dichinson Vacutainer Systems, Heidelberg, D). 2.2.4. Ruhe- EKG Grundlage für das Ruhe- EKG stellten die Extremitätenableitungen nach Einthoven und Goldberger, sowie die Brustwandableitung nach Wilson dar. Dieses erfolgte in absoluter Ruhe unter der Verwendung des MAC-1200 (Fa. Medical Systems, Freiburg, D). 2.2.5. Belastungsuntersuchung 2.2.5.1. Fahrradergometer und Spirometrie • Fahrradergometer: Fa. ergoline ergometrics 900, Bitz, D • EKG-Gerät: Fa. ergoline ergoscript EK3012, Bitz, D • Spiroergometrie: Zan 600 CPET Fa. nSpire Health GmbH, Obertuhlba, D • Blutdruckmessgerät • Medizinische Notfallausrüstung • 20µl End-to-EndKapillaren, Fa. EKF- Diagnostik, Barleben, D • Einmallanzetten Haemostilett, Fa. ASID Bonz GmbH Herrenberg, D • Eppendorfcups incl. Systemlösung, Fa. Eppendorf Hamburg, D • Messgerät Ebio-plus, Fa. Eppendorf, Hamburg, D An jedem der drei für diese Studie durchgeführten Untersuchungstermine wurden die Probanden einer Belastungsuntersuchung auf dem Fahrradergometer unterzogen. Dies war absolut obligat, um zu erkennen, ob diese unter körperlicher Anstrengung Beschwerden wie beispielsweise Apnoe, Angina pectoris, Ischämien, etc. aufweisen würden. Außerdem konnte anhand der unter Belastung erhobenen EKG-, Laktat- und Blutdruckdaten die 31 Methodik Leistungsfähigkeit diagnostiziert und ein individuelles Training entworfen bzw. die Wirkung des Trainings quantifiziert werden. Zwecks der Datenerhebung während der durchgeführten Belastungsuntersuchungen wurden, neben einem drehzahlunabhängigen Fahrradergometer, auch ein Sechskanal- EKG- Gerät und ein halbautomatisches Blutdruckmessgerät genutzt, welches nach dem RivaRocci- Prinzip mit Hilfe eines Mikrophons zur Erfassung der KorotkowGeräusche arbeitet. In Bezug auf die Belastungsstufen orientierte sich diese Studie an dem WHO- Schema, welches von der WHO und der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie als Standard etabliert wurde. Hierbei handelt es sich um eine Eingangsbelastung mit 25W, die alle zwei Minuten stufenweise sukzessiv um weitere 25W gesteigert wird. Zur Parametererfassung wurden jeweils in den letzten Sekunden einer Stufe die Herzfrequenz, der Blutdruck und das EKG- Bild aufgezeichnet. Außerdem wurde den Probanden, wie in der Laktatdiagnostik und der Verarbeitung des Belastungsvollblutes auf den folgenden Seiten beschrieben, jeweils in den letzten zehn Sekunden einer Stufe kapillares Blut aus dem Ohr und darüber hinaus am Ende jeder zweiten Stufe venöses Blut aus einer Armvene entnommen (s. Abb. 9). Abb.9: Darstellung der Spiroergometrie 32 Methodik Während der gesamte Zeit des Belastungs- EKGs wurde der respiratorische Stoffwechsel der Atemgase mittels einer zuvor geeichten Spirometrie der Fa. nSpire Health GmbH erfasst. Die dabei analysierten Parameter wie maximale Sauerstoffaufnahme, Atemfrequenz, Atemminutenvolumen, Atemäquivalent und der respiratorische Quotient dienten hierbei ebenso wie alle anderen Parameter der Leistungsdiagnostik und Trainingssteuerung. Der Testleiter hatte in Anbetracht der erhobenen Daten zusätzlich die Aufgabe sämtliche Abbruchkriterien wie beispielsweise Angina Pectoris, ST-Senkungen, übermäßiger Blutdruckanstieg, polymorphe Extrasystolen, etc. zu überwachen. Der Proband fuhr andernfalls bis zur maximalen Ausbelastung, welche auch im Verlauf des Belastungstests mit Hilfe der BORG-Skala (Borg, 2004) in Form eines subjektiven Belastungsempfindens abgefragt wurde (s. Tab. 4). In Folge der maximalen muskulären Ausbelastung wurde der Widerstand, in einer Cooldown-Phase, zunächst auf 25W und nach zwei Minuten auf 0W reduziert. Auch in dieser Phase nahm der Testleiter sowohl unmittelbar nach der Ausbelastung als auch jeweils in der 2., 4., 6., 10., 20., 30., 45. und 60. Minute nach Belastungsende eine weitere Laktatprobe in Form von Kapillarblut aus dem Ohr und eine venöse Vollblutprobe aus der Armvene ab. Die Daten von Blutdruck, EKG und Herzfrequenz wurden weiterhin PC-gesteuert in einem zweiminütigen Intervall aufgezeichnet. Nach einer Normalisierung dieser Vitalparameter bestimmte der Testleiter den Zeitpunkt, an dem das Belastungs-EKG endgültig beendet war. 6 7 Sehr, sehr leicht 8 9 Sehr leicht 10 11 Recht leicht 12 33 Methodik 13 Etwas anstrengender 14 15 Anstrengend 16 17 Sehr anstrengend 18 19 Sehr, sehr anstrengend 20 Tab.4: Belastungsskala modifiziert nach der Borg- Skala (Borg, 2004) 2.2.5.2. Kardiale Ausbelastung Anhand der bei der Belastungsuntersuchung erreichten maximalen Leistung der Patienten wurde unter Berücksichtigung des Lebensalters und des Körpergewichtes mittels der folgenden Formel (Rost, 2005) die prozentuale kardiale Ausbelastung ermittelt. ππππππππππππππππ π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄: ππππππππ = 3 ππππππππ ∗ ππππ [πΎπΎπΎπΎ ] − 10% πΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏ [ππππ 30. πΏπΏπΏπΏ. ] [πΌπΌπΌπΌπΌπΌ] − [ππππππππ] KG: Körpergewicht; IST: erreichte max. Leistung; SOLL: berechnete Leistung 34 Methodik 2.2.5.3. Bestimmung der Laktatkonzentration • Einmallanzetten- Haemostilett, Fa. ASID Bonz GmbH, Herrenberg, D • 20µl End-to-End-Kapillaren, Fa. EKF- Diagnostik, Barleben, D • Eppendorfcups incl. Systemlösung, Fa. Eppendorf Hamburg, D • Messgerät Ebio-plus, Fa. Eppendorf, Hamburg, D Zwecks der kapillaren Blutgewinnung am Ohr, welche in unserer Studie sowohl vor Belastungsbeginn und am Ende jeder Belastungsstufe als auch in der 1., 2., 4., 6., 10., 20., 30., 45. und 60. Minute nach der Ausbelastung stattfand, stach der Testleiter mit einer Einmallanzette in das durch ihn mittels manuellen Druck hyperämisierte Ohrläppchen. Mit Hilfe der End- to- End- Kapillaren wurden standardisiert 20 µl des kapillaren Blutes entnommen und diese dann in ein Eppendorfcup transferiert. Nach dem Verschließen des Eppendorfcups wurde das kapillare Blut mittels Schütteln mit 1ml vorgefüllter Systemlösung vermischt und bis zur weiteren Verarbeitung bei ca. 4°C kühl gelagert. Die Bestimmung der Blutlaktatwerte erfolgte enzymatisch- amperometrisch mittels des Messgerätes Ebio-plus. Vor der Laktatbestimmung diente ein konfektionierter Standard der Nullpunktbestimmung und einer Gerätekalibrierung. Die Eichung des Gerätes erfolgte mit Hilfe von vier Kontrollen. Sowohl die Kontrolle als auch die Eichung wiederholte sich in regelmäßigen Abständen. Im Folgenden soll nun der allgemeine Untersuchungsprozess des Messgerätes dargestellt werden. Zunächst wird Laktat beim Passieren der Membran zu Pyruvat und Wasserstoffperoxid reduziert. Diese Reduktion wird durch das an der Membran befindliche, immobilisierte, aktive Enzym Laktatoxidase katalysiert. Das Reaktionsprodukt Wasserstoffperoxid wird wiederum an der Membran mittels einer Platinelektrode mit +600mV oxidiert. Das nun während der Probenentnahme stetig differenzierte Messsignal ist demzufolge von der Laktatkonzentration abhängig. Das Maximum, welches durch den maximalen 35 Methodik Anstieg der Strom- Zeit- Kurve gekennzeichnet ist, wird in einen Spannungswert umgewandelt. Dieser ist proportional der Laktatkonzentration. Laktat + ππ2 π»π»2 ππ2 2.2.5.4. • Laktatoxidase +600mV Pyruvat + π»π»2 ππ2 2π»π» + + ππ2 + 2ππ − Verarbeitung des Belastungsvollblutes Blood Collection Set (Butterfly- Nadel), Fa. Becton Dichinson Vacutainer Systems Europe, Heidelberg, D • Heparin- Vakuette, Fa. Becton Dichinson Vacutainer Systems Europe, Heidelberg, D • Zentrifuge- Rotixa 1200, Fa. Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, D • Paraformaldehyd (PFA) – 4% o 4 g Paraformaldehyd (Fa. Merck, Darmstadt, D) in 40 ml Aqua dest. (60° C) lösen o mit 1n NaOH (Fa. Merck, Darmstadt, D) klären und filtrieren o mit 50 ml 0.2 M mischen und mit dem pH-mV-Meter (Fa. Mettler Toledo, Schwerzenbach, CH) mit HCL (Fa. Merck, Darmstadt, D) auf pH 7.4 einstellen o mit Aqua dest. auf 100 ml auffüllen • Phosphate buffered saline (PBS) – 0,1M o 14.4 g/l Dinatrium-Hydrogenphosphat-Dihydrat (Fa. MerckSchuchardt, Hohenbrunn, D) in 250 ml Aqua dest. lösen o 2.6 g/l Natrium-Dihydrogenphosphat.Monohydrat (Fa. Merck, Darmstadt, D) dazugeben o 8.766 g/l Natriumchlorid (Fa. Merck, Darmstadt, D) hinzufügen o mit dem pH-mV-Meter (Fa. Mettler Toledo, Schwerzenbach, CH) mit HCL (Fa. Merck, Darmstadt, D) auf pH 7.4 einstellen o mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen 36 Methodik Die venöse Blutentnahme erfolgte bei jedem der Probanden sowohl vor (t0), am Ende jeder zweiten Belastungsstufe (50W, 100W, etc.) und unmittelbar nach der Belastung (t1), sowie in der 2., 4., 6., 10., 20., 30., 45. und 60. Minute nach Belastungsende jeweils mittels einer Butterfly-Nadel in einen HeparinVacutainer (Fa. Becton Dichinson Vacutainer Systems, Heidelberg, D). Das in diesem Vacutainer befindliche Heparin diente der Antikoagulation der entnommenen Proben. Die entnommenen Blutproben wurden wie im Folgenden beschrieben unmittelbar weiterverarbeitet und die Erythrozyten für weitere Untersuchungsmethoden isoliert. In ein Eppendorfcup wurden 200µl Heparin- Vollblut und 200µl Paraformaldehyd (PFA) gegeben, um die Erythrozyten in ihrem physiologischen Zustand zu fixieren. Nach dem Mischen wurden die Proben für 20 Minuten inkubiert. Dieser Inkubationszeit folgte eine Zentrifugation der Proben bei 800 rpm für drei Minuten. Der Überstand wurde abpipettiert und die im Sediment befindlichen Erythrozyten für zwei- bis drei-Minuten mit 200µl PBS- Puffer gewaschen. Daraufhin erfolgte für drei Minuten eine erneute Zentrifugation bei 800 rpm. Nach dem Abpipettieren des Überstandes wurden am Ende 800µl PBS- Puffer hinzugegeben. Anschließend waren die Proben fertig für die Lagerung im Kühlschrank bei ca. 4°C. 2.2.6. Muskelbiopsie Allen Probanden wurde, nach vorheriger Aufklärung und schriftlichem Einverständnis, zu jedem der drei Untersuchungszeitpunkte, durch eine Muskelbiopsie 50-100 mg Muskelgewebe aus dem M. vastus lateralis entnommen. Durchgeführt wurde die Biopsie mit Hilfe einer nach EVANS et al. modifizierten Biopsienadel (Evans et al., 1982). Zunächst wurde das Biopsieareal desinfiziert und durch die Injektion einer zweiprozentigen Lösung aus Xylocain 1:200.000 mit Adrenalin lokal 37 Methodik anästhesiert. Anschließend erfolgte die Öffnung der Haut- und Muskelfascie über eine Strecke von etwa 1 cm durch ein Skalpell. Durch diese konnte nun die Biopsienadel in den Muskelbauch eingeführt und das Muskelgewebe durch Unterdruck angesaugt werden. Das sich in der Hohlnadel befindliche Gewebe wurde abschließend durch einen Stanzzylinder abgetrennt. Die Hälfte der Gewebeprobe wurde in Tissue- Tek (Fa. Sakura, Zoeterwoude, NL) eingebettet und anschließend, wie auch die nicht in Tissue- Tek eingebettete Hälfte der Probe, in flüssigem Stickstoff gefroren. Die Lagerung erfolgte bei -80°C im Gefrierschrank (Fa. Heraeus Instruments, Osterode, D). Die eröffnete Biopsiestelle wurde adäquat mit einem Klammerpflaster und in den ersten 24 bis 48 Stunden zusätzlich mit einem Kompressionsverband versorgt. 2.3. Immunhistochemischer Nachweis Der Immunhistochemie liegt eine hochspezifische Antigen- Antikörper- Reaktion zugrunde, welche genutzt wird, um zelluläre Antigene detektieren zu können. Im Grundsatz muss bei der Behandlung der Proben zwischen der direkten und der indirekten Nachweisreaktion differenziert werden. Im Vergleich zu der direkten Methode, bei der ein primärer Antikörper unmittelbar durch eine Farbreaktion nachgewiesen wird, geschieht dieser Nachweis bei der für diese Analyse angewendeten indirekten Methode, wie im Folgenden beschrieben, mittels der Bindung eines sekundären Antikörpers, welcher zuvor die Bindung mit einem unkonjugierten primären Antikörper eingeht. Zunächst wurden die Proben mit einem zielantigenspezifischen unkonjugierten primären Antikörper inkubiert. Der im Folgenden angewendete biotinylierte sekundäre Antikörper ist gegen die Tierspezies des primären Antikörpers gerichtet. Der nächste Schritt besteht aus der Inkubation mit einem Horseradish- Peroxidase- Komplex, welcher ein Konjugat aus 38 Methodik Meerrettichperoxidase und Streptavidin ist. Der angewendeten indirekten Strept-ABC-Methode liegt die Streptavidin- Biotin- Bindung zugrunde, welche eine der stärksten bekannten nichtkovalenten biologischen Bindungen darstellt. Streptavidin ist ein von Bakterien der Spezies Streptomyces avidinii produziertes Protein, dass aus vier identischen Untereinheiten besteht und mit sehr hoher Affinität (Ka ~ 1014–1015 M-1) jeweils ein Molekül des Vitamins Biotin des sekundären Antikörpers bindet. Die Visualisierung erfolgt durch die Zugabe des 3,3- Diaminobenzidin – ein Enzym- Substrat- Komplex. 2.3.1. Immunhistochemische Analyse am Erythrozyten Ansätze Trispuffer (TBS) 0.05 mol [pH 7.6]: • 6.057g Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Fa. Merck, Darmstadt, D) in 250ml Aqua dest. lösen • 8.766g NaCl (=150mmol) dazugeben (Fa. Merck, Darmstadt, D) • Mit 1n HCL (Fa. Merck, Darmstadt, D) und pH-mV-Meter (Fa. Mettler Toledo, Schwerzenbach, CH) auf pH 7.6 einstellen • Mit Aqua dest. auf 1000ml auffüllen • pH- Kontrolle Phosphatpuffer (PB) 0.1 mol [pH 7.4]: • 14.4g/l Dinatrium-Hydrogenphosphat-Dihydrat (ππππ2 π»π»π»π»π»π»4 π₯π₯ 2 π»π»2 ππ) in 250ml Aqua dest. Lösen (Fa. Merck- Schuchardt, Hohenbrunn, D) • 2,6g/l Natrium-Dihydrogenphosphat.Monohydrat hinzugeben (Fa. Merck, Darmstadt, D) • (ππππππ2 ππππ4 π₯π₯ π»π»2 ππ) Mittels pH-mV-Meter (Fa. Mettler Toledo, Schwerzenbach, CH) auf pH 7.4 einstellen • Mit Aqua dest. auf 1000ml auffüllen 39 Methodik • pH- Kontrolle 3.3- Diaminobenzidin (DAB)- Lösung: • 15ml 0.1 mol PB [pH 7.4]: o 150 µl Diaminobenzidin (DAB) = 7.5mg (Fa. Merck, Darmstadt, D) o 150 µl Ammoniumchlorid (ππππ4 πΆπΆπΆπΆ) = 6.0mg (Fa. SigmaAldrich, Steinheim, D) o 300 µl Nickel-II-Sulfat (NiSO4 ) = 0.05mol (Fa. Merck, Darmstadt, D) o 300 µl 10% β-D-Glucose (Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim, D) o 50 µl Glucoseoxidase (Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim, D) o Lösung anschließend Filtrieren Wasserstoffperoxid: • 20 ml Methanol (Fa. Merck, Darmstadt, D) • 4.5 ml Aqua dest. • 0.5 ml 30% (H2 O2 ) (Fa. Merck, Darmstadt, D) Alkoholreihe: • Je 2 Minuten in o 70% Ethanol (Fa. Hoffmann, Düsseldorf, D) o 96% Ethanol (Fa. Hoffmann, Düsseldorf, D) o 100% Ethanol (Fa. Hoffmann, Düsseldorf, D) o Xylol (Fa. Quadflieg, Gelsenkirchen, D) Antikörper • Rabbit Anti- Monocarboxylate Transporter 1 (MCT1) – AB3538P, Fa. Chemicon international, Temecula California 92590 USA o Verdünnung: 1:1000 40 Methodik • Goat- Anti Rabbit – Ref.: E0432, Fa. Dako Deutschland GmbH, Hamburg, D o Verdünnung: 1:400 • Normal- Goat- Serum – Ref.: X0907, Fa. Dako Deutschland GmbH, Hamburg, D • Horseradish- Peroxidase- Komplex (HRP) – RPN1051V, Fa. GE Healthcare UK Limited, Chalfont St. Giles, Bucks, GB o Verdünnung: 1:150 Immunhistochemischer Ablauf Etwa 20µl der in PFA fixierten und bei 4°C gelagerten Erythrozyten wurden nun auf einem mit Datum, Probandennamen und Antikörper beschrifteten Objektträger (Fa. Menzel, Braunschweig, D) ausgestrichen und durch mehrmaliges Schwenken über einem Bunsenbrenner hitzefixiert. Unter einem Lichtmikroskop (Fa. Optech, München, D) erfolgte die Begutachtung der Ausstriche, um neben der Unversehrtheit auch die Anzahl der Erythrozyten zu kontrollieren. Auf den Objektträgern wurden nun, mittels eines hydrophoben PAP- Pen Markerstiftes (Fa. Dako, Hamburg, D), zwei Areale markiert. Eines der Areale stellte die immunhistologisch zu behandelnde Fläche dar (s. Abb. 10, Seite 44), das andere Areal hingegen die immunhistologische Kontrolle (IHC) (s. Abb. 11, Seite 44). Dieses, als IHC bezeichnete Areal, erfuhr im Laufe der Untersuchung keinen Kontakt mit dem primären Antikörper, wodurch dieses auch keine Färbung erfahren sollte. Die im Folgenden beschriebene Untersuchungsmethode wurde und im in Institut dieser für Arbeit angewandte Sportmedizin und Kreislaufforschung der Deutschen Sporthochschule Köln unter der Leitung von Prof. Dr. Bloch entwickelt. Zu Beginn der immunhistochemischen Untersuchung wurden die Ausstriche auf den Objektträgern mit Hilfe einer 0.05 M Tris- Pufferlösung (TBS) für fünf Minuten gewaschen. Dieser Vorgang wurde nach jedem der folgenden 41 Methodik Arbeitsschritte wiederholt, außer vor der Inkubation mit dem primären Antikörper. Nach dem ersten Waschen wurden die Proben für 45 Minuten mit dem Enzym Trypsin (Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim, D) inkubiert. Entscheidend war hierbei die Inkubation bei 37° C. Das Verdauungsenzym Trypsin, welches im menschlichen Dünndarm essenziell für die Eiweißzersetzung ist, perforiert die Zellmembran, um den intrazellulären Laktattransporter (MCT1) erreichen zu können. Nach diesem Schritt wurde gewaschen, bevor im nächsten Arbeitsvorgang zweimal eine Lösung aus 20 ml Methanol, 4.5 ml Aqua dest. und 0.5ml Wasserstoffperoxid für je 20 Minuten auf den Objektträger gegeben wurde. Mit diesem Arbeitsschritt sollen die eventuell vorhandene endogene Peroxidase blockiert werden, um so ein verfälschtes Ergebnis zu vermeiden. Auch