Physikalische Chemie - Praktikum Vertiefungseinheit
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Physikalische Chemie - Praktikum VertiefungseinheitKonfokale Einzelmolekülmikroskopie Version: September 2016 Verfasser: Apl. Prof. Dr. Gerald Hinze Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Zusammenfassung In diesem Versuch wird das optische Auflösungsvermögen eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops bestimmt. Anhand zeitabhängiger Fluoreszenzintensitätsmessungen an einzelnen Molekülen wird deren Triplettkinetik berechnet. Grundlagen: Optik, Detektoren, Fluoreszenz, Jablonski Diagramm, Korrelationsfunktionen Lernziele • • • • • konfokale Fluoreszenzmikroskopie Einzelmolekülspektroskopie optische Auflösungsvermögen zeitabhängige Messungen Korrelationsfunktionen Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 2 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 0 0 Inhalt Inhalt .................................................................................................................... 3 1 Die Fluoreszenz einzelner Moleküle – Vergleich zu konventionellen Ensemblemessungen ................................................................................................. 5 1.1 Homogene und inhomogene Linienform ...................................................... 5 1.2 Zeitabhängige Fluoreszenz .......................................................................... 6 2 Experimentelle Voraussetzungen für Fluoreszenzuntersuchungen an einzelnen Molekülen ................................................................................................................... 7 3 2.1 Ensemble: Anzahl der Moleküle im Detektionsvolumen ............................... 7 2.2 Fluoreszenzmessung an einzelnen Farbstoffmolekülen............................... 8 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie.................................................................... 10 3.1 Das Prinzip der konfokalen Mikroskopie .................................................... 10 3.1.1 Auflösungsvermögen .............................................................................. 10 3.1.2 Vergrößerung.......................................................................................... 12 3.1.3 Fluoreszenzmikrokopie ........................................................................... 13 3.1.4 Konfokale Mikroskopie ............................................................................ 14 3.2 Experimenteller Aufbau des Fluoreszenzmikroskopes (Praktikum)............ 16 3.2.1 Anregungsstrahlengang .......................................................................... 16 3.2.2 Scanner .................................................................................................. 18 3.2.3 Detektionsstrahlengang .......................................................................... 18 4 Bedienungsanleitung.......................................................................................... 19 4.1 Wichtig ! ..................................................................................................... 19 4.2 Übersicht der Komponenten und Funktionen ............................................. 20 4.3 Mikroskopsteuerung ................................................................................... 22 4.3.1 Hardware ................................................................................................ 22 4.3.2 Softwaresteuerung des Mikroskops ........................................................ 23 4.4 Einzelnen Operationen ............................................................................... 24 4.4.1 Probenwechsel ....................................................................................... 24 4.4.2 Aufnahme eines Fluoreszenzbilds .......................................................... 26 4.4.3 Aufnahme von Fluoreszenzzeitspuren .................................................... 27 4.5 Datenauswertung ....................................................................................... 28 4.5.1 Analyse der Fluoreszenzbilder................................................................ 28 4.5.2 Analyse der Zeitspuren ........................................................................... 29 5 Aufgabenstellung ............................................................................................... 32 Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 3 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 5.1 Bestimmung des räumlichen Auflösungsvermögen.................................... 32 5.2 Untersuchung von Terrylendiimid (TDI)...................................................... 33 6 Fragen zur Vorbereitung .................................................................................... 37 7 Literatur: ............................................................................................................. 