STED-Nanoskopie - Physikalisches Institut Heidelberg

STED-Nanoskopie:
Durchbrechens der Beugungsgrenze
Anleitung zu F68
30. November 2015
Inhaltsverzeichnis
I. Grundlagen
1
1. Atom- & Molekülphysik
2
2. Optik
4
3. STED
5
4. Fragen zu den Grundlagen
10
II. Durchführung
11
5. Software
12
6. Justage des Setups
13
7. Aufgaben
18
III. Auswertung
26
8. Pflichtaufgaben
27
IV. Anhang
29
A. Berechnung der STED Auflösung
30
B. Hinweise zur Darstellung mikroskopischer Bilder
34
Teil I.
Grundlagen
1
1 ATOM- & MOLEKÜLPHYSIK
Der Grundlagenteil dieser Anleitung führt kurz die wichtigsten Begriffe ein, die zum Verständnis von STED-Mikroskopie und des Versuchsaufbaus notwendig sind. Dabei wird zunächst auf
die Atom- und Molekülphysik eingegangen, dann auf Optik und beugungsbegrenzte Mikroskopie und zuletzt auf STED.
1. Atom- & Molekülphysik
1.1. Stimulierte Emission
Ein System mit diskreten elektronischen Niveaus kann auf drei verschiedene Arten mit einem
Lichtfeld wechselwirken. Betrachten wir ein Atom (oder Molekül) mit den zwei Energieniveaus
Ei und Ek (Ei < Ek ), so kann der Übergang des Elektrons von Ek nach Ei zunächst durch
spontane Emission eines Photons der Energie Eν = Ek − Ei stattfinden. Die Wahrscheinlichkeit
Wkisp für diesen Prozess ist von einem äußeren Strahlungsfeld unabhängig und ist durch den
Einsteinkoeffizienten Aki gegeben:
(1)
Wkisp = Aki .
Für den Übergang vom tieferen ins höhere Niveau hingegen ist Energie notwendig, die von
einem Strahlungsfeld geliefert werden kann. Die Wahrscheinlichkeit Wik für diese Absorption
eines Photons der Energie Eν ist dann gegeben durch
(2)
Wik = Bik · u(ν)
und somit abhängig von der Energiedichte u(ν) des Strahlungsfeldes bei der entsprechenden Frequenz.
Um die Planck’sche Strahlungsformel herleiten zu können, postulierte Einstein 1916,
dass die Anwesenheit eines
Strahlungsfeldes nicht nur
zur Absorption führen, sondern auch der Übergang von
Ek nach Ei vom Strahlungsfeld induziert werden kann.
Dabei wird vom System
ein Photon emittiert, sodass
sich die Anzahl der Photonen im Strahlungsfeld erhöht. Diese induzierte oder
stimulierte Emission hat die
Wahrscheinlichkeit
Ek
Anregung
Stimulierte
Emission
Spontane
Emission
Ei
Abbildung 1: Lichtinteraktion mit einem 2-Niveausystem
Wki = Bki · u(ν).
(3)
Dieser letzte Prozess ist bekanntermaßen der Mechanismus zur Erzeugung von Laserlicht. Er
wird hier jedoch eingeführt, weil er auch die Umgehung der Beugungsgrenze in der Lichtmikroskopie ermöglicht.
2
1.2 Fluoreszenz & Phosphoreszenz
1 ATOM- & MOLEKÜLPHYSIK
1.2. Fluoreszenz & Phosphoreszenz
Fluoreszenz ist ein Prozess der Photolumineszenz. Ein Mehrniveausystem wird durch Photonen
in einen energetisch höheren Zustand angeregt und zerfällt kurz danach spontan durch Emission
von Licht, wobei die Zerfallswahrscheinlichkeit exponentiell von der Zeit abhängt.
Dabei spricht man von resonanter Fluoreszenz, wenn der angeregte Energiezustand wieder
genau in den Ausgangszustand zerfällt. In komplexen Molekülen, wie organischen Farbstoffen,
ist die Wahrscheinlichkeit für resonante Fluoreszenz jedoch sehr gering (s.u.).
Phosphoreszenz ist ebenfalls ein lumineszenter Prozess und wird von der Fluoreszenz auf
Grund der unterschiedlichen Zeitskalen der Prozesse unterschieden. Während fluoreszente Zustände Lebensdauern im Bereich von Nanosekunden (10−9 s) haben, dauert phosphoreszentes
Abklingen 10−6 s bis 102 s. Der Grund für diese langen Lebensdauern ist, dass der entsprechende
Übergang nach Spin-Auswahlregeln verboten ist.
1.3. Organische Farbstoffmoleküle
Da biologische Proben für sichtbares Licht im wesentlichen transparent sind, werden bei der
Fluoreszenzmikroskopie die zu beobachtenden Regionen der Probe mit fluoreszenten Farbstoffen
angefärbt (labeling). Da die Elektronenniveaus der Farbstoffmoleküle zusätzlich Schwingungszustände besitzen, kommt es wegen des Franck-Condon-Prinzips nicht zu resonanter Fluoreszenz. Dies wirkt sich in einer Rotverschiebung des Emmissionssprektrums im Vergleich zum
Anregungs- (Absorptions-) Spektrum des Moleküls aus (Stokes-Verschiebung). Diese spektrale
Verschiebung ist eine essentielle Voraussetzung für die Erweiterung der Fluoreszenzmikroskopie zur STED-Mikroskopie. Abbildung 2 zeigt ein gebräuchliches Farbstoffmolekül und seine
Spektren.
Abbildung 2: Strukturformel und Spektren eines typischen Fluoreszenzfarbstoffes, ATTO565.
http://www.atto-tec.com/uploads/media/Katalog.pdf
3
2 OPTIK
2. Optik
2.1. Basics
Der entscheidende Teil des Versuchaufbaus besteht aus optischen Komponenten. Deshalb werden sowohl theoretische als auch im Optimalfall praktische Kenntnisse (F85 - F87) der Optik
für den Versuch vorausgesetzt; folgende Begriffe sollten prinzipiell bekannt sein (zur Lektüre
sei verwiesen auf: [BEAS07], [Dem10]):
• Geometrische Optik:
Lichtbrechung, Linsengleichung, Abbildung durch Linsensysteme, NA, Linsenfehler, Verwendung von Spiegeln und Linsen zur Manipulation von Laserstrahlen
• Polarisationsoptik:
Polarisierende Strahlteiler, Verzögerungsplatten (λ/2, λ/4) zur Manipulation der Polarisation
• Laseroptik:
Diodenlaser, Eigenschaften und Kenngrößen gepulster Laser, spektrale Eigenschaften
• Detektoren:
Photodiode, Avalanche Photodiode (APD), Photomultiplier Tube (PMT)
2.2. Konfokalmikroskop
Konfokale Mikroskope (KM), ermöglichen die besten beugungsbegrenzten lichtmikroskopischen
Auflösungen. Gleichzeitig kann ein KM zu einem STED Mikroskop erweitert werden, wie später
gezeigt wird. Aus diesem Grund soll hier kurz das Prinzip eines KM erklärt werden.
Beleuchtung Zur Beleuchtung wird in einem Konfokalmikroskop ein Laser verwendet, da er
sich ideal fokussieren lässt und eine hohe spektrale Leistungsdichte ermöglicht. Das entscheidende element des Mikroskps ist das Objektiv, das mit seiner hohen numerischen Apertur (NA)
den Laserstrahl maximal in der Probe bündelt und zudem möglichst viel des zurückgestrahlten
Lichtes aufsammelt.
Scanning Um das vollständige Bild zu erhalten, wird die Probe Punkt für Punkt abgerastert.
Dafür gibt es zwei Möglichkeiten: Beim stage scanning wird die gesamte Probe über den ortsfesten Strahl bewegt. Das in diesem Versuch zur Anwendung kommende beam scanning hingegen
benutzt mehrere motorisierte Spiegel, um den Strahl über die ortsfeste Probe wandern zu lassen.
Wichtig für die spätere Anwendung mit STED ist, dass die relative Genauigkeit der Position
des Laserstrahls (wenige nm) weitaus besser sein muss, als seine laterale Ausdehnung (wenige
100nm).
Detektion Um das Fluoreszenzsignal auf einen feststehenden Detektor lenken zu können,
muss dieses Licht in entegegengesetzter Richtung zum Anregungslicht durch den Scanner laufen (descanning). Da das zu detektierende Signal antiparallel zum Anregungslicht läuft, muss
es aus dem Strahlengang desselben separiert werden. Dies geschieht aufgrund der unterschiedlichen spektralen Eigenschaften von Absorption und Emission (siehe Abbildung 2) mit einem
4
2.3 Beugungsbegrenzte Auflösung
3 STED
Strahlteiler
Anregung
Objektiv
Blende
Emission
Detektor
Scanner
3D Probe
Fokalebene
Spiegel
Linse
Abbildung 3: Funktionsschema eines KM. Aufgrund der starken Fokussierung und der Konfokalisierung wird quasi nur Fluoreszenz aus der Fokalebene detektiert.
dichroitischen Strahlteiler (bzw. mit einem Bandpass Filter). Dann kann es in einem effizienten
Photonendetektor (APD oder PMT) nachgewiesen werden.
Beim Konfokalisieren des Detektionslichtes wird der Beleuchtungsfokus auf eine Lochblende
vor dem Detektor abgebildet; das Licht außerhalb des Fokuspunktes wird ausgeblendet. Man
erreicht so eine besonders hohe Tiefendiskrimnierung und erhöhte axiale Auflösung. Daraus
ergibt sich ein besonders kontrastreiches Bild mit verbessertem Signal- zu Rauschverhältnis
(SNR). Abbildung 3 skizziert den Strahlverlauf.
