In-vitro-Methoden in der Allergie-Diagnostik
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Allergien In-vitro-Methoden in der Allergie-Diagnostik rning.de cme.medlea MkteE CPun sammeln Zusammenfassung Rudolf Gruber Humanwissenschaftliches Zentrum der Ludwig-Maximilians-Universität München und synlab Medizinisches Versorgungszentrum Nürnberg 6 Allergien, einschließlich Nahrungsmittelallergien, und in der Differentialdiagnose damit auch Nahrungsmittelunverträglichkeiten, kann man zu den Volkskrankheiten zählen. Über 20 % der Bevölkerung in bestimmten Altersgruppen haben Symptome einer Allergie oder gehen zur Abklärung einer Allergie zum Arzt. Viele unklare Krankheitsbilder werden primär häufig in den Formenkreis „Allergie“ mit eingeordnet. Dabei ist es oft schwierig, eine Allergie mit einer spezifischen Immunantwort gegen ein bestimmtes Allergen eindeutig zu diagnostizieren und damit die Möglichkeit einer spezifischen Therapie, der systemischen Immuntherapie (SIT), zu haben. Neben Anamnese und klinischer Untersuchung spielen v. a. Allergietests eine wichtige Rolle in der Diagnostik. In-vivo-Tests wie der Patch-, Prick- oder Scratch-Test oder auch die Allergenexposition bergen die Gefahr einer lokalen bis hin zur systemischen, anaphylaktischen Reaktion und sind damit ein Risiko für den Patienten. In-vitro-Allergietests bieten hier eine bewährte, verlässliche und reproduzierbare Methode, bei der keine potentiell gefährlichen Nebenwirkungen wie bei den invivo-Tests auftreten können. Die zur Verfügung stehenden in-vitro-Tests lassen sich in allgemeine Marker zur Abschätzung des Risikos für eine Allergie oder der aktuellen Aktivität und in spezifische Tests einteilen. Unspezifische Marker mit hinreichender klinischer Evidenz für einen sinnvollen Einsatz in der Routinediagnostik sind Gesamt-IgE, ECP, Tryptase im Serum und Methylhistamin im Urin. Gut etablierte und mit Studien untermauerte Tests zum Nachweis einer spezifischen humoralen allergischen Immunantwort sind IgE-Immunoassays, basierend auf Allergenextrakten, aufgereinigten oder rekombinant hergestellten Allergenen oder Basophilenstimulationstests. Zum Nachweis einer zellulären spezifischen allergischen Reaktion kann der Lymphozytentransformationstest (LTT) oder der ELISPOT-Test eingesetzt werden. Schlüsselwörter: Basophilenaktivierungstest, spezifisches IgE, molekulare Allergiediagnostik, rekombinante Allergene, Lymphozytentransformationstest (LTT) Einleitung Das Immunsystem hat die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen „Selbst“ und „Nicht-Selbst“. Dies wurde lange Zeit als wichtigste und einzige Basisfunktion des Immunsystems betrachtet. Mittlerweile geht man davon aus, dass eine zweite Unterscheidungsebene zwischen „Gefahr“ und „Nicht-Gefahr“ wesentlich den Weg einer Immunantwort mitbestimmt. Diese Funktionen und mögliche Fehlregulationen sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Hauptaufgabe des Immunsystems ist die Abwehr von „gefährlichem Fremd“ wie pathogene Bakterien, Viren und Parasiten. Kommt es zu einer überschießenDBI DER BAYERISCHE INTERNIST 6-2013 Allergien cme.medlea den Reaktion gegen Selbst, so entstehen Autoimmunerkrankungen. Eine wichtige und für die Art überlebenswichtige Funktion ist die Toleranz gegenüber „ungefährlichem Fremd“. Hierunter fällt z. B. der Embryo, der immunologisch betrachtet fremd ist, da er zu 50 % den „immunologischen Fingerabdruck“ des Vaters, also die MHC-Moleküle bzw. Transplantationsantigene des Vaters besitzt und damit eigentlich abgestoßen werden müsste. In diese Kategorie ist auch die Toleranz des Immunsystems gegen Allergene einzuordnen: Allergene sind zwar fremd, stellen aber keine Gefahr dar. Werden sie jedoch nicht toleriert, so entstehen die Allergien. Die Komponenten des Immunsystems werden grundsätzlich in zelluläre und humorale Elemente eingeteilt, die Aufgaben der angeborenen (unspezifisch) und erworbenen (spezifisch) Immunität übernehmen (schematisch dargestellt in Tab. 2). Die Pathogenese der Allergien ist sehr komplex und weit überwiegend multifaktoriell. Es wird diskutiert, dass das Zusammenspiel von 3 Hauptmechanismen zur Entwicklung von Allergien, aber auch von Autoimmunerkrankungen führen: 1. genetische Prädisposition, 2. Triggermechanismen aus der Umwelt und 3. der Zusammenbruch der Immuntoleranz und die Entstehung einer Entzündungsreaktion. Der Verlauf von Allergien kann sich bei verschiedenen Patienten interindividuell sehr unterschiedlich gestalten. Auch kann die individuelle Krankheitsaktivität stark variieren, mit Phasen der akuten Exazerbation bei verstärkter Allergenexposition und partieller oder kompletter Remission bei Allergenkarenz. Interessanterweise gibt es gerade bei den im