1 KOMMISSION FÜR MEDIZINISCHE FORSCHUNG Bericht

KOMMISSION FÜR MEDIZINISCHE FORSCHUNG
Bericht Fleckenstein
Arbeitsstelle der Akademie am Virologischen Institut des Klinikums
der Universität Erlangen-Nürnberg: Neue persistierende Viren
bei Immunopathien und Tumorkrankheiten des hämatopoetischen Systems
Chronische Viruspersistenz ist das genetische Prinzip bei der erworbenen Immundefizienz AIDS, ebenso wie bei virusbedingten Neoplasien. Die Arbeitsstelle der Akademie
zu Neuen persistierenden Viren erforscht die Rolle und Interaktionen von Lentiviren,
Herpesviren und Flaviviren bei Immundefizienz und Tumorkrankheiten des blutbildenden Systems. Die Arbeiten unter Koordination durch den Kommissionsvorsitzenden
werden durch Wissenschaftler des Virologischen Instituts am Universitätsklinikum
Erlangen durchgeführt. Am Virologischen Institut ist das Nationale Referenzzentrum für
die Diagnostik von Immundefizienzviren und ein Graduiertenkolleg über Viren des Immunsystems angesiedelt. Der auslaufende SFB Lymphoproliferation und virale Immundefizienz soll in einen neuen Sonderforschungsbereich über Wirtmechanismen mikrobieller Effektoren überführt werden.
Das Kaposi-Sarkom-assoziierte humane Herpesvirus Typ 8 wurde 1994 entdeckt. Es
ist das einzige bisher bekannte Rhadinovirus des Menschen. Aufgrund der Epidemiologie ist klar, dass das Virus an der Tumorentstehung kausal beteiligt sein muss. Die
Wirkmechanismen sind jedoch noch weitgehend nicht verstanden. Die Arbeitsgruppe
von Priv.-Doz. Dr. Frank Neipel konnte durch RNA-Interferenz erstmals zeigen, dass
der virale Interferon-regulatorische Faktor 3 (vIRF-3) an der Onkogenese durch HHV-8
beteiligt ist. Im Jahr 2007 wurden die Arbeiten zur Analyse der Wirkung dieses Gens
weitergeführt. Die Arbeiten waren dabei auf das Zusammenspiel des vIRF-3 mit einem
im Hefesystem identifizierten Interaktionspartner, dem zellulären Interferon-regulatorischen Faktor 5, fokussiert. Die Interaktion der Proteine konnte zunächst mit zwei unabhängigen Methoden bestätigt und die für die Bindung erforderliche Region im vIRF-3
auf 40 Aminosäuren eingegrenzt werden. Für die funktionelle Bedeutung der vIRF3/IRF-5 Interaktion spricht auch, dass beide Proteine in HHV-8-transformierten Lymphozyten im Kern lokalisiert sind. Dies ist für IRF-5 in anderen Zellsystemen nur nach
Stimulierung mit Interferon der Fall. Durch Kotransfektions-Experimente konnte gezeigt
werden, dass die Expression von vIRF-3 die transkriptionelle Aktivität des IRF-5 blockiert. Auch der Mechanismus konnte aufgeklärt werden: durch Bindung an ein Doppelhelix-Motiv in vIRF-3 verliert IRF-5 die Fähigkeit, an DNA-Elemente in den regulierten
Promotoren zu binden. Bereits durch nur geringe Reduktion (ca. 25 %) der Expression
von vIRF-3 verlieren Zellen des primären Effusionslymphoms (PEL) in Kultur die sonst
ausgeprägte Resistenz gegen Interferon-beta und gehen in Apoptose. Da IRF-5 in den
PEL Zellen partiell konstitutiv aktiv ist (oder zumindest ohne externe Gabe von Interferon), ist die Apoptose-Inhibition durch vIRF-3 sicherlich wenigstens zum Teil auf die
Inhibition der Aktivität des IRF-5 durch Sequestrierung dieses Proteins zurückzuführen.