2.3. Beugungsbegrenzte Auflösung
Lange Zeit galt es als unumstößliche Tatstache, dass es aufgrund der Beugung von Licht einen
minimalen Abstand ∆x gibt, den zwei Objekte haben müssen, um sie noch als getrennte Objekte identifizieren zu können.
Zuerst wurde dieser Sachverhalt der Wellenoptik 1873 von Ernst Abbe beschrieben. Eine Herleitung, die seiner Argumentation folgt, findet sich beispielsweise in [LLT97]. Das bekannte
Ergebnis lautet
λ
,
(4)
d=
2 n sin α
wobei λ die verwendete Wellenlänge, n der Brechungsindex und α der halbe Öffnungswinkel
des abbildenden Systems ist (n sin α = NA).
Diese Limit gilt genauso in die umgekehrte Richtung: Der Fokus eines Laserstrahls kann nicht
kleiner sein als durch obige Formel gegeben.
3. STED
Die im vorigen Abschnitt vorgestellte beugungsbedingte Auflösungsgrenze galt lange als unüberwindbar. Allerdings ist die Auflösung eines Mikroskops nicht notwendigerweise durch die
Größe des Laserspots begrenzt. Wird etwa dafür gesorgt, dass nur ein Teil der Objekte im
beleuchteten Volumen ein Antwortsignal liefert, so rückt die (nach wie vor beugungsbegrenzte)
Größe des Beleuchtungsspots in den Hintergrund.
5
3.1 Das STED-Prinzip
3 STED
Das Schalten zwischen quantenmechanischen Zuständen, die entweder fluoreszieren können
(AN - Zustand) oder nicht (AUS - Zustand), liefert eine Möglichkeit um Lichtmikroskope jenseits der Beugungsgrenze zu betreiben. Mittlerweile gibt es mehrere Verfahren, um diese hochauflösende Mikroskopie (Nanoskopie) zu realisieren. STimulated Emission Depletion (STED)
Mikroskopie war dabei die erste Technik, weitere firmieren z.B. unter PALM, STORM und GSDIM. Diese Methoden nutzen andere Versuchsanordnungen als STED, beruhen jedoch ebenfalls
darauf, dass immer nur ein Teil aller beleuchteten Moleküle AN ist.
Im Folgenden wird das Prinzip von STED und seine praktische Umsetzung im Versuch erläutert. Der interessierte Leser sei für weiterführende Lektüre zu STED und den anderen hochauflösenden Techniken auf [Hel09] verwiesen.
3.1. Das STED-Prinzip
Ein STED-Mikroskop baut im technisch einfachsten Fall direkt auf einem Konfokalmikroskop
auf. Um nun ein STED-Mikroskop zu realisieren, wird die Probe zusätzlich zum Anregungsstrahl mit einem rotverschobenen Laserstrahl (dem namesgebende STED-Laser) beleuchtet.
Dieser kann durch stimulierte Emission die angeregten Farbstoffmoleküle zurück in den AUSZustand überführen. Die Auflösung kann nun erhöht werden, indem die angeregten Fluorophore
in den äußeren Bereichen des Anregungsspots gezielt ausgeschaltet werden. Um dies zu erreichen wird das Intensitätsprofil des STED-Lasers so gestaltet, dass es in der Mitte des Strahls
eine Intensitätsnullstelle aufweist (Torusform bzw. Donut). Wird die Probe auf diese Art abgerastert, entsteht ein hochaufgelöstes Bild (siehe Abbildung 4).
3.2. Sättigungsintensität und Auflösung
Abbildung 5: Ausschaltkurve
Das Ausschalten durch stimulierte Emission ist ein stochastischer Vorgang: Die Wahrscheinlichkeit η, dass
ein Fluoreszenzmolekül angeschaltet bleibt, sinkt exponentiell mit der eingestrahlten STED-Intensität: η =
exp(− ln(2)I/Is ). Die Sättigungsintensität Is gibt dabei die Intensität an, bei der die Hälfte der angeregten
Fluoreszenz gelöscht wird.
Der Bereich um die Nullstelle des STED-Donuts kann
in erster Ordnung quadratisch genähert werden: I =
I˜ x2 /(d/2)2 . Der Proportionalitätsfaktor I˜ kann empirisch bzw. aus einer Simulation gewonnen werden, zeigt
aber schon die Abhängigkeit von der Beugungsgrenze
d. Somit ist η eine Gaußglocke in x:
˜
ηST ED (x) = e− ln(2)I/Is = e− ln(2)I/Is · x
2 /(d/2)2
.
(5)
Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Fluorophor überhaupt durch den Anregungslaser angeregt
wurde, ist ηan (x) = exp(ln(2)x2 /(d/2)2 ) . Auch hier spiegelt sich das Beugungslimit in der
Halbwertsbreite d wider (vgl. Formel 4 ). Insgesamt ergibt sich
˜
η(x) = ηan (x) · ηST ED (x) = e− ln(2)(1+I/Is ) x
6
2 /(d/2)2
(6)
3.2 Sättigungsintensität und Auflösung
3 STED
a)
b)
Anregung
Fluoreszenz
2
...
Pixel
(Zeile,Spalte)
Bildaufbau
Anregung
& STED
Fluoreszenz
Bildaufbau
1
Scanning
(2,2)
3
0
(2,3)
2
2
...
(2,4)
c)
d)
Vibrationsrelaxation
-12
10 s
S1
Anregung
-15
10 s
Fluoreszenz
-9
10 s
STED
-15
10 s
beugungsbegrenzt,
ohne STED
-12
10 s
S0
mit STED
Abbildung 4: a) Abrastern einer Probe mit einem KM. Die erste Zeile ist bereits vollständig
abgerastert. Das im jeweiligen Pixel gespeicherte Signal ist in etwa proportional zur Anzahl der
fluoreszierenden Moleküle, was durch die blaue Zahl angedeutet werden soll. b) Die gleiche Probe
wird mit STED abgerastert. Dort, wo Anregungsstrahl und STED-Strahl gleichzeitig wirken,
wird ein angeregter Farbstoff wieder AUS geschaltet und trägt nicht zum Signal bei. c) Bei
STED beteiligte Energieniveaus mit Zeitskalen der einzelnen Übergänge. d) Konfokale und STED
Aufnahme vom gleichen Bildfeld. Die Probe besteht aus fluoreszierenden Beads, Maßstab 500 nm
q
˜ s dieser Gaußglocke ist ein gebräuchliches Maß für die
Die Halbwertsbreite ∆x = d/ 1 + I/I
Auflösung. Ausgeschrieben lautet die so gewonnene erweiterte Abbe’schen Formel:
∆x ≈
λ
1
· p
2NA
1 + Imax /Is
(7)
Hier ist Imax die maximale STED-Intensität im Fokus. Eine formale Herleitung dieser Formel
anhand von Ratengleichungen ist im Anhang A aufgeführt.
7
3.3 Strahlformung
3 STED
3.3. Strahlformung
Eine wichtige Voraussetzung für hohe Auflösungen im STED-Mikroskop ist, den STED-Laser
zu einem möglichst perfekten Donut zu formen, währen der Anregungslaser ein maximal fokussiertes Gaußprofil aufweist. Dazu werden die Laserstrahlen zumeist in der Pupillenebene (oder
einer dazu äquivalenten Ebene) vor dem Fokussieren durch das Objektiv manipuliert.
In vielen Aufbauten wird die Donutform des STED-Strahls vor dem Mikroskop durch reine
Phasenmodulation über eine Phasenschnecke erzeugt. Da Anregungs- und STED-Strahl hierbei
nicht den kompletten Strahlengang teilen, liegen beide im Fokus des Mikroskops nicht automatisch übereinander. Schon kleine Drifts sorgen dafür, dass sich der STED-Donut nicht mehr
über dem Anregungsspot befindet - häufige und zeitraubende Justage der beiden Strahlen ist
notwendig.
Mittlerweile gibt es auch die Möglichkeit, die Strahlen zuerst zu überlagern und sie in eine
Monomoden-Glasfaser (single mode fiber) einzukoppeln. Erst nach der Auskopplung aus der
Faser wird der Donut des STED-Strahls zu erzeugt, während der Anregungsstrahl ein Intensitätsprofil mit zentralem Maximum beibehält [Reu10]. Die Faser transmittiert nur die zentrale
Gaußmode T EM00 des Laserlichts und beide Strahlen verlassen sie perfekt überlagert und
als Gauß-Strahl. So wirken sich alle Drifts auf beide Strahlen gleichermaßen aus - sie liegen
immer perfekt übereinander. Da dieser Ansatz stabiler und einfacher umzusetzen ist, wird er
easySTED genannt. Im Praktikum wird ein easySTED Mikroskop eingesetzt.
easySTED-Phasenplatte
segmentierte Phasenplatte
Polarisation
optische Achse
Strahlprofil
+i
+i
resultierende Verteilung
hinter SWP
zirkulare Polarisation
+i
us
sie
rung
Feld im Fokus
k
Fo
Intensität
im Fokus
Abbildung 6: Schematische Darstellung der verwendeten Phasenplatte zur Erzeugung des torusförmigen Strahlprofils.
8
3.4 Time Gated STED
3 STED
Das Kernelement eines easySTED-Aufbaus ist die sogenannte segmentierte Phasenplatte (segmented waveplate - SWP). Sie ermöglicht durch ihre Wellenlängenabhängigkeit, dass der Strahl
der Wellenlänge λST ED im Fokus zu einem Donut geformt wird, während die Wellenlänge λex
ein annähernd unverändertes (gauß’sches) Profil beibehält. Diese SWP ist in Abbildung 6 dargestellt. Sie besteht aus vier doppelbrechenden Kristallen in verschiedenen Winkelstellungen,
die für die Wellenlänge λST ED als λ/2-Plättchen wirken. Die einzelnen Segmente sorgen dafür, dass gegenüberliegende Teile des Strahls antiparallel zueinander polarisiert werden. Beim
Fokussieren durch das Objektiv erhält man deshalb im Zentrum destruktive Interferenz der
Teilstrahlen.