Kleinkindesalter sehr häufigen DBI DER BAYERISCHE INTERNIST 6-2013 Allergien gegen Kuhmilch-Eiweiße eine spontane Toleranzentwicklung, so dass im Alter von 4 Jahren ca. 85 % der kleinen Patienten beschwerdefrei sind. Die Reaktionen des Immunsystems gegen im Grunde harmlose Substanzen werden nach einem Lehrbuch von Philip Gell und Robin Coombs als Überempfindlichkeitsreaktionen (hypersensitivity reactions) bezeichnet. Danach laufen in der Pathogenese alle Fehlreaktionen des Immunsystems in zwei Stufen ab, einer Sensibilisierungs- und einer Effektorphase. Die Effektormechanismen lassen sich in vier Gruppen einteilen (Tab. 3). Diese verschiedenen Immunreaktionen lassen sich z. T. durch invivo-Tests als auch durch in-vitroTests beim Patienten nachweisen. In der Allergiediagnostik eingesetzte in-vivo-Tests sind der Patch, Scratch- oder Prick-Test zur Abklärung einer IgE-vermittelten Typ-1 Sofort-Reaktion. Der Nachweis einer T-Zell-vermittelten Typ-IV Reaktion erfolgt z. B. mit Hilfe des Mendel-Mantou-Tests, um spezifische T-Zellen gegen M. tuberculosis nachzuweisen. Sowohl für die IgE-vermittelte Typ-1 Sofort-Reaktion als auch einer TZell-vermittelten Typ-IV Reaktion gibt es mittlerweile sehr sensitive und spezifische in-vitro-Tests. In der Regel ist der Allgemeinarzt oder der Pädiater der erste Arzt, der eine mögliche Allergie abklären muss. In-vitro-Tests bieten hier eine bewährte, verlässliche und reproduzierbare Methode, bei der keine potentiell gefährlichen Nebenwirkungen wie bei den in-vivo-Tests auftreten können. Insbesondere die immer genauer werdende Testung mit den Möglichkeiten der molekularen Allergiediagnostik zeigt eine hohe Sensitivität und Spezifität und kann häufig schon eine Aus- Nicht-Selbst Selbst Gefahr Bakterien Viren Pilze Parasiten Tumorzellen NichtGefahr Fötus Darmflora Nahrung Allergene Autoantigene (Autoimmunität) rning.de MkteE CPun sammeln Tab. 1: Schematische Darstellung der Herausforderungen des Immunsystems sage über die Erfolgschancen einer spezifischen Immuntherapie (SIT) treffen. Der Allgemeinarzt kann daher meist schon sehr gut das weitere Vorgehen mit dem Patienten besprechen und in die Wege leiten, z. B. die Überweisung zum Allergologen für weitere Testungen, wie z. B. einer kontrollierten Allergenexposition und dann Einleitung einer SIT. Allergene Das Immunsystem des Menschen ist unzähligen Fremdsubstanzen ausgesetzt, die toleriert werden müssen, da sie keine Gefahr darstellen (s. Einleitung). Interessanterweise reagiert das Immunsystem einiger Individuen mit einigen Fremdsubstanzen mit der Produktion von IgE und damit verbundenen allergischen Reaktionen. „Allergene“ definieren sich also erst als solche durch die Fähigkeit, beim Menschen – oder auch Tieren – eine spezifische IgEoder T-Zell-Reaktion auszulösen. Dabei spielt sowohl die Struktur der Fremdsubstanz, die Exposition, als auch der genetische Hintergrund des Individuums eine Rolle. Des Weiteren spielen wahrscheinlich auch der Zeitpunkt (Prägungsphase) als auch der Weg (oral, nasal) der Exposition, die Menge des Allergens und die Begleitumstände (Co-Exposition, Adjuvantien) eine Rolle. So führt z. B. nach der Hygiene-/Schmutz7 Allergien rning.de cme.medlea MkteE CPun sammeln zellulär humoral angeboren / unspezifisch erworben / spezifisch Elemente Tests Elemente Tests Eosinophile Granulozyten Zählung (bei Allergie meist erhöht) T-Zellen LTT (LymphozytenTransformationsTest) Basophile Granulozyten Mastzellen BasophilenDegranulationstest Entzündungsmediatoren: Quantitiativer Antikörper Nachweis (z.B. Abbauprodukt von Histamin: MethylHistamin im Urin) ECP (Eosinophiles Cationisches Peptid) im Plasma; Tryptase im Serum Histamin Leukotriene ECP Tryptase B-Zellen produzieren alle Immunglobuline (IgE, IgG, IgG4 etc.) IgE gesamt spezifisches IgE Tab. 2: Übersicht der Elemente des Immunsystems als Allergiemediatoren und Testsysteme dazu Hypothese die ausreichende orale Zufuhr von Allergenen und gehäufte Infektionen während der Kindheit zu einer Toleranzentwicklung. Kinder, die mit Geschwistern auf dem Bauernhof aufwachsen, vielen Allergenen ausgesetzt sind und viele Infektionen durchmachen, haben ein sehr geringes Allergierisiko. Dagegen neigen Personen mit entsprechendem genetischem Hintergrund (Atopie) vermehrt zu Allergien und bestimmte Substanzen (Milcheiweiß, Birkenpollen) können vermehrt Allergien auslösen. Die Einteilung der Allergene erfolgt v. a. anhand der natürlichen Quellen, die für den Menschen von Bedeutung sind, wie Milch, Hühnereiweiß, Gräser-Pollen, BaumPollen, Insektengifte oder Tierepithelien („Tierhaarallergie“). Mit der Einführung der rekombinanten Allergene ist es aber immer besser möglich, die relevanten Allergene als Proteine bzw. Glyko- oder