38 8 Gefährdungsbeurteilung des Versuches ............................................................ 39 9 Tabellen für die Messwerte ................................................................................ 40 Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 4 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 1 Die Fluoreszenz einzelner Moleküle – Vergleich zu konventionellen Ensemblemessungen Bei der konventionellen Fluoreszenzspektroskopie wird eine hinreichend große Anzahl (ein Ensemble) von Molekülen auf ihr Fluoreszenzverhalten hin untersucht. Die gemessene Fluoreszenz entsteht durch Überlagerung der Beiträge einzelner Moleküle in dem Probenvolumen, typischerweise eine Küvette. Wenn alle Moleküle zeitlich und spektral genau gleiches Verhalten zeigen, wird die Messung an einem einzelnen Molekül genau die gleichen Ergebnisse liefern wie Ensemblemessungen, allerdings mit einem deutlich ungünstigerem Signal-zu-Rausch Verhältnis. In den meisten Systemen unterscheiden sich jedoch die Fluoreszenzeigenschaften der Moleküle untereinander. Dabei sind Unterschiede sowohl in den spektralen Eigenschaften wie auch im zeitlichen Verhalten möglich. Nimmt beispielsweise die Fluoreszenz einer Farbstofflösung mit zunehmender Bestrahlungsdauer ab, kann im Ensemble nicht ohne weiteres entschieden werden, ob nun jedes einzelne Farbstoffmolekül weniger abstrahlt oder aber ob ein zunehmender Anteil der Moleküle überhaupt nicht mehr fluoresziert – oder ob beide Effekte gleichzeitig auftreten. Viele spektroskopische Eigenschaften von Farbstoffmolekülen können erst durch die Untersuchung einzelner Moleküle bestimmt werden. Im Folgenden werden Beispiele für die beiden wichtigen Aspekte – spektrale Eigenschaften und zeitliches Verhalten – skizziert. 1.1 Homogene und inhomogene Linienform Die Farbstoffmoleküle liegen typischerweise in einer Lösung oder eingebettet in eine feste Matrix vor. Je nach Art der Umgebungsmoleküle und deren räumlicher Anordnung um einen Farbstoff werden dessen spektrale Eigenschaften beeinflusst. Als Beispiel werden in Abbildung 1 die mehrere Emissionsspektren einzelner Farbstoffmoleküle Terrylendiimid gezeigt. Es sind deutliche Unterschiede in den Spektren zu sehen. Je nach lokaler Umgebung werden die Maxima der Spektra verschoben. In einer Ensemblemessungen würde man nur ein Gesamtspektrum erhalten, welches durch die Überlagerung der einzelnen Molekülspektren entsteht. Eine lokale Information wäre nicht zugänglich. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 5 Grundmodul Physikalische Chemie I / [a.u.] Konfokale Einzelmolekülmikroskopie O O N N O O 0 650 700 750 800 λ / nm Abbildung 1 : Emissionspektren von einzelnen Terrylendiimid Molekülen (angeregt @647nm), eingebettet in einen PMMA-Film. PMMA Film. Je nach lokaler Umgebung unterscheiden sich die Spektren der einzelnen Moleküle. Mo 1.2 Zeitabhängige Fluoreszenz Trotz zeitlich konstanter Anregung kann die Intensität des emittierten Lichts sehr stark schwanken. Hierfür kann es sehr unterschiedliche Gründe geben. Häufig führt ein Übergang eines Farbstoffs in einen Triplettzustand zu zu einem kurzzeitigen Verschwinden der Emission, die nach dem Übergang in den Grundzustand aber wieder sichtbar wird. Andere Möglichkeiten Möglichkeiten sind dynamische Vorgänge wie Rotation oder Translation der beobachteten Farbstoffmoleküle, Farbstoffmoleküle, die auch zur Fluktuation der detektierten Intensität führen können. Abbildung 2 : Beispiel einer zeitabhängigen Fluoreszenz eines Moleküls In einem Ensemble-Experiment Experiment wird eine mittlere Fluoreszenz gemessen, d.h. Intensitätsfluktuationen tuationen einzelner Moleküle Mole sind dort nicht sichtbar. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 6 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 2 Experimentelle Voraussetzungen für Fluoreszenzuntersuchungen an einzelnen Molekülen Einzelmolekülmikroskopie ist mittlerweile in vielen wissenschaftlichen Bereichen etabliert. In diesem Abschnitt werden die Voraussetzungen diskutiert, die für die Detektion einzelner Farbstoffmoleküle notwendig sind. Neben einem speziellen experimentellen Aufbau müssen auch die zu untersuchende Farbstoffe bestimmte Bedingungen erfüllen. 