Status Projekt 2013 - Gilead Förderprogramm Infektiologie

KulturKultur-unabhängige mikrobiologische Diagnostik von polymikrobiellen
Infektionen bei Patienten mit Zystischer Fibrose mittels „Deep Sequencing”
*
Prof. Dr. Alexander H.
1
Dalpke ,
Dr. Michael
1
Weitnauer ,Prof.
Dr. Marcus
2
Mall
1Dept.
of Infectious Diseases, Medical Microbiology and Hygiene,
2Division of Pediatric Pulmonology & Allergy and Cystic Fibrosis Center, Department of Pediatrics III, University Hospital Heidelberg, Germany
Das Problem
Patienten mit Cystischer Fibrose (CF) haben eine gestörte mukoziliäre Reinigung und Immunabwehr. Im Gefolge entwickeln Patienten chronische pulmonale Infektionen, die schließlich in irreversiblen Lungenschäden münden. Die klassische mikrobielle Diagnostik zielt im Wesentlichen darauf ab, Erreger mittels kultureller Verfahren anzuzüchten und zu identifizieren, um so eine gezielte antibiotische Therapie zu ermöglichen. Neuere Erkenntnisse zeigen allerdings, dass (i) CF
Patienten häufig polymikrobielle Infektionen aufweisen (PNAS 2008, 105:15070-75) und dass (ii) neben bekannten, anzüchtbaren Erregern auch schwer oder gar nicht
anzüchtbare Erreger vorkommen (Am J Respir Crit Care Med 2008, 177:995-1001, BMC Pulm Med. 2009, 9:14). Hier stößt die klassische mikrobiologische Diagnostik an ihre Grenzen. Die Befunde können erklären, warum trotz Verfügbarkeit moderner Antibiotika chronische Infektionen bei CF Patienten nicht ausreichend therapiert werden.
Die Fragestellung
Anstelle einer mikrobiellen Diagnostik, die - wie bisher - vor allem einzelne Infektionserreger sucht, könnte für CF Patienten die Identifikation der Gesamtheit aller
mikrobiellen Erreger (das „Mikrobiom“) vorteilhaft sein. Im Rahmen des geförderten Projektes wird eine diagnostische Methode zur individuellen Erfassung des
Mikrobioms von CF Patienten entwickelt, die auf ungerichteter, universeller 16S rRNA Nukleinsäureamplifikation und modernsten Sequenzierverfahren („massive
parallel sequencing, deep sequencing“) beruht.
Der Lösungsansatz
Erste Ergebnisse
Die individuellen Mikrobiome der Atemwege von CF Patienten werden
Kultur-unabhängig in einer Longitudinalanalyse untersucht. Es werden
• Aufbau und Rekrutierung einer Kohorte von Kindern mit CF, die zukünftig
mittels der optimierten, Kultur-unabhängigen Mikrobiologie untersucht
werden:
− N=67 Patienten, Alter ½-12 Jahre
− Gewinnung von 377 Proben, davon
N=45 komplette Serien mit RA, NA, Sputum
N=30 Serien prä- und post-Antibiose
N=21 Serien mit stabiler vs. Infekt-exazerbierter Phase
− für alle Proben Untersuchung mittels kompletter konventioneller
Mikrobiologie (einschl. Anaerobier) sowie DNA Extraktion
− aktuell werden die ersten 100 Proben analysiert
(i) Phasen relativer Stabilität,
(ii) Phasen mit infektiösen Exazerbationen und
(iii) Veränderungen nach Antibiotikatherapie
untersucht. Außerdem werden unterschiedliche Beprobungen (Sputa,
Rachenabstriche, Nasenabstriche, tiefe Atemwegsmaterialien) getestet.
Dazu werden mikrobielle 16S RNA Nukleinsäuresequenzen mit einem
kombinatorischen „Barcode“ System mittels Polymerasekettenreaktion
(PCR) universell und unabhängig von kultureller Anzucht amplifiziert. Die
Barcode markierten individuellen 16S Amplikons werden gemischt, mittels
Deep Sequencing analysiert und anschließend bioinformatisch zur
Identitätsbestimmung ausgewertet. Auf diese Weise werden modernste
Methoden der Mikrobiom-Sequenzierung in einer kostensparenden
Methode direkt für die verbesserte Diagnostik von Infektionen bei CF
Patienten eingesetzt.
• Optimierung der DNA Extraktion
und Entfernung von DNA „toter“
Bakterien mittels Monoazid Vorbehandlung und Kreuzvernetzung
• Erhebung eines Probedatensatzes zur Methodentestung
− 0.8-5 Mio Sequenzen/Probe (bei 12 parallelen Proben) Poolen von
bis zu 100 Proben (ca. 25€/Probe)
− >14 Genera mit mehr als 1% Frequenz
− deutliche Mikrobiomveränderungen („richness“&“diversity“) unter
Exazerbation
Ausblick
Die Ergebnisse dieser Studie werden es ermöglichen, individuelle polymikrobielle Infektionen bei CF Patienten im Kindesalter umfassend und sättigend zu
beschreiben und zu analysieren. Das Verfahren kombiniert die Vorteile der ungerichteten Nukleinsäureanalytik (16S rRNA Amplifikation und Sequenzierung) mit
der Quantifizierung wie sie nur mit modernen Hochdurchsatz Sequenzierverfahren (Deep Sequencing) möglich sind und geht damit wesentlich über die
klassische Diagnostik mikrobieller Infektionen mit kulturellen Verfahren hinaus.
* Gefördert durch einen Grant des Gilead Förderprogramms Infektiologie 2012, www.GILEAD-FOERDERPROGRAMM-INFEKTIOLOGIE.de
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