Lipo-Proteine auf molekularer Ebene zu definieren. Die wichtigsten Allergengruppen sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Verschiedene Datenbanken bieten eine kontinu8 ierlich aktualisierte Übersicht über definierte Allergene im Internet an (www.allergome.org, www.allergen.org, www.meduniwien.ac.at/ allergens/allfam)[1, 2]. Allergietests Die zur Verfügung stehenden invitro-Allergietests lassen sich in allgemeine Marker zur Abschätzung der aktuellen Aktivität, vergleichbar mit Entzündungsmarkern, und in spezifische Tests einteilen. Unspezifische Marker mit hinreichender Evidenz aus klinischen Studien für einen sinnvollen Einsatz sind Gesamt-IgE, ECP, Tryptase im Serum und Methylhistamin im Urin. Problematisch auf Grund der schnellen Kinetik und schwierigen Präanalytik ist die Bestimmung Histamin im Serum oder Plasma. Eine Quantifizierung der eosinophilen Granulozyten im Blut ist bei jedem Verdacht auf eine Allergie sinnvoll und kann auch zum Monitoring des Krankheitsverlaufs verwendet werden. Eine Eosinophilie über 10 % sollte auch an andere Differentialdiagnosen neben der Aller- gie denken lassen wie z. B. Parasiteninfektionen, Infektionskrankheiten (Scharlach), Hauterkrankungen (Pemphigus vulgaris), Malignome (CML), medikamenteninduzierte Hypereosinophilie oder das Hypereosinophile-Syndrom. Gut etablierte und mit Studien untermauerte Tests zum Nachweis einer spezifischen humoralen allergischen Immunantwort sind IgE-Immunoassays, basierend auf Allergenextrakten, aufgereinigten oder rekombinant hergestellten Allergenen oder Basophilenstimulationstests. Zum Nachweis einer zellulären spezifischen allergischen Reaktion kann der Lymphozytentransformationstest (LTT) oder der ELISPOT-Test eingesetzt werden. ECP Eosinophiles kationisches Protein (ECP) wird als Mediator bei IgE-vermittelten Typ I- Reaktionen insbesondere aus Eosinophilen freigesetzt und reflektiert die allergische Entzündungskomponente. Für die exakte Bestimmung ist die Präanalytik hier entscheidend. Es muss beachtet werden, dass je nach Hersteller nur bestimmte Blutabnahmeröhrchen empfohlen werden, da verschiedenen Plastikröhrchen zu falsch hohen ECP-Werten führen können. Die Probe muss bei konstanter Temperatur (empfohlen meist 20–24 Grad) eine konstante Zeit (i.d.R. 60–120 Minuten) gerinnen und direkt anschließend zentrifugiert werden. Das Serum wird dann in ein neues Röhrchen dekantiert, da aus Blutzellen freigesetztes ECP zu erhöhten Werten führen kann. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, muss bei wiederholten Abnahmen die Gerinnungszeit und die Temperatur immer gleich sein. Eine ECP-Bestimmung aus Plasma und hämolysierten Seren ist nicht möglich [3]. DBI DER BAYERISCHE INTERNIST 6-2013 Allergien cme.medlea Tryptase In den Mastzellen ist das Protein mit der höchsten Konzentration die Tryptase. Auch die Basophilen Granulozyten enthalten Tryptase, allerdings in viel geringeren Mengen. Immunoassays messen meist die Gesamttryptase-Konzentration, die sich aus den inaktiven Vorstufen von alpha-Tryptase und beta-Tryptase sowie aus den enzymatisch aktiven Formen zusammensetzt. Mastzellen sezernieren ständig eine geringe Menge von Tryptasevorstufen in die Blutbahn. Bei gesunden Menschen lässt sich daher immer eine basale Tryptasekonzentration messen, die die Anzahl der Mastzellen widerspiegelt. Je höher die basalen Tryptasekonzentrationen, umso höher das Risiko von schweren anaphylaktischen Reaktionen, z. B. bei parenteraler Exposition von Allergenen, wie Insektengifte oder Arzneimittel. Pathologisch erhöhte Konzentrationen von Tryptase sind ein Hinweis auf Mastzellenvermehrung. Dies kommt bei bestimmten hämatologischen Erkrankungen und Neoplasien vor. Extrem hohe Werte finden sich bei systemischer Mastozytose und korrelieren mit dem Schweregrad der Erkrankung. In den Granula von ruhenden Mastzellen wird aktive Tryptase gespeichert. Sie kann nach einer Mastzellaktivierung durch IgE-vermittelte oder andere Mechanismen in die Blutbahn abgegeben werden. Vorübergehend erhöhte Konzentrationen von Tryptase dienen als klinische Marker für allergische Reaktionen bis hin zur Anaphylaxie [4]. Methylhistamin im Urin Histamin ist einer der wichtigsten Mediatoren allergischer und anaphylaktischer Reaktionen. Histamin ist in großer Menge in den Granula der eosinophilen und v. a. der basophilen Granulozyten und in den Mastzellen gespeichert. Die Zellen degranulieren bei Stimulation, z. B. bei der Bindung von Allergen an den mit spezifischem IgE besetzten hochaffinen IgE-Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Die Menge des sezernierten Histamins wird z. B. in einem bestimmten Testformat des Basophilendegranulationstests bestimmt. Im Blut ist die Bestimmung