nach diesem Schritt erfolgt das Waschen mit TBS. Nun wurde eine in TBS hergestellte dreiprozentige Milchpulverlösung, für 60 Minuten auf den Objektträger gegeben. In diesem Schritt erfolgte die Blockierung der unspezifischen Bindungsstellen durch das Protein, um zu verhindern, dass diese von dem primären Antikörper gebunden werden. Der MCT1, welcher den primären Antikörper darstellt, wurde, wie vom Hersteller angegeben, 1:1000 mit 0.3%-iger Milchpulverlösung verdünnt und für eine Inkubationszeit von 60 Minuten auf die Proben gegeben. Hier wurde die schon angesprochene IHCProbe nicht mit dem Antikörper versetzt, sondern lediglich mit der 0.3%-igen Milchpulverlösung inkubiert. Das, nach dem folgenden Waschen, für 30 Minuten aufgebrachte dreiprozentige Normal- Goat- Serum blockiert, äquivalent zu der Milchpulverlösung, die unspezifischen Bindungsstellen, so dass diese nicht durch den sekundären Antikörper gebunden werden können, welcher als nächstes aufgebracht wurde. Auch der Goat-Anti-Rabbit, welcher den sekundären Antikörper darstellt, wurde, wie vom Hersteller angegeben, 1:400 mit TBS verdünnt und für 30 Minuten auf den Objektträger gegeben. Dieser bindet gegen die Spezies, aus welcher der primäre Antikörper stammt. Vor dem Aufbringen des Streptavidin- Horseradish- Peroxidase- Komplexes (HRP) wurde der Objektträger erneut gewaschen. Die HRP wird 1:150 in TBS 42 Methodik verdünnt und 30 Minuten auf die Proben gegeben. Die explizite Aufgabe der HRP ist die Markierung des sekundären Antikörpers, damit dieser in der später angewandten 3.3-Diaminobenzidin (DAB)- Entwicklungsmethode nachgewiesen werden kann. Bevor die Entwicklung mittels DAB fortgeführt wurde, musste erneut gewaschen werden. Das DAB, welches im Phosphatpuffer (PB) angesetzt wurde, sollte nun unter ständiger Kontrolle mit Hilfe eines Lichtmikroskops (Fa. Optech, München, D) auf die Proben gegeben werden. Nachdem sich die Proben rötlich bzw. bräunlich angefärbt haben wurde die Entwicklung durch erneutes Waschen gestoppt. Hierbei wird das TBS allerdings sofort wieder abgesaugt und noch zwei weitere Waschschritte, welche nach dem oben schon beschriebenen Schema ablaufen, angeschlossen. Es folgte nun die aus 70-, 96und 100-prozentigem Ethanol, sowie aus Xylol bestehende Entwässerungsreihe. Unmittelbar nach der Entwässerung erfolgt das Eindecken. Hierzu wurde das Medium Entellan (Fa. Merck, Darmstadt, D) auf den Objektträger gegeben und mit einem Deckglas (Fa. VWR, Langenfeld, D) versiegelt. Um im Verlauf der Auswertung ein optimales mikroskopisches Ergebnis erzielen zu können, war das Entfernen von Rückständen und Lufteinschlüssen obligat. Auswertung Visuelle Digitalisierung der Präparate Die visuelle Darstellung erfolgte bei 400-facher Vergrößerung mit Hilfe des Mikroskops KS 300 Axiphot (Fa. Carl Zeiss Vision GmbH, Hallbergmoos, D). Jeder Objektträger wurde standardisiert auf eine Graustufenhelligkeit von 215 ±5 DU eingestellt, welche unter Zuhilfenahme der Software „ImageJ 1.38x“ (Fa. Nationales Institutes of Health, USA) überprüft wurde. Andere Faktoren wie Vergrößerung, Kontrast, Bildeinstellungen, etc. blieben konstant. Die anschließende Digitalisierung erfolgte mittels der an besagtem Mikroskop fest installierten CCD Kamera (Fa. Axio Cam, Jena, D) und dem adäquaten Softwareprogramm „KS 300 3.0“ (Fa. Carl Zeiss Vision GmbH, Hallbergmoos, D). 43 Methodik Abb. 10: Mikroskopische Darstellung (400-fache Vergrößerung) der Erythrozyten der immunhistochemischen Kontrolle im Vergleich zu Abb.11 Abb. 11: Mikroskopische Darstellung (400-fache Vergrößerung) der Erythrozyten der immunhistochemischen Färbung im Vergleich zu Abb. 10 44 Methodik Quantitative Analyse Die quantitative Umsetzung der immunhistochemischen Färbeintensität erfolgte anhand einer densitometrischen Messung der zuvor digitalisierten mikroskopischen Aufnahmen. Das Instrument dieser Messung war die Software „ImageJ 1.38x“ (Fa. Nationales Institutes of Health, USA). Die Graustufenintensität korreliert hierbei proportional zu der immunhistochemisch nachgewiesenen Proteinexpression. Von jedem Patienten und Zeitpunkt wurden jeweils 40 Erythrozyten sowie weitere 10 als Referenz geltende Erythrozyten der immunhistochemischen Kontrolle analysiert. Die weitere Verarbeitung der Werte erfolgte mit Microsoft Excel 2007 (Fa. Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim, D). Die Differenz aus dem arithmetischen Mittelwertes des erythrozytären Graustufenwertes und dem Hintergrundwert stellte die tatsächliche Färbeintensität der Erythrozyten dar. Ebenso erfolgte die Auswertung der immunhistochemischen Kontrolle. Die gesuchte relative spezifische Antigendichte wurde anschließend aus der Differenzbildung der immunhistochemischen Kontrolle und dem immunhistochemischen Areal berechnet. π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄ = (πποΏ½ πΊπΊπΊπΊπΈπΈπΈπΈπΈπΈ (π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄)− πΊπΊπΊπΊ(π»π»π»π») ) − (πποΏ½ πΊπΊπΊπΊπΈπΈπΈπΈπΈπΈ (π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄)− πΊπΊπΊπΊ(π»π»π»π») ) GS: Graustufenwerte; Ery: Erythrozyt; Analyse: Analyseareal; HG: Hintergrund; IHC: Immunhistochemische Kontrolle 45 Methodik 2.3.2. Immunhistochemische Analyse am Skelettmuskel Erstellen von Kryostatschnitten Die Herstellung der Präparatquerschnitte erfolgte mit Hilfe des Kryostaten „Leica CM 1900“ (Fa. Reichert-Jung Nussloch, D). Durch das Rotationsmikrotom ist es möglich, die in Tissue- Tek eingebetteten Biopsieproben (Fa. Sakura, Zoeterwoude, NL) bei einer Umgebungstemperatur von -25°C auf einem Scheideteller zu fixieren und manuell auf eine Schnittdicken von 7µm zu schneiden. Von jedem Probanden und Biopsiezeitpunkt wurden je zwei Objektträger mit jeweils zwei Muskelpräparatarealen angefertigt. Die fertigen Schnitte wurden auf einem Objektträger (Fa. Menzel, Braunschweig, D) fixiert, mittels eines Lichtmikroskops (Fa. Optech, München, D) kontrolliert und bis zur weiteren Verarbeitung für maximal 24 Stunden bei -80°C gelagert (Fa. Heraeus Instruments, Osterode, D). Ansätze Trispuffer (TBS) 0.05 mol [pH 7.6]: • Siehe Kapitel 2.3.1 (Seite 39) Phosphatpuffer (PB) 0.1 mol [pH 7.4]: • Siehe Kapitel 2.3.1 (Seite 39) 3.3- Diaminobenzidin (DAB)- Lösung: • Siehe Kapitel 2.3.1 (Seite 40) Wasserstoffperoxid: • Siehe Kapitel 2.3.1 (Seite 40) 46 Methodik Alkoholreihe: • Siehe Kapitel 2.3.1 (Seite 40) 5% Bovine Serum Albumin (BSA)- Lösung: • BSA (Fa. PAA, Cölbe, D) in 0.05mol TBS Ammoniumchlorid-/ Triton-X- Lösung: • 0.59 g 0.5M Ammoniumchlorid (Fa. Merck, Darmstadt, D) • 50 µl 0.25% Triton X-100 (Fa. Serva, Heidelberg, D) • In 20 ml 0.05mol TBS Antikörper • • • • • • • Rabbit Anti- Monocarboxylate Transporter 1 (MCT1) – AB3538P, Fa. Chemicon international, California USA o Verdünnung: 1:1000 Rabbit Anti- Monocarboxylate Transporter 4 (MCT4) – sc-50329, Fa. Santa Cruz Biotechnology, USA o Verdünnung. 1:500 Purified anti- human CD147, Fa. BioLegend, San Diego, USA o Verdünnung: 1:400 Partially purified anti- human A4.840, Dept. of Molekular Pharmacology, Stanford, USA o Verdünnung: 1:200 Goat-Anti Rabbit –Ref.: E0432, Fa. Dako Deutschland GmbH, Hamburg, D o Verdüssung: 1:400 Goat-Anti Mouse–Ref.: E0433, Fa. Dako Deutschland GmbH, Hamburg, D o Verdünnung: 1:400 Horseradish- Peroxidase- Komplex (HRP) – RPN1051V, Fa. GE Healthcare UK Limited, Chalfont St. Giles, Bucks, GB o Verdünnung: 1:150 47 Methodik Immunhistochemischer Ablauf Die Grundlage für die immunhistochemischen Analysen am Muskelgewebe stellte ein modifiziertes Färbeprotokoll aus der Abteilung für molekulare und zelluläre Sportmedizin des Institutes für Kreislaufforschung und Sportmedizin dar. Zu Beginn wurden auf jedem der zwei zu einem Patienten und Biopsiezeitpunkt gehörenden Objektträgern je zwei Areale mit Muskelgewebe mit einem hydrophoben PAP-Pen Markerstift (Fa. Dako, Hamburg, D) umkreist, so dass pro Proband und Untersuchungszeitpunkt vier immunhistochemische Areale differenziert wurden (s. Abb. 12). Auf einem der oberen Areale erfolgte der Nachweis des MCT1, auf dem anderen der Nachweis von CD147. Die unteren Areale dienten dem Nachweis von MCT4 und A4.840 (s. Abb. 14, Seite 51). Zudem dienten zwei Objektträger als immunhistochemische Kontrolle (IHC) (s. Abb. 13, Seite 50), die keinen Kontakt mit dem Primärantikörper erfuhren. Abb. 12: Darstellung der immunhistochemischen Bearbeitung der Muskelfasern 48 Methodik Darauffolgend wurden die Muskelschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0.05 M TBS gewaschen. Alle weiteren zwischen den einzelnen Arbeitsschritten beschriebenen Waschvorgänge wurden ebenfalls mit 0.05 M TBS über eine Dauer von fünf Minuten durchgeführt. Im anschließenden Arbeitsschritt wurde die endogene Peroxidaseaktivität durch eine 20-minütige Inkubation der Gewebeschnitte mit einer frisch mit TBS angesetzten Wasserstoffperoxidlösung blockiert. Es folgten Muskelmembranen zunächst mittels der zwei Waschvorgänge, einstündigen bevor Inkubation mit die einer Ammoniumchlorid-/ TritonX- Lösung permeabilisiert wurde. Die als Detergens wirkende Chemikalie TritonX löst das Sarkolemm ab, bei welchem zuvor in Folge des Ammoniumchlorids die fixierenden Aldehydbindungen zerstört wurden. Die so erreichte Demaskierung ermöglicht ein optimiertes Bindungsverhalten des Antikörpers gegenüber dem Antigen. Nach den zunächst erneut durchgeführten zwei Waschschritten erfolgte die Blockierung der unspezifischen Bindungsstellen des primären Antikörpers durch die Inkubation mit einer 5.0%igen BSA- Lösung über eine Dauer von 60 Minuten. Ohne weiteren Spülschritt erfolgte anschließend über Nacht bei 4°C im Kühlschrank die Inkubation mit einem in 0.8%-igen BSA verdünnten Primärantikörper, welcher auf die Gewebeschnitte gegeben wurde. Hierbei erfolgte die spezifische Bindung des Primärantikörpers an das Antigen. Bei der immunhistochemischen Kontrolle (IHC) wurden die Proben statt des Primärantikörpers ausschließlich mit einer 0.8%-igen BSA-Lösung inkubiert. Nach der 24- stündigen Inkubation mit dem primären Antikörper wurden die Gewebeschnitte dreimal mit TBS gewaschen, bevor im folgenden Arbeitsschritt der mit TBS verdünnte, Biotin konjugierte sekundäre Antikörper appliziert wurde. Dieser war gegen die Tierspezies des Primärantikörpers gerichtet und wurde für 60 Minuten auf den Muskelschnitten inkubiert. Zunächst erfolgten drei weitere Waschvorgänge, bevor die Proben mit einem im Verhältnis von 1:150 mit TBS angesetzten Streptavidin- HorseradishPeroxidase- Komplex (HRP) für eine Zeit von 60 Minuten inkubiert wurden. 49 Methodik Welcher die Grundlage für nachfolgenden Farbreaktion ist. Für diese wurde auf die Schnitte anschließend eine frisch angesetzte 3.3- Diaminobenzidin (DAB)Lösung in Phosphatpuffer gegeben. Dieser Vorgang dauerte, bei wiederholter mikroskopischer und makroskopischer Kontrolle, bis zum Einsetzen einer bräunlichen Färbung und wurde anschließend mit TBS abgestoppt. Schließlich erfolgte eine Dehydrierung der Gewebeschnitte durch eine aufsteigende Alkoholreihe aus 70-, 96- und 100-prozentigem Ethanol und Xylol. Abschließend wurden die Muskelschnitte mit Entellan (Fa. Merck, Darmstadt, D) und mit einem Deckgläschen (Fa. VWR, Langenfeld, D) luftdicht eingedeckt. Abb. 13: Mikroskopische Darstellung (200-fache Vergrößerung) der Muskelfasern der immunhistochemischen Kontrolle im Vergleich zu Abb. 14 50 Methodik Abb. 14: Mikroskopische Darstellung (200-fache Vergrößerung) der Muskelfasern der immunhistochemischen Färbung im Vergleich zu Abb. 13 Auswertung Visuelle Digitalisierung der Präparate Die visuelle Darstellung wurde bei 200-facher Vergrößerung mit Hilfe des Mikroskops KS 300 Axiphot (Fa. Carl Zeiss Vision GmbH, Hallbergmoos, D) vorgenommen. Jeder Objektträger wurde standardisiert auf eine Graustufenhelligkeit von 215 ±2 DU eingestellt, welche unter Zuhilfenahme der Software „ImageJ 1.38x“ (Fa. Nationales Institutes of Health, USA) überprüft wurde. Andere Faktoren wie Vergrößerung, Kontrast, Bildeinstellungen, etc. blieben konstant. Die anschließende Digitalisierung erfolgte mittels der an besagten Mikroskop fest installierten CCD Kamera (Axio Cam, Jena, D) und dem adäquaten Softwareprogramm „KS 300 3.0“ (Fa. Carl Zeiss Vision GmbH, Hallbergmoos, D). 51 Methodik Quantitative Analyse Relative MCT1-, MCT4- und CD147- Dichte Die quantitative Umsetzung der immunhistochemischen Färbeintensität erfolgt anhand einer densitometrischen Messung der zuvor digitalisierten mikroskopischen Aufnahmen. Das Instrument dieser Messung war die Software „ImageJ 1.38x“ (Fa. Nationales Institutes of Health, USA). Die Graustufenintensität korreliert hierbei proportional zu der immunhistochemisch nachgewiesenen Proteinexpression. Von jedem Patienten und Zeitpunkt wurden jeweils 40 Muskelfaserquerschnitte in die Auswertung einbezogen. Um Kapillaren und Artefakte, welche einen niedrigen densitometrischen Graustufenwert aufweisen und so die Auswertung beeinflussen würden, auszuklammern, erfolgte zunächst die Bearbeitung der Aufnahmen mit dem Programm Adobe Photoshop CS3 Extended, Version 10.0 (Fa. Adobe Systems Software, Dublin, IRL). Hierbei wurden beschriebene Artefakte durch eine helle Überblendung korrigiert (s. Abb. 15 und 16). Ziel war es, im Verlauf der Auswertung eine Aussage über die Proteinexpression in Relation zu der ausgewerteten Gesamtmuskelfläche zu treffen. Um diese bestimmen zu können, musste das Bild noch einmal bearbeitet werden. Die Fläche, die nicht der Muskelfläche zugerechnet werden kann, wurde in diesem Arbeitsschritt ebenfalls weiß überblendet. 52 Methodik Abb. 15: Mikroskopische Darstellung (200-fache Vergrößerung) der immunhistochemisch bearbeiteten Muskelfasern ohne Artefaktentfernung Abb. 16: Mikroskopische Darstellung (200-fache Vergrößerung) der Muskelfasern nach Entfernung der Artefakte Anschließend wurden die bearbeiteten Bilder mit der Software „ImageJ 1.38x“ (Fa. Nationales Institutes of Health, USA) analysiert. Zunächst erfolgte die Konvertierung der Bilder in einen 8-bit Darstellungsmodus. Mit dem Ziel die 53 Methodik membranöse Proteinexpressionsdichte zu erfassen, wurde zunächst anhand von 100 Bildern die densitometrische Schwelle der membranösen Graustufenintensität auf den Wert von 175 DU festgelegt. Im ersten Schritt wurde der auszuwertende Bereich folglich zwischen 0 DU und 175 DU festgelegt und somit die membranöse Graustufenintensität erfasst (s. Abb. 17). Aus den gemessenen Graustufen wurde der arithmetische Mittelwert berechnet und der Hintergrundwert des Bildes abgezogen, um so die bei den mikroskopischen Aufnahmen entstandenen bildspezifischen Differenzen auszuschließen. Abschließend wurde die Schwelle auf 245 DU festgelegt um jetzt, bis auf weiße Areale, alle Pixel mit in die Auswertung einzubeziehen und so eine Aussage über die ausgewertete Gesamtmuskelfläche zu treffen (s. Abb. 18). Abb. 17: Mikroskopische Darstellung (200-fache Vergrößerung) der Muskelfasern mit dem Grenzwert 175 DU 54 Methodik Abb. 18: Mikroskopische Darstellung (200-fache Vergrößerung) der Muskelfasern mit dem Grenzwert 245 DU Die Berechnung der relativen Proteindichte und die weitere Verarbeitung der Werte erfolgten mit Microsoft Excel 2007 (Fa. Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim, D). Für die Berechnung der relativen Proteinexpression wurde zunächst der Quotient aus der Fläche der Proteinexpression und der Gesamtmuskelfläche gebildet und dieser mit der gemessenen absoluten Proteinexpression multipliziert. ππππππππππππππππ ππππππππππππππππππππππππππππππππππ = οΏ½οΏ½οΏ½οΏ½ ππ π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄ππππππ οΏ½οΏ½οΏ½οΏ½ ππ π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄π΄πΊπΊπΊπΊπΊπΊπΊπΊπΊπΊπΊπΊ − οΏ½οΏ½οΏ½οΏ½ ππ ππππππ−π·π·π·π·π·π·βπ‘π‘π‘π‘ − π»π»π»π» GS: Graustufenwerte; HG: Hintergrund 55 Methodik Cytoplasmatische MCT1-, MCT4- und CD147- Dichte Neben der membranösen Proteindichte, welche wie beschrieben über Schwellenwerte analysiert wurde, ist auch die cytoplasmatische Dichte ermittelt worden. Bei der cytoplasmatischen Auswertung wurde der Graustufenwert jeder einzelnen Muskelzelle in drei unterschiedlichen Bereichen gemessen. Dies erfolgte mit Hilfe der Software „ImageJ 1.38x“ (Fa. Nationales Institutes of Health, USA). Für die Auswertung wurde bei jedem Patienten und Untersuchungszeitpunkt der Graustufenwert an 50 Muskelzellen analysiert. Die weitere Verarbeitung der Werte erfolgte mit Microsoft Excel 2007 (Fa. Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim, D). Muskelfasertypisierung Die quantitative Umsetzung der immunhistochemischen Ergebnisse erfolgte anhand einer manuelle Auszählung der zuvor digitalisierten mikroskopischen Aufnahmen. Das Instrument dieser Messung ist die Software Adobe Photoshop CS3 Extended, Version 10.0 (Fa. Adobe Systems Software, Dublin, IRL). Die immunhistochemisch angefärbten Muskelfasern stellen dabei den Fasertyp- I dar (s. Abb. 19). Von jedem Patienten und Zeitpunkt wurden jeweils 100 Muskelfaserquerschnitte in die Auswertung einbezogen. 