3.4. Time Gated STED
1
0.9
Anregung
STED
Signal ohne STED
Signal mit STED
Gate
Signal mit Gate
Fluoreszenz [A.U.]
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
36nm
0.3
0.2
0.1
0
30nm
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
−8
x 10
t [s]
Abbildung 7: Links: Schema zum Signalverlauf mit Gating. Fluoreszenz aus dem Zentrum des
Donuts (’Signal ohne STED’) wird nicht stimuliert ausgeschaltet und zerfällt mit der natürlichen
Lebensdauer. Flurophore aus dem Randbereich wechseln durch stimulierte Emission deutlich
schneller in den Grundzustand (’Signal mit STED’): Ohne Gating wäre dies als beugungsbegrenzter Hintergrund sichtbar. Rechts: Simulierte PSFs mit einem STED-Puls der Länge T = 2 ns und
den entsprechenden Halbwertsbreiten. Oben ohne Gating, unten mit einem Gate, das nach 1.5 ns
beginnt.
Der angeregte Zustand eines Farbstoffmoleküls geht typischerweise mit einer Lebensdauer von
τf l ≈ 3 ns durch spontane Emission in den Grundzustand über. Werden angeregte Farbstoffmoleküle mit einem STED-Laser (innerhalb des Emissionsspektrums) bestrahlt, können sie auch
durch stimulierte Emission in den Grundzustand zurückkehren (vgl. Abschnitt 1.1). Welcher
Prozess dominiert, hängt von der Pulsenergie des STED-Lasers ab. Ein effektiver STED-Effekt
kann nur beobachtet werden, falls der STED-Laser ausreichend viele Photonen innerhalb eines
Zeitintervalls liefert, das im Vergleich zu τf l klein ist.
Im Optimalfall sind Anregungs- und STED-Puls kurz verglichen mit τf l . Für den Anregungslaser ist das im Versuch mit einer Länge von unter 100 ps der Fall. Der STED-Laser hingegen
hat eine Pulslänge von ca. 1.5 ns. Deshalb werden während des Ausschaltvorgangs noch aus
9
4 FRAGEN ZU DEN GRUNDLAGEN
dem gesamten angeregten Bereich emittierte Photonen detektiert. Dieser beugungsbegenzte Hintergrund verschlechtert die erreichbare Auflösung, wie in Abbildung 7 verdeutlicht wird. Um
diesen Effekt zu umgehen wird das sogenannte (Detektions) Time Gating verwendet. Hierbei werden bei der Signalauslese nur Photonen berücksichtigt, die innerhalb eines bestimmten
Zeitfensters (Time Gate) ankommen. Wird dieses Zeitfenster zeitlich hinter den STED-Puls
geschoben, ist sichergestellt, dass kein Signal aus dem ’noch nicht ausgeschalteten’ Bereich zum
Bild beiträgt. Den Vorteil, den das Time Gating bringt, muss man gegen das bis zum Gate
Startpunkt emittierte (nutzbare) Signal eintauschen.
4. Fragen zu den Grundlagen
• Was ist Fotobleichen von Fluoreszenzfarbstoffen und worauf beruht es?
• Wie ist die Punktantwort (PSF) eines abbildenden optischen Systems definiert?
• Wodurch wird bei einem KM die Auflösung (lateral und axial) bestimmt?
• Wann und warum werden Immersionsobjektive verwendet (Wasser n ≈ 1.3, Öl n ≈ 1.5)?
• Das Auflösungsvermögen eines KM kann man (im Prinzip) mit Hilfe von Streuung an
kleinen Goldkügelchen (Goldbeads, ∅ ≈ 20 nm) bestimmen. Funktioniert das auch bei
STED? Warum nicht?
• Vervollständigen Sie die schematische Abbildung 3 eines KM zu einem easySTED Aufbau.
• Erklären Sie die Funktionsweise der easySTED Phasenplatte
• Wie funktioniert eine Avalanche-Photodiode und welche Parallelen bestehen zu einem
Photomultiplier?
10
Teil II.
Durchführung
11
5 SOFTWARE
Bitte beachten Sie bei der Durchführung des Versuches, dass der Aufbau auch zur
Forschung verwendet wird. Die Komponenten sind zum Teil sehr teuer und empfindlich. Benutzen Sie nur Geräte, die Sie kennen und bedienen können. Insbesondere die
Optiken (v. a. das Objektiv) bedürfen äußerst sorgsamer Handhabung. Vielen Dank!
Abbildung 8: Aufbau. 1. Galvanometernetzteil 2. Kamera 3. Hilfsfaser 4. Powermeter 5. Mikroskopstativ und Probentisch 6. Strahlführung zum Objekt und Detektor 7. Laser und -einkopplung
5. Software
Bei der Durchführung des Versuches kommt Software zum Einsatz, die speziell für die Verwendung und Simulation des STED-Mikroskops entwickelt wurde. Beide Programme werden in der
Arbeitsgruppe im täglichen Betrieb verwendet. Sie sind daher sehr umfangreich und können auf
den ersten Blick unübersichtlich erscheinen. Am Praktikumssetup liegen jedoch Bedienhilfen
aus, in denen die für Sie nötigen Funktionen beschrieben werden. Lassen Sie sich die Programme
außerdem von Ihrem Betreuer erklären bzw. wenden Sie sich bei Fragen an ihn.
Quad-Scanner
Zur Experimentsteuerung kommt das LabView-Programm QUAD-Scanner zum Einsatz. Es
steuert über eine FPGA-Karte die Laser und den Strahlscanner. Es nimmt die Signale der
12
6 JUSTAGE DES SETUPS
APD bzw. der PMT entgegen und erlaubt die Aufbereitung und die Anzeige der Rohdaten.
PSF-Rechner
Zur Simulation von point spread functions und auch des gesamten STED-Prozesses steht das
Programm PSF-Rechner zur Verfügung. Es berechnet die vektoriellen (elektromagnetischen)
Lichtfelder in der Umgebung der Fokusebene. Da in der Mikroskopie hohe numerische Aperturen
auftreten, sind die gebräuchlichen skalaren Näherungen der Lichtfeld-Berechnung nicht mehr
ausreichend.
6. Justage des Setups
ACHTUNG: Bitte beachten Sie während der gesamten Durchführung des Versuchs die Grundregeln der Lasersicherheit. Legen Sie reflektierende Elemente wie Uhren oder Schmuck ab, wenn
Sie am Aufbau arbeiten. Vergewissern Sie sich stets über den Status der Laser und sprechen Sie
sich mit Ihrem Partner ab, bevor Sie Ihren Kopf auf Strahlhöhe bringen. Sie gefährden sonst
nicht nur sich selbst, sondern auch Ihren Partner.
Der gesamte optische Aufbau ist zu Beginn des Praktikums bereits justiert. Bis auf das
Einkoppeln des STED-Lasers in die Faser ist die Justage nicht Aufgabe des Praktikums. Der
optische Aufbau zwischen Faser und dem Mikroskopstativ (Abbbildung 11) ist extrem justageempfindlich. Eine geringe unkontrollierte Verstellung macht meistens eine gesamte Feinjustage
notwendig, was den Ablauf des Praktikums erheblich verzögern kann. Ändern Sie deshalb bitte
keine Einstellungen in diesem Teil des Aufbaus, ohne mit Ihrem Betreuer gesprochen zu haben.
6.1. Faserkopplung
Das Lasersystem (siehe Abbildung 10) besteht aus einem Anregungslaser und zwei STED-Lasern. Beim Anregungslaser handelt es sich um
einen Halbleiterlaser, der Picosekundenpulse bei 560 nm emittiert. Als
STED-Laser kommen zwei DVD-Laserdioden (660 nm) zum Einsatz,
die ebenfalls gepulst betrieben werden und über einen polarisierenden
Strahlteilerwürfel kombiniert werden. Alle Laser werden zusammen in
eine Faser gekoppelt, wie im Abschnitt 3.3 zu easySTED erläutert.
Grobjustage
Der Anregungslaser und einer der STED-Laser sind zu Beginn schon
in die Faser gekoppelt. Ihre erste Aufgabe ist es den zweiten STEDAbbildung 9: Direkte Laser ebenfalls in die Faser zu koppeln. Machen Sie sich zunächst mit
Laseransteuerung, ohder Laserdirektansteuerung (Abbildung 9) der QUAD-Scanner-Software
ne Scanning
vertraut und schalten Sie den entsprechenden Laser an. Bringen Sie den
losen Spiegelhalter in eine Position, in der Laserstrahl möglichst in rechtem Winkel zum Faserkoppler gespiegelt wird. Achten Sie darauf, dass
der Strahl mittig den Spiegel und den polarisierenden Strahlteiler trifft.
13
6.1 Faserkopplung
6 JUSTAGE DES SETUPS
Abbildung 10: Laser und Einkopplung. 1. Die STED-Laser 2. Spektralfilter zum Abschwächen 3.
Anregungslaser 4. Polarisierender (oben) und dichroitischer (unten) Strahlteiler. 5. Faserkoppler
Schrauben Sie ihn mit der Pratze auf dem optischen Tisch fest. Die Schraube sollte sehr fest
sitzen (bitte mitdenken: nach fest kommt ab!).
Um möglichst viel Licht durch die Faser zu transmittieren (theoretisch möglich sind bis zu
70%), müssen Auftreffort und -winkel sehr präzise mit der Orientierung des Faserkerns übereinstimmen. Um alle Freiheitsgrade einstellen zu können, steht mit den beiden optomechanischen
Haltern für Ort und Winkel in horizontaler und vertikaler Richtung je eine Schraube zur Verfügung (insgesamt 4). Da die beiden Parameter nicht nacheinander separat eingestellt werden
können, kommt später das iterative Beam-walking zur Anwendung.