von Histamin möglich, aber kritisch. Zum einen kann Histamin sehr schnell in größeren Mengen aus den Blutzellen nach der Blutabnahme ausgeschüttet werden und so artifiziell, z. B. bei längerer Transportzeit, erhöht sein. Zum anderen hat Histamin in vivo eine sehr kurze Halbwertszeit und ist wenige Stunden nach dem aktuellen Ereignis nicht mehr erhöht in der Blutzirkulation vorhanden. Methylhistamin ist ein deutlich stabileres Abbauprodukt des Histamins. Durch die Messung von Methylhistamin im Urin kann so ein Anhalt auf eine allergische Reaktion gefunden werden. Im funktionellen Test, bei V. a. eine manifeste Nahrungsmittelallergie, sammelt der Patient unter der Kost, die Beschwerden verursacht (normale Misch- und Vollkost mit potentiellen Allergenen) sowie Formen der Überempfindlichkeitsreaktion nach Gell und Coombs I II III IV andere Namen Sofortreaktion, Allergie, IgE-vermittelte Atopie zytotoxische Antikörperreaktion Immunkomplexreaktion Überempfindlichkeitsreaktion des verzögerten Typs (delayed type hypersensitivity, DTH) Symptomatik < 1–30 Minuten 5–8 Stunden 4–6 Stunden 24–72 Stunden Antigen löslich zellgebunden zunächst löslich löslich Effektormechanismus IgE IgM, IgG IgM, IgG CD4+ TH1-Zellen Pathogenese Antigen kreuzvernetzt IgE-Moleküle, die an Mastzellen und Basophile gebunden sind, und löst deren Degranulation aus Antikörper binden an Zellen, die durch Komplement, ADCC oder Phagozytose zerstört werden Immunkomplex-Ablagerungen in Geweben aktivieren Komplement und die Ausschüttung entzündungsfördernder Substanzen durch Phagozyten TH1-Zellen aktivieren durch IFNJ und andere Zytokine Makrophagen, die entzündungsfördernde Substanzen ausschütten Beispiele Heuschnupfen, Asthma, Ekzeme, Urtikaria, Nahrungsmittelallergien, anaphylaktischer Schock Hämolytische Anämie, Goodpasture-Syndrom, Morbus haemolyticum neonatorum durch RhImmunisierung Arthus-Reaktion, Serumkrankheit, Aspekte von rheumatoider Arthritis und systemischem Lupus erythematosus (SLE) Kontaktdermatitis Tab. 3: Einteilung der Überempfindlichkeitsreaktion des Immunsystems nach Gell und Coombs DBI DER BAYERISCHE INTERNIST 6-2013 9 rning.de MkteE CPun sammeln Allergien rning.de cme.medlea MkteE CPun sammeln unter einer hypoallergenen/allergenarmen Eliminationskost (z. B. Kartoffel-Reisdiät) Urin. Zur Standardisierung der Messergebnisse wird die Methylhistaminkonzentration auf die Kreatininausscheidung und die Körperoberfläche bezogen. Die hohe Sensitivität dieser Diagnostik ist auf die große Schleimhautoberfläche des Gastrointestinaltrakts zurückzuführen, wobei der Großteil des im Intestinaltrakt gebildeten Histamins über die Leber zum stabilen Methylhistamin abgebaut wird. Patienten mit manifester gastrointestinaler Allergie zeigen unter Voll- kost eine Methylhistamin-Ausscheidung in einer erhöhten Konzentration. Unter der Eliminationsdiät kommt es zu einem typischen Abfall der Mediatorproduktion, also des Methylhistamins im Urin und auch des ECP im Serum. Bezüglich der Befundinterpretation ist zu beachten, dass keine histaminreichen Lebensmittel (Fisch, Käse, Rotwein, Bier), Antibiotika oder Antiallergika eingenommen werden. Weiterhin sollten Histamin-produzierende Erkrankungen (z. B. myeloische Leukämien) sowie chronisch entzündliche Darmerkrankungen (Zöliakie, M. Crohn) ausgeschlossen werden. Erhöhtes Methylhistamin unter Vollkost sowie die typische Abnahme der Mediatorproduktion unter der Eliminationsdiät rechtfertigt eine weiterführende Allergiediagnostik, wie z. B. eine orale Provokationstestung. Die Methylhistaminbestimmung mit Vollkost -/Eliminationsdiät gilt als geeignetes Screeningverfahren für Nahrungsmittelallergien [5]. Gesamt-IgE Die Bestimmung des Gesamt-IgE sollte bei jeder Allergiediagnostik Allergenfamilien Beispiele Bemerkungen PR-10 Protein, Bet v 1- Homolog Bet v 1 (Birkenpollen) rAra h 8 – Erdnuss rCor a 1 – Haselnuss rGly m 4 – Soja t )JU[FMBCJMFT1SPUFJOEBNJUHFLPDIUF/BISVOHTNJUUFMPGUPIOF4ZNQUPNFWFSUSÊHMJDI t MPLBMFO4ZNQUPNFOXJFEFN0"4BNIÊVåHTUFO t WBJO/PSEFVSPQBBTTP[JJFSUNJUBMMFSHJTDIFO3FBLUJPOFOHFHFO0CTUVOE(FNàTF -51OJDIUTQF[JåTDIFT -JQJE5SBOTGFS1SPUFJO nsLTP) rAra h 9 – Erdnuss S1SVQo1åSTJDI rCor a 8 – Haselnuss t 1 SPUFJOFTJOEIJU[FTUBCJMVOEHFHFO7FSEBVVOHSFTJTUFOU3FBLUJPOFOBVGHFLPDIUF / BISVOHTNJUUFMEBIFSNÚHMJDI t O FCFOEFNPSBMFO"MMFSHJFTZOESPN0"4 PGUBVDINJUTZTUFNJTDIFOVOETDIXFSFO 3 FBLUJPOFOWFSCVOEFO t BMMFSHJTDIF3FBLUJPOFOHFHFO0CTUVOE(FNàTFJO4àEFVSPQBPGUNJU-51TBTTP[JJFSU 1SPåMJOF rBet v 2 – Birke rPhl p 12 – Gras t 1BOBMMFSHFONJUBVTHFQSÊHUFS)PNPMPHJFVOE,SFV[SFBLUJWJUÊUTFMCTUVOUFSFOUGFSOU WFSXBOEUFO1ýBO[FOBSUFO t .JOPSBMMFSHFOVOETFMUFO"VGUSFUFOWPOLMJOJTDIFO4ZNQUPNFOJO&JO[FMGÊMMFOBCFSBVDI TDIXFSF3FBLUJPOFONÚHMJDI 4QFJDIFSQSPUFJOF S"SBIVo&SEOVTT