1,4MB

Genetik der Resistenz
tetR
B
tetA
59be
Repressor
(Thr)
A
(Ala)
G
(Pro)
C
(Stop)
A
T
(Ser)
A
C
G
(Trp) (Leu)
G
T
(Ser)
C
(Ser)
T
Peter Heisig
Universität Hamburg
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
1
Ursachen der Entwicklung von Resistenz
- mikrobielle Faktoren
Parameter
Mikroorganismus
Mensch
Faktor
Zellzahl gesamt
5 x 1031
6 x 109
∼ 1022
Masse [t]
5 x 1016
3 x 108
∼ 108
Generationszeit
30 min.
30 Jahre
∼ 5 x 105
Zeit auf Erden [Jahre]
3,5 x 109
4 x 106
∼ 103
haploides Genom
kurze Generationszeit
hohe Zellzahl
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
Spellberg et al., 2008
2
Resistenz
– ein „altes“ Problem der Antibiotikatherapie,
ein viel älteres Phänomen der Mikrobiologie
Antibiotikum
Jahr der
Zulassung (USA)
ersten Meldung
geschätztes Alter
der Resistenzgene
1939 * B. Wiedemann
Penicillin
1943
1940
2.000 Mio. Jahre
Streptomycin
1947
1947
610 Mio. Jahre
Tetracyclin
1952
1956
Methicillin
1960
1961
Nalidixinsäure*
1964
1966
Gentamicin
1967
1969
Vancomycin
1972
1987
Cefotaxim
1981
1983 (ESBL)
Linezolid*
2000
1999
*: synthestisch hergestellt
UniHH, PH2009
240 Mio. Jahre
ESBL: extended spectrum β-lactamase
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
3
Ursachen der Entwicklung von Resistenzgenen
- Antibiotika-bedingte Faktoren I
Natürliche Antibiotika
Synthetische Antibiotika
z.B. β-Lactamantibiotika
Produzent Pilz
Selektionsdruck sehr lang
Koevolution mit Erreger
enzymatische Inaktivierung
übertragbare Resistenzgene
z.B. Fluorchinolone
Produzent Mensch
Selektionsdruck sehr kurz
keine Koevolution
(keine enzym. Inaktivierung)
(kein Resistenzgentransfer)
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
4
Ursachen der Entwicklung von Resistenzgenen
- Antibiotika-bedingte Faktoren II
Abnehmende Zahl von Neuentwicklungen
Zahl neuer Antibiotika
n 16
14
12
10
8
6
4
2
0
19831987
19881992
19931997
19982002
20032007
Zahlen der FDA für USA
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
5
Die drei Grundmechanismen der
Resistenz beruhen auf nur
zwei genetischen Veränderungen
Veränderung der Zielstruktur
Inaktivierung des Antibiotikums
Verringerung der Antibiotikumkonzentration am
Wirkort
Mutation in vorhandener DNA
oder
Aufnahme neuer DNA
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
6
Ursachen für Resistenzentwicklung
- Mutation und Selektion
genetische
Veränderung
(Mutation)
Selektion durch
Antibiotikum
Inoculum
Mutationsfrequenz
Fitness
MHK-Anstieg
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
7
Intrazelluläre Mobilisation
von Resistenzgenen
R-Gen
R-Gencassetten:
Integron-codierte Integrase
schneidet R-Gen aus
59be
IntI
aadA, aadB,
aacA, aacC,
catB, cmlA,
dfrA, dfrB
sat
qacE
IntI
pant
pintI
attI
Integron
Isoliertes R-Gen wird von
Integron aufgenommen
Integron mit R-Gen
UniHH, PH2009
Multiresistenz durch
R-Gen-Kombinationen
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
8
Interzellulärer Transfer
von Resistenzgenen
Konjugation
(Multiresistenzplasmide
Enterobakterien)
Transduktion
(Pseudomonas)
Transformation
(Pneumokokken)
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
9
Co-Selektion von Resistenzgenen
- tet-Gene
Beispiele
Integron-assoziierte tet-Gene:
tet (A) / tet (E) / tet (G) in Klasse I-Integron-Strukturen. Co-Selektion
mit Resistenzgenen bla, cat, aadA, sul bei S. Typhimurium DT104
Transposon-assoziierte tet-Gene:
tet (M) auf Tn916 und Derivaten. Co-Selektion
mit ermB bei Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus
mit cat, aphA in S. pneumoniae
tet-Gene assoziiert mit konjugativen Transposons:
tet (Q) auf konjugativem Transposon CTnDOT. Co-Selektion
mit ermF / ermG bei Bacteroides spp.