Schrauben Sie zunächst die Faser vom Koppler ab und zielen Sie mit den Justageschrauben
des Laserhalters und des gerade angeschraubten Spiegelhalters auf das Zentrum des Faserkopplers, bis der Strahl möglichst symmetrisch (in Lage und Winkel) austritt. Dann nehmen Sie
einen (alten) Spiegel, drücken ihn plan gegen den Faserkoppler (Laserschutz beachten!!) und
richten den reflektierten Strahl mit den Schrauben des Spiegelhalters auf den Laser aus 1 . Wiederholen Sie die Schritte bis per Augenmaß sowohl der Strahl am Faserkoppler, als auch der
reflektierte Strahl am Laser zentrisch auftrifft.
Schrauben Sie nun die Hilfsfaser ein und überprüfen Sie (Faserende dicht an eine weiße
Fläche halten), ob bereits Licht durch die Faser gelangt. Falls dies nicht der Fall ist, sollte es
sich durch geringfügige Änderungen an einer Schraube erreichen lassen. Andernfalls sollte der
1
Einen Laserstrahl in seine Laserquelle zu reflektieren ist nur bei unempfindlichen Lasern (wie den hier eingesetzten Halbleiterlasern) zu empfehlen. Viele Lasertypen können durch einen solchen externen Resonator
zerstört werden
14
6.2 Beleuchtungsstrahlengang
6 JUSTAGE DES SETUPS
Strahl erneut bei abgeschraubter Faser zentriert werden.
Geht Licht durch die Faser, suchen Sie eine möglichst helle Einstellung mit Hilfe der vier
Schrauben. Nach diesem Schritt sollte die Kopplungseffizienz (Messung der Leistung vor und
hinter der Faser) schon mindestens einige Prozent betragen.
Feinjustage
Entfernen Sie nun die Hilfsfaser und verwenden Sie ab sofort die Faser, die zum Mikroskopstativ
führt. Stellen Sie das Powermeter so auf, dass der Messkopf vor dem Scanner steht (Vorsicht,
möglichst keine anderen Komponenten des Aufbaus dabei berühren) und optimieren Sie die
Lasereinkopplung. Lassen Sie sich dazu nochmals erklären, wie sie möglichst effizient das Beamwalking betreiben. Die Transmissionseffizienz des Laserlichts durch die Faser sollte mindestens
50% − 60% betragen. Optimieren Sie zum Abschluss alle Lasereinkopplungen der Reihe nach,
beginnend mit dem grünen Laser (Wellenlänge am Powermeter ändern). Nach dem grünen
Laser optimieren Sie den bereits voreingestellten STED Laser und danach den von Ihnen selbst
aufgebauten Strahlweg (warum diese Reihenfolge?).
6.2. Beleuchtungsstrahlengang
In diesem und im nächsten Abschnitt wird der Aufbau zwischen Faser und Mikroskop beschrieben (s. Abb. 11). Justieren Sie bitte nicht ohne Absprache nach. Verwenden Sie zum
Nachvollziehen des Strahlengangs im Folgenden den grünen Laser.
Hinter der Faser befinden sich zunächst zwei Spiegel, mit denen der Laserstrahl (durch Beamwalking), auf die Achse des Scanners ausgerichtet werden kannn. Dann folgt ein doppelter
Bandpass Filter, der die Beleuchtung von der Detektion trennt. Der Strahlscanner ist um die
Position des Mikroskop-Zwischenbildes herum am Sideport des Stativs angeflanscht. Durch die
zwei Galvanometerspiegelpaare kann der Laserstrahl durch das Zwischenbild bewegt werden.
So lässt sich jeder Punkt in der Probenebene adressieren.
Abbildung 11: Strahlengang vor Stativ und Detektor. 1. Objekttisch 2. Sperrfilter 3. Detektor
(APD) 4. Strahlscanner 5. Multibandpass 6. Faserauskoppler. Anregung: grün, STED-Lich: rot,
Fluoreszenzlicht: orange
15
6.3 Auflegen von Proben und Fokussuche
6 JUSTAGE DES SETUPS
6.3. Auflegen von Proben und Fokussuche
Auflegen der Probe Im weiteren Verlauf des Versuchs werden Sie mehrfach die Probe wechseln und den Fokus suchen müssen. Vor dem Auflegen sollten Sie gegebenenfalls vom Objektiv
und dem Deckglas der Probe mit einem Labortuch (vorsichtig!) altes Immersionsöl entfernen.
Bringen Sie nun einen kleinen Tropfen neues Öl auf die Mitte des Objektivs auf und legen Sie
die Probe vorsichtig in die passende Aussparung des Probentischs.
Fokussuche Aufgrund der hohen Apertur und der Konfokalisierung wird nur Licht aus der
unmittelbaren Umgebung (wenige 100 nm) der Fokusebene detektiert. Zwar ist das absolut
erwünscht, erschwert aber erst einmal die hier sehr dünne Schicht von Beads in die Fokusebene
zu bekommen. Um die Suche schon in der Nähe des Fokusses zu starten, drehen Sie mit den
Probentischschrauben die Probe soweit in Richtung Objektiv, bis sich der Ölfleck, der von
oben zwischen Deckglas und Objektiv sichtbar ist (s. Abb. 12), nicht mehr weiter vergrößert.
Dann liegt die Probe auf dem Objektiv auf. Achtung: nicht noch weiter runter drehen, sonst
Abbildung 12: Deckglas auf Objektiv
zerstören Sie die Probe! Von dieser Position aus finden Sie die korrekte Fokuslage grob eine
halbe ’Schraubenumdrehung’ weiter oben.
6.4. Detektionsstrahlengang
Nun sollen Sie überprüfen, ob das emittierte Signal sauber auf den Detektor abgebildet wird.
Legen Sie die Probe ’Goldbeads 1:5’ auf. Drehen Sie die Probe so, dass das verspiegelte Viertel
beleuchtet wird. Der Reflex dieses Spiegels kann verwendet werden um den Detektionsstrahlengang zu visualisieren. Decken Sie mit einem Papier das Loch ab, durch das der Detektionsstrahl
in die abgedunkelte Detektorbox fällt und ziehen Sie den Netzversorgungsstecker aus der APD
um diese vor zu viel Licht zu schützen. Aktivieren Sie den grünen Laser (s. Abb. 9) und suchen
Sie mit den senkrechten Schrauben am Objekttisch den Fokus. Um dem Fokus nahe zu sein,
muss der reflektierte Strahl auf dem Papier vor der Detektorbox möglichst fokussiert sein.
Verwenden Sie zunächst den xzt-Scanmodus (siehe Abbildung 13 und aktivieren Sie den grünen Laser. Starten Sie den Prescan-Modus (vgl. Hauptfenster in Abb. 17). Durch das Scannen
16
6.4 Detektionsstrahlengang
6 JUSTAGE DES SETUPS
sehen Sie seine Größe schwanken (woher kommt der zweite Punkt auf dem Papier?). Nehmen
Sie den Deckel der Detektorbox ab und klappen Sie den Sperrfilter aus dem Strahlengang
(Abbildung 11).
Schieben Sie das Karbonröhrchen vor dem Detektor zurück, um
das Auftreffen des Strahls auf dem Detektor zu kontrollieren. Die
Detektorfläche mit einem Durchmesser von 100 µm dient in diesem
Aufbau als Pinhole der Detektion. Sollte der Strahl nicht treffen,
informieren Sie Ihren Betreuer.
Stoppen Sie den Scan, bringen Sie alles wieder in Ausgangsstellung (außer den Sperrfilter). Regeln Sie mit dem Clean-up Filter
die Intensität des grünen Lasers so weit herunter, dass Sie es mit
dem Auge gerade noch sehen und versorgen Sie die APD mit Strom.
Starten Sie den Scan. Nun sollte der Spiegel als horizontahorizontaler Strichler Strich sichtbar werden. Justieren Sie ggf. den Fokus
Abbildung 13: Scanmodi nach oder passen Sie die Helligkeit an. Stellen Sie den Fokus mit Hilfe des Schiebereglers genau auf die Mitte des Bildfeldes. Die QUAD
Scanner Software gibt Ihnen einen ungefähren Wert für die Halbwertsbreite des Spiegellinie an
(unter y- Richtung, siehe Abbildung 17). Liegt dieser zwischen 600 nm und 800 nm, und zeigen
sich außerdem keine ausgeprägten oder asymmetrischen Nebenmaxima, so ist die Detektion
gut eingestellt und das Mikroskop kann verwendet werden. Ansonsten informieren Sie Ihren
Betreuer, damit er die Detektion mit Ihnen feinjustiert.
17
7 AUFGABEN
7. Aufgaben
7.1. Aufnahme von Goldbeads
Um das fertig justierte abbildende System zu charakterisieren, muss ein Bild der lateralen (xy-Objektebene) und der axialen (x-z-, bzw. y-z- Ebenen) Punktantwort (PSF) aufgenommen
werden. Dazu eignen sich streuende Objekte wie z.B. Goldkügelchen, sog. Goldbeads. Solche
Beads befinden Sich auch in der Probe mit der der Detektionsstrahlengang überprüft wurde.
Stellen Sie eine Stelle neben dem Spiegel auf der Goldbead-Probe scharf. Nehmen Sie mit einem
xyt-Scan und einem xzt-Scan die Umgebung eines Goldbeads unter Beleuchtung mit 560 nm
auf. Blaue Pixel im Bild deuten auf einen übersättigten Detektor hin - die Intensität sollte in
dem Fall noch weiter reduziert werden.