S(MZNVo4PKB S5SJBo8FJ[FO t PGUTUBCJMFVOEIJU[FCFTUÊOEJHF1SPUFJOFEJFOBDIEFN,PDIFOOPDI3FBLUJPOFO WFSVSTBDIFOLÚOOFO t 1SPUFJOFLPNNFOWBJO4BNFOWPS 4FSVNBMCVNJO O#PTEoBMQIBMBDUBMCVNJO,VINJMDI O#PTEoCPWJOF TFSVNBMCVNJO,VI t XFJUWFSCSFJUFUF1SPUFJOFJOWFSTDIJFEFOFOCJPMPHJTDIFO'MàTTJHLFJUFOVOE(FXFCFO ,VINJMDI&JFS3JOEVOE)àIOFSýFJTDI t ,SFV[SFBLUJPOFO[XJTDIFOWFSTDIJFEFOFO5JFSBSUFOLPNNFOWPS 1BSWBMCVNJO (BEDDPE(BEVT DBMMBSJT 4BMT-BDIT $ZQD,BSQGFO 4DPK4DPB4DPD .BLSFMFO t )BVQUBMMFSHFOJO'JTDIFO t (BEDIPNPMPHF"MMFSHFOFTJOEWFSBOUXPSUMJDIGàSIPIF,SFV[SFBLUJWJUÊUFOCFJ 'JTDIBMMFSHJFOVOEBVDI"NQIJCJFO t )JU[FTUBCJMVOEHFHFO7FSEBVVOHSFTJTUFOUFT1SPUFJOEBIFS3FBLUJPOFOBVGHFLPDIUF /BISVOHTNJUUFMNÚHMJDI Tropomyosin .FUFVOES1FOBo t "LUJOCJOEFOEFT1SPUFJOEFS.VTLFMGBTFSO 4DISJNQT t 7FSBOUXPSUMJDIGàS,SFV[SFBLUJWJUÊUFO[XJTDIFO,SVTUFOUJFSFOBCFSBVDI.JMCFOVOE )PNBo-PCTUFS ,àDIFOTDIBCFO $IBGo,SBCCFO $$%oDBSCPIZESBUF DSPTTSFBDUJWFEFUFSminants t.69 tBMQIBHBMBDUPTF HBMBDUPTFBMQIBo HBMBDUPTF t IÊVåH,SFV[SFBLUJWF,PIMFOIZESBU%FUFSNJOBOUFOCJTEFS"MMFSHJLFSIBCFO*H& HFHFOv.69o)PNPMPHFi t NFJTUOJDIUNJULMJOJTDIFO4ZNQUPNFOBTTP[JJFSUBCFSCFJTFISXFOJHFO1BUJFOUFOOBDIXFJTCBSFPEFSTPHBSTDIXFSF3FBLUJPOFOEBSBVG[VSàDL[VGàISFO Tab. 4: Klassifikation der Allergene auf molekularer Ebene 10 DBI DER BAYERISCHE INTERNIST 6-2013 Allergien cme.medlea durchgeführt werden und die Konzentration sollte in die Bewertung der CAP- bzw. RASTKlasse der spezifischen IgE-Ergebnisse einfließen. Bezüglich der Höhe des Gesamt-IgE besteht eine breite Überlappung zwischen Gesunden und Kranken. Die Festlegung eines allgemein gültigen Grenzwertes ist daher schwierig und die Referenzwertangaben schwanken von Labor zu Labor, obwohl Messungen auf Systemen verschiedener Hersteller gut vergleichbare Ergebnisse zeigen. Als Einheit für die IgE-Konzentration werden meist IU/ml ( = internationale Units) oder kU/l ( = Kilounit) angegeben. Bei der Beurteilung der Ergebnisse der IgE-Konzentration ist zu berücksichtigen, dass ein normaler IgE-Spiegel eine Allergie niemals ausschließt. Bei erhöhten IgE-Werten sind verschiedene Differentialdiagnosen neben der Allergie abzuklären. Dazu zählen allen voran parasitäre Erkrankungen, aber auch bakterielle Infektionen wie die bronchopulmonale Aspergillose sowie transiente Erhöhungen z. B. bei Mycoplasmeninfektion oder Bordetella pertussis aber auch virale Infektionen wie Masern. Verschieden angeborene Immundefekte gehen mit einer IgE-Erhöhung einher. Das seltene HyperIgE-Syndrom (HIOB-Syndrom, vergesellschaftet mit Staphylokokkeninfekten der Haut ohne Entzündungszeichen und Pneumonien) weist i.d.R. Werte über 20.000 IU/ml auf. Ebenso sehr selten und extrem hohe Werte findet man beim IgE-Plasmozytom. Als Anhaltspunkt für Adoleszente und Erwachsene gilt, dass bei Werten von weniger als 20 IU/ml eine Allergie unwahrscheinlich ist. Bei Werten zwischen 20 und 100 IU/ml ist eine Allergie möglich, aber nicht sehr wahrscheinlich. Werte von über 100 IU/ml geDBI DER BAYERISCHE INTERNIST 6-2013 ben bei unklarer Anamnese einen Hinweis darauf, dass die Beschwerden des Patienten auf eine Allergie zurückzuführen sind. Im Nabelschnurblut können Werte > 1 IU/ml bereits als Hinweis auf eine Atopieneigung interpretiert werden. Eine Kontamination mit mütterlichem Blut – z. B. durch einen negativen IgA-Nachweis – muss ausgeschlossen werden. Bei der Interpretation von IgE-Werten bei Kindern sollten altersabhängige Entscheidungsgrenzen beachtet werden. Aufgrund der erwähnten Einschränkungen der Gesamt-IgE-Konzentration ergibt sich eine eher orientierende Bedeutung dieses Testes [6]. Spezifisches IgE In der konventionellen In-vitroAllergiediagnostik wird die Bestimmung von spezifischen IgEAntikörpern mit Hilfe von Allergenextrakten durchgeführt. Diese gewinnt man aus natürlichen Allergenquellen wie zum Beispiel Schimmelpilzen, Tierepithelien oder Pflanzen durch Extraktionsund Proteinaufreinigungsverfahren. Die Allergenextrakte werden für in-vivo-Tests verwendet, wie z. B. dem Pricktest, bei dem Allergenlösungen auf die Haut aufgetragen werden oder für eine in-vitro-IgE-Antikörper-Bestimmung im Blut. Allergenextrakte sind komplexe Gemische aus einer Vielzahl an unterschiedlichen Proteinen, Glycoproteinen, Lipoproteinen oder Lipiden. Nicht all diese Moleküle wirken allergen, sondern nur wenige davon sind wirklich Auslöser für eine Allergie. Des weiteren besitzen viele Allergene kreuzreagierende Determinanten, die klinisch keine oder kaum Bedeutung haben, aber in den Allergietesten zu positiven Ergebnissen gegen eine Vielzahl von Allergenen führen. Allem voran sind hier Zuckerseitenketten zu nennen wie das CCD (cross-reactive carbohydrat determinant). Ein deutlicher Fortschritt der Allergiediagnostik, mit einer Verbesserung der