Tetracyclin induziert Excision des Transposons aus dem Chromosom
als initialen Schritt des Transpositionsvorgangs.
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009 Shoemaker et al., 2001
Bad Honnef
10
Genetische Veränderungen
bedingen Resistenz
Mutation in vorhandener genetischer Information
reduzierte Affinität zum Target:
gyrA, rpoB, rpsL, rrnB
Inaktivierung des genetischen Repressors: marR, acrR, mecI
Inaktivierung des biochemischen Regulators: ampD
veränderte Enzymaktivität:
blaTEM, dfr, aac6‘Ib-cr
Aufnahme neuer genetischer Information
Genfragmente:
vollständiges Gen:
vollständiger Stoffwechselweg:
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
pbpX
mecA, bla, tetA und tetM
vanA
11
Genetische Grundlagen der Resistenz
am Beispiel der Fluorchinolone
Erwerb von Punktmutationen
• geänderte Affinität der Zielstrukturen (gyrA, gyrB, parC, parE)
• erhöhte Expression von mdr-Effluxpumpen (marR, acrR)
durch loss-of function mutation
• geändertes Substratspektrum von aac6‘Ib-cr für 7-Piperazinyl-Chinolone
Erwerb von Deletionsmutationen
• erhöhte Expression von mdr-Effluxpumpen
durch Funktionsverlust von Repressoren (marR, acrR)
Erwerb von neuem genetischen Material
• vollständiges Gen codiert Schutz für Zielstrukturen (qnr/mfpA)
• Gen codiert für Acetyltransferase von 7-Piperazinyl-Chinolonen aac6‘Ib-cr)
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
12
Bedeuting von Punktmutationen
- gyrA Mutationen bei E.coli
Mutante
MHKCip
[µg/ml]
WT
0.015
WT-4*
0.008
MI
0.25
MI
0.5
M I-4*
0.5
WT-3
0.5
M I-3
1
M II
4
M II*
2
M II-3
8
M I-3-4a 16
M I-3-4b 32
M III
64
UniHH, PH2009
gyrA
parC
------D87G
S83L
S83L
S83L,D87G
S83L,D87G
S83L
D87G
S83L,D87G
S83L,D87G
S83L,D87G
S83L,D87G
---S80I
------S80I
---------------E84K
S80I
S80I
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
erhöhter Efflux
------------------?
ΔmarR
ΔmarR
ΔmarR
------ΔmarR
* in vitro erzeugt
13
Genetische Grundlage reduzierter
Antibiotikumkonzentration am Wirkort
antisense RNA
acrR
AA
tolC
B
micF
efflux pump
UniHH, PH2009
marR
marO Repressor
ompF
porin
marA
Activator
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
14
Überexpression von MDR Effluxpumpen
durch Mutationen
Gram-negative Erreger
Outer
membran
Cytoplasmicmembran
Genlocus
acrAB
acrEF
acrR
acrS
acrA acrB
acrE acrF
tolC
tolC
nalB
mexR mexA mexB oprM
nfxB
Expressionsstatus
Δ MHK
Cip [µg/ml]
schwach
konstitutiv
acrR-
0,015
0,06
schwach
konstitutiv
mexR-
0,125
0,5
reprimiert
nfxB-
0,125
1
nicht aktiv,
reprimiert
mvaT-
0,125
1
nfxB mexC mexD oprJ
+
nfxC
mvaT
UniHH, PH2009
mexT mexE mexF oprN
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
15
MFP-A Protein ausMycobacterium tuberculosis ist ein
Qnr-Homolog und schützt DNA Gyrase durch DNA„Mimicking“
