(2013-01) Mast Isoplex RNA-DNA dt.indd - mast

Newsletter
2013/02
R
Inhalt
• Warum Mast Isoplex® verwenden?
Mast Isoplex DNA & RNA Amplifikations-Kits
LAMP leicht gemacht!
Warum Mast Isoplex® verwenden?
Mast Isoplex® bietet die Vorteile der
LAMP* (Loop mediated isothermal amplification) Technologie, um einfach und schnell Testsysteme zu etablieren. LAMP ist eine häufig
publizierte, alternative Amplifikationsmethode,
auf die viele praktische Beschränkungen der
PCR nicht zutreffen.
Schnell
Mast Isoplex® bildet innerhalb kürzester Zeit
(15-60 Minuten) sehr große Mengen amplifizierter Nukleinsäuren, die das entsprechende
PCR-Produkt bis zum 1000fachen übersteigen.
Zuverlässig
LAMP Technologie ist für Inhibitoren aus Probenmaterialien weniger anfällig als die PCR.
Daher sind Mast Isoplex® Amplifikations-Kits
ideal für Proben wie Blut6, Stuhl7, Lebensmittel
oder Umweltproben7 geeignet, bei denen Inhibitoren eher zu erwarten sind.
Robust
Unter bestimmten Voraussetzungen kann die
LAMP-Technologie exzellente Ergebnisse ohne
DNA/RNA-Extraktion erzielen, die bei einer
PCR zwingend erforderlich ist4, um z. B. Inhibitoren abzutrennen.
Mast Isoplex® Amplifikations-Kits vereinfachen die LAMP:
Komfortabel
CE-gekennzeichnete DNA und RNA Amplifikations-Kits ermöglichen eine Zeitersparnis
und erleichtern die LAMP-Entwicklung. Der
Aufwand der Qualitätssicherung für in-Haus
Assays wird drastisch reduziert.
Isotherme Amplifikation
Sehr einfaches Temperaturmanagement bei
60-65 °C minimiert den Geräteaufwand und
ermöglicht eine kontinuierliche Amplifikation
der Targetsequenz. Die Amplifikation ist nicht
auf die kurzen, aber häufigen Zyklen wie in der
PCR beschränkt.
Einfaches Assay Design
Primer können Online oder mittels kommerziell
verfügbarer Software ermittelt werden.
Tube Assay
Alle Reaktionsschritte wie reverse Transkription, Bildung des Loop-Templates, exponentielle Amplifikation und Detektion erfolgen in
geschlossenen Tubes; dies vermindert das
Kontaminationsrisko.
Einführung in die LAMP* Reaktion
Amplifikation von DNA (RNA Transkription erfolgt mittels reverser Transkriptase, die in den
RNA Amp Produkten enthalten ist) ist ein simultaner, 2-stufiger Prozess. Beginnend mit der
Bildung eines “hantelförmigen” Templates aus
der Targetsequenz folgt anschließend die exponentielle Amplifikation des Templates.
Die Bindung aller vier Primer, FIP (Forward Inner
Primer) und BIP (Backward Inner Primer) sowie
die zusätzlichen äußeren Primer (F3 und B3)
sind für eine Amplifikation erforderlich.
Zusätzlich können Loop-Primer eingesetzt werden, um die Reaktion zu beschleunigen.
• Mast Isoplex®
Amplifikations-Kits
vereinfachen die
LAMP
• Einführung in die
LAMP* Reaktion
• Exponentielle
Amplifikation
• Nukleinsäure
Nachweis
• Vorteile der LAMPTechnologie
Newsletter
2013/02
Das Primerdesign, auch das der Loop-Primer, erfolgt über frei
verfügbare Software wie Primer Explorer (http://primerexplorer.jp/e/) oder kommerzielle Software.
Die Kombination aus frei verfügbarer Software und Mast Isoplex® Amplifikations-Kits führt zu einer wesentlichen Erleichterung beim Aufbau individueller Amplifikationstests.
Template Bildung
Bei 60-65 °C erfolgt die Bindung von FIP an der Targetsequenz der Proben-DNA. Gleichzeitig bindet F3 an seiner
Targetsequenz und setzt den, durch FIP neu synthetisierten
DNA-Strang frei. Der verwendeten Bst-Polymerase (aus Bacillus stearothermophilus) fehlt die 5´-3´-Exonukleaseaktivität,
wodurch eine enzymatische Verdrängung des neugebildeten
DNA-Stranges ermöglicht wird (Bild 1 und 2).
Parallel zur FIP/F3 initiierten Reaktion erfolgt die BIP/B3-Reaktion nach gleichem Schema auf dem gegenläufigen Strang
der Proben-DNA.