therapeutischen Strategie von Typ l-Allergien, konnte durch die Einführung rekombinanter Allergene in in-vitro-Tests, aber zunehmend auch für die Therapie erzielt werden. Jeder Allergiker besitzt ein sehr individuelles IgE-Reaktivitätsmuster gegen einzelne molekulare Bausteine des Auslösers. Handelt es sich um eine Sensibilisierung gegen kreuzreaktive Strukturen, so kann das Bild einer Polysensibilisierung vorgetäuscht werden. Der Einsatz rekombinanter Allergene ermöglicht die Erstellung eines individuellen Allergieprofils. Gegenüber natürlichen Allergenextrakten zum Nachweis von spezifischem IgE weisen rekombinant hergestellte Allergenkomponenten eine Reihe von Vorteilen auf. Dazu zählen das Erkennen von speziesspezifischen Sensibilisierungen, die Differenzierung von Doppelsensibilisierungen und Kreuzreaktionen und das Erkennen von Reaktivitäten, die mit einer erhöhten Anaphylaxiebereitschaft einhergehen. Auch in der Abklärung von Nahrungsmittelunverträglichkeiten kann mit Hilfe von rekombinanten Allergenen der spezifische Auslöser einer Nahrungsmittelallergie häufig eindeutig bestimmt werden, wenn beim Screening mit Extrakten ein Verdacht auf eine bestimmte Gruppe von Nahrungsmitteln gefunden wird. Auch für die Identifizierung von in Extrakten unterrepräsentierter Nahrungsmittelallergene, wie dem Omega-5-Gliadin bei der Weizenallergie, bieten rekombinante Allergene deutliche Vorteile. Schließlich können durch die 11 rning.de MkteE CPun sammeln Allergien rning.de cme.medlea MkteE CPun sammeln erweiterte Diagnostik, basierend auf rekombinanten Allergenen, individuelle Sensibilisierungsmuster eines Patienten gegen einzelne definierte Komponenten der Allergenquelle, aber auch vorhandene Ko- und/oder Kreuzsensibilisierungen aufgedeckt werden und eine gezielte Immuntherapie mit Allergenextrakten eingeleitet werden. Auch in der Verlaufskontrolle der spezifischen Immuntherapie bietet die molekulare Allergiediagnostik entscheidende Hilfestellung. Die regelmäßige Messung der spezifischen IgE- und IgG-Antikörperspiegel im Serum gegen einzelne rekombinante Allergene kann dazu verwendet werden, die Entwicklung der Erkrankung in ihrem natürlichen Verlauf oder unter Immuntherapie zu objektivieren. So kann z. B. bei einer Verschlechterung der Symptomatik oder einem schlechten Ansprechen auf die Immuntherapie häufig erkannt werden, ob eine unzureichende Produktion von blockierenden IgG-Antikörpern als Ursache dahinter stecken könnte. Als die quasi natürliche Weiterentwicklung der molekularen Allergiediagnostik kann die Einführung von Multiplex-Testsystemen bezeichnet werden. Durch die Möglichkeit, die rekombinanten Allergene standardisiert in guter Qualität und hoher Antigendichte reproduzierbar herzustellen, ist es möglich geworden, eine spezifische IgE-Antwort gegen multiple Allergene auf kleinstem Raum mit geringer Serummenge parallel zu testen. Schon lange vorhandene Verfahren zum gleichzeitigen Test von vielen Antigenen konnten aufgrund der geringen Sensitivität nur zum Nachweis klinisch meist irrelevanter IgG-Antikörper angewendet werden. Kommerziell erhältlich sind Blotstreifen- und ELISA-Platten-Tests 12 zum Nachweis von bis zu 300 IgGReaktivitäten v. a. gegen Nahrungsmittel. Einige Blotstreifentests zum Nachweis von IgE-Reaktivitäten sind durchaus valide einzusetzen, auch wenn die Sensitivität möglicherweise etwas geringer ist als bei den klassischen Immunoassays. Der ImmunoCAP ISAC® Allergie-CHIP ist der erste in-vitroTest, der ausschließlich mit hochaufgereinigten nativen und rekombinanten Allergenkomponenten arbeitet, also das Prinzip der Komponenten-basierten invitro-Allergiediagnostik (Component-resolved diagnostics - CRD) mit dem Prinzip der MultiplexAnalytik verbindet. Damit ergibt sich die Möglichkeit der Erstellung eines umfangreichen Allergenprofil von über 100 Allergenkomponenten mit nur einer Analyse aus minimalem Probenvolumen (ca. 20µl Serum- bzw. Plasma). Insbesondere für Kleinkinder und Säuglinge ergibt sich durch die Möglichkeit, Kapillarblut zu verwenden eine genaue Bestimmung des Allergieauslösers und Identifizierung von Kreuzreaktivitäten mit minimaler Belastung für den Patienten [1, 7, 8]. Basophilen-Aktivierungs-Tests (z. B. CAST) Bei den Basophilen-AktivierungsTests handelt es sich um zelluläre Tests zum indirekten allergenspezifischen IgE-Nachweis. Hier ist das IgE auf den Basophilen über hochaffine IgE-Rezeptoren gebunden und das zugegebene Allergen löst durch die Bindung am IgE und damit die Quervernetzung der IgE-Rezeptoren, die Aktivierung der Zellen mit folgender Degranulation aus. Die Basophilen werden dazu aus der Blutprobe isoliert oder einige 100µl der Probe werden direkt mit dem fraglichen Allergen inkubiert. An- schließend