Weitergeführt wurden auch die Arbeiten zur Identifizierung zellulärer Rezeptoren dieses
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Virus, insbesondere zur funktionellen Analyse des Proteins FLJ40722. Dieses bisher unerforschte Protein wurde durch Immunopräzipitation und Massenspektrometrie als
Bindungspartner des abundanten viralen Hüllproteins gpK8.1 identifiziert. Die physiologische Funktion dieses Proteins ist trotz seiner breiten Expression und hohen Konservierung unbekannt. Erste Daten weisen darauf hin, dass FLJ40722 über einen sogenannten GPI-Anker an der äußeren Seite der Zytoplasmamembran lokalisiert ist. Überexpression von FLJ40722 erhöht die Rate der mit HHV-8 infizierten Zellen. Umgekehrt
kann man die Infektion kultivierter Zellen mit HHV-8 sowohl durch Reduktion der
FLJ40722 Expression via RNA-Interferenz reduzieren als auch durch Vorinkubation der
Zellen mit einem neu hergestellten Antiserum gegen FLJ40722. Diese Befunde (Lokalisation, Veränderung der Infizierbarkeit) sind kompatibel mit der Hypothese, dass mit
FLJ40722 tatsächlich ein relevanter Rezeptor für HHV-8 identifiziert wurde.
Die Arbeitsgruppe von Dr. med. Dr. rer. nat. Heide Reil befasst sich mit der Interferenz des Flavivirus GBV-C mit Immundefizienzviren. Erst vor ungefähr 10 Jahren
wurde das GB-Virus C auf der Suche nach neuen Hepatitisviren isoliert. Obwohl es eng
mit dem Hepatitis C-Virus verwandt ist, geht man heute davon aus, dass es weder eine
Hepatitis noch eine andere Erkrankung im Menschen hervorruft. Die Seroprävalenz von
GBV-C ist mit 10-15 % in der Bundesrepublik Deutschland sehr hoch. GBV-C wird
ähnlich wie HIV sexuell, parenteral und vertikal übertragen. In mehreren epidemiologischen Studien konnte gezeigt werden, dass GBV-C-infizierte HIV-Patienten einen signifikanten Überlebensvorteil gegenüber GBV-C-negativen HIV-Patienten besitzen. Aus
diesem Grund untersucht die Arbeitsgruppe, welche Mechanismen diesen Beobachtungen zugrunde liegen und ob das Verständnis dieser Mechnismen zur Entwicklung von
neuen anti-retroviralen Therapien führen kann. Durch in vitro-Experimente mit GBV-C
und HIV in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) konnte die Arbeitsgruppe
eindeutig zeigen, dass sowohl die GBV-C-Infektion als auch die Transfektion von GBVC-kodierender RNA die HIV-Replikation signifikant unterdrücken kann. Insgesamt ist
bisher die Arbeit mit den GB-Viren C sehr erschwert, da kein gutes produktives Zellsystem bekannt ist, welches die GB-Replikation effizient propagiert. In neuester Zeit ist
es der Arbeitsgruppe aber nun gelungen, Zellkulturbedingungen und eine Zellart zu definieren, in der GBV-C produktiv repliziert. Es handelt sich hierbei um primäre mononukleäre Zellen aus Nabelschnurblut. Auch wenn hier nur ca. 4–8 Wochen die Virusproduktion nachweisbar ist, bietet dieses System nun neue Möglichkeiten, die Interferenz mit HIV oder Medikamententestung zu untersuchen.
Weiterhin ist es in dem Projekt gelungen, den HIV-inhibitorischen Mechanismus einzugrenzen. So konnte die Arbeitsgruppe zeigen, dass rekombinantes Glykoprotein E2
von GBV-C, welches auf der GB-Virusoberfläche vorliegt, spezifisch HIV in Zellkultur
hemmt. Für diese Untersuchungen wurde ein Fusionsprotein zwischen dem E2-Glykoprotein und der humanen IgG-Fc-Region hergestellt. Dies hat unter anderem den Vorteil,
dass die Proteinreinigung erleichtert wird und dass auch mit einer erhöhten biologischen
Halbwertzeit des rekombinanten Proteins zu rechnen ist. Durch den Einsatz von pseudotypisierten HIV-Reporterviren mit dem G-Protein des VSV (Virus der vesikulären Stomatitis) konnte gezeigt werden, dass durch das E2-Protein ausschließlich die frühen
Replikationsschritte während der HIV-Infektion unterdrückt werden. Durch Zugabe von
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monoklonalen E2-Antikörpern kann spezifisch diese HIV-Inhibition aufgehoben werden.