2.1 Ensemble: Anzahl der Moleküle im Detektionsvolumen Bei konventionellen Fluorometern wird das erfasste Volumen in einer Küvette durch den Anregungs- und den Emissionsstrahlengang bestimmt (siehe Abbildung 3). Abbildung 3 : Strahlengang in einer Fluoreszenzküvette Nur die Photonen aus einem Teilvolumen in der Mitte der Küvette gelangen auf den Detektor. Die Größe dieses Teilvolumens ist von der genauen Geometrie der Strahlengänge abhängig. Eine Abschätzung der Anzahl von fluoreszierenden Molekülen wird hier beispielhaft durchgeführt: Detektionsvolumen : Kugel mit Radius r = 1mm VDet = 4 3 πr = 4.2.10 −9 m 3 3 (1) Konzentration einer Farbstofflösung : c Farbstoff = 10 −4 mol L−1 = 0.1mol m −3 Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 7 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Mit NA = 6.022.10 23 mol −1 lässt sich die Anzahl der Farbstoffmoleküle NFarbstoff in dem Volumen VDet berechnen: . . NFarbstoff = N A c Farbstoff VDet ≈ 2.5 .10 14 (2) 2.2 Fluoreszenzmessung an einzelnen Farbstoffmolekülen Um die Fluoreszenzeigenschaften einzelner Moleküle untersuchen zu können, werden oft extrem stark verdünnte Proben untersucht. Die Konzentration der zu untersuchenden Spezies wird so gewählt, dass sich immer nur maximal ein Molekül im Fokus des Mikroskopobjektivs befindet. Außer bei Messungen in der Gasphase befinden sich die Fluorophore typischerweise in einer festen oder flüssigen Matrix. Als feste Matrix können amorphe Stoffe(z.B. Polymere) oder Kristalle verwendet werden. Abbildung 4: Bei genügend großem Abstand zueinander können einzelne Fluorophore getrennt betrachtet werden Oft zeigt die Matrix auch eine schwache Fluoreszenz, die durch Verunreinigungen verursacht wird. Daneben treten Streueffekte (Rayleigh- und Ramanstreuung) an den Molekülen der Matrix auf. Reflexionen an den Phasengrenzflächen sind eine weitere Ursache für ungewünschte Effekte. Daher ist es vorteilhaft, möglichst kleine Anregungs- und Detektionsvolumina zu verwenden. Je kleiner das beleuchtete Volumen ist, in dem sich der Fluorophor befindet, desto signifikanter kann das Fluoreszenzsignal auf dem Lichtuntergrund detektiert werden. Ausschlaggebend ist dabei nicht nur die Höhe des Untergrundes selbst, sondern auch die zeitliche Änderung (Fluktuation) des Untergrundes (Signal/Rausch-Verhältnis). Je kleiner das Detektionsvolumen ist, desto geringer wird auch das Hintergrundrauschen bei einer Messung sein. Um die Fluoreszenz einzelner Moleküle messen zu können, werden sehr empfindliche Detektoren benötigt. Oftmals (auch hier im Praktikum) werden Halbleiterphotodioden eingesetzt, die mit Hilfe eines Lawineneffekts einzelne Photonen detektieren können (Avalanche Photodiode, APD). Dabei sind Quanteneffizienzen von 50-70% möglich, d.h. 50-70% der auftreffenden Photonen werden registriert und gezählt. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 8 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Neben einer sehr empfindlichen Photonendetektion müssen auch die Fluorophore bestimmten Anforderungen genügen, damit signifikante Messergebnisse resultieren können: (A) Der Absoptionsquerschnitt σB eines Moleküls B muss bei der verwendeten Anregungswellenlänge λ ex möglichst groß sein, damit der fluoreszenzfähige Zustand von dem Molekül effizient besetzt werden kann. Im Zusammenhang mit Einzelmoleküluntersuchungen ist es zweckmäßig, anstelle der molaren Größe εB den Absoptionsquerschnitt σB zu verwenden, der sich auf ein einzelnes Molekül bezieht : σ B = ln 10 ⋅ εB NA (3) NA ist die Avogadrische Konstante und εB der molare dekadische Extinkionskoeffizient. Daraus folgt, dass σB die Dimension einer Fläche hat. (B) Die Fluoreszenzquantenausbeute des Moleküls sollte groß sein, damit aus fast jedem Absorptionsprozess eine Emission resultiert. Eine Fluoreszenzquantenausbeute von 100% bedeutet, dass nach jeder Anregung eines Farbstoffmoleküls tatsächlich auch ein Photon emittiert wird. (C) Die Besetzungswahrscheinlichkeit für langlebige Molekülzustände sollte klein sein. Z.B. sollten Übergänge in einen Triplett-Zustand möglichst selten erfolgen. Die Moleküle sollten also eine kleine Intersystemcrossing-Rate besitzen. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 9 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 3 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie Diese experimentelle Methode hat sich in den letzten Jahren als Standardmethode für Fluoreszenzmesungen an einzelnen Moleküle etabliert. Die folgende Beschreibung des experimentellen Aufbaus ist in zwei Teile untergliedert. In dem folgenden Abschnitt wird das Prinzip der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie beschrieben (3.1.) , danach folgt der im Praktikum verwendete Aufbau (3.2.). 3.1 Das Prinzip der konfokalen Mikroskopie 3.1.1 Auflösungsvermögen Um tatsächlich nur einzelne Moleküle optisch anzuregen, muss das Anregungslicht sehr stark fokussiert werden. Allerdings sind der Fokussierung von Licht, z.B. mit einem Mikroskopobjektiv, durch das Beugungslimit Grenzen gesetzt. Der laterale Durchmesser (senkrecht zur Ausbreitungsrichtung) der erreichbaren Strahltaille (Stelle im Strahlengang mit dem geringsten Durchmesser) ist abhängig von der Wellenlänge λ des Lichtes, von dem Brechungsindex n des Mediums (in dem sich das Licht ausbreitet) und vom Öffnungswinkel 2α des Lichtkegels. Die radiale Ortsabhängigkeit der Intensitätsverteilung I(x ) in der Taille, beschrieben durch die Koordinate x, ist näherungsweise Gaußförmig, x2 I(x ) ∝ exp − 2 . 