können entweder die freigesetzten Mediatoren (Histamin, Leukotriene) bestimmt oder wie beim Zellulären-Antigen–Stimulationstest (CAST) die heraufregulierten Aktivierungsmarker (CD63, CD203c) gefärbt und durchflusszytometrisch gemessen werden. Als Probenmaterial für den CAST wird EDTA-Vollblut benötigt. Die Blutprobe kann gekühlt mindestens 24 Stunden problemlos transportiert werden. Da pro Allergen nur eine geringe Blutmenge (ca. 50µl) verbraucht wird, können auch bei Kindern mit kleiner Probenmenge (z. B. EDTA-Röhrchen mit 2 ml) relativ viele Allergene getestet werden. Bei ca. 30 % der gesunden Bevölkerung und auch bei 5–10 % der Allergiker können die Basophilen nicht mit Anti-IgE-Antikörpern, die meist als Positivkontrolle eingesetzt werden, stimuliert werden. Dann ist eine Auswertung von negativen Ergebnissen nicht möglich. Als alternative Positivkontrollen kommen Anti-IgE-Rezeptor-Antikörper oder das chemotaktische Peptid FMLP (N-formyl-Met-Leu-Phe) in Frage. Letzteres stimuliert allerdings nicht spezifisch nur die Basophilen, sondern auch andere Zellen. In einigen Fällen kann ein zellulärer Test, insbesondere der Basophilen-Allergenstimulationstest, besser als ein IgE-Immunoassay geeignet sein spezifische IgE-Antikörper nachzuweisen. Dieser Test hat sich in den letzten Jahren als sinnvolle Labormethode zur weiteren Abklärung unklarer Befunde, vor allem bei Patienten, bei denen der spezifische IgE-Befund nicht mit der Klinik korreliert, bei Verdacht einer Soforttypallergie mit unklarem Hauttest und bei negativem IgE-Resultat, beispielsweise aufgrund extrem niedriger Gesamt-IgE-Konzentration im Serum, bewährt. Auch bei Allergien, DBI DER BAYERISCHE INTERNIST 6-2013 Allergien cme.medlea für die keine gereinigten oder rekombinanten Allergene für den Immunoassay zur Verfügung stehen, kann der Test eingesetzt werden. Bei dieser in vitro-Reaktion kann auf beliebige Allergene getestet werden. Der Test besitzt gerade bei schwierigen Allergenen, wie z. B. Insektengiften, Medikamenten, Nahrungsmittelzusatzstoffen und Latex eine hohe Sensitivität und Spezifität, u. a. durch den Einsatz einer unspezifischen Stimulationskontrolle und einer Negativkontrolle. Für den CAST sind über 100 standardisierte Allergene ohne Zusatzstoffe erhältlich. Da eine IgE-vermittelte Allergie meist bei Atopikern mit erhöhten Gesamt-IgE-Konzentrationen auftritt bei denen ein direkter Nachweis allergenspezifischer IgE-Antikörper häufig möglich ist, ist ein zellulärer Test mit basophilen Leukozyten oft entbehrlich [9, 10]. LTT (Lymphozyten TransformationsTest), ELISPOT-Assay Mit dem LTT wird die T-Lymphozyten-induzierte Zelluläre Immunabwehr getestet. Er stellt eine Alternative zu den sonst üblichen Hauttests dar. Der LTT ist mittlerweile gut standardisiert und validiert und wird vom Robert-Koch-Institut bei der Frage nach Metall- oder Arzneimittelallergien empfohlen. In dieser Fragestellung und zur Abklärung der lymphozytären Immunkompetenz bei immunsupprimierten Patienten, wird der Test auch von den gesetzlichen Krankenkassen bezahlt. Metalle wie Nickel, Gold, Palladium, Quecksilber u. a. können bei häufigem Kontakt mit der Mundschleimhaut den Ausbruch einer Allergie vom verzögerten Typ – die so genannte Typ IV-Allergie – auslösen. Nach 48 bis 72 DBI DER BAYERISCHE INTERNIST 6-2013 Stunden zeigt sich dann ein Kontaktekzem. Die T-Lymphozyten müssen dabei durch einen früheren Metallkontakt sensibilisiert worden sein. Die sensibilisierten Lymphozyten reagieren mit einer Transformation zu aktivierten Lymphozyten mit Zytokinsekretion und Proliferation. Es entstehen Effektorzellen, die Zytokine sezernieren und damit die Allergie vom Typ IV auslösen. Das Prinzip des in-vitro-Tests beruht auf der Inkubation des Patientenbluts und der darin enthaltenen Lymphozyten mit einzelnen Antigenen bzw. Allergenen (Medikamente, Metalle, Zahnersatzstoffen). Die Reaktion der T-Lymphozyten kann über die Quantifizierung der sezernierten Zytokine oder der Proliferation gemessen werden. Die zytokinproduzierenden Lymphozyten können z. B. im ELISPOT-Test dargestellt und quantifiziert werden. Zur Messung der Proliferation werden die Zellen mit radioaktiven Nukleotiden (3H-Thymidin) oder immunologisch nachweisbaren markierten Nukleotiden (BRDU) in der Wachstumsphase inkubiert. Am Ende der Proliferationsphase wird das Verhältnis der Wachstumsrate der Lymphozyten mit oder ohne Kontakt zum getesteten Allergen ausgewertet und als sogenannter Stimulationsindex (SI) quantitativ dargestellt. Die Reaktionsstärke korreliert mit der Reaktion der Gedächtnis-T-Lymphozyten. In der Regel zeigt sich bei einer starken Sensibilisierung ein SI von größer 3, der dann als positiv bewertet wird. Der positive Ausfall