Der inhibierende Effekt des E2-Proteins ist nicht auf eine HIV-Untergruppe beschränkt;
sowohl CXCR4- als auch CCR5-trope HIV-Isolate werden spezifisch gehemmt. Somit
handelt es sich bei dem E2-Fc-Fusionsprotein um einen neuen X4- und R5-wirksamen
Inhibitor, dessen IC50 auf primären mononukleären Zellen des Blutes ca. 6nM beträgt.
Der genaue Wirkmechanismus ist damit jedoch noch nicht verstanden; die Hemmung
scheint unabhängig von der Induktion von 6- und 7-Chemokinen wie SDF-1 oder
RANTES zu sein. Vorläufige Daten lassen vermuten, dass das E2-Protein nicht die Bindung und Fusion des HIV-Partikel mit der Wirtszelle beeinflusst, sondern dass nach der
Fusion das frühe Uncoating beinträchtigt wird. Die genaue Charakterisierung dieser
Wirkung ist Gegenstand aktueller Arbeiten. Weiterführende Untersuchungen haben ergeben, dass GBV-C Wildtyp-Isolate unterschiedliche Phänotypen aufweisen: so konnten
die Isolate als HIV-Hemmer oder als Nicht-HIV-Hemmer typisiert werden. Der HemmPhänotyp für HIV korreliert nicht mit der Eigenschaft, effizient in PBMC zu replizieren.
Die genauere Charakterisierung der HIV-hemmenden Isolate ergab, dass einige GBV-CViren ausschließlich HIV-Entry unterdrücken, während andere Post-entry Ereignisse
hemmen. Da ausgeschlossen werden konnte, dass das E2-Protein Post-entry Ereignisse
hemmt, impliziert dies, dass mehrere Proteine des GB-Virus C mit der HIV-Replikation
interferieren können. Demzufolge scheint die GBV-C-vermittelte HIV-Hemmung aus
mehreren Komponenten zu bestehen, und unterschiedliche Isolate scheinen diese Fähigkeit heterogen erworben zu haben. Zurzeit fokussiert sich die Arbeitsgruppe darauf,
diese unterschiedlichen Komponenten genauer einzugrenzen. Vorläufige Daten können
bestätigen, dass die Expression nicht-struktureller GBV-C-Proteine (NS2–NS5A) in
vitro tatsächlich zur Hemmung von Post-entry-Ereignissen der HIV-Replikation führt.
Die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. rer. nat. Stefan Pöhlmann ist an der Interaktion von
viralen Oberflächenproteinen mit zellulären Faktoren interessiert. Die Zytoplasmamembran stellt eine natürliche Barriere gegen die Virus-Infektion dar. Umhüllte Viren
überwinden dieses Hindernis, indem sie ihre Hüllmembran mit einer zellulären Membran verschmelzen und somit ihr genetisches Material in das Zelllumen einschleusen.
Die spezifische Erkennung von Zielzellen und die nachfolgende Membranfusion werden
durch die Bindung viraler Oberflächenproteine an zelluläre Rezeptoren vermittelt. Ein
thematischer Schwerpunkt der Arbeitsgruppe ist die HIV-Bindung an zelluläre Lektine
und deren Bedeutung für die HIV-Ausbreitung. Die Arbeitsgruppe konnte das Lektin
CLEC-2 als HIV-Anheftungsfaktor identifizieren. CLEC-2 wird auf Thrombozyten
exprimiert und vermittelt zusammen mit DC-SIGN die HIV-Bindung an diese Zellfragmente. Ein wesentlicher Teil der HIV-Partikel im peripheren Blut infizierter Patienten ist mit Thrombozyten assoziiert, die Bindung von HIV an CLEC-2 könnte daher die
virale Ausbreitung im Wirtsorganismus modulieren. Im Gegensatz zu DC-SIGN bindet
CLEC-2 nicht an das virale Hüllprotein, sondern an einen zellulären Faktor, der bei der
Virus-Freisetzung in die virale Hüllmembran eingebaut wird. Das zelluläre Glykoprotein
Podoplanin wurde kürzlich als CLEC-2-Ligand identifiziert; die Rolle von Podoplanin
bei der HIV-Bindung an Thrombozyten ist Gegenstand laufender Forschungen.