2σ (4) Brechungsindex n und Öffnungswinkel α werden zur numerischen Apertur NA zusammengefasst, (5) NA = n sin α Hohe numerische Aperturen werden mit extrem kurzbrennweitigen Objektiven erreicht, deren Öffnungswinkel 2α sehr groß ist. Prinzipiell ist der Öffnungswinkel von der Brennweite und dem Frontlinsendurchmesser des verwendeten Objektives abhängig. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 10 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Abbildung 5 : Gaußsche Strahltaille und laterale Intensitätsverteilung Die Breite der Gaussförmigen Intensitätsverteilung I(x ) kann mit der Standardabweichung σ angegeben werden. Alternativ kann aber auch die volle Breite in halber Höhe FWHM (full width at half maximum) angegeben werden (in Abb.5 kurz HWB, Halbwertsbreite genannt). Die Halbwertsbreite der Intensitätsverteilung HWB (FWHM) wird berechnet durch HWB lateral = 0.51 λ . n sin α (6) Ein sehr gutes Immersionsölobjektiv besitzt z.B. eine NA = 1.4 . Bei einer Wellenlänge von λ = 600 nm ergibt sich daraus eine Breite der Gaußschen Strahltaille von HWB = 219 nm . Dies ist sehr groß im Vergleich zu molekularen Abmessungen. Zur Erinnerung: typische C-C Bindungslängen betragen 0.12 − 0.15 nm . Befinden sich also mehrere Moleküle innerhalb der Strahltaille, können sie nicht mehr voneinander getrennt werden. Diese wellenlängenabhängige Abbildungsgrenze wird daher auch als Auflösungsvermögen des Mikroskops bezeichnet. Je kürzer die verwendete Wellenlänge und je größer die NA sind, desto feinere Strukturen können aufgelöst werden. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 11 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Für die Anregung von Farbstoffen in einem Mikroskop werden sehr kleine Intensitäten benötigt. Ist P die Leistung (Energie pro Zeit), die mit einem Leistungsmeter in dem Strahlungsgang gemessen wird, wird, lässt sich daraus die Anregungsintensität I (Energie pro Zeit und Fläche) mittels der Beziehung I= P (HWB lateral (7) 2 1.177 ) ⋅ π berechnen. Mit einem typische Wert von z.B. P = 2µW , direkt vor dem Objektiv gemessen, sen, ergibt sich (Annahme: NA = 1.4 , λ = 600 nm ) eine Anregungsintensität von I = 1.7 ⋅ 107 W m −2 ! 3.1.2 Vergrößerung Ein typischer Strahlengang eines modernen Mikroskops (nicht nicht konfokal) konfokal wird in der folgenden Abbildung gezeigt, schematisch dargestellt bestehend aus zwei Linsen (tatsächlich bestehen schon Mikroskopobjektive aus mehreren Linsen). Das Objekt befindet sich in der Brennebene des Mikroskopobjektives mit der Brennweite f1, so dass das Bild des Objekts im Unendlichen liegt. Zwischen dem Mikroskopobjektiv und der Tubuslinse liegt der sogenannte Infinity-Bereich, Bereich, in dem die Strahlen parallel zur Verbindungsachse sachse der beiden Linsen sich ausbreiten. ausbreiten. Dies hat den ganz entscheidenden Vorteil, dass der Abstand zwischen diesen beiden Linsen verändert werden kann, ohne dass es sich auf die Abbildungsschärfe oder die Vergrößerung auswirkt. Abbildung 6 : Schematischer Aufbau eines optischen Mikroskops Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 12 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Werden in den Infinity-Bereich Bereich weitere optische Elemente wie Filter, Polarisatoren oder Strahlteile eingefügt, so wird die Abbildungsqualität dadurch weit weniger beeinträchtigt, als wenn die Strahlenbündel in diesem Bereich konvergent (nicht parallel) wären. Die Tubuslinse mit der Brennweite f2 erzeugt ein reales Zwischenbild in der Brennebene der Tubuslinse. Die Vergrößerung dieses Systems ist durch das Verhältnis der beiden Brennweiten f2/f1 gegeben. Die auf Mikroskopobjektiven aufgedruckte Vergrößerung macht also nur in Kombination mit einer Tubuslinse Sinn. Als möglicher Detektor kann z.B. der CCD-Chip CCD Chip einer Videokamera genau im Abstand f2 positioniert werden. Mann erhält dann ein scharfes Bild, wenn sich das Objekt im Abstand f1 vom Mikroskopobjektiv befindet. 3.1.3 Fluoreszenzmikros skopie Die Fluoreszenzmikroskopie bietet gegenüber reinen TransmissionsTransmissions und Reflektionsmethoden den Vorteil, daß das Anregungslicht, mit dem die Probe beleuchtet wird, mittels optischen Filtern sehr effektiv vom Fluoreszenzlicht abgetrennt werden kann.. Ein sehr einfacher Aufbau dafür kann mit einem farbteilenden (dichroitischen) Spiegel realisiert werden. Abbildung 7 : schematischer atischer Strahlengang eines Fluoreszenzmikroskops mit Weitfeldbeleuchtung (nicht nicht konfokal) konfokal Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 13 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Das kürzerwellige Anregungslicht wird an dem farbteilenden Spiegel reflektiert. In unserem Beispiel wurde es außerdem derart fokussiert, dass in der Objektebene ein weites Feld beleuchtet wird (Weitfeldmikroskopie). Das längerwellige Fluoreszenzlicht kann den farbteilenden Spiegel passieren und wird in der Zwischenbildebene fokussiert. Von der Probe rückgestreutes Anregungslicht (keine Änderung der Wellenlänge) wird von dem farbteilenden Spiegel abgetrennt. 