eines LTT ist der Hinweis auf eine Sensibilisierung der T-Lymphozyten, beweist jedoch nicht das Vorliegen einer Allergie. Umgekehrt ist der negative Befund kein sicherer Ausschluss einer möglichen Allergie. Der LTT für Medikamente, Metalle und auch Kunststoffe und sonstige, v. a. in der Zahnmedizin oder Gelenksprothetik verwandte Materialien, hat auf Grund brauchbarer klinischer Daten, aber auch wegen fehlender besserer in-vitro-Tests in der Diagnostik, eine gewisse Bedeutung erlangt [10, 11]. IgE-Nachweise in Immunoassays oder Basophilenaktivierungstests haben für die T-Zell-vermittelten Allergien keine Bedeutung. Weitere, wissenschaftlich nicht untermauerte Tests ALCAT (Citox) Es gibt keine ausreichenden Studien, die belegen, dass der als zytotoxischer Lebensmitteltest bezeichnete ALCAT-Test (Antigen Leukocyte Cellular Antibody Test), auch Leukozytenaktivierungstest genannt, zur Diagnostik einer Allergie geeignet ist. Die Beurteilung zellulärer Veränderungen nach dem Zusatz von Immunstimulantien, Nahrungsmitteln oder Zusatzstoffen entbehrt einer rationalen wissenschaftlichen Basis, ist abhängig von der subjektiven Interpretation und nicht reproduzierbar und zeigt keine Übereinstimmung mit der klinischen Diagnose [12]. Spezifisches IgG, IgG4 Diverse Tests zur Bestimmung von Serum-IgG oder IgG4 gegen Nahrungsmittel werden angeboten. Dabei werden bis zu 300 Nahrungsmittel getestet und meist semiquantitativ ausgewertet. Die Ergebnisse werden oft zusammen mit umfangreichen Diätempfehlungen interpretiert. Diese Tests werden von nationalen und europäischen allergologischen Fachverbänden einhellig abgelehnt. Dabei wird weniger die analytische Methodik angezweifelt, son13 rning.de MkteE CPun sammeln Allergien rning.de cme.medlea MkteE CPun sammeln dern vor allem die unzulässige Interpretation und Diätempfehlungen. IgG-Antikörper gegen Nahrungsmittel entsprechen einer intakten Immunantwort und sind keinesfalls als krankmachend im Sinne einer Nahrungsmittelunverträglichkeit oder Allergie einzustufen [12]. Summary Allergies including food allergies and as differential diagnosis therefore also food intolerance are with an incidence of more than 20 % a major public health problem. A lot of unclear diseases are classified as „probably allergy“. Often it is very difficult to clearly show specific immune reaction against a certain allergen and than to open the possibility for a specific immuno therapy (SIT). Beside anamnestic and clinical evaluation of the patient, tests for allergies are a main part of the diagnosis. In-vivo-tests like patch-, scratch- or prick-test or allergen exposition have the potential risk for the patient of local or even systemic or anaphylactic reactions. In-vitro allergy-tests provide a standardized, validated and reproducible method with no risk for the patient. The available invitro tests can be classified in unspecific markers for predisposition or activity of allergies. Unspecific markers with good evidence for clinical use are whole IgE-concentration, ECP and tryptase in serum and methylhistamine in urine. Well established and by scientific studies supported tests for the specific immune response to allergens are IgE immuno assays based on allergen extracts or recombinant allergens or the basophile activation test. For the detection of a specific cellular allergic reaction, the lymphocyte transformation test (LTT) or the 14 ELISPOT assay can be used. Keywords: Basophile aktivation test, specific IgE, molecular allergy diagnosis, recombinant allergens, lymphocyte transformation test (LTT) occupational sensitization and disease. Current opinion in allergy and clinical immunology 2012; 12(2): 102–10. [12] Kleine-Tebbe J, Fuchs T, Lepp U, et al. Positionspapier der Deutschen Gesellschaft fu r Allergologie und klinische Immunologie (DGAI) und des Ärzteverbandes deutscher Allergologen (ÄDA). Allergo Journal 2001; 10: 333–9. Prof. Dr. med. Rudolf Gruber synlab Medizinisches Versorgungszentrum Nürnberg Fürther Str. 212 90429 Nürnberg [email protected] Interessante Internetadressen: www.allergome.org www.allergen.org www.meduniwien.ac.at/allergens/allfam Literatur [1] Sastre J. Molecular diagnosis in allergy. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology 2010; 40(10): 1442–60. [2] Schmid-Grendelmeier P. [Recombinant allergens. For routine use or still only science?]. Der Hautarzt; Zeitschrift fur Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete 2010; 61(11): 946–53. [3] Bystrom J Fau - Amin K, Amin K Fau Bishop-Bailey D, Bishop-Bailey D. Analysing the eosinophil cationic protein--a clue to the function of the eosinophil granulocyte. (1465–993X (Electronic)). 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