Die Inhibition des viralen Eintritts ist ein attraktiver Ansatz zur HIV-Therapie. Niedermolekulare Inhibitoren des HIV-Korezeptors CCR5 werden seit kurzem in der Klinik
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eingesetzt. Resistenzentwicklung und Pathogenität resistenter Varianten sind jedoch nur
unvollständig verstanden. Studien der Arbeitsgruppe Pöhlmann zeigten, dass lediglich
zwei Mutationen in einem variablen Bereich des Hüllproteins des Affen-Immundefizienz-Virus (SIV, simian immunodeficiency virus) ausreichend sind, um Resistenz
gegen einen CCR5-Inhibitor zu vermitteln. Die entsprechende SIV-Variante war zudem
in der Lage, in einigen experimentell infizierten Tieren AIDS-ähnliche Symptome zu
induzieren. Es ist daher denkbar, dass bei Therapie von HIV-Patienten mit CCR5-Inhibitoren relativ rasch resistente Varianten entstehen, die noch in der Lage sein könnten,
AIDS auszulösen. Im Rahmen einer Kollaboration mit der Arbeitsgruppe von Prof.
Kirchhoff, Universitätsklinikum Ulm, konnte weiterhin ein antivirales Peptid identifiziert werden, das an das Fusionspeptid des HIV-1-Hüllproteins bindet und die virale
Infektion blockiert.
Im Fokus der Forschung des Labors steht weiterhin der Eintritt von so genannten
emerging viruses in Zielzellen. Lektine wie DC-SIGN, DC-SIGNR und LSECtin verstärken die Ebolavirus (EBOV)-Infektion in Zellkultur und beeinflussen möglicherweise
den viralen Zell- und Organtropismus im infizierten Wirt. Es war jedoch unklar, ob diese
Faktoren lediglich die Infektionseffizienz erhöhen oder ob ihre Expression ausreichend
ist, den infektiösen Eintritt in Zielzellen zu vermitteln. Im letzteren Fall würde man
erwarten, dass DC-SIGN-Expression für die Infektion verschiedener, ansonsten nichtpermissiver Zelllinien ausreicht. Darüber hinaus sollte DC-SIGN die Aufnahme von
Viren in endosomale Vesikel befördern, in denen die Glykoprotein-getriebene Membranfusion erfolgt. Es zeigte sich jedoch, dass die DC-SIGN-vermittelte Verstärkung der
EBOV-Infektion zelltypabhängig ist und dass Lektin-Internalisierung für diesen Prozess
verzichtbar ist. Schließlich war die experimentell induzierte Ankonzentrierung von
Virus-Partikeln auf der Zelloberfläche ausreichend, um die DC-SIGN-Funktion zu
ersetzten; DC-SIGN fungiert daher als EBOV-Anheftungsfaktor und nicht als Rezeptor.
Die Lektine DC-SIGNR und LSECtin werden auf sinusoidalen Endothelzellen in
Leber und Lymphknoten koexprimiert. Beide verstärken die EBOV-Infektion, jedoch
nur DC-SIGNR erhöht die Infektiosität von HIV. Ein detaillierter Vergleich der Interaktion zwischen Lektin und Ligand ergab, dass LSECtin nicht an HIV-Partikel bindet,
aber effizient das lösliche HIV-Hüllprotein komplexiert. Die Lektin-Interaktion mit
löslichem Hüllprotein ist daher nicht notwendigerweise prognostisch für die LektinBindung an Virus-assoziiertes Hüllprotein; dies ist eine Beobachtung, die sowohl für die
retrospektive Analyse publizierter Daten als auch für das Verständnis der Erkennung von
Pathogenen durch Lektine von Bedeutung ist. Weiterhin zeigte sich, dass bei erniedrigtem pH-Wert, der das Milieu in Endosomen abbildet, Komplexe aus DC-SIGNR und
Ligand aufgelöst werden, während die Liganden-Bindung an LSECtin unbeeinträchtigt
bleibt. LSECtin und DC-SIGNR unterscheiden sich daher wesentlich in der LigandenBindung und wahrscheinlich in der biologischen Funktion.