MfpA-Dimer
Aufsicht
MfpA nimmt eine α-helikale Struktur, ähnlich der B-Konformation von DNA
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
16
Inaktivierung von 7-Piperazinyl-Fluorchinolonen
durch ein modifiziertes AAC(6‘)-Ib-Enzym mit nur
2 Punktmutationen (W102R und D179Y)
O
H
H N
HS-CoA
O
O
N
AAC(6')-Ib-cr
O
C
H3C N
ciprofloxacin
O
N
O
N
N-acetyl-ciprofloxacin
MHK [µM] für E. coli WT in
Ab- und
ciprofloxacin (cipro)
N-acetyl-ciprofloxain
N-ethyl-cipro (enrofloxacin)
norfloxacin
0.02
0.08
0.02
0.15
kanamycin [µg/ml]
4
UniHH, PH2009
H
F
F
N
O
acetyl-CoA
Anwesenheit von AAC(6‘)-Ib-cr
0.08
0.08
0.02
0.6
64
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
17
Genetische Grundlagen der Resistenz
am Beispiel der β-Lactamresistenz
Erwerb von Punktmutationen
• geänderte Affinität der Zielstrukturen (pbp)
• erhöhte Expression von mdr-Effluxpumpen (marR, acrR)
durch loss-of function mutation von Repressoren
• geändertes Substratspektrum von bla-Genprodukten (TEM-3 bis -1??)
Erwerb von Deletionsmutationen
• erhöhte Expression von mdr-Effluxpumpen
• durch Funktionsverlust von Repressoren (marR, acrR, mecI)
Erwerb von neuem genetischen Material
• vollständiges Gen codiert bla-Genprodukte (TEM-1 -2, SHV, CTX-M)
• vollständiges Gen codiert neues, β-Lactam-unempfindliches PBP (mecA)
• Genfragmente codieren β-Lactam-unempfindliche PBP-Bereiche (pbpX)
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
18
Molekulare Struktur der TEM-1 β-Lactamase
Ω-Loop
E104
R164
β-Lactambindung
Inhibitorbindung
M69
G238
E240
R244
N276
T265
M182
Q39
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
Jelsch et al., 1992
19
Auswirkungen häufiger Mutationen in ESBL vom TEM-Typ
auf die Enzym-Substratwechselwirkung
Glu-104 ist über H-Brücken zu Asp-132 gebunden.
Mutation zu Lys:
Interaktion mit Asp-132 stört Positionierung von Ser-130; flexible NH2-Gruppe von Lys
interagiert mit COOH-Gruppe der Oximinosubstituenten von Ceftazidim, Ceftibuten,
Azthreonam.
Arg-164 stabilisiert durch ionische Wechselwirkung zu Asp-179 den Ω-Loop mit Glu-166.
Mutation zu Ser oder His:
Weniger H-Brücken zu Glu-166 destabilisieren Ω-Loop, so daß größere Substituenten zur
„active site“ gelangen.
Glu-240 interagiert mit größeren Acylamid-Substituenten
Mutation zu Lys:
Elektrostatische Wechselwirkung mit COOH-Gruppen von Oximinosubstituenten von
Azthreonam, Ceftazidim.
Ala-237 bildet einen Rand der β-Lactam-Bindungsstelle, so daß die CO und NH-backboneGruppen mit CO des β-Lactamrings und NH des C6/C7-Acylamidosubstituenten interagieren.
Mutation zu Thr:
Verzweigte Oximino-Substituenten werden aus der Bindungsstelle herausgehalten, dafür
interagiert NH mit Thr über eine Wasserstoffbrücke.