7.2. Aufnahme von fluoreszierenden Beads und NA
Um das Mikroskop nun in seiner Funktion als Fluoreszenzmikroskop zu
testen, soll eine Probe von 200 nm großen Kügelchen, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefüllt sind, betrachtet werden. Tauschen Sie dazu
die Goldbeadprobe gegen eine Probe mit 200 nm großen fluoreszenten
Beads aus. Klappen Sie den Sperrfilter, welcher nur Licht der Wellenlänge λ = 595 nm ± 25 nm transmittiert, zurück in den Detektionsstrahlengang. Durch ihn kann kein störender Linsenreflex der Beleuchtung in den
Detektor gelangen. Stellen Sie durch einen xzt-Scan den Fokus grob ein.
Die Auflösung eines Lichtmikroskops ist (in skalarer Näherung) invers
proportional zur Numerischen Apertur des Systems (vgl. (4)). Durch
Vergrößerung/Verkleinerung der Blende des Mikroskops kann die Numerische Apertur in einem Bereich von 1.4 bis 0.7 durchvariiert werden.
Voraussetzung hierfür ist jedoch, dass das Objektiv voll ausgeleuchtet
wird. Nehmen Sie von der aufliegenden Probe jeweils ein Bild mit minimaler und maximaler Apertur auf. Die Blende im Objektiv lässt sich Abbildung 14: Das
mit Hilfe des geriffelten Rings (Abbildung 14 ) verändern, der minimale verwendete Objektiv.
Wert liegt beim Stop dieses Rings, für den maximalen Wert muss er etwa
eine halbe Umdrehung gegen den Uhrzeigersinn (Blickrichtung in Laserstrahlrichtung) gedreht
werden.
7.3. Manipulation der Phasenplatte
Die Phasenplatte erzeugt die torusförmige STED-Intensitätsverteilung und ist somit essentiell
für die Auflösungsverbesserung, die mit dem System erreicht werden kann. In dieser Aufgabe
soll Ihre Wirkungsweise durch Manipulation der Polarisation von Teilstrahlen untersucht werden. Dazu wird der STED-Strahl auf eine CCD Kamera fokussiert, wofür eine vormontierte
Optik bereitsteht (Abbildung 15). Drehen Sie den Revolver des Mikroskopstativs so, dass die
Phasenplattenhalterung mit der Aufschrift 660 nm oben ist und schrauben Sie den Messinghalter anstelle des Objektivs auf die Phasenplattenhalterung. Setzen Sie das Gestänge mit der
Kamera auf den Messinghalter. Vorsicht: überprüfen Sie zuerst, dass die Kamera fest auf dem
Gestänge sitzt und kein Loses Teil auf den Aufbau fallen kann! Benutzen Sie zunächst keinen
Polfilter. Stellen Sie den Strahlscanner auf die Mitte des Bildfelds ein und schalten Sie einen
18
7.4 Gating und Pulstiming
7 AUFGABEN
Abbildung 15: Vorrichtung zur Charakterisierung der Phasenpalatte. (1), (2), (4): Linsen zur
Fokussierung des Strahls auf der CCD Kamera (5). (1) verfügt über eine Feinverstellung des
Fokusses. (2) kann lateral verschoben werden um das Bild zu zentrieren. Am unteren Bildrand
sind der Messinghalter für das Gestänge und der Polfilter zu sehen. Letzterer kann in den Halter
(3) eingesetzt werden.
der roten Laser an. Schauen Sie sich das Bild mit dem Programm IC Capture an und suchen
Sie den Fokus. Dabei erscheint der Donut deutlich erkennbar, aber als sehr kleine Struktur auf
der Kamera. Achten Sie darauf, dass die Kamera nicht übersättigt ist und reduzieren Sie ggf.
die Lichtleistung noch weiter. Speichern Sie ein Bild des torusförmigen Strahlprofils ab.
Setzen Sie dann den Polfilter vor die Kamera. Welche Funktion hat er und welchen Effekt
erwarten Sie dementsprechend bei Verwendung an dieser Stelle? Schalten Sie einen der STEDLaser an und betrachten Sie die resultierende Intensitätsverteilung. Drehen Sie den Filter und
speichern Sie zwei Bilder, wobei Sie den Polfilter zwischendurch um 90◦ drehen. Benutzen Sie
nun den anderen STED Laser und schauen Sie schließlich die Intensitätsverteilung beider Laser
zusammen an. Sollten Sie während dieses Versuchsteils eine Asymmetrie im Intensitätsmuster
der STED Strahlen feststellen, informieren Sie Ihren Betreuer. Dies deutet auf eine Dejustage
hin, die es später erschwert gute STED Aufnahmen zu machen.
Schalten Sie nun nur den grünen Laser an und entfernen Sie den Polfilter. Evtl. müssen Sie
den Fokus neu einstellen. Speichern Sie auch hier ein Bild ab.
7.4. Gating und Pulstiming
Gating In der Tabelle mit der Überschrift Detector channels (siehe Abbildung 16) im
QUAD-scanner-Programm können Sie die Time Gating Einstellungen vornehmen. Sie können
19
7.4 Gating und Pulstiming
7 AUFGABEN
Abbildung 16: Konfiguration der Laser und Detektionskanäle. In diesem Beispiel wird die volle
Repetitionsrate genutzt (die oberen ’pulse’ Matrizen sind vollständig aktiviert). Nur ein Detektionskanal ist aktiv (line 0, dabei sind der Anregungslaser (560 ) und ein STED-Laser (660 )
aktiv.
(bei jedem der maximal vier Detektionskanäle) ein Zeitfenster (Gate) auswählen, während dem
das Detektorsignal ausgelesen werden soll. In der Tabelle können Sie Startzeitpunkt (ns delay)
und die Länge des Gating-Zeitfensters (ns gate) einstellen. Beachten Sie, dass die vier Kanäle
leicht unterschiedliche Signallaufzeiten aufweisen können und der Startzeitpunkt dementsprechend für alle Kanäle einzeln kalibriert werden sollte. Dazu stellen Sie zum Beispiel auf eine
Goldbead-Probe oder einen Spiegel scharf, beleuchten mit dem grünen Anregungslaser und
verschieben für jeden Kanal den Startzeitpunkt des Gates so lange(in welche Richtung?), bis
kein Signal mehr detektiert wird. Die Gate-Länge sollte einige Nanosekunden betragen. Wird
die Länge auf den speziellen Wert 0 gesetzt, wird das Gating deaktiviert und die ganze Zeit
detektiert. Diese Einstellung wird im folgenden Abschnitt benötigt.
Pulstiming Die zeitliche Abfolge des Anregungs- und STED-Pulses muss für einen möglichst
guten STED-Effekt sehr genau eingestellt sein. Vergegenwärtigen Sie sich nochmals, warum der
STED-Puls weder zu spät, noch zu früh kommen darf. Die Pulse sind zu Praktikumsbeginn bis
auf wenige Nanosekunden so eingestellt, dass Sie in etwa gleichzeitig starten. Ihre Aufgabe ist es
nun, diese Einstellung zu optimieren. Dieser Schritt ist notwendig, weil die elektronischen Triggersignale, die die Pulse auslösen, täglichen Schwankungen von einigen hundert Pikosekunden
unterliegen können.
Ein möglichst guter STED-Effekt ist erreicht, wenn die angeregten Fluorophore durch das
STED-Licht möglichst effizient per stimulierter Emission zurück in den Grundzustand (AUS-)
geschaltet werden. Werden etwa fluoreszente Beads erst angeregt und direkt darauf durch das
STED-Licht wieder ausgeschaltet, ist das Timing genau dann am besten, wenn das entstehende
Beadbild möglichst dunkel ist (wieviel dunkler sollte es in diesem Aufbau etwa werden können?).
Dazu Schrauben Sie das Objektiv auf ein Auge des Objektivrevolvers, das keine Phaseplattenhalterung trägt (was ändert sich, wenn die Laserstrahlen die Phasenplatte nicht durchlaufen?),
schrauben den Probentisch wieder an (so, dass er nicht wackelt, aber nicht zu fest) und legen
die fluoreszente Probe mit den 200 nm großen Beads auf (Öl nicht vergessen).
20
7.5 Messung der Sättigungsintensität
7 AUFGABEN
Das Verschieben der Lasertimings geschieht in der Matrix Laser channels im Quad-Scanner
(s. Abb. 16) in der Zeile ns delay. Wie dort zu sehen, soll zunächst der Anregungslaser und
einer der STED-Laser, sowie ein Detektionskanal (z.B. line 0) aktiviert sein. Sind die fluoreszenten Beads im Fokus, wird nun das Timing des STED-Lasers verschoben, bis das Bild
möglichst dunkel wird. Am einfachsten wird im prescan-Modus der Cursor in das Feld ns delay
gesetzt und mit den Pfeiltasten oder dem Scrollrad der Maus verschoben. Anschließend wird
dieses Prozedere mit dem zweiten STED-Laser wiederholt. Sind die (relativen) Einstellung der
beiden STED-Laser gefunden, können auch beide gemeinsam über das Feld common delay (keine negativen Werte möglich) gegen den Anregungslaser verschoben werden. Notieren Sie die
gefundenen Werte für die Laser Delays unbedingt, denn bei einem Neustart des Programms
werden die Default-Werte wiederhergestellt.
7.5. Messung der Sättigungsintensität
Die Sättigungsintensität Is ist ein Maß dafür, wie viel STED-Intensität benötigt wird um angeregte Fluorophore mit fünfzigprozentiger Wahrscheinlichkeit ’auszuschalten’ (s. Abschnitt 3.2).