Die Arbeitsgruppe von PD Dr. med. Barbara Schmidt beschäftigt sich mit der nativen
Immunabwehr (engl. innate immune response) von plasmazytoiden dendritischen Zellen
(PDC) gegen Viren. Die Zellen wurden 1999 von zwei unabhängigen Arbeitsgruppen als
die Hauptproduzenten von antiviral wirksamen Interferonen im Blut identifiziert. PDC
sind negativ für hämatopoietische Linienmarker, exprimieren jedoch neben CD4, HLA4
DR und CD123 die spezifischen Oberflächenmarker BDCA2 (=CD303) und BDCA4
(=CD304) sowie die Toll-ähnlichen Rezeptoren 7 und 9. Im Sinne der evolutionär konservierten nativen Immunabwehr erkennen sie einzelsträngige RNA sowie unmethylierte
CpG-Motive, worauf sie innerhalb weniger Stunden mit der Produktion von Typ I-Interferonen sowie proinflammatorischer Zytokinen reagieren. Sie sind weiterhin in der Lage,
naive T-Zellen zu stimulieren und in Richtung Th1 zu dirigieren, wodurch sie das angeborene und erworbene Immunsystem miteinander verknüpfen.
Der wissenschaftliche Fokus richtet sich dabei auf zwei Schwerpunkte: das humane
Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) sowie Herpes simplex Virus Typ 1 (HSV-1). Die
Rolle der PDC in der nativen Immunabwehr gegen HIV wurde von der Arbeitsgruppenleiterin während ihres Forschungsaufenthalts im Labor von Prof. Jay A. Levy, University
of California, San Francisco (UCSF), bearbeitet. Hier konnte in einer klinischen Studie
gezeigt werden, dass die Zahl der PDC mit dem klinischen Status der Patienten sowie
der CD4+ Zellzahl direkt korreliert, während für die Viruslast eine inverse Assoziation
besteht. Unter antiretroviraler Therapie erholte sich die PDC-Zahl zumindest teilweise,
was für den CD4+ Zellanstieg prädiktiv war. Für den PDC-Abfall in fortgeschrittenen
Stadien ließen sich zwei Gründe definieren: (i) zum einen konnten PDC durch HIV-1
infiziert werden; allerdings kam es erst in Gegenwart von neutralisierenden IFN-alphaAntikörpern bzw. löslichem CD40-Ligand zu einer produktiven Infektion, und (ii) durch
Kontakt mit HIV-1 infizierten Zellen regulierten PDC den Chemokinrezeptor 7 hoch,
welcher PDC in Richtung lymphatischer Gewebe dirigiert. Diese Daten lassen sich in
dem Modell des „trojanischen Pferdes“ zusammenfassen, in dem PDC in der peripheren
Blutbahn infiziert werden, aber erst im Lymphknoten durch Kontakt mit aktivierten TLymphozyten die Virusreplikation unterstützen und neu produzierte Viren an uninfizierte Zellen weitergeben.
Die aktuellen Studien beschäftigen sich mit dem Mechanismus der Interferon-Induktion. Die Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass selbstleuchtende Viruspartikel an PDC adhärieren, wobei der CD4-Rezeptor eine wichtige Rolle spielt. Anschließend kommt es zu
einer Rezeptor-vermittelten Endozytose, bei der die Affinität zum CD4-Rezeptor, nicht
jedoch die HIV-Korezeptoren CXCR4 und CCR5 eine Rolle spielen. Wie durch elektronenmikroskopische Untersuchungen gezeigt, finden sich virale Partikel im Zytosol
der Zellen wieder, welche dann in Endosomen aufgenommen werden. Dort lassen sich
subvirale Strukturen nachweisen, welche eine Rupturierung des Viruspartikels durch
endosomale Azidifizierung mit Freiwerden der viralen Nukleinsäure vermuten lassen.