56 Methodik Abb. 19: Mikroskopische Darstellung (100-fache Vergrößerung) der Muskelfasertypisierung – Typ I- Faser angefärbt Die weitere Verarbeitung sowie statistische und grafische Auswertung der Werte erfolgte mit Microsoft Excel 2007 (Fa. Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim, D.). Muskelfaserdurchmesser Grundlage der Bestimmung der Muskelfaserdurchmesser waren die mikroskopischen Aufnahmen der Muskelfasertypisierung. Von jedem Patienten und Untersuchungszeitpunkt wurden jeweils 100 Typ-I und Typ-II- Muskelfasern unter Zuhilfenahme der Software „ImageJ 1.38x“ (Fa. Nationales Institutes of Health, USA) vermessen. Durch das Verwenden einer Ellipse wurde jeweils der geringste Durchmesser einer Muskelfaser bestimmt. Die weitere Verarbeitung und graphische Aufarbeitung der Daten erfolgte mit Microsoft Excel 2007 (Fa. Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim, D). Anschließend wurden diese Daten mit der Software SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) statistisch ausgewertet. 57 Methodik 2.4 Durchflusszytometrische Analyse am Erythrozyten (FACS) Eine der im Rahmen dieser Arbeit angewandten Untersuchungsmethoden ist die Durchflusszytometrie. Die auch als Fluorescence- activated- cell- sorter oder kurz FACS bekannte Methodik macht sich die Fluoreszenz der mit einem floureszenz-gekoppelten Antikörper markierten Zellen zu Nutze. Prinzipiell werden durch das Gerät ‚FACS Array‘ mikroskopisch kleine Partikel bezüglich ihrer Größe, der intrazellulären Beschaffenheit und der einzelnen Oberflächeneigenschaften voneinander getrennt und gemessen. Die Bandbreite der Anwendung ist bei diesem Gerät groß, da es von Lymphozytentypisierungen bis hin zu der DNA- und Zellzyklusanalyse ausreicht. Die entsprechend zu typisierenden Zellen, wie in dieser Arbeit beispielsweise die Erythrozyten, werden mit einem fluoreszenzgekoppelten Antikörper markiert. Die Messung der entsprechenden Zellen erfolgt durch die Bestimmung der Wellenlänge des emittierenden Lichtes der zuvor durch einen Laser angeregten Fluoreszenzfarbstoffe. Jeder der unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe geht eine entsprechend spezifische Bindung ein und liefert folglich auch ein sehr spezifisches Signal. Neben der Fluoreszenz kann auch durch die Streuung der Strahlen beim Passieren des Lasers eine Aussage über die Granularität und die Größe der Zelle gemacht werden. Hierbei nutzt das Gerät den Forwardscatter (FSC) – auch Vorwärtsstreulicht genannt – welcher Aufschluss über die Streuung der Lichtstrahlen in Verlängerung des Laserstrahls gibt, um die Größe der Zelle zu bestimmen. Der Sidscarter (SSC) – auch Seitwärtsstreulicht genannt – beschreibt das an Strukturen innerhalb der Zelle in einem 90°-Winkel reflektierte Licht, welches für die Darstellung der Zellgranularität genutzt wird. Vor der Messung wurden bereits die einzelnen Messmethoden auf dem Gerät erstellt und gespeichert. Die Kompensation des Fluoreszenzfarbstoff erfolgte nach der Messung von einfach markierten Zellen automatisch und ist von der zu diesem Gerät gehörende Software vorgegeben. Hierfür wurden die Proben mit 58 Methodik dem Antikörper markiert und unter Berücksichtigung einer Kontrolle ohne Antikörper, wie oben beschrieben, vorbereitet (BD Biosciences, 2003). 2.4.1 Probenaufbereitung Geräteparameter: Gerät FACSArray (Becton Dickinson) Laser Grünlichtlaser: 532 nm (10 mW) Rotlichtlaser: 635 nm (10mW) Maximum Acquisition Rate 15000 events per second/ real time data Six parameter detection 2 scatter, 4 Farben FSC/SSC sensitivity Identifikation von 2.5 µm bis 50 µm Beads möglich Filter (Grünlichtlaser) Yellow: 585/42 nm (PE) FarRed: 685 LP (PE-Cy7) Filter (Rotlichtlaser) Red: 661/16 nm (APC) NIR: 780/60 nm (APC-Cy7) Tab. 5: Tabellarische Darstellung der Geräteparameter Antikörper • CD147-Phycoerythrin anti- human CD147 (Fa. eBioscience, San Diego, USA) Zwecks der Blutaufarbeitung im Rahmen der FACS Untersuchung wurden 200µl der in PFA fixierten und bei 4°C gelagerten Erythrozyten in ein Reagenzglas gegeben. Zu Beginn wurden die Proben zweimal gewaschen, um die PFARückstände zu entfernen, da andernfalls eine genaue Messung nicht möglich 59 Methodik wäre. Ein Waschvorgang bestand hierbei jeweils aus dem Vermengen der Erythrozyten mit 1.5 ml Cellwash- Lösung (Fa. Becton Dickinson, Heidelberg, D) durch einen Vortex- Schüttler (Fa. Scientific Industries, Bohemia, USA) und dem anschließenden zwei-minütigen Zentrifugieren mit 2500G in der RotixaZentrifuge (Fa. Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, D). Sobald der zweite Waschvorgang beendet war, wurden 1.5 ml Cellwash- Lösung auf die Erythrozyten gegeben und deren Konzentration durch den Blutbildanalyser (Fa. Sysmex, Norderstedt, D) bestimmt. In einer nun folgenden Verdünnungsreihe wurde die vorliegende Stammlösung zu einer Zwischenstammlösung mit 10.000.000 Erythrozyten/ ml verdünnt. Aus dieser wurden nun 100 µl, also etwa 1.000.000 Zellen, in ein neues Reagenzglas gegeben und für 60 Minuten mit dem Antikörper CD147 in einem abgedunkelten Raum inkubiert. Nach der Inkubationszeit erfolgten nochmals zwei Waschvorgänge mit jeweils 3 ml Cellwash- Lösung und der anschließenden Zentrifugation bei 1000G in der Rotixa-Zentrifuge (Fa. Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, D). Die nun verbleibenden Zellen wurden in 200 µl Cellwash- Lösung gelöst und auf eine entsprechendes 96- Array- Wellplate übertragen. Die Analyse der Proben (s. Abb. 20) erfolgte mit dem FACSArray Plate, 96 Well, U-Bottom (Fa. Betcton Dickinson, Heidelberg, D). Die statistische Verarbeitung und grafische Auswertung wurde mit Microsoft Excel 2007 (Fa. Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim, D) durchgeführt. 60 Methodik Abb. 20: Darstellung der FACS- Analyse 2.5 Sportwissenschaftliche Methodik Das 12-wöchige sporttherapeutische Interventionsprogramm wurde unter der Anleitung von Diplomsportwissenschaftlern und Diplomanden in den Räumlichkeiten der Deutschen Sporthochschule Köln durchgeführt. Die Kontrollgruppe führte in diesem Zeitraum ein allgemeines trainingsunspezifisches Bewegungsprogramm durch. Das Ziel war es, die Patienten an verschiedene Bewegungsformen heranzuführen, aber keine 61 Methodik Trainingseffekte zu erzielen. In der Ausdauergruppe hingegen wurden die Patienten einem intensitätsgesteuerten Ausdauerprogramm auf dem Fahrradergometer unterzogen. 2.5.1 Kontrollgruppe Das trainingsunspezifische Bewegungsprogramm fand teilweise in einer der Sporthallen der Deutschen Sporthochschule Köln (DSHS), auf den angrenzenden Sportplätzen oder in den städtischen Grünanlagen statt. Aufgrund der Zwischenuntersuchung in der 6. Woche wurde der Interventionszeitraum in zwei Perioden eingeteilt. Das Bewegungsprogramm gliederte sich in der ersten Hälfte in drei Präsenzeinheiten an der DSHS und eine in Eigenverantwortung durchgeführte und dokumentierte Interventionseinheit. In der zweiten Hälfte wurden diese vier Bewegungseinheiten in zwei Präsenz- und zwei eigenverantwortliche Einheiten eingeteilt. Für das eigenverantwortlich durchgeführte Bewegungsprogramm erhielt jeder Patient unterschiedliche Übungsformen vorgegeben, die gezielt in den wöchentlichen Alltag integriert werden sollten. Jede der Interventionseinheiten umfasste insgesamt 90 Minuten. Das trainingsunspezifische Bewegungsprogramm war durch motorische Beanspruchungsformen unterschiedlichster Arten gekennzeichnet. Neben vielen Koordinations- und Flexibilitätsübungen wurden die Patienten auch in verschiedene Techniken einer ganzheitlichen Sporttherapie eingeführt. Die Interventionseinheiten bestanden aus dem Heranführen an Techniken des Ausdauertrainings, wie Walking und Nordic- Walking, des Krafttrainings, wie das Theraband oder Rückentraining und aus theoretischen Aspekten des Kraft- und Ausdauertrainings, dem rückengerechten Heben und unterschiedlichen Entspannungsverfahren. 62 Methodik Mit dem Ziel, keine Trainingseffekte zu erzielen, wurde die Belastungsintensität so niedrig gewählt, dass das subjektive Belastungsempfinden bei sehr leicht nach BORG einzuordnen war. 2.5.2 Ausdauergruppe Das Training der Ausdauergruppe fand ebenfalls an der Deutschen Sporthochschule Köln statt. Der hierfür vorhandene Ergometerraum ermöglichte eine individuelle Belastungssteigerung bei konstantem EKGMonitoring (s. Abb. 21). Die Gliederung der Trainingseinheiten verhielt sich, mit drei Präsenzeinheiten und einer eigenverantwortlichen Trainingseinheit in der ersten Hälfte und zwei Präsenzeinheiten sowie zwei eigenverantwortlich durchgeführte Trainingsblöcke in der zweiten Hälfte, analog zu der Kontrollgruppe. Die Dauer der einzelnen Ergometereinheiten wurde innerhalb der ersten zwei Wochen sukzessive von anfangs 35 Minuten auf 60 Minuten gesteigert. Die insgesamt 90-minütige Trainingseinheit wurde abgerundet mit Aspekten des subjektiven Belastungsempfindens, der eigenen Trainingsintensitätssteuerung sowie der Vermittlung alternativer Ausdauertrainingsformen. Die Patienten sollten auf diese Art animiert werden, die körperliche Aktivität in den Alltag zu integrieren und so ihren bewegungsarmen Lebensstiel zu verändern. Die Grundlage für die Planung und Durchführung des Ausdauertrainings waren die evidenzbasierten Leitlinien der Deutschen Diabetes Gesellschaft (DDG) sowie die Leitlinien zu körperlicher Aktivität bei Sekundärprävention und Therapie von kardiovaskulären Erkrankungen. Das Ziel des Ausdauertrainings stellte die Verbesserung der Grundlagenausdauer unter aeroben Stoffwechselbedingungen dar. Die Ergebnisse die der Belastungsuntersuchungen waren die Basis für 63 Methodik Trainingssteuerung. Die Trainingsintensität war bei jedem Patienten die individuelle Wattleistung im Bereich von 75% der ππππ2 ππππππππ . In jeder Trainingseinheit wurde zu Beginn und am Ende der Trainingsphase das subjektive Belastungsempfinden nach BORG (s. Tab. 4, Seite 33) und der Blutdruck gemessen. Im Laufe der Trainingsphase wurden außerdem stetig die Herzfrequenz und das EKG aufgezeichnet. Diese Parameter dienten der weiteren Trainingssteuerung. Abb. 21: Patienten der Ausdauergruppe während der Trainingsphase Die einzelnen Trainingseinheiten bestanden jeweils aus vier Phasen: 1. Aufwärmphase I Die erste Aufwärmphase begann über eine Dauer von zwei Minuten mit einer Wattbelastung <50% der vorher individuell ermittelten Trainingsintensität. 64 Methodik 2. Aufwärmphase II In Folge der ersten Aufwärmphase wurde die Belastung über eine Zeit von fünf Minuten sukzessive bis auf die festgelegte Trainingswattbelastung gesteigert. 3. Trainingsphase Während der Trainingsphase erreichten die Patienten ihre individuelle Trainingsherzfrequenz und –wattleistung. Innerhalb der ersten zwei Trainingswochen wurde die Dauer der Belastung ausgehend von 25 Minuten kontinuierlich auf 50 Minuten gesteigert. Die subjektive Belastung sollte in der Trainingsphase maximal als anstrengend (12-14 nach der BORG-Skala) empfunden werden. 4. Erholungsphase In der Erholungsphase wurde die Trainingslast allmählich auf 0 Watt reduziert und die Trainingsdaten protokolliert. Die von den Patienten der Ausdauergruppe ebenfalls in Eigenverantwortung durchgeführte Heimtrainingseinheit sollte sowohl den Umfang als auch die Intensität betreffend analog zu den Ergometereinheiten an der DSHS gestaltet werden. Die Trainingssteuerung wurde von den Patienten in Form von subjektiven Belastungsempfinden und Trainingsherzfrequenz in einem vorgefertigten Trainingsprotokoll dokumentiert. Die Sportart konnten die Patienten dabei selbst wählen. Die Patienten erhielten zu Beginn der Studie eine Einführung in die Techniken der Ausdauertrainingsformen: Walking, Nordic- Walking, Schwimmen und Radfahren. 65 Methodik 2.6 Statistik Die in dieser Studie erhobenen Tabellenkalkulationsprogramms Deutschland GmbH, Microsoft Unterschleißheim, Daten Excel D). wurden 2007 mittels (Fa. aufgearbeitet. des Microsoft Nach einer Überprüfung auf Normalverteilung durch den Kolmogorov- Smirnov- Test mit Lilliefors- Korrektur erfolgte die graphische Darstellung anhand der berechneten Mittelwerten und Standardabweichungen. Unter Zuhilfenahme des Statistikprogrammes SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) wurden die Mittelwerte der Ausdauer- und Kontrollgruppe über den Verlauf und im Gruppenvergleich statistisch ausgewertet. Das Signifikanzniveau wurde auf p<0.05 festgelegt und mittels t-Test und Anova Varianzanalyse verifiziert (Eckey et al. 2008; Hoffmann et Orthmann, 2009; Sachs, 2009). 66 Ergebnisse 3. Ergebnisse Im Rahmen der Gruppenanalyse werden im Folgenden die für die Ergebnisinterpretation dargestellt. Diese der Diabetespatienten zunächst detailiert relevanten beschriebenen Basisdaten Ergebnisse sind anschließend tabellarisch dargestellt (s. Tab. 6, Seite 69-71). Alle in dieser Arbeit untersuchten Parameter sind im Anhang tabellarisch zusammengefasst (s. Anhang, Seite XLV). 3.1. Anthropometrische Daten Der Body- Mass- Index wurde aus den jeweils bei den einzelnen Untersuchungseinheiten erfassten Daten von Gewicht und Größe berechnet. Mit einem mittleren BMI zwischen 30-35 kg m2 werden sowohl die Patienten der Ausdauer- als auch der Kontrollgruppe dem Adipositas Grad I zugerechnet (WHO Technical Report Series, 2000). Durch die trainingsbedingte Gewichtsreduktion in der Ausdauergruppe konnte der BMI im Gruppenvergleich (p≤0.01) von 31.2 ±3.5 kg m2 in der 0. Woche auf 30.4 ±3.6 kg m2 in der 12. Woche signifikant gesenkt werden. Während die Änderung in der ersten Hälfte der Trainingsintervention nicht signifikant war, konnte im Vergleich 6. vs. 12. Woche (p≤0.01) und 0. vs. 12. Woche (p≤0.01) eine Signifikanz nachgewiesen werden. In der Kontrollgruppe ist keine signifikante Änderung erkennbar. 67 Ergebnisse Kontrollgruppe Ausdauergruppe 50 45 BMI [kg/ m²] 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0. Wo. 6. Wo. 12. Wo. 0. Wo. 6. Wo. 12. Wo. Abb. 22: Graphische Darstellung des Body-Mass-Index (BMI) im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe (#: p<0.05 AG vs. KG; *: p<0. 05 vs. 0. Wo.; +: p<0.05 vs. 6. Wo.) 3.2. Ruheblutdruck Der erhöhte Ruheblutdruck wird bei Diabetespatienten als ein Risikofaktor für das Auftreten von Folgeerkrankungen gesehen (WHO, 1999) und stellt einen Diagnosefaktor für das Metabolische Syndrom dar (Behrens et al., 2010). Sowohl der systolische als auch der diastolische Blutdruck konnten in der Ausdauer- und der Kontrollgruppe in den Normalbereich gesenkt werden (Bretzel et al., 2008). Ein signifikanter Gruppenunterschied war nicht festzustellen. In Bezug auf das Gesamtkollektiv wiesen der systolische Blutdruck im Vergleich 0. vs. 6. Woche (p=0.05) bzw. 0. vs. 12. Woche (p≤0.01) und der diastolische Blutdruck im Vergleich 0. vs. 6. Woche (p=0.04) bzw. 0. vs. 12. Woche (p=0.02) eine Signifikanz auf. 68 Parameter Alter [Jahre] Größe [cm] Gewicht [kg] BMI [π¦π¦ππ ] Cholesterin π¦π¦π¦π¦ [ ππππ ] Triglyceride π¦π¦π¦π¦ [ ππππ ] HDL π¦π¦π¦π¦ [ ππππ ] LDL π¦π¦π¦π¦ [ ππππ ] Blutzucker π¦π¦π¦π¦ [ ππππ ] HbA1c [%] Ausdauergruppe 0. 6. 12. Sig. p-Wert Woche Woche Woche Gesamtkollektiv Gruppenvergleich 58.6 ±10.6 58.6 ±10.6 58.6 ±10.6 - 60.7 ±9.1 60.7 ±9.1 60.7 ±9.1 - - - 173.3 ±8.0 173.4 ±7.8 173.4 ±8.0 - 178.7 ±7.1 178.7 ±7.0 178.8 ±6.9 - - - 98.0 ±15.7 97.3 ±15.4 97.1 ±15.7 n. s. 99.9 ±14.0 99.7 ±14.1 97.3 ±14.4 - 32.6 ±4.6 32.3 ±4.5 32.3 ±4.5 n. s. 31.2 ±3.5 31.2 ±3.5 30.4 ±3.6 - 187.9 ±35.8 187.6 ±34.1 191.5 ±30.1 n. s. 186.9 ±32.6 189.6 ±30.7 191.3 ±39.5 0.Wo. vs. 6.Wo: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo: ≤0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 0.Wo. vs. 6.Wo: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo: ≤0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 n. s. - n. s. 192.1 ±99.3 192.9 ±138.5 181.9 ±94.9 n. s. 167.9 ±70.0 195.5 ±109.4 152.0 ±78.2 n. s. - n. s. 43.2 ±11.7 41.9 ±13.6 45.7 ±14.3 0.Wo. vs. 6.Wo: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo: ≤0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: n. s. 43.5 ±11.6 41.9 ±9.6 40.3 ±10.3 0.Wo. vs. 6.Wo: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo: 0.05 0.Wo. vs. 12.Wo.: 0.01 - ≤0.01 103.6 ±24.5 106.7 ±25.1 110.1 ±25.7 - 108.3 ±25.3 107.7 ±27.8 120.8 ±33.2 - 0.Wo. vs. 6.Wo: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo: 0.02 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 n. s. 153.1 ±39.4 149.3 ±43.4 158.3 ±52.1 n. s. 161.6 ±38.1 143.0 ±38.3 135.6 ±27.3 0.Wo. vs. 6.Wo: ≤0.01 6.Wo. vs. 12.Wo: n. s. 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 - ≤0.01 6.5 ±1.0 6.5 ±0.9 6.8 ±0.9 7.0 ±0.9 6.9 ±1.0 6.8 ±0.8 n. s. - ≤0.01 0.Wo. vs. 6.Wo: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo: ≤0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: 0.01 ≤0.01 ≤0.01 Ergebnisse π€π€π€π€ Kontrollgruppe 0. 6. 12. Sig. p-Wert Woche Woche Woche 69 136.9 ±20.3 132.5 ±19.7 127.6 ±14.5 - 130.0 ±17.6 122.4 ±18.5 123.3 ±15.0 - 92.8 ±15.2 85.7 ±15.3 83.8 ±12.0 - 87.1 ±13.9 83.5 ±12.9 84.7 ±12.3 - Max. sBP [mmHg] Max. dBP [mmHg] Ruhe HR 215.7 ±22.7 218.5 ±20.7 217.2 ±23.3 n. s. 213.0 ±20.0 208.4 ±26.9 211.6 ±28.2 n. s. 0.Wo. vs. 6.Wo: 0.05 6.Wo. vs. 12.Wo: n. s. 