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
20
Aminosäuresubstitutionen bei TEM-1-Typ β-Lactamasen
zu einer Erweiterung des Substratspektrums führen
Enzym
TEM-1
TEM-12
TEM-20
TEM-25
TEM-10
TEM-17
TEM-26
TEM-6
TEM-5
TEM-15
TEM-4
TEM-9
TEM-27
TEM-28
TEM-29
TEM-43
TEM-47
TEM-48
TEM-49
TEM-52
TEM-55
TEM-58
UniHH, PH2009
21 39 42 69 104 153 164 165 182 218 237 238
L Q A M E H R W M G A G
S
T
S
F
S
S
K
K
S
K
H
S
T
K
S
F
K
S
F
K
S
H
H
H
K
H
T
S
F
S
F
S
K
T
S
E
240 244 265 268
E R T S
M
K
K
M
M
M
K
K
K
K
K
M
M
M
G
S
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
21
Punktmutationen erweitern das Substratspektrum
zur ESBL - am Beispiel von TEM-β-Lactamasen
Enzym
TEM-1
Aminosäure
104
164
240
Glu
Arg
Glu
Relative Hydrolyserate
CTX
CAZ
AZT
1
1
1
TEM-17
Lys
Arg
Glu
10
23
12
TEM-12
Glu
Ser
Glu
18
650
15
TEM-X
Glu
Arg
Lys
8
31
8
TEM-26
Lys
Ser
Glu
43 19.000
640
TEM-10
Glu
Ser
Lys
21
320
4.500
Glu=Glutamat; Arg=Arginin; Lys=Lysin; Ser=Serin;
CTX=Cefotaxim; CAZ= Ceftazidim; AZT=Azthreonam
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
Sowek et al., 1991
22
Faktoren mit Einfluss auf die β-Laktamresistenz
(ohne β-Laktamase)
Anzahl der Genkopien bzw. der Expressionsstatus
( Chromosomal bzw. Plasmid-codiert (z.B. SHV-1),
Promotor- bzw. Attenuatormutationen z.B. K1-β-Laktamase
Inaktivierung von negativen Regulatoren, z.B. AmpD)
Expressionsstatus und Affinität von Effluxpumpen in der Äußeren Membran
Menge und damit Aktivität
an verfügbarer β-Laktamase am Wirkort
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
23
Erwerb von β-Lactamresistenz bei PRSP in Form
von Resistenz-determinierenden Genfragmenten
S. oralis
S. pneumoniae
PBP2-analog
PBP2
Mutation
Mutation
Mutation
Transformation
resistentes
Mosaikgen
PBPX
Penicillinresistenter S. pneumoniae
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
Hakenbeck, 1995
24
Erwerb von Methicillinresistenz durch Transfer
von SCCmec-Elementen bei MRSA
mecA
UniHH, PH2009
mecRI
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
Deurenberg,
Stobberingh, 2008
25
Induktion von Resistenz
- genetische Grundlagen
Bindung von Tetracyclin an TetR-Repressor
der Tetracyclin-spezifischen Effluxpumpe TetA
Loss-of-function Mutation in ampD:
Chromosomal codierte AmpD-Amidase hydrolysiert
Induktor für AmpR-Regulator der AmpC β-Lactamase
Erwerb eines Transposons mit Signaltransduktionsystem
VanRS für Glycopeptide
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
26
Induktion der Expression Tetracyclin-spezifischer
Effluxpumpen durch Tetracyclin
tetR
tetAB
tetR
tetAB
Effluxpumpe
Repressor
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
TetracyclinMg2+-Komplex
27
Induktion der Expression chromosomal codierter
β-Laktamasen vom Typ AmpC (Klasse A)
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
Wiedemann et al., 1998
28
Induktion der Glycopeptidresistenz durch
Sensorkinasesystem VanRS
IRL Transposition Regulation
ORF1 ORF2 vanR vanS
UniHH, PH2009
Van-Resistenz
vanH vanA
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
Modulation
vanX
IRR
vanY vanZ
Courvalin, 2006
29
Mechanismen enzymatischer
Inaktivierung von Antibiotika
durch Hydrolyse
bla:
ere:
vgb:
β-Lactamase
Erythromycin- Esterase
Streptogramin B-Esterase
β-Lactame
Erythromycin
Streptogramin B
durch Acetyltransfer
aac:
cat:
vat,sat:
Aminoglycosid-Acetyltransferase