Gegenwärtig etabliert die Arbeitsgruppe ein Tiermodell mit für den humanen CD4-Rezeptor transgenen Mäusen, welche die Rolle der Toll-ähnlichen Rezeptoren aufklären
sollen. Ein weiterer Schwerpunkt besteht in der Frage, ob nicht ausschließlich virale
Nukleinsäuren, sondern im Viruskapsid verpackte zelluläre Nukleinsäuren an der Interferoninduktion beteiligt sind.
Ein zweiter Schwerpunkt ist die Rolle der PDC in der nativen Immunabwehr gegen
HSV-1. In einer klinischen Studie konnte die Arbeitsgruppe zeigen, dass man bei Patienten mit schweren Netzhautinfektionen durch HSV und dem verwandten Windpockenvirus eine erniedrigte PDC-Zahl sowie funktionelle Defekte im Sinne einer verringerten Interferon-Produktion findet. Zusätzlich ließen sich bei diesen Patienten eine
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reduzierte Funktion der CD8+ zytotoxischen Zellen und NK-Zellen nachweisen. Da
PDC eine wesentliche Funktion in der Aktivierung dieser beiden Zellpopulation haben,
liegt nahe, dass hier ein selektiver Immundefekt für die schwere Herpes-Reaktivierung
prädisponiert. Bisher ist allerdings die genetische Ursache dieser Erkrankung unbekannt.
Das Modell der Interferon-Sekretion, ausgelöst durch die Aktivierung von PDC über
verschiedene Stimuli, erlaubt Immundefekte im nativen Immunsystem näher zu klassifizieren. Als Grundlage für diese Untersuchungen wurde in der Arbeitsgruppe ein Affymetrix-Chip-Array von HSV-1 stimulierten PDC durchgeführt, welcher die Herauf- und
Herrunterregulierung PDC-spezifischer Gene aufzeigt. Weitere Chip-Analysen sowie die
gezielte funktionelle Testung einiger ausgewählter Gene könnten Aufschluss über die
Immunmechanismen bei bekannten, aber auch unbekannten Viren geben. Insbesondere
ist bei Patienten mit selektiven Immundefekten in der Abwehr viraler Infektionen mit
dem klinisch apparenten Auftreten neuer Viren zu rechnen.
Publikationen der Arbeitsgruppen aus dem Jahr 2007
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Helm, M., Walter, H., Ehret, R., Schmit, J.-C., Kurowski, M., Knechten, H., Korn, K., Braun, P.,
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short-term therapy outcomes of treatment-experienced HIV-1 infected patients: a retrospective
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Marzi, A., Möller, P., Hanna, S.L., Harrer, T., Eisemann, J., Steinkasserer, A., Becker, S., Baribaud, F., & Pöhlmann, S. (2007). Analysis of the interaction between Ebolavirus glycoprotein
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Mueller, S. M., Schaetz, B., Eismann, K., Bergmann, S., Bauerle, M., Schmitt-Haendle, M.,
Walter, H., Schmidt, B., Korn, K., Sticht, H., Spriewald, B., Harrer, E. G., & Harrer, T. (2007).
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Chaipan, C., Biet, T., Peters, T., Meyer, B., Wilhelm, D., Lu, H., Jing, W., Jiang, S., Forssmann,
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Pöhlmann, S., Münch, J., Aziz, S, Reeves, J.D., Otto, C., Leslie, G.J., Hofmann, H., Puffer, B.A.,
Baribaud, B., Marzi, A., Gramberg, T., Chen, Z., Stolte, N., Haaft, P.T., Heeney, J.L., StahlHennig, C., Mätz-Rensing, Schneider, K.T., Doms, R.W., & Kirchhoff, F. (2007). A simian
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Reil, H., Bartlime, A., Drerup, J., Grewing, T., & Korn, K.: Clinical validation of a real time PCR
based triplex assay for Herpes Simplex Virus 1 and 2. JMD, in Revision.
Reil, H., & Jung S.: GBV-C und HIV, was wissen wir heute?, MedReport (9), 31, 2007, 4, Hrsg:
Blackwell Verlag.