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 0.Wo. vs. 6.Wo: 0.04 6.Wo. vs. 12.Wo: n. s. 0.Wo. vs. 12.Wo.: 0.02 - 95.1 ±14.0 89.6 ±18.1 92.1 ±13.5 n. s. 94.6 ±13.8 90.8 ±17.5 89.7 ±13.2 n. s. - 86.8 ±15.8 81.8 ±14.1 80.9 ±16.3 81.1 ±15.2 77.8 ±12.7 67.7 ±13.2 π¦π¦π¦π¦π¦π¦. 147.1 ±21.9 141.6 ±26.8 145.9 ±18.4 135.6 ±19.5 133.5 ±18.8 139.6 ±20.5 n. s. π¦π¦π¦π¦π¦π¦. 134.2 ±35.6 135.5 ±36.6 143.4 ±48.5 n. s. 142.1 ±28.9 160.5 ±33.7 173.7 ±35.8 1.2 ±0.4 1.3 ±0.4 1.2 ±0.4 n. s. 1.5 ±0.6 1.5 ±0.4 1.6 ±0.7 Max. Laktat π¦π¦π¦π¦π¦π¦π¦π¦ [ ] 4.4 ±1.6 4.5 ±1.8 4.9 ±2.1 5.1 ±1.8 5.5 ±1.9 6.2 ±1.9 72.9 ±29.8 77.3 ±36.1 85.3 ±32.1 - 72.7 ±34.4 87.1 ±36.3 75.5 ±48.9 - 4 mmol [Watt] 131.3 ±38.3 140.5 ±43.6 134.1 ±28.3 n. s. 130.8 ±36.0 138.0 ±36.1 136.0 ±40.4 n. s. Ruhe dBP [mmHg] [ ππ ] Max. HR [ ππ ] Max. Leistung [Watt] Ruhe Laktat π¦π¦π¦π¦π¦π¦π¦π¦ [ ππ ] ππ 2 mmol [Watt] n. s. - n. s. n. s. n. s. n. s. 0.Wo. vs. 6.Wo: 0.02 6.Wo. vs. 12.Wo: n. s. 0.Wo. vs. 12.Wo.: 0.01 - n. s. 0.Wo. vs. 6.Wo: 0.05 6.Wo. vs. 12.Wo: 0.04 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 - 0.03 n. s. - n. s. - - 0.Wo. vs. 6.Wo: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo: n. s. 0.Wo. vs. 12.Wo.: 0.01 0.Wo. vs. 6.Wo: 0.01 6.Wo. vs. 12.Wo: n. s. 0.Wo. vs. 12.Wo.: 0.02 - n. s. n. s. n. s. n. s. Ergebnisse Ruhe sBP [mmHg] 70 Kard. Ausbelastung [%] 72.29 ±21.32 75.42 ±20.73 79.26 ±20.34 n. s. 73.60 ±17.90 84.40 ±19.50 96.20 ±23.00 0.Wo. vs. 6.Wo: ≤0.01 6.Wo. vs. 12.Wo: 0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 - ≤0.01 Tab. 6: Tabellarische Darstellung der Parameter im Vergleich Kontroll- und Ausdauergruppe Ergebnisse 71 Ergebnisse 3.3. Stoffwechselparameter Blutglukose Ein erhöhter Nüchternglukosespiegel im Blut stellt, wie in der Einleitung beschrieben, einen Diagnosefaktor für Diabetes Mellitus dar. Der Referenzwert von 126 mg dl wurde in beiden Gruppen überschritten. Im Rahmen des Interventionszeitraumes stieg der Blutzuckerspiegel in der Kontrollgruppe von 153.1 ±39.4 mg dl auf 158.3 ±52.1 mg dl weiter an. In der Ausdauergruppe hingegen konnte dieser über die Zeit der 12 Wochen und im Vergleich zu der Kontrollgruppe (p≤0.01) von 161.6 ±38.1 mg dl auf 135.6 ±27.3 mg dl signifikant gesenkt werden. In Bezug auf diese Reduktion des Blutzuckerspiegels konnte im Vergleich 0. vs. 6. Woche (p≤0.01) bzw. 0. vs. 12. Woche (p≤0.01) eine Signifikanz nachgewiesen werden. Kontrollgruppe Ausdauergruppe 250 Blutzucker [mg/ dl] 200 150 100 50 0 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. Abb. 23: Graphische Darstellung des Nüchternblutzuckers im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe (#: p<0.05 AG vs. KG; *: p<0.05 vs. 0. Wo.) 72 Ergebnisse HbA1c Das Glykohämoglobin gibt die prozentuale endogene Glykation des Hämoglobins an und gilt als aussagekräftigster Parameter zur Qualität der Blutglukoseeinstellung über einen Zeitraum von acht bis zwölf Wochen (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group, 1993). Der Referenzwert liegt zwischen 4 – 6 % oder 20 – 42 Diabetespatienten auf unter 7 % bzw. 53 2010). In der Kontrollgruppe ππππππππ stieg ππππππ ππππππππ ππππππ . Ziel ist es, Typ-2- einzustellen (Matthaei et al., der HbA1c während des Untersuchungszeitraumes durchschnittlich von 6.5 ±1.0% auf 6.8 ±0.9% bzw. von 48 auf 51 ππππππππ ππππππ an. Dieser Anstieg ist im Vergleich der 6. vs. 12. Woche (p≤0.01) und 0. vs. 12. Woche (p=0.01) signifikant. In der Ausdauergruppe konnte durch die sportliche Intervention eine im Gruppenvergleich signifikante Reduktion von 7.0 ±0.9% auf 6.8 ±0.8 % bzw. von 53 auf 51 werden (p≤0.01). ππππππππ ππππππ erreicht Ruhelaktat Der Refenzwert für das Ruhelaktat liegt bei 1,8 mmol L (Biedler et al., 1995) und wird bei Diabetes- Patienten in einigen Studien als erhöht dargestellt (Lovejoy et al., 1992). Weder in der Ausdauergruppe noch in der Kontrollgruppe konnte dies festgestellt werden. Ein trainingsinduzierter Effekt auf das Ruhelaktat blieb ebenfalls aus. Cholesterin Die Dyslipoproteinämie ist bei Diabetes-Typ-2-Patienten ein entscheidender Risikofaktor für kardiovaskuläre Folgeerkrankungen. Die Cholesterin- konzentration lag bei beiden Gruppen im Durchschnitt unter dem Referenzwert 73 Ergebnisse der ADA von 200 mg dl . Eine signifikante Veränderung konnte weder in der Ausdauer- noch in der Kontrollgruppe festgestellt werden (American Diabetes Association, 2010). High Density Lipoprotein (HDL) Die mittlere Konzentration des High Density Lipoprotein lag bei beiden Gruppen zu Beginn der Intervention über dem von der ADA empfohlenen Wert von >40 mg dl (American Diabetes Association, 2010). In Bezug auf die HDL- Konzentration konnte zwischen den Gruppen ein signifikanter Unterschied herausgestellt werden (p≤0.01). In der Ausdauergruppe kam es über den Trainingszeitraum zu einer Reduktion von 43.5 ±11.6 mg dl auf 40.3 ±10.3 mg dl , der empfohlene Referenzwert wurde hierbei nicht unterschritten. Diese Reduktion ist im Vergleich 6. vs. 12. Woche (p=0.05) und 0. vs. 12. Woche (p=0.01) signifikant. Die Kontrollgruppe zeigte einen Anstieg von 43.2 ±11.7 mg dl auf 45.7 ±14.3 Woche (p≤0.01) signifikant. mg dl . Dieser ist im Vergleich 6. vs. 12. Low Density Lipoprotein (LDL) Der Referenzwert bezüglich des Low Density Lipoprotein für Diabetespatienten liegt laut der ADA bei ≤100 mg dl (American Diabetes Association, 2010). Zu Beginn der Untersuchungen lagen beide Interventionsgruppen über diesem Wert. Sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der Ausdauergruppe konnte keine signifikante Änderung ermittelt werden. In Bezug auf das Gesamtkollektiv zeigte sich im Vergleich 6. vs. 12. Woche (p=0.02) und 0. vs. 12. Woche (p≤0.01) eine signifikante Steigerung. 74 Ergebnisse Triglyzeride Der ADA zufolge liegt der Referenzwert für Diabetespatienten bei <150 mg dl (American Diabetes Association, 2010). Der Basalwert der Ausdauer- und Kontrollgruppe lag über diesem empfohlenen Grenzwert. Eine Reduktion konnte sowohl in der Ausdauergruppe von 167.9 ±70.0 und der Kontrollgruppe von 192.1 ±99.3 mg dl mg dl auf 152.0 ±78.2 auf 181.9 ±94.9 werden. Eine signifikante Änderung blieb dagegen aus. mg dl mg dl nachgewiesen 3.4. Leistungsphysiologische Parameter Maximale Leistung Die maximale Ausdauerleistungsfähigkeit wurde mittels eines Belastungs-EKGs ermittelt, welches unter standardisierten Bedingungen nach dem Stufentest des WHO-Schemas auf einem drehzahlunabhängigen Fahrradergometer durchgeführt wurde. In der Kontrollgruppe wurde ein nicht signifikanter Anstieg der maximalen Leistung von 134,2 ±35,6 Watt auf 143,4 ±48,5 Watt nachgewiesen. Im Gruppenvergleich zu der Kontrollgruppe stieg die maximale Wattleistung in der Ausdauergruppe von 142.1 ±29.9 Watt auf 173.7 ±35.8 Watt signifikant an (p=0.03). Dieser Anstieg wies im Vergleich 0. vs. 6. Woche (p=0.05), 6. vs. 12. Woche (p=0.04) und 0. vs. 12. Woche (p≤0.01) eine Signifikanz auf. 75 Ergebnisse Kontrollgruppe Ausdauergruppe 300 Max. Leistung [Watt] 250 200 150 100 50 0 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. Abb. 24: Graphische Darstellung der maximalen Leistung im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe (#: p<0.05 AG vs. KG; *: p<0. 05 vs. 0. Wo.; +: p<0.05 vs. 6. Wo.) Kardiale Ausbelastung Die im Rahmen der Belastungsuntersuchung festgestellte maximale Leistung wurde unter Berücksichtigung von Lebensalter und Körpergewicht in eine prozentuale kardiale Ausbelastung umgerechnet. In der Ausdauerinterventionsgruppe konnte diese im Gruppenvergleich von 73.60 ±17.90% auf 96.20 ±23.00% signifikant gesteigert werden (p≤0.01). Dieser Anstieg ist im Vergleich 0. vs. 6. Woche (p≤0.01), 6. vs. 12. Woche (p=0.01) und 0. vs. 12. Woche (p≤0.01) signifikant. Eine signifikante Änderung blieb in der Kontrollgruppe aus. Mit 79.26 ±20.34% liegt die Kontrollgruppe nach der dritten Untersuchung deutlich unter dem in Bezug auf das Lebensalter und Körpergewicht zu erreichenden Sollwert (Rost, Heck et Hollmann, 1985). 76 Ergebnisse Konrollgruppe Ausdauergruppe 160 140 [%] - max. Soll 120 100 80 60 40 20 0 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. Abb. 25: Graphische Darstellung der kardialen Ausbelastung im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe (#: p<0.05 AG vs. KG; *: p<0. 05 vs. 0. Wo.; +: p<0.05 vs. 6. Wo.) Maximale Laktatkonzentration Die maximale Laktatkonzentration wurde aus kapillarem Blut bei maximaler subjektiver Ausbelastung analysiert. In der Ausdauergruppe stieg diese von 5.1 ±1.8 ππππππππ ππ signifikant auf 6.2 ±1.9 ππππππππ ππ an. Eine signifikante Änderung konnte allerdings nur in Bezug auf das Gesamtkollektiv im Vergleich 0. vs. 12. Woche (p=0.01) nachgewiesen werden. 2mmol- Schwellenwert Aus der in den jeweiligen Untersuchungseinheiten ermittelten physiologischen Ausdauerleistung und der Laktatkonzentration des kapillaren Blutes wurde die Leistungsfähigkeit an der 2mmol- Grenze errechnet. Diese lässt einen Rückschluss auf die aerobe Leistungsfähigkeit zu und stieg in beiden Untersuchungsgruppen an. In Bezug auf das Gesamtkollektiv zeigte sich im Vergleich 0. vs. 6. Woche (p=0.01) und 0. vs. 12. Woche (p=0.02) eine signifikante Änderung. 77 Ergebnisse 4mmol- Schwellenwert Aus der in den jeweiligen Untersuchungseinheiten ermittelten physiologischen Ausdauerleistung und der Laktatkonzentration des kapillaren Blutes wurde die Leistungsfähigkeit an der 4mmol- Grenze errechnet. Weder in der Kontrollnoch in der Ausdauergruppe ließ sich eine signifikante Änderung nachweisen. 3.5. Muskelfasertypisierung Die durch die Ausdauerintervention bedingte Veränderung der Muskelfasertypenspezifizierung wurde immunhistochemisch an den Bioptaten aus den einzelnen Untersuchungszeitpunkten nachgewiesen. In Folge der quantitativen Analyse ist in der Kontrollgruppe keine signifikante Änderung festzustellen. In der Ausdauergruppe hingegen wurde im Gruppenvergleich ein signifikanter Anstieg der oxidativen Typ I- Muskelfasern von 42.4 ±10.4% auf 55.8 ±9.3% nachgewiesen (p=0.03). Dieser Anstieg war im Vergleich 0. vs. 6. Woche (p≤0.01), 6. vs. 12. Woche (p=0.01) und 0. vs. 12. Woche (p≤0.01) signifikant. 78 Ergebnisse Typ I Typ II Muskelfasertypisierung [%] 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. Abb. 26: Graphische Darstellung der Muskelfasertypisierung der Kontrollgruppe im Vergleich zu Abb.27 (#: p<0.05 AG vs. KG; *: p<0. 05 vs. 0. Wo.; +: p<0.05 vs. 6. Wo.) Typ I Typ II Muskelfasertypisierung [%] 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. Abb. 27: Graphische Darstellung der Muskelfasertypisierung der Ausdauergruppe im Vergleich zu Abb. 26 (#: p<0.05 AG vs. KG; *: p<0. 05 vs. 0. Wo.; +: p<0.05 vs. 6. Wo.) 79 Ergebnisse 3.6. Muskelfaserdurchmesser Die Veränderung des Durchmessers in den oxidativen Typ I- Muskelfasern der Kontrollgruppe von 56.0 ±8.2 µm auf 58.0 ±7.5 µm und der Typ II- Muskelfasern von 55.9 ±8.1 µm auf 59.3 ±8.3 µm waren nicht signifikant. Der Durchmesser des Fasertyps I der Ausdauergruppe betrug zu Beginn der Studie 59.7 ±8.7 µm und zum Ende der Intervention 61.0 ±8.4 µm. Der Fasertyp II änderte sich in seinem Durchmesser von 60.4 ±7.9 µm auf 62.6 ±5.6 µm. Beide wiesen, wie auch schon in der Kontrollgruppe, keine Signifikanz auf. 3.7. Immunhistochemischer Nachweis des MCT1 und MCT4 im Muskelgewebe des M. vastus lateralis In Folge einer immunhistochemischen Untersuchung der Bioptate, die jeweils in den drei Untersuchungseinheiten entnommen wurden, konnte die cytoplasmatische und membranöse MCT1- bzw. MCT4- Konzentration analysiert werden. Die Biopsie aus dem M. vastus lateralis fand jeweils in der 1., 6. und 12. Woche statt. 80 Ergebnisse Cytoplasmatische MCT1- Dichte im Muskelgewebe Die Analyse der cytoplasmatischen MCT1- Dichte zeigte im Gruppenvergleich zwischen Ausdauer- und Kontrollinterventionsgruppe einen signifikanten Unterschied (p≤0.01). Dieser zeigte sich in der Ausdauergruppe in Form eines signifikanten prozentualen Anstiegs um 53.44 ±7.01% in der 6. Woche (p≤0.01) und 92.65 ±9.55% in der 12. Woche (p≤0.01). Die Kontrollgruppe zeigte keine signifikanten Veränderungen der cytoplasmatischen MCT1-Dichte. Kontrollgruppe Ausdauergruppe Densitometrische Einheiten β % 140 120 100 80 60 40 20 0 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. Abb. 28: Graphische Darstellung der cytoplasmatischen MCT1- Dichte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe (#: p<0.05 AG vs. KG; *: p<0. 05 vs. 0. Wo.; +: p<0.05 vs. 6. Wo.) 81 Ergebnisse Cytoplasmatische MCT4- Dichte im Muskelgewebe Die cytoplasmatische MCT4- Dichte zeigte im Gruppenvergleich zwischen Ausdauer- und Kontrollinterventionsgruppe einen signifikanten Unterschied (p≤0.01). Dieser zeigte sich in der Ausdauergruppe in Form einer signifikanten prozentualen Reduktion um -14.62 ±5.2% in der 6. Woche (p≤0.01) und -41.35 ±1.79% in der 12. Woche (p≤0.01). Die Kontrollgruppe hingegen zeigte keine signifikante Änderung der cytoplasmatischen MCT4-Dichte. Kontrollgruppe Ausdauergruppe Densitometrische Einheiten β % 40 30 20 10 0 -10 0.Wo. 0.Wo. 6.Wo. 6.Wo. 12.Wo. 12.Wo. -20 -30 -40 -50 Abb. 29: Graphische Darstellung der cytoplasmatischen MCT4- DIchte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe (#: p<0.05 AG vs. KG; *: p<0. 05 vs. 0. Wo.; +: p<0.05 vs. 6. Wo.) 82 Ergebnisse Absolute membranöse MCT1- Dichte im Muskelgewebe In der Ausdauergruppe veränderte sich die absolute membranöse MCT1- Dichte von 43.81 ±0.97DU in der 0. Woche auf 43.63 ±1.72DU in der 12. Woche. Die Kontrollgruppe zeigte eine Veränderung von 42.65 ±0.64DU in der 0. Woche auf 43.82 ±1.26DU in der 12. Woche. Weder in der Ausdauer- noch in der Kontrollgruppe konnte eine signifikante Änderung in Bezug auf die MCT1- Dichte festgestellt werden. Kontrollgruppe Ausdauergruppe 50 Densitometrische Einheiten 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. Abb. 30: Graphische Darstellung der absoluten membranösen MCT1- Dichte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe 83 Ergebnisse Absolute membranöse MCT4- Dichte im Muskelgewebe In der Ausdauergruppe veränderte sich die absolute membranöse MCT4- Dichte von 43.26 ±1.09DU in der 0. Woche auf 43.02 ±1.24DU in der 12. Woche. Die Kontrollgruppe zeigte eine Veränderung von 43.71 ±1.04DU in der 0. Woche auf 42.97 ±1.19DU in der 12. Woche. Weder in der Ausdauer- noch in der Kontrollgruppe konnten signifikante Änderungen festgestellt werden. Kontrollgruppe Ausdauergruppe 50 Densitometrische Einheiten 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. Abb. 31: Graphische Darstellung der absoluten membranösen MCT4- Dichte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe 84 Ergebnisse Relative membranöse MCT1- Dichte im Muskelgewebe Die relative membranöse MCT1- Dichte, bei der wie in der Methodik beschrieben die ausgewertete Muskelfläche berücksichtigt wird, zeigte in der Kontroll- und der Ausdauergruppe keine signifikanten Änderungen. In der Ausdauergruppe veränderte sich die relative membranöse MCT1- Dichte von der 0. Woche zu der 6. Woche um -0.47 ±0.53DU und von der 6. zu der 12. Woche um -0.20 ±0.30DU. Die Kontrollgruppe zeigte eine Veränderung um +0.16 ±0.24DU von der 0. Woche zu der 6. Woche und um -0.23 ±0.32DU von der 6. Woche zu der 12. Woche. Kontrollgruppe Ausdauergruppe Densitometrische Einheiten β 0,5 0 0.Wo. vs. 6.Wo 6.Wo. vs. 12.Wo. 0.Wo. vs. 6.Wo. 6.Wo. vs. 12.Wo. -0,5 -1 -1,5 Abb. 32: Graphische Darstellung der relativen membranösen MCT1- Dichte im Vergleich Kontrollgruppe und Ausdauergruppe 85 Ergebnisse Relative membranöse MCT4- Dichte im Muskelgewebe In Bezug auf die relative MCT4- Dichte zeigte sich sowohl in der Ausdauergruppe als auch in der Kontrollgruppe keine signifikante Änderung. In der Ausdauergruppe veränderte sich die relative membranöse MCT4- Dichte von der 0. Woche auf die 6. Woche um -0.37 ±0.62DU und von der 6. zu der 12. Woche um -0.14 ±0.71DU. Die Kontrollgruppe zeigte eine Veränderung um 0.19 ±0.37DU von der 0. Woche zu der 6. Woche und um +0.17 ±0.30DU von der 6. Woche zu der 12. Woche. Kontrollgruppe Ausdauergruppe 0.Wo. vs. 6.Wo. 0.Wo. vs. 6.Wo. Densitometrische Einheiten β 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 -0,4 6.Wo. vs. 12.Wo. 6.Wo. vs 12.Wo -0,6 -0,8 -1,0 -1,2 Abb. 33: Graphische Darstellung der relativen membranösen MCT4- Dichte im Vergleich Kontrollgruppe und Ausdauergruppe 86 Ergebnisse 3.8. Immunhistochemischer Nachweis des CD147 im Muskelgewebe des M. vastus lateralis In Folge einer immunhistochemischen Untersuchung der Bioptate, die jeweils in den drei Untersuchungseinheiten entnommen wurden, konnte ebenfalls die trainingsinduzierte Veränderung der cytoplasmatischen und membranösen CD147- Konzentration analysiert werden. Die Biopsie aus dem M. vastus lateralis fand jeweils in der 1., 6. und 12. Woche statt. Cytoplasmatische CD147- Dichte im Muskelgewebe Die Analyse der cytoplasmatischen CD147- Dichte zeigte im Gruppenvergleich zwischen Ausdauer- und Kontrollinterventionsgruppe eine signifikant unterschiedliche Entwicklung über den Interventionszeitraum (p=0.01). Während die Änderung in der Ausdauergruppe von der 0. Woche in die 6. Woche -23.95 ±68.64% und von der 6. in die 12. Woche -30.57 ±84.11% betrug, blieb eine Signifikanz aus. Die Kontrollgruppe zeigte eine Veränderung um +16.28 ±57.93% von der 0. Woche in die 6. Woche und um +77.1 ±64.2% von der 6. Woche in die 12. Woche (p=0.03). Kontrollgruppe Ausdauergruppe Densitometrische Einheiten % 200 150 100 50 0 0.Wo. 0.Wo. 6.Wo. 6.Wo. 12.Wo. 12.Wo. -50 -100 -150 Abb. 34: Graphische Darstellung der cytoplasmatischen CD147- Dichte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe (#: p<0.05 AG vs. KG; *: p<0. 