Sie ist definiert als
Is = hν · ln(2)/σst T
(8)
mit der Photonenenergie hν und der STED-Pulsdauer T (siehe Anhang 18). Somit ist sie vom
verwendeten STED-System abhängig. Wie in Gleichung 7 gezeigt wurde, kann man bei bekannter Sättigungsintensität die erreichbare Auflösung abschätzen. Diese Größe sollen Sie nun mit
Hilfe des exponentiellen Abklingens der Fluoreszenz bei verschiedenen STED-Laserleistungen
bestimmen (vgl. Abb. 5 in Abschnitt 3.2). Auch hier verwenden Sie die Probe mit den 200 nm
großen fluoreszenten Beads.
Da die Messung nicht durch ’frühe’ Photonen aus dem beugungsbegrenzten Hintergrund (vgl.
Abschnitt 3.4) verfälscht werden soll, stellen Sie ein Gate ein, das eine Detektion erst nach dem
Ende des STED-Pulses zulässt, also etwa einen Wert von 1.5 im Feld ns delay.
Messen Sie als erstes die Anregungsleistung. Zu starke Anregung kann die Messung verfälschen und später auch die Auflösung verschlechtern. Eine Pulsenergie des Anregungslaser von
etwa 0.5 pJ vor dem Scanner reicht aus. Überlegen Sie sich nun geeignete Messpunkte, um den
exponentiellen Abfall der Bead-Helligkeit möglichst gut einzufangen. Da alle Beads etwas unterschiedlich hell sind, ist es zweckmäßig, den Quotienten der Helligkeit mit und ohne STED-Licht
für alle Beads separat zu bilden und anschließend über mehrere Beads zu mitteln.
Beispielhaft sind in Abb. 18 nur die Anregung als Referenz in line 0 und Anregung sowie
STED für die restlichen drei Detektionskanäle in line 1 verwendet um für jeden Bead schneller
Statistik zu gewinnen. Dazu sollte das Timing der einzelnen Kanäle wie beschrieben kalibriert
sein.
Die ’Helligkeit’ der Beads kann im Quad-Scanner links im Reiter view und dann measure
ermittelt werden (vgl. Abbildung 17). Dazu wird das grüne Kreuz im Display auf den zu vermessenden Bead zentriert. Anschließend wird das blau gestrichelte Quadrat im Display so gewählt,
dass es den Bead gerade umschließt. Ein Klick auf grab center startet den zweidimensionalen
Gaußfit. Der Parameter FWHM gibt die Halbwertsbreite an, der Parameter amp ist ein Maß für
die Helligkeit des Beads.
Beginnen Sie die Messung der Sättigungskurve, indem Sie ein eher kleines Bildfeld mit einigen
Beads auswählen und darin die Fluoreszenz mit und ohne aktiviertem STED-Laser (warum ist
ein STED-Laser in diesem Fall ausreichend?) messen. Notieren sie ebenfalls die Halbwertsbreite
21
7.5 Messung der Sättigungsintensität
7 AUFGABEN
Abbildung 17: Messwertanzeige in der Software. Rot umrandet und vergrößert sind die Werte für
den zweidimensionalen Gaußfit. Wichtig sind die Werte für die Halbwertsbreite FWHM und und
die Amplitude amp.
(FWHM) (wozu?). Ändern Sie mit dem Clean Up-Filter vor der Faser die STED-Leistung, messen
diese erneut um dann wieder die Fluoreszenzlevels zu messen. Legen Sie eine Messreihe mit
7-10 verschiedenen Leistungswerten an.
Achten Sie auf eine ausreichend hohe Helligkeit und wechseln Sie ggfs. den Bildausschnit,
damit Photobleichen die Messung nicht verfälscht. Überprüfen Sie regelmäßig den Fokus!
Es hat sich bewährt, die Konsistenz der Messwerte durch eine grobe Auswertung (z.B. in
Excel) zu überprüfen, bevor Sie mit den nächsten Versuchsteil fortfahren: Passen die Messwerte
in etwa auf zu einem exponentiellen Abfall gemäß Abb. 18? Andernfalls ist eine Fehlersuche
und erneute Messung ratsam.
Checkliste
Anregungsleistung eingestellt?
STED-Leistung für 7-10 sinnvoll gewählte Messpunkte eingestellt?
Für jeden Leistungswert an mehreren Beads Amplitude und Halbwertsbreite vermessen?
War die Probe immer im Fokus?
Quotient der Amplituden mit und ohne STED gebildet und grobe Auswertung geplottet?
22
7.6 Optional: Herstellung von fluoreszenten Proben
7 AUFGABEN
Abbildung 18: beispielhafte Laser- und Detektionskonfiguration um gleichzeitig ein beugungsbegrenztes und drei Bilder mit STED aufzunehmen.
7.6. Optional: Herstellung von fluoreszenten Proben
Stellen Sie eine Probe von Red Fluorescent oder Nile-Red Beads her. Insbesondere Proben mit
kleineren fluoreszenten Beads neigen zum Auslaufen (weshalb tritt das vor allem bei kleineren
Beads auf?). Der enthaltene Farbstoff verteilt sich in der Probe und senkt den Kontrast. Deshalb
sind frische Proben vor allem für die folgend Aufgabe wichtig. Lassen Sie sich das Prozedere
von ihrem Betreuer zeigen.
Eine technische Probe mit fluoreszenten Beads wird wie folgt hergestellt:
1. Probenplättchen mit Ethanol reinigen
2. Mit 200 µl Poly-L-Lysin beschichten und 5-10 Minuten inkubieren lassen
3. Mit destilliertem Wasser waschen
4. Bead-Lösung im gewünschten Mischungsverhältnis mit dest. Wasser (1:40 000) herstellen
5. 200 µl Bead-Lösung auf Probenplättchen aufbringen und 10 Minuten inkubieren lassen
6. Mit destilliertem Wasser waschen und mit Druckluft trocknen
7. Mit 20 µl Mowiol oder TDE mit einbetten
8. Probe mit Nagellack versiegeln und beschriften
7.7. Time Gated STED
Nun soll das volle Potential des Mikroskops ausgeschöpft werden. Sie werden die Auflösungsverbesserung durch STED zuerst an einer technischen Probe mit farbstoffgefüllten Beads untersuchen. Verwenden Sie eine Probe mit geringerer Dichte als zur Messung der Sättigungsintensität
(z.B. red fluorescent beads, ø 40 nm, 1:40.000). Die kleineren Beads beinhalten viel weniger
23
7.8 Mikroskopie einer biologischen Probe
7 AUFGABEN
Farbstoff (wieviel weniger?) und sind entsprechend dunkler. Deshalb sollte die Anregungsleistung entsprechend angepasst und verschiedene Werte getestet werden.
Bestimmen Sie als erstes gute Parameter für das Time-Gating. Verwenden Sie dazu verschiedene Detektionskanäle, mit unterschiedlichen Gating-Einstellungen. Bevor Sie allerdings die
STED-Laser jeweils aktivieren, stellen Sie immer sicher, dass Sie sich im Fokus befinden. Machen Sie dazu mit ’PreScan’ Aufnahmen mit großer Pixelgröße und kurzer Pixelverweildauer
(Dwell Time) (z.B. 20 µs, 100 nm) , die Sie im Kasten pixel size in Abb. 17 einstellen können.
Suchen Sie mit dem z-Regler den Fokus. Danach stellen Sie für eine große Photonenausbeute
einige 100 µs Dwell Time und eine geeignete Pixelgröße für die STED-Aufnahme ein. Die geeignete Pixelgröße hängt von der anvisierten Auflösung ∆x ab, Stichwort undersampling, als
Faustregel gilt höchstens ∆x/2. Wählen Sie einen Kanal aus, der das beugungsbegrenzte Bild
aufnimmt und machen Sie mit den anderen Kanälen STED-Aufnahmen mit Gating. Speichern
Sie die Aufnahmen von mindestens zwei Bildfeldern ab, bei denen der Gating-Effekt gut sichtbar war. Durch speichern im ’save’ Tab werden übrigens automatisch Bilder von allen aktiven
Kanälen abgespeichert.
Führen Sie nun eine Messreihe durch, bei der am Ende die Auflösung in Abhängigkeit der
STED-Leistung dargestellt werden soll. Gehen Sie vor wie in 7.5. Für die beste Auflösung muss
möglichst viel STED-Leistung zur Verfügung stellen. Überprüfen Sie deshalb die Effizienz der
Faserkopplung beider STED-Laser und koppeln sie ggfs. nach.
Checkliste
Kleine fluoreszente Beads aufgelegt?
Beste Gating-Einstellung gefunden?
Beste Anregungsleistung eingestellt?
Pixelgröße passend gewählt?
Counts pro Pixel hoch genug? Dwell Time passend gewählt?
Volle STED-Leistung verfügbar (Einkoppeleffizienz überprüft)?
Probe genau im Fokus (wichtig!)?
Messreihe: Auflösung vs. STED-Leistung mit genügend Messpunkten und Statistik?
Bild mit höchster Auflösung abgespeichert?
7.8. Mikroskopie einer biologischen Probe
Nun soll noch die Anwendbarkeit von STED auf biologische Proben demonstriert werden. Stellen Sie auf jeden Fall unmittelbar vor der Messung der biologischen Probe sicher, dass Ihre
Timing- und Gating-Einstellungen optimal sind. Benutzen Sie dazu eine Bead-Probe. Legen
Sie eine biologische Probe auf, die Sie von Ihrem Betreuer erhalten. Lassen Sie sich zeigen, wie
Sie die Probe mit der Quecksilberdampflampe beleuchten und durch das Okular betrachten
können. Dies ist von Vorteil, da durch das Okular schneller ein viel größeres Bildfeld sichtbar
ist als beim Scannen. Das erleichtert die Suche nach interessanten Strukturen und nach dem
24
7.8 Mikroskopie einer biologischen Probe
7 AUFGABEN
Fokus ungemein. Schieben Sie den Teil der Probe, den Sie mit STED betrachten wollen in die
Mitte des Bildfeldes und schalten Sie auf Scannen um. Gehen Sie nun wie gewohnt vor um
STED Aufnahmen zu machen und speichern Sie einige gelungene Bilder ab.