Sander, G., Konrad, A., Thurau, M., Wies, E., Leubert, R., Kremmer, E., Dinkel, H., Schulz, T.,
Neipel, F., & Sturzl, M. (2007). Intracellular Localization Map of HHV-8 Proteins. J. Virol., im
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Wies, E., Mori, Y., Hahn, A., Kremmer, E., Sturzl, M., Fleckenstein, B., & Neipel, F. (2007). The
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effusion lymphoma cells. Blood, im Druck.
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Bericht Zahn
Einfluss der Umweltbelastung auf die Programmierte Biosynthese
Leitung: Hr. Zahn und Dr. sc. Renato Batel
Hauptmitarbeiter: Dr. sc. Bojan Hamer mit technischer Assistenz von Drasko Maros
Experimentelle Arbeiten und Kurzbeschreibung der Ergebnisse
aus der Arbeitsstelle Rovinj und der Arbeitsstelle Mainz
In Fortführung früherer Arbeiten wurde die cDNA eines der „p53“-Gene, die die Proteinstruktur und die putativen Phosphorylierungsstellen bei der Meeresmuschel Mytilus
galloprovinvialis bestimmen, sequenziert. Die in experimentellen Aquarien gehaltenen
Muscheln wurden dazu mit einem Modell-Genotoxin, dem 4-Nitrochinolin-N-Oxid
(NQO), von dem bekannt ist, dass es DNA-Einzelstrangbrüche verursacht, durch Einzelinjektionen unter den Mantel in die palliale Flüssigkeit, behandelt. Dadurch wurden
DNA-Schäden in dem stark proliferierenden Gewebe der Kiemen induziert. Die tiefgefrorenen Kiemen wurden dann, evtl. auch später in Mainz, weiter verarbeitet. Wir
haben die Expression der spezifischen P53-Proteine mit Hilfe von spezifischen, monoklonalen Antikörpern über Western Blot-Analyse und dabei deren Verteilung im Zytosol
und im Zellkern bestimmt. Darüber hinaus wurden auch die Phosphorylierungen nicht
spezifischer Stellen bei dem P53-Protein über den ELISA-Bindungstest ermittelt.
Es zeigt sich, dass die DNA-Schäden in den Kiemen mit NQO behandelter Muscheln
dosis- und zeitabhängig sind, ebenso wie die Aktivität des P53-Proteins. Es stellte sich
heraus, dass das käufliche SIGMA antiP53 (Ab/clone2)-Protein mit zwei Banden von 73
und von 28 kDa reagiert.
Arbeiten in Mainz
Mit Hilfe der FAST-Mikromethode konnte die zeit- und dosisabhängige DNA-Schädigung in den Kiemen ermittelt werden. In den gleichen Präparaten wurden die „P53 artigen Proteine“ bestimmt mit der Standard antiP53 monoklonlen Antikörper und der Routine Scanning Prozedur nach Western Blots. Der Phosphorylierungsstatus konnte mittels
der kovalent-bindungs-Sandwich-Elisa-Technik und darüber hinaus mit den PIERCEPhosphoprotein-Bestimmungs-Kits, einer chemischen Detektions-Methode für Phosphoproteine, erfasst werden.
Das Ziel ist letztlich, Korrelationen und Erklärungen für DNA-Schaden Entstehung,
„P53 artiger Protein“-Aktivitäten und Zell-Zyklus-Veränderungen einschließlich der
Apoptose zu verstehen.
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Darstellung der Ergebnisse
1.) Phorphorylierungsorte. Die verschiedenen Phosphorylierungs-Stellen „p53“-ähnlicher Proteine wurden bestimmt, ihre Position im Genom ermittelt und aufgelistet.
(Die umfangreichen Unterlagen stehen auf Anfrage zur Verfügung).
2.) Die Dosis-Abhängigkeit von DNA-Schädigungen (Strand Scission Factor) in Abhängigkeit von verschiedenen NQO-Dosen ist in Abb. 1 dargestellt als Strand Scission Factor, einem logarithmischen Verhältnis einsträngiger DNA zu doppelsträngiger DNA, das mittels alkalischer Filterelution ermittelt wurde.
Abb. 1: Die Dosis-Abhängigkeit von DNA-Schädigungen (Strand Scission Factor) in Abhängigkeit von Einzeldosen an $-Nitrochinolin-N-Oxid (NQO). X-Achse: Einzeldosen an NQO in μg/g
Kiemen-Gewicht. Y-Achse: Strand Scission Factor (-1). (DNA-Einzelstrandbrüche).