05 vs. 0. Wo.; +: p<0.05 vs. 6. Wo.) 87 Ergebnisse Absolute membranöse CD147- Dichte im Muskelgewebe Die absolute CD147- Dichte zeigt über den Verlauf des Untersuchungszeitraumes eine signifikante Änderung im Vergleich zwischen der Ausdauer- und Kontrollgruppe (p≤0.01). In der Ausdauergruppe veränderte sich die absolute membranöse CD147Dichte von 45.15 ±1.62DU in der 0. Woche auf 44.77 ±1.70DU in der 12. Woche. Es konnte keine signifikante Änderung nachgewiesen werden. In der Kontrollgruppe hingegen war sowohl die Änderung von 44.68 ±1.70DU in der 0. Woche auf 44.50 ±1.57DU in der 6. Woche (p≤0.01) als auch die Änderung von der 0. Woche auf 43.96 ±1.90DU in der 12. Woche (p≤0.01) signifikant. Die Entwicklung von der 6. Woche vs. 12. Woche zeigte keine signifikanten Änderungen. Kontrollgruppe Ausdauergruppe Densitometrische Einheiten 60 50 40 30 20 10 0 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. Abb. 35: Graphische Darstellung der absoluten membranösen MCT4- Dichte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe (#: p<0.05 AG vs. KG; *: p<0. 05 vs. 0. Wo.) 88 Ergebnisse Relative membranöse CD147- Dichte im Muskelgewebe Die relative membranöse CD147- Dichte im Muskelgewebe zeigte weder in der Ausdauergruppe noch in der Kontrollgruppe nach der Trainingsintervention eine signifikante Änderung. In der Ausdauergruppe veränderte sich die relative membranöse CD147- Dichte von der 0. Woche auf die 6. Woche um -0.0019 ±0.0028DU und von der 6. in die 12. Woche um -0.0021 ±0.0027DU. Die Kontrollgruppe zeigte eine Veränderung um -0.0010 ±0.0046 von der 0. Woche in die 6. Woche und um +0.0005 ±0.0031DU von der 6. Woche in die 12. Woche. Kontrollgruppe Ausdauergruppe Densitometrische Einheiten β 0,006 0,004 0,002 0 -0,002 6.Wo. vs. 12.Wo. 0.Wo. vs. 6.Wo. 6.Wo. vs. 12.Wo. 0.Wo. vs. 6. Wo. -0,004 -0,006 Abb. 36: Graphische Darstellung der relativen membranösen CD147- Dichte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe 89 Ergebnisse 3.9. Immunhistochemischer Nachweis des MCT1 in den Erythrozyten Der immunhistochemische Nachweis der MCT1- Dichte in den Erythrozyten der Diabetespatienten wurde an den venösen Blutproben durchgeführt, die wie in der Methodik beschrieben, vor, während und nach der Belastungsuntersuchung genommen wurden. Hierbei stand einerseits die belastungsbedingte – kurzfristige und andererseits die trainingsinduzierte – langfristige Veränderung im Augenmerk der Untersuchung. Trainingsinduzierte Änderung der MCT1- Dichte in den Erythrozyten Die über den Verlauf des 12- wöchigen Untersuchungszeitraumes untersuchte MCT1- Dichte in den Erythrozyten stieg in der Kontrollgruppe von 4.84 ±2.20DU auf 5.72 ±2.00DU an, zeigte jedoch keine signifikanten Änderungen. In der Ausdauergruppe hingegen konnte eine basale Zunahme nachgewiesen werden. Die basale MCT1- Dichte stieg hier von 6.64 ±3.64DU auf 12.43 ±2.92DU an und zeigte im Gruppenvergleich eine signifikante Änderung (p=0.01). Dieser Anstieg ist im Vergleich 0. vs. 6. Woche (p≤0.01), 6. vs. 12. Woche (p=0.03) und 0. vs. 12. Woche (p≤0.01) signifikant. 90 Ergebnisse Konrollgruppe Ausdauergruppe 20 Densitometrische Einheiten 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. 0.Wo. 6.Wo. 12.Wo. Abb. 37: Graphische Darstellung der basalen MCT1- Proteinexpression im Erythrozyten im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe (#: p<0.05 AG vs. KG; *: p<0. 05 vs. 0. Wo.; +: p<0.05 vs. 6. Wo.) Abb. 38: Mikroskopische Darstellung des MCT1 (400-fache Vergrößerung) in den Erythrozyten im untrainierten Zustand vor (links) und nach (rechts) Belastung Abb. 39: Mikroskopische Darstellung des MCT1 (400-fache Vergrößerung) in den Erythrozyten im trainierten Zustand vor (links) und nach (rechts) Belastung 91 Ergebnisse Belastungsinduzierte Änderung der MCT1- Dichte in den Erythrozyten Unter Belastung zeigte die MCT1- Dichte in der Kontrollgruppe und der nicht trainierten Ausdauergruppe in der 0. Woche keine signifikante Veränderung. In der Ausdauergruppe hingegen konnte in Folge der Trainingsintervention eine signifikante Abnahme der MCT1- Dichte von 12.43 ±2.92DU auf 3.04 ±1.71DU nach der 12. Woche nachgewiesen werden (p≤0.01). In der Erholungsphase konnte ebenfalls nur in der trainierten Ausdauergruppe eine signifikante Änderung nachgewiesen werden. Über den Zeitraum von 60 Minuten stieg die MCT1- Dichte nach der 12. Woche von 3.04 ±1.71DU auf 8.29 ±2.98DU signifikant an (p≤0.01). 0. Woche 6. Woche 12. Woche Densitometrische Einheiten 14 12 10 8 6 4 2 0 0 50 100 1' n. Watt Watt Watt Bel. 0 50 100 1' n. Watt Watt Watt Bel. 0 50 100 1' n. Watt Watt Watt Bel. Abb. 40: Graphische Darstellung der MCT1- Dichte der Kontrollgruppe im Erythrozyten unter Belastung im Vergleich zu Abb. 42 92 Ergebnisse 0. Woche 6. Woche 12. Woche Densitometrische Einheiten 14 12 10 8 6 4 2 0 1' n. 30' n. 60' n. Bel. Bel. Bel. 1' n. 30' n. 60' n. Bel. Bel. Bel. 1' n. 30' n. 60' n. Bel. Bel. Bel. Abb. 41: Graphische Darstellung der MCT1- Dichte der Kontrollgruppe in der Erholungsphase im Vergleich zu Abb. 43 0. Woche 6. Woche 12. Woche 0 50 100 1' n. Watt Watt Watt Bel. 0 50 100 1' n. Watt Watt Watt Bel. Densitometrische Einheiten 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 50 100 1' n. Watt Watt Watt Bel. Abb. 42: Graphische Darstellung der MCT1- Dichte der Ausdauergruppe unter Belastung im Vergleich zu Abb. 40 (#: p<0.05 AG vs. KG; *: p<0. 05 vs. 0. Wo.; +: p<0.05 vs. 6. Wo.) 93 Ergebnisse 0. Woche 6. Woche 12. Woche Densitometrische Einheiten 14 12 10 8 6 4 2 0 1' n. 30' n. 60' n. Bel. Bel. Bel. 1' n. 30' n. 60' n. Bel. Bel. Bel. 1' n. 30' n. 60' n. Bel. Bel. Bel. Abb. 43: Graphische Darstellung der MCT1- Dichte der Ausdauergruppe in der Erholungsphase im Vergleich zu Abb. 41 (#: p<0.05 AG vs. KG; *: p<0. 05 vs. 0. Wo.; +: p<0.05 vs. 6. Wo.) 3.10. Duchflusszytometrischer Nachweis der CD147- Dichte in den Erythrozyten Die während der Belastungsuntersuchung venös gewonnenen Blutproben wurden nach der Aufarbeitung mit Hilfe der FACS- Analyse auf die CD147Dichte untersucht. In der Kontroll- und der Ausdauergruppe konnten keine signifikanten Änderungen nachgewiesen werden. Während in der Kontrollgruppe eine tendentielle Zunahme der Basalwerte von 2287 ±2503 auf 4157 ±4557 zu erkennen war, nahmen diese in der Ausdauergruppe in Folge der Trainingsintervention tendentiell von 2524 ±1588 auf 1610 ±812 ab. 94 Ergebnisse 0. Woche 12. Woche 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 50 100 150 1' n. Watt Watt Watt Watt Bel. 0 50 100 150 1' n. Watt Watt Watt Watt Bel. Abb. 44: Graphische Darstellung der CD147- Dichte der Kontrollgruppe im Erythrozyten unter Belastung im Vergleich zu Abb. 46 0. Woche 12. Woche 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 1' n. Bel. 30' n. Bel. 60' n. Bel. 1' n. Bel. 30' n. Bel. 60' n. Bel. Abb. 45: Graphische Darstellung der CD147- Dichte der Kontrollgruppe in der Erholungsphase im Vergleich zu Abb. 47 95 Ergebnisse 0. Woche 12. Woche 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 50 100 150 Watt Watt Watt Watt 1' n. Bel. 0 50 100 150 Watt Watt Watt Watt 1' n. Bel. Abb. 46: Graphische Darstellung der CD147- Dichte der Ausdauergruppe unter Belastung im Vergleich zu Abb. 44 0. Woche 12. Woche 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1' n. Bel. 30' n. Bel. 60' n. Bel. 1' n. Bel. 30' n. Bel. 60' n. Bel. Abb. 47: Graphische Darstellung der CD147- Dichte der Ausdauergruppe in der Erholungsphase im Vergleich zu Abb. 45 96 Diskussion 4. Diskussion 4.1. Auswirkungen der Interventionsmaßnahme auf die Leistungsfähigkeit und Stoffwechselparameter Die Bedeutung körperlicher Aktivität in der Therapie bzw. Sekundärprävention bei Diabetes Typ-2- Patienten ist sehr groß (Kennedy et al., 1999; Boule et al., 2001; Sigal et al., 2004; Sigal et al., 2006; Martinus et al., 2006). In zahlreichen Studien konnten die Effekte von Ausdauertraining bereits herausgestellt werden (Boule et al., 2001; Boule et al., 2003; Snowling et al., 2006). Einerseits wird dadurch die diabetische Stoffwechsellage verbessert und andererseits die Entstehung von Risikofaktoren eines manifesten Typ-2-Diabetes reduziert (Tuomilehto et al., 2001, Hu et al., 2002; Lindstrom et al., 2006; Engberg et al., 2010). Folglich können dadurch die Faktoren des metabolischen Syndroms und demzufolge das kardiovaskuläre Risikoprofil minimiert werden (Biermann, 2010; Laukkanen et al., 2010). Neben der körperlichen Aktivität nimmt die Ernährung eine entscheidende Rolle in der Behandlung ein. Eine Umstellung der Ernährungsgewohnheiten stand nicht im Fokus der Diabetes-Typ-2-Studie, um isoliert die Effekte der sportlichen Interventionsmaßnahme analysieren zu können. Wie bereits in Metaanalysen betrachtet (Boule et al., 2001; Boule et al., 2003) konnten auch in der Diabetes-Typ-2-Studie die diabetische Stoffwechsellage und die allgemeinen Stoffwechselparameter verbessert werden. Das Ausdauertraining bewirkte eine signifikante Reduktion des Körpergewichtes und in dessen Folge des BMI- Wertes. Diese zu erwartende und auch schon in weiteren Studien belegte Abnahme des Körpergewichtes konnte in der Kontrollgruppe nicht festgestellt werden (Dunstan et al., 1997; Boule et al., 2001; Cuff et al., 2003). In Verbindung mit einer Modifikation der 97 Diskussion Ernährungsgewohnheiten könnte der Effekt der Gewichtsreduktion zusätzlich verstärkt werden (Halle et al., 2008). Die sporttherapeutische Intervention im Rahmen der Diabetestherapie wurde von der amerikanischen Diabetesgesellschaft mit dem Evidenzgrad A beschrieben. Die hierbei von SIGAL et al. publizierte Verbesserung der glykämischen Stoffwechsellage (Sigal et al., 2004) konnte in der Diabetes-Typ-2Studie belegt werden. Als Indikatoren dienten der HbA1c- sowie der Nüchternglukose- Wert, die im Rahmen des 12-wöchigen Ausdauertrainings im Vergleich zu der Kontrollgruppe signifikant gesenkt werden konnten. In einer Meta- Analyse von SNOWLING et al. und einer weiteren von BOULE et al. konnte eine durchschnittliche Reduktion des HbA1c- Wertes von 0.7-0.8% in Folge eines Ausdauertrainings bei 50-70% der ππππ2 ππππππ herausgestellt werden (Boule et al., 2001; Boule et al., 2003; Snowling et al., 2006). Trotz der im Vergleich zu der Kontrollgruppe signifikanten Abnahme der HbA1c- Konzentration in der Ausdauergruppe wurde gruppenintern keine Signifikanz über den Studienverlauf festgestellt. Dies könnte in der Dauer und dem Umfang der Trainingsintervention begründet sein. Die bei 75% der ππππ2 ππππππ festgelegte Trainingsintensität stellt somit eine optimale Belastung dar, allerdings könnte auch hier eine noch höhere Belastung zu größeren Effekten führen (Boule et al., 2003; Zanuso et al., 2009). Neben der Abnahme des HbA1c korreliert die Belastungsintensität außerdem mit der Insulinsensitivität bei Diabetespatienten (O`Donovan et al., 2005; Coker et al., 2006; Dipietro et al., 2006). Des Weiteren kann im Rahmen der Untersuchung nicht ausgeschlossen werden, dass ein suboptimales Ernährungsverhalten auf Seiten der Patienten zu einer Reduktion des positiven sporttherapeutischen Effektes in Bezug auf den HbA1c- Wert vorliegt. 98 Diskussion Lipidstoffwechsel Als Indikatoren für den Lipidstoffwechsel wurde die Cholesterin-, HDL-, LDL- und Triglyceridkonzentration analysiert. Die Kontrolle dieser Parameter ist für den Diabetespatienten obligat, da diese mit der Entstehung von Komorbiditäten, wie beispielsweise die durch die endotheliale Dysfunktion bedingte Arteriosklerose, korrelieren (Stehouwer et al., 1997; Verma et Anderson, 2002; Dunn, 2010). Entgegen der Erwartungen konnte das allgemeine Lipidprofil weder in der Ausdauer- noch in der Kontrollgruppe signifikant verbessert werden. Lediglich die LDL-Konzentration zeigte in Bezug auf das Gesamtkollektiv eine signifikante Verbesserung über den 12-wöchigen Trainingsverlauf. Diese tendenzielle Entwicklung wird von KELLEY et al. bestätigt. Hier konnte eine signifikante Reduktion der LDL-Konzentration, nicht aber der übrigen Lipidparameter nachgewiesen werden (Kelley et al., 2007). In weiteren Studien konnte dieser Trend, bezogen auf das Lipidprofil, bestätigt werden (Thomas et al., 2006; Kadoglou et al., 2007). Insbesondere die geringe Anzahl der Patienten und der, bezogen auf körperliche Adaptationsprozesse, kurze Interventionszeitraum könnten ausschlaggebende Faktoren für dieses Ergebnis darstellen. Blutdruck Das Blutdruckverhalten unter Belastung zeigte im Gegensatz zu dem Ruheblutdruck keine signifikante Veränderung. Allerdings ist auch die signifikante Reduktion des systolischen und diastolischen Blutdrucks auf das Gesamtkollektiv zu betrachten, da ein signifikanter Gruppenunterschied ausblieb. Die Ursachen für diesen Verlauf stellt der schon in der Ausgangsuntersuchung für Diabetespatienten relativ niedrige Blutdruckwert im ‚hochnormalen‘ Bereich dar deutliche Verbesserung (WHO, 1999; Bretzel et al., 2008), der eine kaum zulässt. Des Weiteren könnte der Trainingszeitraum für eine ausgeprägte Optimierung des systolischen 99 Diskussion Blutdrucks als zu kurz angesehen werden. In einer Studie von LOIMAALA et al. konnte eine signifikante Reduktion des systolischen Blutdrucks in Folge einer Trainingsintervention von 12 Monaten nachgewiesen werden (Loimaala et al., 2007). Ein weiterer Aspekt ist die relative Verbesserung des Blutdruckverhaltens aufgrund der konstanten Blutdruckwerte unter maximaler Belastung bei steigender Wattlast über den Interventionszeitraum. Körperliche Leistungsfähigkeit Als Indikatoren für die spezifische körperliche Leistungsfähigkeit der Patienten wurde neben der maximalen Wattlast und der Laktatkonzentration auch die prozentuale kardiale Ausbelastung herangezogen. Alle Faktoren belegen eine signifikante Steigerung der Ausdauerleistungsfähigkeit. Die maximale, im Rahmen der Belastungsuntersuchung bewältigte Wattlast, stieg in der Ausdauergruppe im Mittel um 31,6 Watt signifikant an. Dieser Anstieg der Ausdauerleistungsfähigkeit spiegelt sich auch in weiteren Studien an Typ-2Diabetespatienten wieder, die ein Ausdauertraining absolvierten (Boule et al., 2001; Sigal et al., 2004; Cauza et al., 2005; Kadoglou et al., 2007; Matthaei et al., 2010). Die Effizienz des absolvierten Ausdauertrainings lässt sich ebenso in der prozentualen kardialen Ausbelastung erkennen. Diese wird, wie in der Methodik besprochen, mit 3 ππππππππ πΎπΎπΎπΎ ∗ πΎπΎπΎπΎπΎπΎ (KGW: Körpergewicht) abzüglich einem Prozent pro Lebensjahr ab der dritten Lebensdekade berechnet. Mit der signifikant gesteigerten körperlichen Fitness korreliert eine verbesserte diabetische Stoffwechsellage und folglich die Reduktion des kardiovaskulären Risikos (Look AHEAD Research Group, 2010). Sowohl die Ausdauer- als auch die Kontrollgruppe wiesen in der Ausgangsuntersuchung eine unter dem Sollwert liegende kardiale Ausbelastung auf. In der Kontrollgruppe konnte diesbezüglich keine signifikante Änderung dargestellt werden. Die Ausdauergruppe hingegen konnte diese durch das 12-wöchige Interventionsprogramm signifikant auf 96.20% des berechneten Sollwertes steigern (Kroidl et al., 2010). 100 Diskussion Laktatmetabolismus Als weitere leistungsphysiologische Parameter wurden in der Diabetes-Typ-2Studie neben dem Ruhelaktatwert auch der 2- und 4- mmol- Schwellenwert analysiert. Der Laktatwert in Ruhe lag bei den Diabetespatienten in beiden Gruppen unter dem Referenzwert von 1,8 mmol L (Biedler et al., 1995). Ein wie bei LOVEJOY et al. unter Ruhebedingungen erhöhter Laktatspiegel bei Patienten mit Typ 2 Diabetes konnte nicht nachgewiesen werden (Lovejoy et al., 1992). Eine signifikante Änderung blieb durch die Trainingsintervention ebenfalls aus. Des Weiteren konnte auch in Bezug auf die 2- und 4- mmol- Grenze keine gruppenspezifische Signifikanz nachgewiesen werden. Fasershift im Skelettmuskel Im Rahmen der Analyse der Skelettmuskelfasern wurde die prozentuale Zusammensetzung aus den oxidativ arbeitenden Typ I- und den glykolytisch arbeitenden Typ II- Fasern erhoben. Ein kontinuierliches Ausdauertraining führt aufgrund der veränderten energetischen Beanspruchung zu einer vermehrten Dichte der Typ I- Fasern und ein intensives Krafttraining hingegen zu einer Umstrukturierung der Typ I- Fasern zugunsten von Typ II- Fasern (Fitzsimons et al., 1990; Huang et al., 2007). Die Auswirkung eines ausdauerorientierten Trainings spiegelt sich dem zufolge in einer prozentualen Zunahme der mitochondrienreichen Typ I- Muskelfasern wieder (Putman et al., 2004). Neben der erhöhten Mitochondriendichte ist, im Vergleich zu Typ II- Fasern, auch die Dichte des GLUT4 in den Typ I- Muskelfasern erhöht und kann durch vermehrte körperliche Aktivität positiv beeinflusst werden (Kennedy et al., 1999; Daugaard et al., 2000; Gaster et al., 2001a; Gaster et al., 2001b; Kroidl et al., 2010). Dieser für die Glukoseregulation essentielle Transporter ist bei Diabetes- Typ 2Patienten vermindert und kann durch die Normalisierung infolge einer Ausdauerintervention die diabetische Stoffwechsellage verbessern (König et al., 2006). Die Ergebnisse der vorliegenden Diabetes Typ-2-Studie bestätigen diese 101 Diskussion Daten. In Folge des Ausdauertrainings konnte eine signifikante Zunahme der Typ I- Muskelfasern nachgewiesen werden. Dies zeigte sich auch in weiteren Studien, in denen nicht nur eine signifikante Zunahme der Typ I- Fasern, sondern auch eine gesteigerte GLUT4-Translokation nachgewiesen werden konnte (Kennedy et al., 1999; Dubouchaud et al., 2000). 