3.1.4 Konfokale Mikroskopie Mit dem konfokalen Prinzip kann im Vergleich zur konventionellen (Weitfeld-) Mikroskopie das axiale Auflösungsverhalten wesentlich verbessert werden, zudem erhöht sich auch das laterale Auflösungsvermögen etwas (in der Objektebene). Anders als bei dem Aufbau in Abbildung 7 wird hier das Anregungslicht auf einen Punkt in der Probe fokussiert. Damit konzentriert sich die Anregungswahrscheinlichkeit in dem kleinen Bereich der Strahltaille: nur hier ist die Anregungsintensität hoch genug, um eine detektierbare Anzahl von Absorptionsprozessen (pro Zeiteinheit) zu ermöglichen. Abbildung 8 : Anregungsstrahlengang in einem konfokalen Fluoreszenz-Mikroskop Zusätzlich wird in dem Detektionsstrahlengang eine Lochblende in der Zwischenbildebene eingefügt. Befindet sich ein Objekt (Molekül) genau in dem Fokus in der Objektebene, wird dessen Abbildung die Lochblende in der Zwischenbildebene passieren können. Objekte an anderen Positionen werden von der Lochblende geblockt. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 14 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Abbildung 9 : Ortsabhängige Lichtunterdrückung durch eine Lochblende in der Zwischenbildebene. Der Anregungsstrahlengang wurde hier weggelassen. Unter der Annahme, dass AnregungsAnregungs und Emissionswellenlängen gleich sind (λ = λ ab = λ em ) , ergibt sich folgendes (optimales) Auflösungsvermögen : HWBlateral = 0.36 λ 0,64 λ und HWBaxial ≈ NA NA (8) Meistens liegen aber AnregungsAnregungs und Emissionswellenlänge mehr als 10 nm auseinander, so dass eigentlich eine gesonderte Betrachtung jeweils für die Absorption und die Emission vorgenommen werden müsste. NA ist hier wieder die numerische Apertur des es verwendeten Mikroskopobjektives (siehe Abbildung 5). Bisher wurde genau ein Punkt der Probe angeregt und dessen Emission beobachtet. Um ein zwei- oder drei-dimensionales dimensionales Bild der Probe zu erhalten, wird die Probe mit Hilfe eines Piezoscanners vor dem Objektiv Objektiv bewegt, d.h. abgerastert. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie hat sich als Schlüsseltechnologie zur spektroskopischen Untersuchung einzelner Moleküle erwiesen. Sind sie in einer Probe weiter als das oben angegebene Auflösungsvermögen voneinander entfernt, können einzelne Moleküle unterschieden werden: man erhält einzelne Leuchtobjekte. Neben der Intensität können prinzipiell alle möglichen spektroskopischen Parameter einzelner Moleküle bestimmt werden wie Fluoreszenzlebensdauern, EmissionsEmissions und Anregungsspektren, spektren, Polarisationseigenschaften, Polarisationseigenschaften, Triplettkinetik, photochemische Prozesse etc. . Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 15 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 3.2 Experimenteller Aufbau des Fluoreszenzmikroskopes (Praktikum) Nach dem in den vorhergehenden Abschnitten der prinzipielle Aufbau eines konfokalen Fluorezenzmikroskops gezeigt wurde, wird hier der aktuelle, im Praktikum verwendete Aufbau beschrieben. 3.2.1 Anregungsstrahlengang Zur Zeit (Stand September 2016) wird für Anregung ein Diodenlaser mit einer mittleren Wellenlänge von 638nm verwendet Meistens werden die Lichtquellen bei einem konfokalen Mikroskop in eine Glasfaser eingekoppelt. Zusätzlich sind noch folgende optische Elemente in dem Anregungsstrahlengang eingebaut: - kontinuierlichen Abschwächer: hier wird die Anregungsintensität eingestellt - Laserlinienfilter: unerwünschte Laserlinien werden abgeblockt. Nur die gewünschten Laserlinien können den Filter passieren (=Bandpassfilter) - Polarisationsfilter (optional): die Anregung erfolgt mit linear polarisiertem Licht - Shutter / Verschluss : die Probe wird nur während einer Messung angeregt Über eine Linse wird das Anregungslicht in eine Glasfaser eingekoppelt. Prinzipiell ist die Faser nicht notwendig, sie bietet aber deutliche Vorteile: - die Anregungslichtquellen können ausgetauscht werden, ohne dass der Anregungsstrahlengang im Mikroskop verändert werden muss - die Anregungslaser können räumlich vom Mikroskop getrennt werden - bei geeigneten Fasern erhält man an der Austrittsöffnung eine ideale punktförmige Lichtquelle Über einen teildurchlässigen Spiegel wird das Anregungslicht in das Objektiv gelenkt. Die punktförmige Anregungslichtquelle wird also in der Objektebene wieder als Punkt abgebildet. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 16 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie LF : Laserlinienfilter (nur die gewünschten Wellenlängen werden durchgelassen) A : optischer Abschwächer (Einstellen der Anregungsleistung) P : Polarisator SH : Shutter (Verschluss) L : Linsen GF : Glasfaser DS : teildurchlässiger Spiegel (ca. 10% des Anregungslicht werden umgelenkt, 90% des emittierten können passieren) S : Spiegel LP : Langpassfilter (ab einer bestimmten Wellenlänge kann längerwelliges Licht den Filter passieren) PS : polarisationsabhängiger Strahlteiler D1 : hochempfindlicher Detektor (APD, avalanche photo diode) D2 : “ “ “ “ Abbildung 10: Experimenteller Aufbau des konfokalen Fluoreszenzmikroskops im Praktikum Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 17 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 3.2.2 Scanner Durch das konfokale Prinzip bedingt, wird immer nur ein Punkt der Probe in der Objektebene beleuchtet bzw. auch detektiert. Um eine Abbildung der Probe zu erhalten, muss die Probe vor dem Objektiv abgerastert werden. Dazu befindet sich die Probe auf einem Verschiebetisch, der über Piezoaktuatoren in alle drei Raumrichtungen verschoben werden kann. Der im Praktikum verwendet Scanner hat eine Auflösung von ca. 20-50 nm. Die Steuerung erfolgt über einen Computer, der auch die detektierten Intensitäten registriert und auswertet. 3.2.3 Detektionsstrahlengang Von der Probe emittierte Photonen werden über das Objektiv wieder eingesammelt und können zu ~93% den teildurchlässigen Spiegel passieren. Nach einem Spiegel wird mit einem hochwertigen Langpassfilter das längerwellige Fluoreszenzlicht von dem unveränderten Streulicht getrennt. Ein polarisationsabhängiger Strahlteilerwürfel lenkt die Photonen polarisationsabhängig auf den Detektor D1 oder D2. Anstelle der in Abbildung 8 gezeigten Lochblende wird die räumlich begrenzte, photoempfindliche Detektionsfläche der Photodioden verwendet. Dadurch können einige optische Elemente vermieden werden, die immer einen bestimmten Verlust an Photonen durch Reflexion bedeuten würden. Die Detektoren sind empfindlich genug, um einzelne Photonen detektieren zu können. Ein Computer zählt die ankommenden Photonen. Aus dem Intensitätsverhältnis von D1 zu D2 kann die Polarisation der emittierten Photonen ermittelt werden. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 18 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 4 Bedienungsanleitung In den folgenden Abschnitten wird die Bedienung des im Praktikum eingesetzten Mikroskops und der Auswertungssoftware beschrieben. (Stand 28.Mai 2010) 4.1 Wichtig ! Einige der im Mikroskop verwendeten Komponenten sind sehr teuer und können durch Bedienungsfehler zerstört werden. Hier sind die beiden ‚gefährdetsten’ Komponenten beschrieben : Als Detektoren werden Avalanche Photodioden (APD) verwendet, die durch einen zu hohen Photonenstrom zerstört werden können. Findet keine Messung statt, müssen sie daher immer ‚ausgeschaltet’ sein. Abbildung 11: Handsteuerung für das Mikroskop mit Funktionsleuchten Der Probenwechsel muss äußerst vorsichtig durchgeführt werden, da ansonsten das Mikroskopobjektiv beschädigt werden könnte. Niemals die Linsen des Objektivs berühren! Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 19 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Mikroskopobjektiv Abbildung 12: Probenhalter des invertierten Mikroskops: Die Probe wird von unten betrachtet 4.2 Übersicht der Komponenten und Funktionen Die Ansteuerung und Datenerfassung des konfokalen Mikroskops wird vollständig mit einem zentralen Computer durchgeführt. Er erfüllt dabei drei verschiedene Aufgaben: a) Monitor für die angeschlossene CCD-Kamera (Justage des Objektiv-Focus) b) Vollständige Steuerung (LABVIEW-Routinen) des Mikroskops (Kontrolle des Piezoscanners, Datenerfassung) c) Datenauswertung mit Hilfe von MATLAB-Routinen Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 20 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Probe . . . . .. XY-Piezoscanner Objektiv Shutter teildurchlässiger Spiegel klappbarer Spiegel CCD Kamera D1 (APD) L LP S L D2 (APD) Abbildung 13: Schematischer Aufbau der Mikroskopsteuerung und Datenerfassung Abbildung 14 : konfokales Laserscanningmikroskop Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 21 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 4.3 Mikroskopsteuerung 4.3.1 Hardware Die folgenden Komponenten können gesteuert werden: - XY Piezoscanner (erfolgt vom Hauptcomputer) - APD ‚Gate’ : aktivieren/deativieren der hochempfindlichen Detektoren (erfolgt vom Hauptcomputer bzw. auch per Handsteuerung) - SHUTTER : öffnen / schließen des Shutters im Anregungsstrahlengang (erfolgt vom Hauptcomputer bzw. auch per Handsteuerung) - MIRROR : Spiegel für die Justage des Fokus in den Strahlengang drehen (erfolgt per Handsteuerung) Abbildung 15 : Handsteuerung des Mikroskops Während einer Messung übernimmt der Hauptcomputer die Kontrolle der einzelnen Komponenten. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 22 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 4.3.2 Softwaresteuerung des Mikroskops Eine Messung wird vollständig über eine Software gesteuert (Labview-Routinen). Über eine Maske können die verschiedenen Parameter für z.B. Scanbereich, Scangeschwindigkeit etc. eingestellt werden. Anschließend können die gemessenen Daten (Bilder oder Zeitspuren) auf der Festplatte gespeichert werden. Details der Eingabemöglichkeiten werden in den folgenden Abschnitten beschrieben. Abbildung 16 : Eingabemaske der Steuerungssoftware Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 23 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 4.4 Einzelne Operationen 4.4.1 Probenwechsel Ein Probenwechsel muss mit äußerster Sorgfalt durchgeführt werden, da ansonsten das Mikroskopobjektiv beschädigt werden könnte. Zuerst muss der Deckel des Probenraumes entfernt werden, er wird einfach abgehoben. Wichtig ist hierbei, dass keine Messung läuft und dass die Detektoren (APD) ausgeschaltet sind. Ansonsten könnten sie durch den Lichteinfall zerstört werden. Magnetische Folie Metallring Manuelle Fokuseinstellung Abbildung 17 : Probenraum (Deckel wurde entfernt) Die Probe besteht aus einem Objektdeckgläschen, auf das die eigentliche Probe als dünner Film aufgebracht wurde. Das Gläschen liegt auf einem runden silberfarbenen Metallring und wird durch eine magnetische Folie festgehalten. Nachdem eine neue Probe eingebaut wurde, muss das Objektiv neu fokussiert werden. Dazu gibt es zwei Möglichkeiten: - über den Drehknopf ‚manuelle Fokuseinstellung’ wird das Objektiv hoch- oder runterbewegt (siehe Abbildung 16). - Der Piezoscanner kann auch in Z-Richtung bewegt werden. Dies erfolgt über einen Controller, der in der Abbildung 17 gezeigt wird Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 24 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Abbildung 18 : Controller für die Z-Achse des Piezoscanners (Fokuseinstellung desObjektivs) Die Einstellung des Fokus wird über die Reflexion an der Glas-Luft-Grenzfläche des Probengläschen durchgeführt. Dazu muss der motorisierte Spiegel in den Strahlengang eingedreht werden. Dies wird durch die Handsteuerung (Abbildung 3) durchgeführt. Auf Tastendruck (‚ON’) dreht der Spiegel und gleichzeitig wird der Shutter des Anregungsstrahls geöffnet. Nun fällt das an der Grenzfläche reflektierte Licht auf eine CCD-Kamera (siehe Abbildung 1), die an den Hauptcomputer angeschlossen ist. Mit der Software ’CCD-Kamera’ wird das von der Kamera aufgenommene Bild auf dem Monitor angezeigt. Nun wird der Fokus so eingestellt, dass sich ein möglichst kleiner und heller Punkt ergibt. Der Brennpunkt des Objektivs liegt nun genau bei der Glas/Luft-Grenzfläche. Nun den Spiegel über die Handsteuerung wieder aus den Strahlengang entfernen (‚OFF’). Zusammenfassung: (1) Prüfen, dass keine Messung läuft (APD ausgeschaltet!) (2) Deckel des Probenraum öffnen (3) Magnetische Folie entfernen (4) Objektdeckgläschen vorsichtig mit Pinzette austauschen (5) Mit Folie befestigen (6) Deckel des Probenraums einsetzen (7) Spiegel für die Fokussierung eindrehen (8) CCD-Software aktivieren (9) Fokussieren (10) Spiegel wieder rausdrehen. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 25 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 4.4.2 Aufnahme eines Fluoreszenzbilds Für die Aufnahme eines Fluoreszenzbildes müssen einige Parameter in der Bildschirmmaske der Softwaresteuerung eingestellt werden. Abbildung 19 : Bedienelemente für die Aufnahme eines Fluoreszenzbildes Beschreibung der wichtigsten Parameter: range [µm] : Größe der zu scannenden Fläche (10 X, 10 Y bedeutet 10x10µm) Der Mittelpunkt der Fläche ist 0/0, d.h. bei 10 µm wird von -5...+5µm gescannt. # of pixels : Anzahl der pixels (128 X, 128 Y bedeutet 128x128Pixel=16384Pixel) offset [mm] : Der Mittelpunkt der zu scannenden Fläche. Maximal können 80x80µm gescannt werden. time/pixel [ms] : Zeitdauer für ein Pixel. Beispiel 128x128 Pixel, 3ms pro Pixel -> die Messung dauert 128x128x3=49 Sekunden. direction : sollte immer auf ‚uni’ gestellt sein. Es wird immer nur in einer Richtung gescannt. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 26 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Sind die Parameter eingestellt, kann der start Knopf betätigt werden. APD und Shutter werden automatisch aktiviert und nach einer Messung wieder ausgeschaltet. Justage der Laserleistung Übliche Laserleistungen für die Detektion einzelner Farbstoffmoleküle liegen im Bereich von 1-2 µW, direkt vor dem Objektiv gemessen. Da dies zur Zeit nicht möglich ist, muss die Leistung indirekt eingestellt werden. Typische Emissionszählraten sind ~ 100-200 counts pro 5ms. Bei höheren Zählraten muss die Anregungsleistung mit dem Abschwächer (siehe Abbildung 2) verringert werden. Die Zählrate kann während einer Messung in der oberen rechten Abbildung abgelesen werden. Daten speichern Ist ein Bild vollständig gescannt, müssen die Daten für die weitere Bearbeitung gespeichert werden. Dazu muss die save Taste gedrückt werden. 