3.) Eine klare, zeitabhängige Dosiswirkung ergab sich (Abb. 2) nach Injektion dreier
verschiedener NQO-Mengen für die ersten 24 Stunden, die aber nach 48 Stunden auf
einen niederen Spiegel abgeklungen war.
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Abb. 2: Die Zeitabhängigkeit der Dosiswirkung. X-Achse: Zeit in Stunden nach Injektion von drei
verschiedenen NQO-Dosen (3 μg; 10 μg; 20 μg). Y-Achse: Strand Scission Factor.
4.) Die zeitabhängige Induktionen „p53“-ähnlicher Proteine (Abb. 3) zeigt ein Maximum nach 6 bis 12 Stunden für das 75 kDa-Protein, während sie für die Summe der
zwei Komponenten möglicherweise eine erhöhte längere Dauer anzeigt.
Abb. 3: Zeitabhängige Induktionen „p53“-ähnlicher Proteine in den Kiemen. X-Achse: Zeit in
Stunden nach Injektion. Y-Achse: Relative Induktion „p53“-ähnlicher Proteine: Linke Säule:
75 kDa-Protein im Cytosol. Rechte Säule: 75+28 kDa-Proteine in den Zellkernen. Das Säulenpaar
ganz links betrifft die Injektion mit reinem Lösungsmittel (DMSO = Dimehtylsulfoxid).
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5.) Die zeitabhängigen Aktivitäten in den Zellkernen ergeben für die 75 kDa-Komponente wenig Aussagekräftiges, während bei 28 kDa eine Erhöhung zu resultieren
scheint (Abb. 4).
Abb. 4: Zeitabhängige Induktionen „p53“-ähnlicher Proteine in Zellkernen. X-Achse: Zeit in
Stunden nach Injektion. Y-Achse: Relative Induktion „p53“-ähnlicher Proteine: Linke Säule:
75 kDa-Protein. Rechte Säule: 75+28 kDa-Proteine. Das Säulenpaar ganz links betrifft die
Injektion mit reinem Lösungsmittel (DMSO = Dimehtylsulfoxid).
6.) Aus Abb. 5 ergibt sich, dass der relative Phosphoryierungsgrad der „p53“-ähnlichen
Proteine im Zytosol innerhalb von 24 Stunden sein Maximum erreicht, um dann
schon wieder abzuklingen, während in den Zellkernen der geringere Anstieg noch
andauert.
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Abb. 5: Zeitabhängige Phosphorylierungen „p53“-ähnlicher Proteine (P75 + P28) in den Kiemen
nach Exposition von 20 μg NQO/g Muschel in Meerwasser. X-Achse: Zeit in Stunden der
Exposition. Y-Achse: Prozentuale Steigerung der Phosphorylierungen „p53“-ähnlicher Proteine:
Linke Säule: im Cytosol. Rechte Säule: in den Zellkernen.
7.) In (Abb. 6) ist das Ausmaß der Phosphorylierung der Komponente P75 auf deren
Summengehalt bezogen. Auch dabei ist die Komponente im Zytosol etwas schneller
als die prozentual höhere in den Zellkernen.
Abb. 6: Zeitabhängige Phosphorylierungen des „p53“-ähnlichen Proteins P75 in den Kiemen nach
Exposition von 20 μg NQO/g Muschel in Meerwasser. X-Achse: Zeit in Stunden der Exposition.
Y-Achse: Prozentuale Steigerung der Phosphorylierungen des Proteins P75: Linke Säule: im
Cytosol. Rechte Säule: in den Zellkernen.
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Aus dem Dargestellten ergeben sich eine ganze Reihe von Aufgabenstellungen für zukünftige Arbeiten, die einmal der Verfestigung der bisherigen Befunde dienen und zum
anderen der Klärung resultierender zellulärer Steuerungsmechanismen.
Literatur
Hamer, Bojan; Najdek, Mirjana; Blažina, Marija; Radić, Tomislav; Reifferscheid, Georg; Mueller,
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