Die Freisetzung des DNA-Templates mit Loops am 3’ bzw. 5’Ende durch “self-priming“ dient als Starttemplate für die folgende exponentielle Amplifikation.
Bild 1: Bei 60 - 65 °C bindet FIP an die Targetsequenz und initiiert die DNANeusynthese. Die Bst-Polymerase synthetisiert den Komplementärstrang und
verdrängt den original DNA-Strang (nicht abgebildet).
Bild 2: Der F3 Primer bindet an F3c vor der FIP Targetsequenz. Dieser neu synthetisierte DNA-Strang verdrängt den FIP synthetisierten DNA Strang und setzt
diesen frei.
Bild 3: Der gebildete Einzelstrang dient als Template für die
BIP-initiierte (Backwards Inner Primer) und im Folgenden für
die B3-initiierte DNA-Synthese mit Verdrängung des gebildeten BIP-Target-Stranges. Der freigesetzte Einzelstrang dient als
Starttemplate für die folgende exponentielle Amplifikation.
Exponentielle Amplifikation
Die Bildung des DNA-Templates mit den zwei Loop-Strukturen
ist das Starttemplate für die exponentielle Amplifikation. Kann
diese Struktur durch unspezifische Bindung oder durch fehlende Bindung eines Primers nicht gebildet werden, kommt es
nicht zur exponentiellen Amplifikation.
Wird diese Struktur jedoch gebildet, erfolgt sofort die Elongation ausgehend von der 3’-F1-Region. Zusätzlich binden die FIP
und BIP Primer an die exponierten F2c- bzw. B2-Regionen und
es erfolgt die exponentielle Amplifikation (Bild 4).
Bild 4: Exponentielle Amplifikation. Amplikons unterschiedlicher Größe als Multimere der ursprünglichen Targetsequenz
Unter diesen isothermalen Bedingungen werden permanent
neue Templates gebildet und die bestehenden wieder verwendet. Da die Reaktion an beiden Enden des Templates erfolgt,
werden permanent Amplikons der Targetsequenz als auch die
entsprechenden komplementären Sequenzen synthetisiert.
Dies führt zu Produkten unterschiedlicher Größe, die ein Vielfaches der urspünglichen Targetsequenz enthalten (Bild 4).
Die Reaktionszeit kann durch Einsatz von Loop-Primern wesentlich verkürzt werden. Loop-Primer können an jeden entstanden Loop binden und führen zu riesigen Mengen amplifizierter Nukleinsäuren und damit zu einem raschen Ansteigen
des Messsignals. (Bild 5)
Die Bilder 1 bis 5 wurden freundlicherweise von Eiken, Co., Ltd., Japan, zur Verfügung
gestellt.
Bild 5
d
d
Pi
F und
dL
Pi
B
5: Bi
Bindung
der L
Loop-Primer
Loop-Primer
B.
Nukleinsäure-Nachweis
Die Bildung enormer Mengen an Nukleinsäuren (109–1010 Kopien der Targetsequenz innerhalb 15–60 Minuten) führt zu einer sichtbaren Trübung des Reaktionsansatzes durch Bildung
von Magnesium-Pyrophospat (Mg2P2O7) als Nebenprodukt
der Elongation. Diese Trübung kann visuell ohne Verwendung
teurer Messinstrumente erkannt werden. Ferner kann dem Reaktionsansatz Farbstoff zugesetzt werden, der eine visuelle
Beurteilung der Reaktion erleichtert oder die Messung mittels
Real-time Thermo-Cyclern ermöglicht.
Ihr Vorteil
Alle Mast Isoplex® DNA/RNA Amplifikations-Kits enthalten zur
Erleichterung der Reaktionsauswertung generell 2 Farbstoffe:
Newsletter
2013/02
• Visueller Farbstoff (DD) zur Auswertung der Endpunkt-Messung. Hydroxynaphtholblau (HNB), ein Indikator
zum Nachweis vorhandener Mg2+ Konzentrationen, zeigt die Abnahme der
Mg2+ -Konzentration durch einen Farbumschlag von rot-violett nach blau
an. In einer positiven Lamp-Reaktion
nimmt die Mg2+ -Konzentration durch
Bildung von Magnesium-Pyrophospat
ab und es kommt zum Farbumschlag,
während bei einer negativen Reaktion
die Farbe unverändert bleibt4 (Bild 6).
• Fluorochrome (FD) kann dem Reaktionsmix zugesetzt werden, um die
Reaktion auf Real-time Thermo-Cylern durchzuführen. Die Messung des
Fluorochroms erfolgt im FAM-Kanal
(Bild 7).
* Lizenziert unter internationalen Patentnummern:
WO 00/28082, WO 01/34790, WO 01/34838, WO
01/83817, WO 01/77317, WO 02/24902, WO
02/103053 und entsprechender Eiken, Co., Ltd.,
Japan Patente für andere Länder.