25
Teil III.
Auswertung
26
8 PFLICHTAUFGABEN
8. Pflichtaufgaben
Die wichtigste Kenngröße bei der Auswertung Ihrer Mikroskopiedaten ist die Auflösung (∆x).
Die erreichbare Auflösung kann definiert werden als die kleinste gemessene Halbwertsbreite
(FWHM ) eines Testobjekts (hier fluoreszente Beads). Da die Ausdehnung des Testobjekts die
gemessene Halbwertbreite vergrößert, sollte die Größe des Testobjekts idealerweise deutlich
kleiner sein als die optische Auflösung des Mikroskops. Andernfalls muss die Objektgröße durch
Entfaltung von der gemessenen FWHM herausgerechnet werden. Weitere wichtige Größen in
der Mikroskopie sind das Signal-zu-Rausch-Verhältnis sowie der Kontrast. Achten Sie bei der
Auswertung auch auf diese Größen und diskutieren Sie Fälle, in denen Ihrer Meinung nach die
Aussagekraft des Bildes von diesen Werten beeinflusst wird.
8.1. Bestimmung der Sättigungsintensität
Aus der Messung der Leistung des STED-Strahls kann bei bekanntem Strahlprofil die maximale
STED-Intensität Imax bestimmt werden.
Zuvor muss jedoch die Leistung eines einzelnen Laserpulses, PPuls , berechnet werden. Gemessen wurde die Durchschnittsleistung Pø . Diese hängt über die Repetitionsrate des Lasers,
νL = 10 MHz, mit der Pulsenergie über die Beziehung EPuls = Pø /νL zusammen. Deshalb
ergibt sich mit der Pulsdauer T 2
P
EPuls
=
(9)
T
νL · T
Ohne Manipulation durch die Phasenplatte ist das Strahlprofil im Fokus des Objektivs gegeben
durch eine Gaußkurve
r2
−
(10)
I(r) = Imax e b2
PPuls =
mit b2 ≈
2 λ2
. Die Leistung PPuls ist gegeben durch
17 NA2
ˆ
PP uls = I(r) dA ,
(11)
womit Sie unter Verwendung von Gleichung 9 die maximale Intensität Imax bestimmen können.
Weiterhin gilt für die Restfluoreszenz bei STED Bestrahlung
If l (Imax )/I0,f l = η(Imax ) = e−ln(2) Imax /Is
(12)
im Vergleich zu der Fluoreszenz I0,f l ohne angeschalteten STED-Laser. vgl. Abschnitt 3.2. Erklären Sie warum Sie bei dieser Messung schon ein bestimmtes Gate eingestellt haben. Die Größen If l und If l,0 wurden indirekt aus den Amplituden eines Gaußfits als Maß für die Helligkeit
der fluoreszenten Beads bestimmt. Plotten Sie die Fluoreszenzunterdrückung η in Abhängigkeit
von Imax und bestimmen Sie mit einem Fit den Parameter Is .
2
Dabei wird vereinfachend ein Rechteckspuls der Breite T angenommen.
27
8.2 Die beugungsbegrenzte PSF
8 PFLICHTAUFGABEN
8.2. Die beugungsbegrenzte PSF
Bestimmen Sie theoretische Auflösungen, die sich nach der der Abbe’schen Auflösungsgrenze
∆xAbbe = λ/(2 NA) und der Auflösung des konfokalen Mikroskops ∆xkonf. ∼
= 0.4 · λ/NA.
Vergleichen Sie diese Werte mit den experimentell bestimmten Werten.
8.3. Bestimmung der Auflösung
Berechnen Sie die maximal zu erwartende Auflösung anhand von (7) und mit Hilfe des Wertes
für die Sättigungsintensität Is . Messen Sie außerdem in Ihrem Bild mit der besten Auflösung
die FWHM eines Beads, indem Sie die FWHM eines zweidimensionalen Gaußfits bestimmen
und eine Gaußkurve an das Linienprofil fitten. Aus dem Fit erhalten Sie die Breite (beachten
Sie FWHM 6= σ). Dieses Bild und den Fit geben Sie bitte extra ab, damit Sie beim F68 STED
Resolution Ranking eingetragen werden können. Stellen Sie sicher, dass der gemessene Bead
deutlich aus dem Rauschen heraustritt - einige wenige Counts in den hellsten Pixeln ist nicht
unbedingt vertrauenswürdig!
Tragen Sie sowohl die gemessenen Auflösungen ∆xexp , als auch die mit der gemessenen Sättigungsintensität zu erwartenden Auflösungen ∆xtheo über Imax auf. Beachten Sie, dass bei dieser
Aufgabe ein anderes Strahlprofil benutzt wurde, die Intensitätswerte entsprechen also bei gleichen Leistungen nicht denen aus der vorigen Aufgabe. Das STED-Strahlprofil kann genähert
werden durch
x2
2
2
(13)
I(x) = Imax 2 e1−x /a
a
mit a2 ≈ 15 λ2 /N A2 . Vergleichen Sie die beiden Kurven für Theorie und Experiment. Nennen Sie mögliche Gründe für Abweichungen. Welche Auflösungsverbesserung im Vergleich zur
beugungsbegrenzten Aufnahme haben Sie erreicht?
Aus den Messwerten für die Laserleistung soll Is erneut berechnet werden. Vergleichen Sie
die Werte aus der Rechnung und Experiment für (höchste) Auflösung und Sättigungsintensität
und diskutieren Sie die Ergebnisse.
Checkliste
Theoretische (beugungsbegrenzte) Auflösung berechnet? Vergleich mit Praxis?
Am Powermeter gemessene Leistung in Imax umgerechnet (für Donut und Gaußstrahl)?
Fluoreszenzunterdrückung η gegen Imax aufgetragen?
Sättingungsintensität als Fitparameter bestimmt?
Beste Auflösung (2d oder 1d Gaußfit)? Vergleich mit Theorie?
Auflösung in Abhängigkeit von Imax aufgetragen?
Aus Fit an dem Wurzelgesetz Is erneut ermittelt?
Wurzelgesetz mit Is aus erstem Versuchsteil zum Vergleich aufgetragen?
Kritische Diskussion zu Messfehlern und Belastbarkeit der Ergebnisse (insbes. hinsichtlich
Kontrast-/Rauschverhältnisse)
28
Teil IV.
Anhang
29
A BERECHNUNG DER STED AUFLÖSUNG
A. Berechnung der STED Auflösung
A.1. Gepulster Betrieb
Die Anzahl an Molekülen im Grundzustand E0 sei N0 und die Anzahl an Molekülen im angeregten Zustand E1 sein N1 . Vor Beginn der Messung ist N1 vernachlässigbar klein und die
Teilchen im Grundzustand werden durch einen Lichtpuls angeregt. Nach diesem Lichtpuls erfolgt keine weitere Anregung. Das Strahlprofil der Anregung im Fokus erscheint in der lateralen
Objektebene (x-y-Ebene) gaußförmig mit Maximum in (0, 0). Aufgrund der Radialsymmetrie
des Problems wird die Ortsabhängigkeit nur eindimensional entlang der x-Richtung untersucht.
Damit ergibt sich zum Zeitpunkt t = 0 folgende Ortsabhängigkeit des angeregten Zustandes:
x2
N1 (t = 0, x) = A · e− b2 , A, b > 0
(14)
Zum Zeitpunkt t = 0 wird instantan ein Laserstrahl mit einer Wellenlänge zur stimulierten
Emission eingeschaltet, der eine konstante Leistung bis zur Zeit t = T liefert (Rechteckpuls).
1
Für dN
gilt:
dt
∂N1 (t, x)
1
IST ED (x)
= −N1 (t, x)
(15)
− N1 (t, x) σst
∂t
τsp
hν
Mit der Fluoreszenzlebensdauer τsp , der Intensität des STED Strahls IST ED und dem Wirkungsquerschnitt für die stimulierte Emission σst . Dies ist eine gewöhnliche lineare Differentialgleichung erster Ordnung mit der Lösung
N1 (t, x) = N1 (t = 0, x) · e
−t·( τ 1 + σst
sp
IST ED (x)
)
hν
(16)
.
Nach der Zeit t = T endet die Bestrahlung mit STED wieder instantan und das Fluoreszenzlicht
des übrig gebliebenen fluoreszierenden Spots wird detektiert. Dieser Spot ergibt sich also durch
fluoreszentes Zerfallen aller bis t = T noch in N1 verbliebenen Moleküle:
x2
N1 (t = T, x) = A · e− b2 · e
− τT
sp
=A·e
−T ·( τ 1 + σst
sp
2
− x2
b
·e
·e
IST ED (x)
)
hν
I
(x)
−ln(2) STIED
sat
(17)
.
(18)
Hier wurde die Sättigungintensität Isat = hνT ln(2)
als der Wert eingeführt, bei dem die Restfluoσst
reszenz nach dem STED Prozess auf die Hälfte zurückgegangen ist. Der Vergleichswert ist dann
der Wert für IST ED = 0, ebenfalls zur Zeit t = T , es handelt sich also um den Fall mit Gating.