4.2. Auswirkungen der Interventionsmaßnahme auf den MCT im Skelettmuskel MCT1 Im Vergleich der Kontroll- und Ausdauergruppe zeigte die immunhistochemische Analyse der Skelettmuskelfasern bezogen auf die MCT1Dichte einerseits einen signifikanten Anstieg der cytoplasmatischen Proteindichte, andererseits aber keine signifikante Änderung in der absoluten und relativen membranösen MCT1- Dichte. Bereits in zahlreichen Studien wurde die MCT1- Proteinexpression infolge eines Ausdauerinterventionsprogrammes untersucht. Die Basis des Vergleiches unterschiedlicher Studien ist der methodische Ansatz der Analysen. Insbesondere die methodische Gestaltung des Ausdauertrainings und die der Auswertung sind kritisch zu hinterfragen. In den überwiegend bisher publizierten Studien wurde als Analyseverfahren ein Western- Blot mit einem Homogenat aus dem Cytoplasma und den Endothelzellen der Kapillaren verwendet. In der immunhistochemische ‚Diabetes-Typ-2-Studie Auswertung angewandt, 2009‘ wurde eine die zwischen der cytoplasmatischen und membranösen Proteindichte differenziert. Dadurch ist eine direkte Vergleichbarkeit der Studie lediglich auf einige Wenige anzuwenden (Dubouchaud et al., 2000; Juel et al., 2004b; Kreutz, 2010). 102 Diskussion In Übereinstimmung mit den hiesigen Ergebnissen konnte sowohl in Tierstudien (Baker et al., 1993a; Yoshida et al., 2004) als auch im menschlichen Skelettmuskel (Bonen et al., 1998; Dubouchaud et al., 2000; Kreutz, 2010) eine ausdauerbedingte signifikante Steigerung der MCT1- Proteinexpression nachgewiesen werden. Die Effekte eines Ausdauertrainings auf den MCT1 bei Diabetespatienten wurden bislang erstmals von KREUTZ nachgewiesen (Kreutz, 2010). BAKER et al. konnte darstellen, dass eine reduzierte MCT1- Dichte mit einer Abschwächung des Laktattransportes korreliert (Baker et al., 1998). Diese Ergebnisse wurden in weiteren Studien bestätigt (McCullagh et al., 1997; Hajduch et al., 2000). In einer Studie an diabetisch eingestellten Ratten konnte ENOKI et al. eine Erhöhung der basal reduzierten MCT1- Dichte in Folge eines Ausdauertrainings über einen Zeitraum von drei Wochen nachweisen (Enoki et al., 2003). METZ et al. konnten diesen Befund an adipösen Ratten in Folge eines 10-wöchigen Ausdauertrainings bestätigen (Metz et al., 2005). Neben dem, durch eine vermehrte MCT1- Proteinexpression verbesserten Laktattransport, zeigten PILLEGRAAD et al. und BONEN et al. auch eine deutliche Korrelation zu dem oxidativen Potential, welches in erheblichem Maße eine protektorische Funktion gegenüber kardiovaskulären Komorbiditäten darstellt (Baker et al., 1998; Pilegaard et al., 1999a; Bonen et al., 2000c; Blumenstein, 2004). Die direkte Vergleichbarkeit mit weiteren Studien ist, wie oben beschrieben, abhängig von der methodischen Gestaltung des Ausdauertrainings. Mit einer Trainingsbelastung von 75% der ππππ2 ππππππ liegt diese über dem von BAKER et al. durchgeführten moderaten Ausdauertraining auf dem Laufband, bei dem keine vermehrte MCT1- Proteinexpression feststellbar war. Erst bei höheren Trainingsintensitäten konnte eine signifikante Zunahme beobachtet werden (Baker et al., 1998). Ein vergleichbarer Effekt konnte in Untersuchungen an trainierten Ausdauersportlern dargestellt werden. So zeigte sich in einer Studie von EVERTSEN et al., dass erst im Intensitätsbereich zwischen 80-90 % der ππππ2 ππππππ eine gesteigerte MCT1- Proteinexpression nachweisbar ist (Evertsen et al., 2001). 103 Diskussion Insbesondere mit den Daten der Muskelfasertypspezifizierung lässt sich dieses Ergebnis in Einklang bringen. Der MCT1 wird vermehrt in Typ I- Muskelfasern exprimiert (Baker et al., 1998; Bonen et al., 2000b; Kobayashi et al., 2004), so dass ein Fasershift einen möglichen Erklärungsansatz darstellen könnte. Die Regulationsprozesse der Proteinexpression werden dabei in den aktuellen Publikationen aus unterschiedlichen Sichtweisen beschrieben. Als einen Transkriptionsfaktor beschrieben ZHANG et al. den hypoxia inducible factor 1 α (HIF1α) in den Astrocyten und BENTON et al. das Peroxisome proliferatoractivated receptor γ (PPARγ) coactivator 1α (PGC1α), welches die mitochondriale Biogenese begünstigt und so eine entscheidende Rolle in der trainingsbedingten Proteinexpression einnimmt (Zhang et al., 2005; Benton et al., 2008). Daher ist ein cytoplasmatischer Anstieg der MCT1- Dichte zu erwarten gewesen. Bei der Differenzierung zwischen membranöser und cytoplasmatischer Dichte ist letztere nicht signifikant gestiegen. Dies könnte einerseits mit einer zu niedrig gewählten Belastung begründet sein, da die Proteinexpression mit der Trainingsintensität korreliert (Baker et al., 1998). So konnte in einer Studie von JUEL et al. eine Steigerung der Proteindichte von 15% in Folge eines Hochintensitätstrainings (HIT) von 150% der ππππ2 ππππππ nachgewiesen werden (Juel et al., 2004a). In einer Studie von BONEN et al. führten bereits niedrige Trainingsintensitäten bei untrainierten Probanden zu einer deutlichen Proteinexpression (Bonen et al., 1998). Analog zu diesen Daten und denen von DUBOUCHAUD et al., der eine Steigerung von 90% im M. vastus lateralis in Folge eines neunwöchigen Ergometertrainings bei 75% der ππππ2 ππππππ belegen konnte (Dubouchaud et al., 2000), ist auch die cytoplasmatische Steigerung der MCT1- Proteindichte um 92% in der ‚Diabetes-Typ-2-Studie 2009‘ zu betrachten. Der schon angesprochene Fasershift führt zu einer erhöhten Mitochondriendichte in der Muskulatur. BENTON et al. und BUTZ et al. konnten den MCT1 in der Mitochondrienmembran nachweisen, welcher möglicherweise für den Transport von Monocarboxylaten als direkte Energiequelle für den 104 Diskussion Citratcyklus durch die äußere Mitochondrienmembran verantwortlich ist (Benton et al., 2004; Butz et al., 2004). Der ausschließlich cytoplasmatisch nachweisbare Anstieg bzw. eine nahezu unveränderte membranöse MCT1- Dichte könnte als ein Indiz für eine mögliche belastungsbedingte Membrantranslokation, die vergleichbar zum GLUT4 zu betrachten ist, gedeutet werden. Das GLUT4- Protein transloziert unter Belastung aus intrazellulären Vesikeln in das Sarkolemm, so dass erst unter Belastung eine erhöhte Proteindichte in der Membran nachweisbar ist (Pessin et al., 1999). Folglich wären in weiteren Studien nicht ausschließlich Ruhebiopsien sondern auch Belastungsbiopsien wünschenswert. MCT4 Im Vergleich der Kontroll- und Ausdauergruppe zeigte die immunhistochemische Analyse der Skelettmuskelfasern bezogen auf die MCT4Dichte einerseits eine signifikante Reduktion der cytoplasmatischen Proteindichte, andererseits aber keine signifikante Änderung in der absoluten und relativen membranösen MCT4- Dichte. Vergleichbar zu Proteinexpression den soeben wurde diskutierten mehrfach auch Ergebnissen für den der MCT4 MCT1eine muskelfasertypspezifische Expressionsrate nachgewiesen. So besteht hierbei eine Korrelation zwischen der MCT4- Dichte und dem prozentualen Anteil der glycolytisch arbeitenden Typ II- Fasern (Wilson et al., 1998; Pilegaard et al., 1999a; Bonen et al., 2004; Kobayashi et al., 2004). BONEN et al. und YOSHIDA et al. konnten intensitätsabhängig eine Differenz zwischen der Proteinexpression des MCT1 und MCT4 darstellen (Bonen et al., 2000b; Yoshida et al., 2004). Folglich werden unterschiedliche Ansätze der Genregulation, wie beispielsweise die posttranslationale Modifikation, in den aktuellen Publikationen kontrovers diskutiert (Bonen et al., 2000a; Coles et al., 2004). 105 Diskussion Als ein weiterer Faktor, der die MCT4- Proteinexpression beeinflusst, wurde von ULLAH et al. der Transkriptionsfaktor HIF1α beschrieben (Ullah et al., 2006). Noch viel mehr als die MCT1- ist die MCT4- Proteinexpression von der trainingsinduzierten Belastungsintensität abhängig. So erfährt zunächst der MCT1 und erst bei höheren Trainingsintensitäten mit diesem gemeinsam der MCT4 eine gesteigerte Proteinexpression (Juel, 2006). In Bezug auf die trainingsbedingte Veränderung der MCT4- Dichte ist die Datenlage sehr unterschiedlich beschrieben. In Kombination mit der Pathophysiologie von Typ2-Diabetes konnte PY et al. eine reduzierte MCT4- Dichte und Laktattransportkapazität nachweisen (Py et al., 2002). Beides konnte durch ein über drei Wochen stattfindendes tägliches Ausdauertraining normalisiert werden (Enoki et al., 2003). Während JUEL et al. weder bei Diabetespatienten, verglichen mit einer gesunden Kontrollgruppe, noch nach einer achtwöchigen Trainingsintervention an gesunden Probanden eine signifikante Änderung feststellen konnte, ist in einer Studie von PILEGAARD et al. in Folge eines Trainings bei 150% der ππππ2 ππππππ eine 34%- ige MCT4- Zunahme festzustellen (Pilegaard et al., 1999b; Juel et al., 2004a; Juel et al., 2004b). Die in der Diskussion der analysierten MCT1- Expression schon erwähnte Studie von DUBOUCHAUD et al. ist auf die Belastungsintensität bezogen mit 75 % der ππππ2 ππππππ vergleichbar durchgeführt worden wie die ‚Diabetes-Typ-2-Studie 2009‘. Neben der analog zu dieser Studie beschriebenen Zunahme von 90% in Bezug auf den MCT1 ist den MCT4 betreffend eine Zunahme von 47% festgestellt worden (Dubouchaud et al., 2000). Diese Zunahme steht der in dieser Studie nachgewiesenen Abnahme der MCT4- Dichte gegenüber. Ebenfalls eine Abnahme der MCT4- Dichte konnte nach einer Reduzierung der Trainingsbelastung bei trainierten Skiläufern festgestellt werden (Evertsen et al., 2001). Eine mögliche Erklärung für diese Abnahme ist der schon angesprochene Fasershift mit einer Abnahme der Typ II- Muskelfasern um 13% (Dimmer et al., 2000). Die Dichte des vornehmlich in Typ II- Fasern exprimierten MCT4- Proteins unterläge so, ohne eine trainingsbedingte Beeinflussung der 106 Diskussion Proteinexpression, einer Abnahme. Verglichen hierzu ist die über den Untersuchungszeitraum analysierte MCT1- Zunahme vom Betrag her deutlich größer und könnte somit ein Hinweis auf die belastungsabhängigen Regulationsprinzipien sein. Analog zu den unterschiedlichen Regulationsmechanismen könnte auch der Trainingszustand für die Zunahme einer Proteinexpression relevant sein. So konnte BISHOP et al. an trainierten Sportstudenten auch nach einem hochintensiven Intervalltraining über einen Zeitraum von fünf Wochen keine signifikanten Veränderungen bezüglich der MCT4- Dichte feststellen (Bishop et al., 2008). Auch in Bezug auf den MCT4 ist eine ausschließlich cytoplasmatische Veränderung nachweisbar. Vergleichbar zu den Diskussionsansätzen des MCT1 stellt sich die Frage, ob die Analyse eines Bioptates unmittelbar nach der Belastung eine signifikante Änderung darstellen würde. Analog zu dem GLUT4 konnten im Gegensatz zu dem MCT1 schon intrazelluläre Speicherpools für den MCT4 nachgewiesen werden. BONEN et al. nimmt an, dass der MCT4 unter Belastung in die Membran transloziert und so den πΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏ −/π»π»+ -Transport positiv beeinflusst (Bonen et al., 2000a). 107 Diskussion Abb. 48: Darstellung des Laktattransportes im trainierten Zustand; Vergleich untrainierter Zustand Abb. 7, Seite 18 4.3. Auswirkungen der Interventionsmaßnahme auf den MCT1 im Erythrozyten Die Analyse der MCT- Dichte im Erythrozyten in der Ausdauergruppe hat im Vergleich zu der Kontrollgruppe zu zwei Ergebnissen geführt. Zunächst konnte durch die Trainingsintervention eine signifikante basale Zunahme, also eine gesteigerte MCT- Proteinexpression nachgewiesen werden (s. Abb. 48). Des Weiteren zeigten die Ergebnisse eine signifikante trainingsinduzierte Reduktion der MCT1- Dichte unter Belastung sowie einen progressiven signifikanten Anstieg in der Erholungsphase bis eine Stunde nach Ausbelastung. 108 Diskussion Wie schon in der Einleitung beschrieben stellt der MCT1 im Erythrozyten unter körperlicher Belastung mit 89 % den größten Anteil des πΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏπΏ −/π»π»+ - Kotransportes dar (Skelton et al., 1998). In den bisherigen Studien wurden häufig kinetische Aspekte des erythrozytären Laktattransportes untersucht oder die Analyse wie oben beschrieben auf die Muskulatur beschränkt (Patillo et al., 2005; Sara et al., 2006). Lediglich zwei Studien untersuchten bisher den langfristigen Trainingseffekt auf die MCT- Dichte im Erythrozyten. AOI et al. konnte im Rahmen einer Tierstudie an Ratten den signifikanten Anstieg der MCT- Proteinexpression im Erythrozyten in Folge eines dreiwöchigen Schwimmtrainings nachweisen. Als Rückschluss auf den zugrundeliegenden Regulationsmechanismus stellte er heraus, dass die MCT1- Dichte in jungen Erythrozyten höher ist als bei Älteren und verwies somit auf die im Rahmen der Erythropoese stattfindende Proteinexpression (Aoi et al., 2004). CONNES et al. beschrieben in ihrer Studie einen Zusammenhang zwischen dem, unter physiologischen Bedingungen bei Belastung entstehenden, Hormon Erythropoetin (EPO) und der MCT- Proteinexpression. In Folge von vier, im Abstand von sieben Tagen aplizierten, EPO- Injektionen konnte ein signifikanter Anstieg der Laktataufnahmerate in den Erythrozyten nachgewiesen werden (Connes et al., 2004b). In weiteren Studien sollte gezielt auf regulatorische Mechanismen hin untersucht werden, um zu klären, ob die Proteinexpression in den organellenfreien Erythrozyten auf die erythropoetischen Vorläuferzellen oder doch auf die posttranskriptionelle Modifikation zurückzuführen ist. Die zweite der angesprochenen Studien wurde von KREUTZ im Institut für Kreislaufforschung und Sportmedizin der Deutschen Sporthochschule Köln an Typ-2-Diabetespatienten durchgeführt. In Rahmen der Studie konnte ein signifikanter Anstieg der erythrozytären MCT1- Dichte in Folge eines 12wöchigen Krafttrainings dargestellt werden. In der im Rahmen dieser Studie auch durchgeführten Ausdauerinterventionsgruppe blieb ein signifikanter Anstieg der MCT1- Proteinexpression im Erythrozyten aus (Kreutz, 2010). Die ‚Diabetes-Typ-2-Studie 2009‘ konnte erstmals einen signifikanten Anstieg der 109 Diskussion MCT1- Proteinexpression an humanen Erythrozyten in Folge einer Ausdauerinterventionsmaßnahme nachweisen. Im Vergleich zu der von KREUTZ durchgeführten Studie ist insbesondere das Trainingsdesign zu nennen. Das Ausdauertraining wurde an zwei Tagen pro Woche mit einer Intensität von 2 mmol L durchgeführt. Es ist zu vermuten, dass dies, neben einer statistisch heterogenen Gruppe, ein möglicher Erklärungsansatz ist. Die signifikante Steigerung der MCT1- Proteinexpression in der vorliegenden Studie ist die Folge einer Ausdauerintervention, welche mit 75 % der ππππ2 ππππππ eine höhere Intensität und mit 4 Trainingseinheiten pro Woche auch einen doppelt so großen Trainingsumfang aufweist. Als ein weiterer Aspekt könnten neben den Trainings- auch die Ruhetage beschrieben werden. Gemäß der Empfehlung der ADA und DDG sind weniger als zwei konsekutive Tage ohne Trainingseinheit für die langfristige Adaptation empfehlenswert (Sigal et al., 2006; Kemmer et al., 2009). Um einen aussagekräftigen Vergleich schaffen zu können, reicht die internationale Studienlage, aufgrund der geringen Zahl der Publikationen, nicht aus. Bezogen auf die Belastungsintensität und den Umfang können aus der hiesigen Kontrollgruppe, der moderaten Ausdauergruppe von KREUTZ und der stärker belasteten hiesigen Ausdauergruppe erste Rückschlüsse gezogen werden. Insbesondere aber die pathophysiologischen Zusammenhänge werden erst deutlich, wenn vergleichbare gesunde Kontrollstudien durchgeführt werden. Neben der trainingsbedingten basalen Zunahme der MCT1- Proteinexpression, die als langfristige Adaptation betrachtet werden kann, konnte in der Ausdauergruppe, wie oben beschrieben, auch eine kurzfristige Regulation der MCT1- Dichte beobachtet werden. In der trainierten Ausdauergruppe konnte unter Belastung eine progressive signifikante Reduktion der MCT1- Dichte im Erythrozyten nachgewiesen werden, die mit maximaler Belastung den Scheitelpunkt erreichte und in der darauffolgenden 60-minütigen Erholungsphase sukzessive zugunsten des Ausgangsniveaus ansteigt. 