Chloramphenicol-Acetyltransferase
Streptogramin A-Acetyltransferase
Aminoglykoside
Chloramphenicol
Streptogramin A
durch Phosphotransfer
aph:
fosC:
Aminoglycosid-Phosphotransferase
Fosfomycin-Phosphotransferase
Kanamycin
Fosfomycin
durch Adenyltransfer
aad:
rad:
Aminoglycosid-Adenyltransferase
Rifampin-Adenyltransferase
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
Gentamicin
Rifampicin
30
Mechanismen der Veränderung
der Zielstruktur
durch Erwerb einer Mutation
rpsL:
rpoB:
gyrA:
Protein S10 des 30S-Ribosoms
RNA-Polymerase β-Untereinheit
Gyrase A-Untereinheit
Streptomycin
Rifampicin
Nalidixinsäure
durch Erwerb genetischen Materials
mecA:
pbpX:
dfr,sul:
tetM/O:
Penicillin-Bindeprotein 2a
Penicillin-Bindeprotein 2‘
DHPS, DHFR
EF-G-, EF-Tu-Analoga
Oxacillin
Penicillin
Sulfonamid, TMP
Tetracyclin
durch enzymatische Modifikation
ermC:
vanA:
rmtA:
UniHH, PH2009
23S-rRNA-Methylase
D-Ala-D-Lac-Ligase
16S-rRNA-Methylase
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
Erythromycin
Vancomycin
Aminoglycoside
31
Reduzierter Zugang zum Wirkstoff
durch reduzierten Einstrom
ompF:
oprD2:
uhpT:
Porin
Porin
„Uptake“ von Hexose-P
Chinolone
Imipenem
Fosfomycin
durch erhöhten Ausstrom
tet:
vga:
mef:
mex, acr:
mtr,mdfA
H+/ Tetracyclin-Antiporter
Streptogramin A-Efflux
Macrolid-Efflux
Multiple Resistenz
Multiple Resistenz
durch Kombination beider Mechanismen
mar:
multiple Antibiotikaresistenz
Tetracyclin
Streptogramin A
Makrolide
Chinolone, Tetracyclin,
Chloramphenicol,
Oxazolidinone, β-Lactame
Chinolone, Tetracycline,
durch Schutzproteine
qnr:
UniHH, PH2009
DNA mimicking
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
Chinolone
32
Veränderung vorhandener
genetischer Information
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
33
Erwerb neuer genetischer Information
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
34
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
35
Faktoren, die bei β-Laktamasemutationen Einfluss
auf die Ausbildung von Resistenz haben
Geschwindigkeit der Hydrolyse-Reaktion (hoher kcat-Wert)
Affinität für das Substrat (niedriger Km-Wert)
Kombination von β-Laktamasen (AmpC + ESBL)
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
Livermore, 1998
36
D-Alanyl-D-Alanin ist die Zielstruktur
der Glycopeptidantibiotika
Cycloserin
2 L-ala
2 D-ala
D-Ala-D-alaligase
UDP-NAc-Mur
L-ala
D-ala
D-glu
D-ala
L-lys
V
a
n
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
37
Glycopeptidresistenz bei Enterokokken
durch Erwerb neuer genetischer Information
IRL Transposition Regulation
ORF1 ORF2 vanR vanS
Van-Resistenz
vanH vanA
Modulation
vanX
IRR
vanY vanZ
vanH
2 L-ala
vanX
2 D-ala
UDP-NAc-Mur
D-ala+ D-lac
L-ala
vanA
D-ala
D-glu
D-ala
L-lys
vanY
UniHH, PH2009
V
a
n
V
a
PEG
n Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
2H
Pyruvat
D-Ala-D-lac-Ligase
D-ala
D-lac
Van-resistant
38
Wirkungsspektren verschiedener β-Laktamasen
β-Laktamase
Vorkommen
Substrate
Penicillinase BlaZ
S. aureus
Penicillin
β-Laktamase TEM-1, SHV-1
Enterobacteriaceae
+ Aminopenicillin
Überexprimierte TEM-1, SHV-1 Enterobacteriaceae
+ Inhibitor
ESBL TEM-3, SHV-2, CTX-M
AmpC-Überproduktion
Enterobacteriaceae
+ Cephalosporine
(2. - 4. Gen.) AZT
(- Inhibitor)
Carbapenemasen +
Efflux/Permeabilität
Gram-negative
+ Carbapeneme
UniHH, PH2009
PEG Symposium 06.-07.04.2009
Bad Honnef
39