Es sei außerdem darauf hingewiesen, dass die Sättigungsintensität nicht nur ein Parameter des
Farbstoffes ist, sondern der Kombination aus Farbstoff und STED Laser. Die Ortsabhängigkeit
von IST ED (x) im Fokus ist näherungsweise gegeben durch
IST ED (x) = Imax
x2 1− x22
e a
a2
(19)
PST ED
(20)
e π a2
Wobei PST ED die instantane Leistung des STED-Pulses darstellt, nicht zu verwechseln mit der
gemessenen Durchschnittsleistung Pavg . Aus der genauen vektoriellen Rechnung (simuliert mit
Imax =
30
A.1 Gepulster Betrieb
A BERECHNUNG DER STED AUFLÖSUNG
dem PSF-Rechner, basierend auf [Wol59, WR59]) ergibt sich für die Parameter a und b in guter
Näherung:
1 λ2
2 λ2
2
2
a ≈
, b ≈
(21)
5 NA2
17 NA2
Da nur eine kleine Umgebung um x = 0 von Interesse ist, kann IST ED durch folgende Entwicklung genähert werden:
e
(22)
IST ED (x) ≈ Imax 2 x2
a
Es ergibt sich damit
e·ln(2) Imax
− T
−x2 ( 12 +
)
Isat
b
a2
N1 (t = T, x) = A · e τsp · e
(23)
Für die Halbwertsbreite (FWHM) ∆x gilt
∆x
N1 (t = T, x = 0)
)=
2
2
N1 (t = T, x =
(24)
Und damit
∆x = q
2
1
b2
r
≈2
denn b ≈
2
a2
3
.
e·ln(2)
Mit 2
q
2 ln(2)
17
p
ln(2)
+
(25)
e·ln(2) Imax
a2
Is at
1
2 ln(2) λ
q
17 NA 1 +
(26)
,
Imax
Isat
≈ 0.57 ergibt sich schließlich
∆x ≈ 0.57
λ
q
NA 1 +
(27)
.
Imax
ISat
Dieses Ergebnis lässt sich unter Verwendung der Pulsenergie EST ED umformulieren, womit es
vom verwendeten STED Laser unabhängig wird. Die Pulsenergie ergibt sich durch zeitliche
Integration eines Laserpulses, was mit Hilfe von (20) zu
ˆ T
EST ED =
PST ED (t) = Imax T πa2 e
(28)
0
wird. Setzt man dies in (25) ein, so ergibt sich
p
p
2 ln(2)πa2
2 ln(2)πa2
∆x = q
=q
.
EST ED
πa4
EST ED
17π
λ 2
+ hν σst
+ hν σst
b2
50
NA
Wegen
17π
50
p
≈ 1 und 2 πln(2)/5 ≈ 0.59 wird daraus
∆x ≈ 0.59
3
(29)
λ
q
NA 1 +
EST ED
σst
hν
(λ/NA)2
.
(30)
Dies ist eine etwas grobe Näherung, bedenken Sie beim Nachvollziehen jedoch auch, dass die Wellenlängen λ
in a und b eigentich nicht gleich sind.
31
A.2 Dauerstrichbetrieb
A BERECHNUNG DER STED AUFLÖSUNG
Im für STED interessanten Fall, bei dem der Radikant im Nenner 1 wird, kann man daraus
den Ausdruck
λ2
√
∆x ≈ 0.59
(31)
NA2 NST ED σst
gewinnen, bei dem NST ED = EST ED /hν die Anzahl der Photonen im STED Puls ist. Man sieht
in (31), dass die Auflösung nunmehr quadratisch von der Wellenlänge und der Numerischen
Apertur NA abhängt. Außerdem hängt sie nur noch von der Pulsenergie und dem Wirkungsquerschnitt der stimulierten Emission ab, nicht mehr von der Pulslänge.
A.2. Dauerstrichbetrieb
Im Dauerstrichbetrieb des Lasers des Mikroskops kann die Auflösung wie folgt berechnet werden. Dabei wird ein 4-Niveau-System (Energieniveaus siehe Abbildung 4 c)) als Modellsystem
verwendet:
Die Anzahl an Teilchen im Grundzustand sei N0 , die Anzahl an Teilchen im angeregten Zustand sei N1 und die Gesamtanzahl an Teilchen sei N = N0 + N1 . Letztere Gleichung kann
angenommen werden, da die Zeitskala der Zerfälle durch strahlungslose Relaxion der Vibrationszustände sehr klein ist gegenüber dem Zerfall aus dem angeregten Zustand.
Des Weiteren sei Wex = σex Iex /hνex die Wahrscheinlichkeit für die Anregung aus dem Grundzustand und WST ED = σst IST ED /hνST ED die Wahrscheinlichkeit für die stimulierte Emission. Der
Zerfall aus dem angeregten Zustand ist außerdem über spontane Emission oder nichtstrahlende
1
(τsp : Spontaner Zerfall,
Prozesse möglich. Die Zerfallskonstante dafür sei τ2 mit τ12 = τ1sp + τnr
τnr : Nichtstrahlende Prozesse) Es gilt dann:
1
∂N1 (x, t)
= Wex (x) N0 (x, t) − WST ED (x) N1 (x, t) − N1 (x, t)
∂t
τ2
(32)
1
∂N1 (x, t)
= Wex (x)(N (x, t) − N1 (x, t)) − WST ED (x) N1 (x, t) − N1 (x, t)
∂t
τ2
(33)
Für das stationäre Gleichgewicht mit
N1 (x) =
∂N1
∂t
= 0 folgt
Wex (x) N (x)
Wex (x) + WST ED (x) +
N1 (x) =
1+
1
τ2
=
σex Iex (x) N (x)
σex Iex (x) + σst IST ED (x) +
σex Iex (x) N (x)
σst IST ED (x)
+ τ2 σex1Iex (x)
σex Iex (x)
1
τ2
(34)
(35)
Die Ortsabhängigkeiten der Funktionen für Iex und IST ED sind bei eindimensionaler Betrachtung wieder gegeben durch
x2
max − b2
Iex (x) = Iex
e
2
x 1− x22
e a
a2
(37)
PST ED
e π a2
2 λ2
b2 ≈
17 NA2
(38)
max
IST ED (x) = IST
ED
max
IST
ED =
a2 ≈
1 λ2
,
5 NA2
32
(36)
(39)
A.2 Dauerstrichbetrieb
A BERECHNUNG DER STED AUFLÖSUNG
Wobei die Parameter a und b analog zu (21) bestimmt wurden. Betrachtet man nun einen
kleinen Bereich um x ≈ 0, so kann man Iex und IST ED annähern durch
max
,
Iex (x) ≈ Iex
max
IST ED (x) = IST
ED
e 2
x
a2
(40)
Das Signal der Fluoreszenz ist proportional zu N1 (x), deshalb ist die Auflösung durch die
Halbwertsbreite von N1 (x) gegeben. Es gilt
N1 (x) =
1
N
1+
1
max
τ2 σex Iex
1+
max
σst IST
ED
2
max + 1 )
a (σex Iex
τ
x2
=
N
1+
1
max
τ2 σex Iex
1
1 + α x2
(41)
2
α :=
max
σST ED IST
ED
1
max
2
)
σex Iex a (1 + τ2 σex
Iex
(42)
Das Profil von N1 (x) in naher Umgebung von x ≈ 0 ist also durch eine Lorenz-Kurve gegeben,
wohingegen die Verteilung beim gepulsten Betrieb einer Gaußverteilung (23) entspricht. Die
Halbwertsbreite ∆x (FWHM) errechnet sich daher zu
q
max + 1
σex Iex
p
τ2
λ
1
1
2λ
max + 1
p
q
=
0,
89
∆x = 2 √ = √
τ2 σex Iex
(43)
max
max
IST
NA
α
5 NA σST ED IST
ED
ED
ISat
ED
1, da für kleine STED-Intensitäten die TaylornäheAnmerkung: (43) gilt nur für σSTσexIST
Iex
rung von Iex in (40) ungenügend genau ist.
33
B HINWEISE ZUR DARSTELLUNG MIKROSKOPISCHER BILDER
B. Hinweise zur Darstellung mikroskopischer Bilder
• Für einfarbige Bilder wird typischerweise die ’fire’ (Imspector: ’fire’, Matlab: ’hot’, ImageJ:
’redhot’) colormap benutzt, wie es auch in der QUAD Scanner Software standardmäßig
der Fall ist.
• passen Sie die look up table (LUT) der colormap ggf. an um die für Sie interessanten
Bereiche im Bild kontrastreich darzustellen.
• Lassen Sie die LUT neben dem Bild anzeigen, damit offensichtlich ist, wie viele Photonen
Sie gesammelt haben.
• Verwenden Sie scale bars (’Maßstabsbalken’) um dem Betrachter direkt eine Vorstellung
der Größenskala zu vermitteln.
• Um die Auflösungsverbesserung durch STED zu verdeutlichen stellen Sie ein beugungsbegrenztes und ein STED Bild vom selben Bildausschnitt direkt nebeneinander.
• Besonders bei Bildern von biologischen Proben macht es sich gut, ein Übersichtsbild zu
zeigen, in dem beispielsweise eine ganze Zelle zu sehen ist, und einen Ausschnitt daraus,
in dem die erzielte Auflösung besonders gut zur Geltung kommt. Machen Sie dann auch
auf der Übersicht kenntlich, welchen Bildbereich Sie vergrößert darstellen
• Um die Auflösung, die Sie erreicht haben nachzuweisen, kann außerdem ein Linienprofil
verwendet werden, an dem die FWHM einer Struktur abgelesen werden kann, oder sie
wird gar über einen Fit an das Profil bestimmt.
Nicht alle diese Tipps müssen bei jedem Bild berücksichtigt werden, je nach gewünschter
Aussage. Wie ein Bild für die Auswertung aussehen kann zeigt Abbildung 19.
Abbildung 19: Fig. 3 aus ’Rankin, B. R., S. W. Hell: STED microscopy with a MHz pulsed
stimulated-Raman-scattering source Opt. Express 17, 15679-15684’. Diese Bilder enthalten zwar
keine typischen scalebars, als Größenskala dienen jedoch die Ausschnittsquadrate, bei denen die
Seitenlängen angegeben sind.
34
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