1. Kaneko H, Kawana T, Fukushima E, Suzutani T
(2007). Tolerance of loop-mediated isothermal
amplification to a culture medium and biological
substances. J. Biochem. Biophys. Methods 70.
2. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa
T, Watanabe K, Amino N, Hase T (2000). Loopmediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research 28 (12): e63.
3. Li S, Fang M, Zhou B, Ni H, Shen Q, Zhang H,
Han Y, Yin J, Chang W, Xu G, Cao G. (2011).
Simultaneous detection and differentiation of
dengue virus serotypes 1-4, Japanese encephalitis virus, and West Nile virus by a combined
reverse-transcription loop-mediated isothermal
amplification assay. Virol J. 21(8):360.
Bild 6: Färbung der LAMP-Reaktion
mit HNB (positiv: +, negativ -).
Bild 7: LAMP-Reaktionverlauf positiver und negativer
Proben auf einem Real-time Thermo-Cycler.
Vorteile der
LAMP-Technologie
4. Hadersdorfer J, Neumüller M, Treutter D, Fischer TC (2011). Fast and reliable detection of
Plum pox virus in woody host plants using the
Blue LAMP protocol. Ann Appl Biol, 159, 456.
5. Han ET, Watanabe R, Sattabongkot J, Khuntirat B, Sirichaisinthop J, Iriko H, Jin L, Takeo S,
Tsuboi T. (2007). Detection of four Plasmodium
species by genus- and species-specific loopmediated isothermal amplification for clinical
diagnosis. J Clin Microbiol 45(8):2521.
6. Lau YL, Meganathan P, Sonaimuthu P, Thiruvengadam G, Nissapatorn V, Chen Y. (2010).
Specific, sensitive, and rapid diagnosis of active toxoplasmosis by a loop-mediated isothermal amplification method using blood samples
from patients. J Clin Microbiol. 48(10):3698.
Mast Isoplex® ist eine Produktgruppe, die
vielfältige Anwendungen ermöglicht und somit zur Verbreitung der LAMP-Technologie
beiträgt.
LAMP hat sich als sehr effektiv beim Nachweis von Viren1-4, Protozoen5-7, Bakterien8
oder Pilzen erwiesen.
• Gebrauchsfertige Reaktionsmixe optimieren Laborabläufe
Hohe Spezifität:
• Durch den Einsatz mehrerer spezifisch (!)
bindender Primer wird die Anzahl falsch
positiver Ergebnisse drastisch reduziert
Im Vergleich mit der PCR bestätigen Wissenschaftler häufig die wesentlich höhere Sensitivität bei gleicher Spezifität.
Die verwendeten Komponenten und die isothermalen Bedingungen machen LAMP zu
einem sehr robusten Testsystem, in dem viel
seltener Inhibitionen bei kritischen Probenmaterialien wie Blut, Lebensmittel oder Stuhlproben die Reaktionen stören.
7. Plutzer J, Karanis P. (2009). Rapid identification
of Giardia duodenalis by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) from faecal and environmental samples and comparative findings
by PCR and real-time PCR methods. Parasitol
Res. 104(6):1527.
Schnelle Ergebnisse:
• Die Bildung größter Mengen an Amplifikaten (bis zu 1010 Kopien) innerhalb 15–60
Minuten ermöglicht schnelles Monitoring
und rasche Befundung
8. Ohtsuka K, Yanagawa K et al (2005). Detection
of Salmonella enterica in Naturally Contaminated Liquid Eggs by Loop-Mediated Isothermal
Amplification, and Characterization of Salmonella Isolates, Appl Environ Microbiol. 71(11):
6730.
Ihre Vorteile:
Einfache Durchführung:
• Oft kann durch die Robustheit der LAMP
auf eine aufwendige Probenvorbereitung
verzichtet werden
• Die Verwendung einer robusten Polymerase reduziert die Anzahl falsch negativer
Ergebnisse durch Proben, die Enzyminhibitoren enthalten
Flexible Detektionsverfahren:
• Visuelle Detektion durch Farbumschlag
zeigt positive Reaktion ohne Verwendung
zusätzlicher Geräte an
• Fluoreszenznachweis auf Real-time Thermo-Cyclern ermöglicht die Abarbeitung
großer Probenserien
Kostengünstig:
• Minimale Geräteanforderungen ermöglichen allen Laboren, die Vorteile von Mast
Isoplex® anzuwenden.
Mast Diagnostica GmbH
Feldstraße 20,
DE-23858 Reinfeld
Tel. +49 (0)4533 2007 0
Fax +49 (0)4533 2007 68
[email protected]
www.mastgrp.com