110 Diskussion Dieser belastungsbedingte sehr kurzfristige Regulationsmechanismus konnte am Skelettmuskel bereits auch in anderen Studien dargestellt werden. In einer Studie an Ratten konnten COLES et al. bereits nach einer einzelnen moderaten Trainingseinheit auf dem Laufband eine Zunahme der MCT1- Dichte nachweisen (Coles et al., 2004). Auch in humanen Studien konnte ein kurzfristiger Effekt der MCT1- Regulation gezeigt werden. So kam es zwei, vier und sechs Tage nach einer sechsstündigen Trainingseinheit bei 60 % der ππππ2 ππππππππ zu einer signifikanten Zunahme der MCT1- Dichte (Green et al., 2002). Gegensätzlich zu den beschriebenen MCT1- Dichtezunahmen in Folge von moderaten Ausdauerbelastungen beschreiben weitere Studien eine MCT1- Abnahme in Folge von hochintensiver Belastung. Im Tiermodell wurde an Ratten bei einer Laktatkonzentration von 20 mmol L in Folge einer zehnminütigen hochintensiven elektrischen Stimulation eine Abnahme der MCT1- Dichte um zehn Prozent nachgewiesen (Tonouchi et al., 2002). In einer Studie am humanen Skelettmuskel dagegen konnte in Folge einer hoch intensiven Trainingseinheit (HIT) von 45 Sekunden bei 200 % der ππππ2 ππππππππ sogar eine 24 prozentige MCT1- Abnahme nachgewiesen werden (Bishop et al., 2007). Diese Ergebnisse sind mit denen der hiesigen Studie in Einklang zu bringen, da es im Rahmen der Belastungsuntersuchung, welche bis zur subjektiven maximalen Ausbelastung durchgeführt wurde, im trainierten Zustand ebenfalls zu einer signifikanten Abnahme kam. Dieser Regulationsmechanismus könnte analog zu dem GLUT4 auf eine Translokation der Transportproteine hinweisen. In einigen Studien konnte nicht nur der nachhaltige Trainingseffekt eines Ausdauertrainings in Form einer vermehrten Genexpression des GLUT4 nachgewiesen werden (Goodyear et al., 1998; Yu et al., 2001), sondern auch eine kurzfristige insulinabhängige membranständige Translokation (Saltiel et al., 2001). Diese kurzfristige Regulation ist allerdings nicht nur insulinabhängig, sondern auch unabhängig davon durch körperliche Belastung belegt worden (Phillips et al., 1996; Richter et al., 1998; O’Gorman et al., 2006). Anlalog zu dieser bereits am GLUT4 nachgewiesenen belastungsinduzierten Translokation in das Sarkolemm 111 Diskussion ist ebenfalls die Translokation des MCT1 im Erythrozyten vorstellbar. Eine isolierte Analyse der MCT1- Dichte in der erythrozytären Membran lassen die immunhistochemischen Verfahren nicht zu, die optische Dichtereduktion im erythrozytären cytoplasmatischen Raum gibt allerdings Hinweise darauf. Ein vergleichbares Ergebnis, in Bezug auf eine belastungsbedingte signifikante MCT1- Abnahme, konnte in der Studie von KREUTZ ebenfalls dargestellt werden (Kreutz, 2010). Hier konnte in Folge einer Krafttrainingsintervention eine belastungsbedingte erythrozytäre MCT1- Reduktion nachgewiesen werden. Im Rahmen von Untersuchungen am Skelettmuskel konnte BONEN et al. bereits analog zu dem GLUT4 auch für den MCT4 intrazelluläre Vesikel und die belastungsinduzierte Translokation in die Membran darstellen (Bonen et al., 2000a). Für Patienten mit Diabetes Mellitus Typ-2 konnte gezeigt werden, dass das Ausdauertraining eine Zunahme der MCT1- Proteinexpression begünstigt. Diese führt in Kombination mit einer optimierten belastungsbedingten Reaktion zu einem erhöhten Stoffwechsel in Bezug auf den Laktattransport (s. Abb. 48, Seite 108). So kann einerseits eine erhöhte Leistung erbracht bzw. diese über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten und andererseits die Regenerationszeiten zwischen körperlichen Belastungen verkürzt werden. Obwohl die Ergebnisse sehr eindeutig sind und so ohne jeden Zweifel die Stoffwechsellage der Diabetespatienten optimiert werden konnte, bedarf es weiterer Ergebnisse aus der Grundlagenforschung um hier intrazelluläre Signalwege und Regulationsmechanismen wie beispielsweise die Translokation des MCT1 in die Erythrozytenmembran expliziter herauszuarbeiten. 112 Diskussion 4.4. Auswirkungen der Interventionsmaßnahme auf die CD147- Dichte im Skelettmuskel und im Erythrozyten Auswirkungen am Skelettmuskel Im Rahmen der immunhistochemischen Analyse des CD147- Proteins am Skelettmuskel konnte nachgewiesen werden, dass die cytoplasmatische Dichte in der Kontrollgruppe zunahm, während diese durch das Ausdauerinterventionsprogramm tendenziell abnahm. Im Gegensatz dazu zeigte sich bezogen auf die membranöse Proteindichte in der Kontrollgruppe eine signifikante Abnahme, die in Folge des Ausdauertrainings nicht erkennbar war. Das Protein CD147 wird in der Literatur als Chaperon für den MCT1 und MCT4 diskutiert. So führte die kontroverse Literaturlage zu der These, dass durch eine Ausdauertrainingsintervention nicht nur eine vermehrte MCT-, sondern auch CD147- Expression erzielt und somit der Stoffwechsel positiv beeinflusst werden kann. In einigen Studien konnte sowohl im Herz- und Skelettmuskel als auch im Gewebe von Retina, Leber und Niere eine Kolokalisation von CD147 und MCT1 nachgewiesen werden (Deora et al., 2005; Nakai et al., 2006). Allerdings konnte in der Untersuchung von NAKAI et al. auch dargestellt werden, dass in CD147KO- Mäusen die Lokalisation, nicht aber die gesamte Proteinmenge von MCT1 beeinflusst wird (Nakai et al., 2006). Dies lässt den Schluss zu, dass das Membranprotein CD147 möglicherweise als Chaperon für eine mögliche Konformationsänderung und anschließende Translokation obligat ist, nicht aber an dessen Proteinexpression beteiligt ist. Neben einigen wenigen Studien, in denen eine physiologische Kolokalisation und die essentielle Abhängigkeit in Bezug auf die katalytische Aktivität von MCT- und CD147- Proteinen beschrieben wird (Kirk et al., 2000; Wilson et al., 2002; Wilson et al., 2005; Mykkänen et al., 2010), ist ein funktioneller Zusammenhang dieser Proteine vor allem für pathologisch veränderte Gewebe beschrieben (Pinheiro et al., 2009a; Pinheiro et al., 2009b). So konnte bereits in 113 Diskussion einigen Studien nachgewiesen werden, dass insbesondere ein pathologischer Reiz, beispielsweise in Form einer Hypoxie, bei tumorös veränderten Geweben, zu einer vermehrten CD147- Expression führte (Gallagher et al., 2007; Baba et al., 2008; Su et al., 2009; Pinheiro et al., 2010; Kennedy et al., 2010). Die hypoxisch arbeitenden Tumorzellen nutzen im Rahmen der Energiebereitstellung Substrate, die insbesondere durch den MCT transportiert werden. So führt diese glykolytische Situation in den Tumorzellen zu einer vermehrten MCT-, CD147- und auch Matrix Metalloproteasen- Expression, um so die Migration und die Angiogenese zu steigern (Gallagher et al., 2009). In weiteren Studien konnte ein gewebespezifisches polarisiertes Verteilungsmuster in Bezug auf die Kolokalisation von MCT1, MCT4 und CD147 nachgewiesen werden. So konnte KIRK et al. eine erhöhte Proteinkonzentration an den T-Tubuli und den Z- Scheiben von Herzmuskelzellen nachweisen (Kirk et al., 2000). Bei Untersuchungen an der humanen Plazenta konnte SETTLE et al. einen signifikanten Unterschied der lokalisierten MCT1-/ CD147- und MCT4-/ CD147- Proteine in Bezug auf das Verteilungsmuster an der maternalen und fetalen Seite nachweisen (Settle et al., 2004). Ebenso konnte an retinalem Epithel ein differenziertes Verteilungsmuster nachgewiesen werden. Während der MCT1-/ CD147- Komplex vermehrt an der apikalen Seite lokalisiert ist, konnte basolateral eine vermehrte Lokalisation des MCT3-/ CD147- Komplexes nachgewiesen werden (Philp et al., 2003b). Im Einklang mit der aktuellen Studienlage kann vermutet werden, dass CD147 als Chaperon für die Lokalisation des MCT eine entscheidende Rolle einnimmt. In Bezug auf die Expression ist dieses hingegen differenzierter zu betrachten. Die trainingsbedingte Zunahme der MCT- Expression ist vergleichbar mit der metabolisch bedingten Zunahme der MCT- Dichte in Tumorzellen. Der entscheidende Unterschied, welcher Hinweis auf einen pathologischen Stoffwechsel ist, könnte hier allerdings die Expression des CD147 sein. Auch eine sportliche Intervention könnte eine vermehrte Angiogenese begünstigen, 114 Diskussion die allerdings nicht auf eine Zunahme der CD147- Dichte zurückzuführen wäre. Dieser Zusammenhang muss in weiterführenden Studien genauer untersucht werden. Durch die vermehrte Expression von CD147 ist die Migration sowie die Induktion der Angiogenese von Tumorzellen und folglich eine Metastasierung möglich. In Folge der Ausdauerintervention konnte die CD147- Dichte konstant gehalten werden, während diese in der Kontrollgruppe signifikant anstieg. In weiteren Untersuchungen wären Hinweise auf eine vermehrte CD147Expression bei Diabetespatienten im fortgeschrittenen Stadium oder mit schlecht eingestellter glykämischen Stoffwechsellage zu suchen. Wie auch bei Tumorerkrankungen könnte dies ein ungünstiger Prognosefaktor sein. Des Weiteren könnte die Theorie aufgestellt werden, dass eine mögliche vermehrte CD147-Proteinexpression besonders bei den in der Skelettmuskulatur vorhandenen Kapillaren Stoffwechsel zu lokalisiert ist, um so einen lokalen hypoxischen kompensieren. Dies gilt es ebenfalls in weiteren Untersuchungen zu hinterfragen. Auswirkungen am Erythrozyten Die Dichteveränderungen des transmembranären CD147- Proteins am Erythrozyten wurde mittels eines durchflusszytometrischen Analyseverfahrens ausgewertet. Es konnte weder in der Kontroll- noch in der Ausdauergruppe in Bezug auf den Einfluss der Trainingsintervention und der Belastungsuntersuchung eine signifikante Veränderung festgestellt werden. In der Ausdauergruppe ist in Folge der Trainingsintervention allerdings eine tendenzielle Abnahme der CD147- Dichte in den Basalwerten zu erkennen. Die kontrovers diskutierte Rolle des CD147 als Chaperon des MCT1 wurde in Bezug auf die Skelettmuskulatur bereits beschrieben. Während der Zusammenhang von CD147 und MCT in einigen Studien am Muskel und insbesondere an Tumoren beschrieben und publiziert wurden, ist die 115 Diskussion Studienlage für einen möglichen gemeinsamen Regulationsprozess im Erythrozyten sehr wenig untersucht worden. Aber auch am Erythrozyten konnte dargelegt werden, dass die CD147Konzentration mit der Laktattransportaktivität und somit auch mit dem MCT1 korreliert. In einer Studie an Pferden konnte nachgewiesen werden, dass die CD147- Dichte im Muskel mit der im Erythrozyten korrelierte und dass Erythrozyten mit einer erhöhten Laktattransportaktivität ebenfalls eine erhöhte CD147- Dichte aufwiesen (Koho et al., 2002; Koho et al., 2006). Diese Ergebnisse sind nicht mit denen dieser Studie in Einklang zu bringen und könnten auf eine speziesabhängige Regulation hinweisen. Der veränderte Metabolismus in Folge von Sport ist vermutlich, insbesondere auf Grund der unterschiedlichen Belastungssituationen bei Rennpferden und Diabetes Typ-2- Patienten, nicht zu vergleichen. Nachgewiesen wurde bei den ausdauertrainierenden Diabetespatienten, dass die Interventionsmaßnahme zu einer trainingsbedingten Adaptation der MCT1Expression und einer belastungsinduzierten Veränderung führte. Diese basale Proteinzunahme muss nicht mit einer vermehrten CD147- Expression einhergehen (Nakai et al., 2006). In Folge der belastungsbedingten metabolischen Änderung adaptieren Transportprozesse, wie beispielsweise der Kotransport von Laktat und π»π»+ durch den MCT. Sofern die Funktion von CD147 allerdings mit einer vermehrten Angiogenese und der Expression von Matrix Metalloproteasen einhergeht, stellt sich die Frage, weshalb dieser Adaptationsprozess in Folge vermehrter körperlicher Aktivität eintreten sollte (Gallagher et al., 2009). 116 Zusammenfassung Zusammenfassung Insbesondere unter Belastung stellen die Monocarboxylat- Transporter (MCT) einen essentiellen Bestandteil für den Transport von Laktat sowie die pHHomöostase dar. Die gegenwärtige Literatur beschreibt nur in wenigen Untersuchungen die Zusammenhänge Stoffwechselveränderungen und Laktattransporters. vorliegende Die Regulationsmechanismen und den deren zwischen pathologischen Regulationsmechanismen Studie untersuchte Beeinflussung in Folge des diese eines dreimonatigen Ausdauerinterventionsprogrammes im Vergleich zu einer Kontrollgruppe an männlichen nicht- insulinpflichtigen Diabetes- Typ 2Patienten im Alter von über 30 Jahren (n=43, Alter: 59,7 ±9,9 Jahre, kg BMI: 31,8 ±4,0 der m2 ). Das Ziel der Studie bestand einerseits in der Untersuchung langfristigen, trainingsbedingten Proteinexpression des MCT1 im Erythrozyten und des MCT1- und 4- Proteins in der Skelettmuskulatur. Andererseits wurden ebenfalls die kurzfristigen, belastungsbedingten Regulationsmechanismen dieser Transportproteine in der Skelettmuskulatur und dem Erythrozyten untersucht. Neben dem MCT als Transportprotein lag das Augenmerk der Untersuchungen auch auf dem Protein CD147, welches in der aktuellen Literatur als ein evtl. für den MCT obligates Chaperon beschrieben wird. Im Vergleich zu der Kontrollgruppe, welche lediglich ein belastungsunspezifisches Bewegungsprogramm absolvierte, konnten neben einer signifikant gesteigerten Leistungsfähigkeit auch Veränderungen in der MCT- Dichte nachgewiesen werden. Die MCT1- Proteinexpression in den Erythrozyten nahm in Folge des Ausdauertrainings signifikant zu. Des Weiteren zeigte sich im trainierten Zustand eine signifikante Reduktion der MCT1- Dichte unter Belastung, welches für eine mögliche Translokation des Proteins in die Membran spricht. 117 Zusammenfassung In Bezug auf die MCT1- und MCT4- Dichte in der Skelettmuskulatur wurde im Rahmen der Auswertung der immunhistochemischen Analyse zwischen membranöser und cytoplasmatischer Dichte differenziert. Über den Zeitraum der dreimonatigen Ausdauerintervention konnte bei den Diabetespatienten eine signifikante trainingsbedingte Zunahme der cytoplasmatischen MCT1Proteinexpression nachgewiesen werden. Indes nahm die cytoplasmatische MCT4- Dichte signifikant ab. Die membranöse MCT1- und MCT4- Dichte zeigte keine signifikante Veränderung. In Rahmen der Muskelfasertypisierung konnte nach den insgesamt zwölf Wochen eine signifikante Zunahme der Typ-I Muskelfasern und eine analoge Abnahme der Typ-II Muskelfasern nachgewiesen werden. In Folge des für den MCT vorliegenden gewebespezifischen Verteilungsmusters und der Zunahme der oxidativ arbeitenden Typ-I Muskelfasern ist die cytoplasmatische Zunahme durch das vorrangig in diesen Fasern exprimierte MCT1- Protein zu erklären. Die CD147- Dichte erfuhr in Folge des Ausdauertrainings keine signifikanten Änderungen. In der Kontrollgruppe zeigte sich hingegen eine signifikante Zunahme dieses häufig in pathophysiologischen Zusammenhängen beschriebenen Proteins. Dieses könnte als ungünstiger Prognosefaktor gewertet werden. Die körperliche Aktivität nimmt in der diabetischen Sporttherapie einen hohen Stellenwert ein. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Ausdauertraining in der Primär- und Sekundärprävention die diabetische Stoffwechsellage positiv beeinflusst. In der vorliegenden Diabetes-Typ-2-Studie konnten diese Daten bestätigt und eine progressive Verbesserung des Laktattransportes nachgewiesen werden. Weitere Forschungsarbeit ist erforderlich, um zelluläre und molekulare Auswirkungen einer Sporttherapie auf die pathologische diabetische 118 Zusammenfassung Stoffwechsellage aufzuklären. Die optimal auf den Patienten abgestimmte Sporttherapie stellt eine Möglichkeit dar, die steigenden Patientenzahlen mit der Erkrankung ‚Diabetes Mellitus Typ 2‘ zu reduzieren und so das Gesundheitssystem kostengünstig und nachhaltig zu entlasten. 119 Abstract Abstract On exertion in particular, monocarboxylate transporters (MCT) constitute an essential element for the transport of lactate and of pH-homoeostasis. Based on a several researches, current literature only describes the interrelations between pathological changes of metabolism and the regulatory mechanism of the lactate transporter. The present study investigates these regulatory mechanisms and their influence as a result of a three-month endurance intervention unit in comparison to a control group of male non-insulin dependent diabetes mellitus patients aged over 30 years ( n=43, Age: 59,7 ±9,9 years, BMI: 31,8 ±4,0 kgm²). On the one hand, the study aims at examining the protein expression of MCT1 in the erythrocytes as well as of protein MCT1 and MCT4 in the skeletal muscles effected by training in the long term. On the other hand, the regulatory mechanisms of these transport proteins in the skeletal muscles and in the erythrocytes effected by stress in the short-term were investigated, too. Furthermore, in addition to MCT as transport protein the attention of the study was turned to the CD147 protein which in current literature is described as being a potentially obligatory chaperone to MCT. In comparison to the control group which was merely completing a non-specific stress exercise unit, changes in MCT density in addition to a significantly increased capacity could be detected. The protein expression of MCT1 in the erythrocytes was evidently increasing as a result of endurance training. Besides, in a trained state a significant reduction of the MCT1 density was recognised on exertion which argues for a possible translocation of the protein into the membrane. 120 Abstract With regard to the density of MCT1 and MCT4 in the skeletal muscles a distinction was made between membranous and cytoplasmic density in the context of the immunhistochemic analysis. Over the three- month period of this endurance intervention unit a significant increase of cytoplasmic MCT1 protein expression effected by training could be verified in the case of the diabetes patients. The membranous MCT1 and MCT4 density did not prove to be object of significant change here. In the context of the standardisation of muscle fibres a significant increase of slow oxidative type I fibres as well as an analogue decrease of fast oxidativ glycolytic type II fibres could be identified after twelve weeks. The cytoplasmic increase through the MCT1 protein preferentially expressed in these fibres can be explanied as a consequence of tissue specific distribution patterns and the increase of slow oxidative fibres. The CD147 density did not chance significantly as a result of endurance training. Within the control group, however, a significant increase of this protein, often referred to in pathophysiological context, was identified which could be evaluated as being an unfavourable factor of prognosis. Physical activity is of great importance in diabetic sports therapy. Several researches have shown that endurance training in primary and secondary prevention positively influences diabetic metabolism. This could be confirmed in the present diabetes mellitus study. Further research work is required in order to clarify cellular and molecular impacts of sports therapy on the pathological diabetic metabolic condition. This constitutes the basis of sports therapy, which is accompanied by sports science, and results in a form of therapy that, in the long term, disburdens the health system cost-efficiently and sustainably. 121 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abb. 1: chemische Strukturformel des Moleküls Laktat Abb. 2: LDH- Reaktion Abb. 3: Strukturelle Darstellung der Laktat Dehydrogenase Reaktion. Nach ROBERGS und AMANN Abb. 4: Mechanismus der einfachen Diffusion Abb. 5: Darstellung des MCT1 nach HALESTRAP und PRICE Abb. 6: Darstellung pH- Regulation Abb. 7: Darstellung des Laktattransportes im untrainierten Zustand; Vergleich trainierter Zustand Abb. 48 Abb. 8: graphische Darstellung des Studienablaufs Abb. 9: Darstellung der Spiroergometrie Abb. 10: Mikroskopische Darstellung (400-fache Vergrößerung) der Erythrozyten der immunhistochemischen Kontrolle im Vergleich zu Abb.11 Abb. 11: Mikroskopische Darstellung (400-fache Vergrößerung) der Erythrozyten der immunhistochemischen Färbung im Vergleich zu Abb. 10 Abb. 12: Darstellung der immunhistochemischen Bearbeitung der Muskelfasern Abb. 13: Mikroskopische Darstellung (200-fache Vergrößerung) der Muskelfasern der immunhistochemischen Kontrolle im Vergleich zu Abb. 14 Abb. 14: Mikroskopische Darstellung (200-fache Vergrößerung) der Muskelfasern der immunhistochemischen Färbung im Vergleich zu Abb. 13 XIV Abbildungsverzeichnis Abb. 15: Mikroskopische Darstellung (200-fache Vergrößerung) der immunhistochemisch bearbeiteten Muskelfasern ohne Artefaktentfernung Abb. 16: Mikroskopische Darstellung (200-fache Vergrößerung) der Muskelfasern nach Entfernung der Artefakte Abb. 17: Mikroskopische Darstellung (200-fache Vergrößerung) der Muskelfasern mit dem Grenzwert 175 DU Abb. 18: Mikroskopische Darstellung (200-fache Vergrößerung) der Muskelfasern mit dem Grenzwert 245 DU Abb. 19: Mikroskopische Darstellung (100-fache Vergrößerung) der Muskelfasertypisierung – Typ I- Faser angefärbt Abb. 20: Darstellung der FACS- Analyse Abb. 21: Patienten der Ausdauergruppe während der Trainingsphase Abb. 22: Graphische Darstellung des Body-Mass-Index (BMI) im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe Abb. 23: Graphische Darstellung des Nüchternblutzuckers im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe Abb. 24: Graphische Darstellung der maximalen Leistung im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe Abb. 25: Graphische Darstellung der kardialen Ausbelastung im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe Abb. 26: Graphische Darstellung der Muskelfasertypisierung der Kontrollgruppe im Vergleich zu Abb.27 Abb. 27: Graphische Darstellung der Muskelfasertypisierung der Ausdauergruppe im Vergleich zu Abb. 26 Abb. 28: Graphische Darstellung der cytoplasmatischen MCT1Dichte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe XV Abbildungsverzeichnis Abb. 29: Graphische Darstellung der cytoplasmatischen MCT4DIchte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe Abb. 30: Graphische Darstellung der absoluten membranösen MCT1- Dichte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe Abb. 31: Graphische Darstellung der absoluten membranösen MCT4- Dichte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe Abb. 32: Graphische Darstellung der relativen membranösen MCT1- Dichte im Vergleich Kontrollgruppe und Ausdauergruppe Abb. 33: Graphische Darstellung der relativen membranösen MCT4- Dichte im Vergleich Kontrollgruppe und Ausdauergruppe Abb. 34: Graphische Darstellung der cytoplasmatischen CD147Dichte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe Abb. 35: Graphische Darstellung der absoluten membranösen MCT4- Dichte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe Abb. 36: Graphische Darstellung der relativen membranösen CD147- Dichte im Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe Abb. 37: Graphische Darstellung Proteinexpression im der basalen Erythrozyten im MCT1Vergleich: Kontrollgruppe und Ausdauergruppe Abb. 38: Mikroskopische Darstellung des MCT1 (400-fache Vergrößerung) in den Erythrozyten im untrainierten Zustand vor (links) und nach (rechts) Belastung XVI Abbildungsverzeichnis Abb. 39: Mikroskopische Darstellung des MCT1 (400-fache Vergrößerung) in den Erythrozyten im untrainierten Zustand vor (links) und nach (rechts) Belastung Abb. 40: Graphische Darstellung der MCT1- Dichte der Kontrollgruppe im Erythrozyten unter Belastung im Vergleich zu Abb. 42 Abb. 41: Graphische Darstellung der MCT1- Dichte der Kontrollgruppe in der Erholungsphase im Vergleich zu Abb. 43 Abb. 42: Graphische Darstellung der MCT1- Dichte der Ausdauergruppe unter Belastung im Vergleich zu Abb. 40 Abb. 43: Graphische Darstellung der MCT1- Dichte der Ausdauergruppe in der Erholungsphase im Vergleich zu Abb. 41 Abb. 44: Graphische Darstellung der CD147- Dichte der Kontrollgruppe im Erythrozyten unter Belastung im Vergleich zu Abb. 46 Abb. 45: Graphische Darstellung der CD147- Dichte der Kontrollgruppe in der Erholungsphase im Vergleich zu Abb. 47 Abb. 46: Graphische Darstellung der CD147- Dichte der Ausdauergruppe unter Belastung im Vergleich zu Abb. 44 Abb. 47: Graphische Darstellung der CD147- Dichte der Ausdauergruppe in der Erholungsphase im Vergleich zu Abb. 45 Abb. 48: Abb. 48: Darstellung des Laktattransportes im trainierten Zustand; Vergleich untrainierter Zustand Abb. 7 XVII Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tab. 1: Diagnostische Kriterien des Diabetes Mellitus Tab. 2: tabellarische Darstellung der erhobenen Parameter Tab. 3: tabellarische Darstellung der anthropometrischen Parameter im Gruppenvergleich Tab. 4: Belastungsskala modifiziert nach der Borg- Skala Tab. 5: Tabellarische Darstellung der Geräteparameter Tab. 6: Tabellarische Darstellung der Parameter im Vergleich Kontroll- und Ausdauergruppe XVIII Literaturverzeichnis Literaturverzeichnis Alberti, K.G. 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Sig. p-Wert Woche Woche Woche Gesamtkollektiv Gruppenvergleich 58.6 ±10.6 58.6 ±10.6 58.6 ±10.6 - 60.7 ±9.1 60.7 ±9.1 60.7 ±9.1 - - - 173.3 ±8.0 173.4 ±7.8 173.4 ±8.0 - 178.7 ±7.1 178.7 ±7.0 178.8 ±6.9 - - - 98.0 ±15.7 97.3 ±15.4 97.1 ±15.7 n. s. 99.9 ±14.0 99.7 ±14.1 97.3 ±14.4 - 32.6 ±4.6 32.3 ±4.5 32.3 ±4.5 n. s. 31.2 ±3.5 31.2 ±3.5 30.4 ±3.6 - 187.9 ±35.8 187.6 ±34.1 191.5 ±30.1 n. s. 186.9 ±32.6 189.6 ±30.7 191.3 ±39.5 0.Wo. vs. 6.Wo.: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 0.Wo. vs. 6.Wo.: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 n. s. - n. s. 192.1 ±99.3 192.9 ±138.5 181.9 ±94.9 n. s. 167.9 ±70.0 195.5 ±109.4 152.0 ±78.2 n. s. - n. s. 43.2 ±11.7 41.9 ±13.6 45.7 ±14.3 0.Wo. vs. 6.Wo.: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: n. s. 43.5 ±11.6 41.9 ±9.6 40.3 ±10.3 0.Wo. vs. 6.Wo.: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo.: 0.05 0.Wo. vs. 12.Wo.: 0.01 - ≤0.01 103.6 ±24.5 106.7 ±25.1 110.1 ±25.7 - 108.3 ±25.3 107.7 ±27.8 120.8 ±33.2 - 0.Wo. vs. 6.Wo.: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo.: 0.02 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 n. s. 153.1 ±39.4 149.3 ±43.4 158.3 ±52.1 n. s. 161.6 ±38.1 143.0 ±38.3 135.6 ±27.3 0.Wo. vs. 6.Wo.: ≤0.01 6.Wo. vs. 12.Wo.: n. s. 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 - ≤0.01 6.5 ±1.0 6.5 ±0.9 6.8 ±0.9 7.0 ±0.9 6.9 ±1.0 6.8 ±0.8 n. s. - ≤0.01 0.Wo. vs. 6.Wo.: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: 0.01 ≤0.01 ≤0.01 Anhang π€π€π€π€ Kontrollgruppe 0. 6. 12. Sig. p-Wert Woche Woche Woche XLV 136.9 ±20.3 132.5 ±19.7 127.6 ±14.5 - 130.0 ±17.6 122.4 ±18.5 123.3 ±15.0 - 92.8 ±15.2 85.7 ±15.3 83.8 ±12.0 - 87.1 ±13.9 83.5 ±12.9 84.7 ±12.3 - Max. sBP [mmHg] Max. dBP [mmHg] Ruhe HR 215.7 ±22.7 218.5 ±20.7 217.2 ±23.3 n. s. 213.0 ±20.0 208.4 ±26.9 211.6 ±28.2 n. s. 0.Wo. vs. 6.Wo.: 0.05 6.Wo. vs. 12.Wo.: n. s. 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 0.Wo. vs. 6.Wo.: 0.04 6.Wo. vs. 12.Wo.: n. s. 0.Wo. vs. 12.Wo.: 0.02 - 95.1 ±14.0 89.6 ±18.1 92.1 ±13.5 n. s. 94.6 ±13.8 90.8 ±17.5 89.7 ±13.2 n. s. - 86.8 ±15.8 81.8 ±14.1 80.9 ±16.3 81.1 ±15.2 77.8 ±12.7 67.7 ±13.2 π¦π¦π¦π¦π¦π¦. 147.1 ±21.9 141.6 ±26.8 145.9 ±18.4 135.6 ±19.5 133.5 ±18.8 139.6 ±20.5 n. s. π¦π¦π¦π¦π¦π¦. 134.2 ±35.6 135.5 ±36.6 143.4 ±48.5 n. s. 142.1 ±28.9 160.5 ±33.7 173.7 ±35.8 1.2 ±0.4 1.3 ±0.4 1.2 ±0.4 n. s. 1.5 ±0.6 1.5 ±0.4 1.6 ±0.7 Max. Laktat π¦π¦π¦π¦π¦π¦π¦π¦ [ ] 4.4 ±1.6 4.5 ±1.8 4.9 ±2.1 5.1 ±1.8 5.5 ±1.9 6.2 ±1.9 72.9 ±29.8 77.3 ±36.1 85.3 ±32.1 - 72.7 ±34.4 87.1 ±36.3 75.5 ±48.9 - 4 mmol [Watt] 131.3 ±38.3 140.5 ±43.6 134.1 ±28.3 n. s. 130.8 ±36.0 138.0 ±36.1 136.0 ±40.4 n. s. Ruhe dBP [mmHg] [ ππ ] Max. HR [ ππ ] Max. Leistung [Watt] Ruhe Laktat π¦π¦π¦π¦π¦π¦π¦π¦ [ ππ ] ππ 2 mmol [Watt] n. s. - n. s. n. s. n. s. n. s. 0.Wo. vs. 6.Wo.: 0.02 6.Wo. vs. 12.Wo.: n. s. 0.Wo. vs. 12.Wo.: 0.01 - n. s. 0.Wo. vs. 6.Wo.: 0.05 6.Wo. vs. 12.Wo.: 0.04 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 - 0.03 n. s. - n. s. - - 0.Wo. vs. 6.Wo.: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo.: n. s. 0.Wo. vs. 12.Wo.: 0.01 0.Wo. vs. 6.Wo.: 0.01 6.Wo. vs. 12.Wo.: n. s. 0.Wo. vs. 12.Wo.: 0.02 - n. s. n. s. n. s. n. s. Anhang Ruhe sBP [mmHg] XLVI 72.29 ±21.32 75.42 ±20.73 79.26 ±20.34 44.5 ±12.1 42.5 ±9.3 46.2 ±7.7 55.5 ±12.1 57.5 ±9.3 53.8 ±7.7 55.96 ±8.24 60.04 ±10.39 57.96 ±7.52 55.91 ±8.15 58.40 ±7.90 59.30 ±8.26 0.00 2.35 ±19.98 7.07 ±19.87 42.65 ±0.64 43.08 ±0.80 43.82 ±1.26 - +0.16 ±0.24 -0.23 ±0.32 n. s. 73.60 ±17.90 84.40 ±19.50 96.20 ±23.00 0.Wo. vs. 6.Wo.: ≤0.01 6.Wo. vs. 12.Wo.: 0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 n. s. 42.4 ±10.4 49.3 ±9.8 55.8 ±9.3 0.Wo. vs. 6.Wo.: ≤0.01 6.Wo. vs. 12.Wo.: 0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 - 0.03 n. s. 57.6 ±10.4 50.7 ±9.8 44.2 ±9.3 0.Wo. vs. 6.Wo.: ≤0.01 6.Wo. vs. 12.Wo.: 0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 - 0.03 n. s. 59.70 ±8.68 58.86 ±6.85 60.99 ±8.45 n. s. - n. s. n. s. 60.38 ±7.94 62.70 ±7.95 62.61 ±5.63 n. s. - n. s. 0.00 53.44 ±7.01 92.65 ±9.55 0.Wo. vs. 6.Wo.: ≤0.01 6.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 - ≤0.01 n. s. 43.81 ±0.97 43.44 ±0.97 43.63 ±1.72 n. s. - n. s. n. s. - -0.47 ±0.53 -0.20 ±0.30 n. s. - n. s. n. s. - ≤0.01 Anhang Kard. Ausbelastung [%] Muskelfasertyp I [%] Muskelfasertyp II [%] Muskelfaserquerschnitt TypI [µm] Muskelfaserquerschnitt TypII [µm] MCT1Cytoplasma [Δ%] MCT1-abs. mem. [DU] MCT1-rel. mem. [ΔDU] XLVII 0.00 +10.37 ±13.40 +10.23 ±14.90 0.00 -14.62 ±5.2 -41.35 ±1.79 0.Wo. vs. 6.Wo.: ≤0.01 6.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 - ≤0.01 43.71 ±1.04 43.16 ±1.24 42.97 ±1.19 n. s. 43.26 ±1.09 43.17 ±1.13 43.02 ±1.24 n. s. - n. s. - -0.19 ±0.37 +0.17 ±0.30 n. s. - -0.37 ±0.62 -0.14 ±0.71 n. s. - n. s. 0.00 +16.28 ±57.93 +77.09 ±64.24 0.Wo. vs. 6.Wo.: n. s. 6.Wo. vs. 12.Wo: 0.03 0.Wo. vs. 12.Wo.: 0.01 0.00 -23.95 ±68.64 -30.57 ±84.11 n. s. - 0.01 44.68 ±1.70 44.50 ±1.57 43.96 ±1.90 0.Wo. vs. 6.Wo.: ≤0.01 6.Wo. vs. 12.Wo.: n. s. 0.Wo. vs. 12.Wo.: ≤0.01 45.15 ±1.62 45.03 ±1.41 44.77 ±1.70 n. s. - ≤0.01 - +0.001 ±0.005 -0.0005 ±0.003 n. s. - -0.0019 ±0.003 -0.0021 ±0.003 n. s. - n. s. n. s. Anhang MCT4Cytoplasma [Δ%] MCT4- abs. mem. [DU] MCT4-rel. mem. [ΔDU] CD147Cytoplasma [Δ%] CD147- abs. mem. [DU] CD147-rel. mem. [ΔDU] XLVIII MCT1 im Erythrozyten In der Belastungsphase 0 Watt 0. Woche 4.84 ±2.2 7.22 ±5.66 5.72 ±2.00 7.22 ±5.26 7.68 ±5.37 4.22 ±3.17 6. Woche 12. Woche 8.17 ±4.38 5.73 ±2.14 5.53 ±4.55 Sig. p-Wert 0 Watt Ausdauergruppe 50 100 1‘ n. Watt Watt Bel. n. s. 6.64 ±3.64 11.54 ±2.64 12.43 ±2.92 6.08 ±3.53 8.67 ±2.62 7.73 ±2.31 1‘ n. Bel. Ausdauergruppe 30‘ n. 60‘ n. Sig. p-Wert Bel. Bel. 5.65 ±2.86 4.41 ±2.14 3.04 ±1.71 6.68 ±2.40 6.42 ±1.93 7.02 ±2.91 6.45 ±3.09 6.73 ±3.24 4.23 ±1.52 n. s. n. s. 5.41 ±2.82 6.30 ±2.59 5.09 ±2.14 5.65 ±2.86 4.41 ±2.14 3.04 ±1.71 Sig. p-Wert Gesamt-kollektiv n. s. - 0.05 - p≤0.01 - Gruppenvergleich p≤0.01 Anhang Zeitpunkt Kontrollgruppe 50 100 1‘ n. Watt Watt Bel. In der Erholungsphase Zeitpunkt 0. Woche 6. Woche 12. Woche 1‘ n. Bel. 30‘ n. Bel. 6.45 ±3.09 6.73 ±3.24 4.23 ±1.52 5.68 ±6.91 2.74 ±2.87 4.13 ±2.67 Kontrollgruppe 60‘ n. Sig. p-Wert Bel. 6.20 ±2.15 6.23 ±2.05 5.52 ±1.55 n. s. n. s. n. s. 7.98 ±2.61 8.32 ±2.15 8.29 ±2.98 Gesamtkollektiv n. s. - 0.03 - p≤0.01 - Gruppenvergleich p≤0.01 XLIX Anhang Lebenslauf Persönliche Daten Name David Opitz Anschrift Ringenstraße 3 51076 Köln Tel: 0221/ 26062533 Fax: 0221/ 26064532 Mobil: 0160/ 7233634 E-Mail: [email protected] Geburtsdatum und -ort 10.04.1984 in Hannover Familienstand ledig Konfession evangelisch Schulische Ausbildung Aug. 1990 – Juli 1994 Grundschule Am Kalkhügel in Osnabrück Aug. 1994 – Juli 1996 Orientierungsstufe Am Kalkhügel in Osnabrück Aug. 1996 – Juli 1997 Graf- Staufenberg Gymnasium in Osnabrück Aug. 1997 – Juni 2002 Tilesius Gymnasium in Mühlhausen/ Thür., Abschluss: Abitur L Anhang Grundwehdienst/ Zivildienst Aug. 2002 – Mai 2003 Zivildienst in der Förderschule für geistig behinderte Menschen in Mühlhausen/ Thür. Hochschulausbildung Okt. 2004 – Juli 2008 Deutsche Sporthochschule in Köln Abschluss: Diplom Sportwissenschaft Okt. 2009 – voraus. 2015 Universität Düsseldorf Abschluss: Staatsexamen der Humanmedizin seit Mai 2007 Deutsche Sporthochschule in Köln Institut für Kreislaufforschung und Sportmedizin Abschluss: Dr. Sportwiss. – Fachbereich Sportmedizin Arbeitserfahrung Nov. 1998 – Mai 2003 Mühlhäuser Basketballverein e.V. Basketballtrainer und Leiter der Abteilung für Leistungssport Juni 2003 – Aug. 2003 Fa. Kromschröder GmbH in Osnabrück, Aufgabenbereich: Produktion Sept. 2003 - Sept. 2004 Fa. Bünte Anhängerbauteile in Osnabrück, Aufgabenbereich: Kraftfahrer Nov. 2004 – Jan. 2007 SG BP Köln- Worringen Basketballball und Leiter der Jugendabteilung LI Anhang Aug. 2006 - andauernd Fa. Deutsche Unfallhilfe DUH GmbH Bochum Aufgabenbereich: Ausbilder im Bereich der Notfallmedizin bei Lebensrettenden Sofortmaßnahmen und Betriebsersthelferausbildungen Okt. 2006 - andauernd SC Janus Basketballtrainer Sept. 2006 - andauernd IN VIA Katholische Mädchensozialarbeit Köln e.V Leiter verschiedener Angebote in z. Zt. 4 Grundschulen und einer Förderschule Sport- und Erlebnispädagogische Angebote Deeskalations- und Teambuildingtraining Projektleitung im Rahmen von Ferienbetreuungen Sprachkenntnisse Englisch Latein LII Anhang Projekte • • • • Ü50 Studie; nichtdiabetische Männer ab 50 Jahre Diabetes Aktiv Studie; männl. Nichtinsulinpflichtige Typ-2 Diabetiker Diabetes Hypoxiestudie; männl. Nichtinsulinpflichte Typ-2 Diabetiker unter normobarer Hypoxie Diabetes-Typ-2-Studie-2009; männl. Nichtinsulinpflichtige Typ-2 Diabetiker Kongressteilnahmen 27.09. – 29.09.2007 40. Deutscher Sportärztekongress der DGSP in Köln 07.11. – 08.11. 2008 Therapie- Monitoring mit beildgebenden Verfahren in Köln 22.03. – 25.03.2009 88. Annual Meeting of the German Physiological Society in Giessen 20.05. – 23.05.2009 44. Jahrestagung Deutsche DiabetesGesellschaft in Leipzig 24.09. – 26.09.2009 41. Deutscher Sportärztekongress der DGSP in Ulm LIII