4.4.3 Aufnahme von Fluoreszenzzeitspuren Nachdem ein Fluoreszenzbild aufgenommen wurde, können einzelne Moleküle näher untersucht werden. Dazu muss der Cursor aktiviert sein und auf ein Molekül positioniert werden. Über einen Tastendruck [goto cursor] fährt nun der Piezoscanner tatsächlich an die Position, d.h. das gewählte Molekül befindet sich im Focus des Mikroskopobjektivs. Eine Zeitspur der Fluoreszenz kann einfach aufgenommen werden. Dazu muss im vornherein die Zeitauflösung (time bin) eingestellt werden. [time bin = 1ms] bedeutet, das jede Millisekunde ein neuer Zählvorgang gestartet wird. Die Zählergebnisse werden fortlaufend in einem File gespeichert. Für eine höhere Zeitauflösung muss der Fastcount-Modus verwendet werden. Hier ist eine Zeitauflösung bis zu 10µs möglich. WICHTIG: Über den Kanalwähler wird bestimmt, welche APD gespeichert wird! Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 27 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Beendet wird die Aufnahme einer Zeitspur durch nochmaliges Drücken des entsprechenden Schalters. Während im Fastcount-Modus die Daten ‚on the fly’, also schon während einer Messung gespeichert werden, müssen im langsameren Modus die Daten manuell gespeichert werden. Bei funktionierendem Betrieb sollten Laser und APD-Detektoren automatisch aktiviert und auch wieder deaktiviert werden. 4.5 Datenauswertung Die gemessenen Daten – Fluoreszenzbilder und Zeitspuren – werden mit speziellen Software-Routinen (MATLAB) ausgewertet. 4.5.1 Analyse der Fluoreszenzbilder Das Programm IMAGE1 muss aufgerufen werden. Abbildung 20 : Oberfläche der Bildauswertungssoftware IMAGE1 Mit Hilfe der Maus wird eine gemessene Bild-Datei ausgewählt. Nach dem Einladen werden die Daten der beiden verwendeten Detektoren APD1 und APD2 gleichzeitig angezeigt. Als Achsenbeschriftung werden die Pixel angezeigt, dies muss bei der Auswertung beachtet werden. Durch einfaches ‚Anklicken’ eines hellen Spots in D1 Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 28 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie oder D2 springt das Fadenkreuz auf diese Position. Durch Drücken der [FIT] Taste wird ein zweidimensionaler Gauss-Fit des markierten Spots (Molekül) durchgeführt. Standardmäßig wird dabei eine Fläche von 30x30 Pixeln angefittet. Diese Größe kann aber mit den beiden Tasten [zoom +] und [zoom -] verändert werden. Die Fit-Ergebnisse erscheinen im unteren linken Fenster. Es werden beide Kanäle unabhängig (hintereinander) angefittet mit: I( x, y) = amp ⋅ e − ( x −x0 )2 2σ 2 ⋅e − ( y − y0 )2 2 σ2 (9) Als Ergebnis werden angegeben x0/y0, σ und amp für beide Kanäle. 4.5.2 Analyse der Zeitspuren Das Programm TRACE1 muss aufgerufen werden. Abbildung 21 : Oberfläche der Auswertungssoftware TRACE1. Damit können zeitabhängige Signale statistisch ausgewertet werden. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 29 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Die Daten einer Zeitspur werden durch einfaches Anklicken in dem Directory-Fenster ausgewählt und geladen. Im Praktikum werden typischerweise zwei Detektoren verwendet, zwischen diesen beiden Kanälen kann über die Taste [ch x] umgeschaltet werden. Wenn nicht die gesamte Zeitspur für die weitergehende Auswertung (Autokorrelation) verwendet werden soll, muss ein Bereich gewählt werden. Dazu muss der Cursor auf den Anfangs- bzw. Endpunkt gesetzt werden und jeweils eine der Tasten [set start] bzw. [set end] gedrückt werden. Der Cursor wird durch einfaches Anklicken der gewünschten Position in der Zeitspur gesetzt. Der angezeigte Ausschnitt der Zeitspur kann ausgewählt werden. Dabei bedeuten : nach links zoomen stauchen nach rechts Eine Autokorrelation des ausgewählten Abschnittes wird durch Drücken der Taste [correlate] gestartet. Je nach Länge der Zeitspur kann dieser Vorgang einige Sekunden dauern. Eine Zeitspur lässt sich durch Wertepaare t i , c i darstellen, i = 1,K, n . Die Breite eines Punktes, die wir bei unserer Messung durch [timebin] eingestellt hatten, ist ∆t = t i+1 − t i , die Anzahl der gezählten Photonen eines Zeitpunktes beträgt c i . Allgemein wird bei einer Korrelation untersucht, in wieweit verschiedene Ereignisse von einander abhängen. Dies können vollkommen unterschiedliche Dinge sein und daher werden Korrelationen in sehr vielen Bereichen wie z.B. in der Medizin, Wirtschaft etc. verwendet. In den Naturwissenschaften basieren einige wichtige Messprinzipien auf dem Aufstellen von Korrelationen. Ein Beispiel dafür ist die hier verwendete Autokorrelation der gemessenen Intensitätsfluktuationen. Da die Intensitätsfluktuationen als Funktion der Zeit untersucht werden, handelt es sich um eine Zeitkorrelationsfunktion. Bei einer Autokorrelation wird eine Größe mit sich selbst korreliert. Mit K wird ganz allgemein der Mittelwert einer Funktion bezeichnet ( ∆t = t'−t ) Fc (∆t) = a ⋅ c(t ) c(t' ) Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie (10) Seite 30 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Da unsere Messwerte diskret vorliegen, wird die normierte Korrelationsfunktion mit dem Software-Programm wie folgt berechnet: n Fc (∆t ) = c (t ) c (t + ∆t ) c (t ) c (t + ∆t ) = n⋅ ∑ c (t ) c (t + ∆t n n ) ∑ c (t ) ⋅ ∑ c (t + ∆t ) (11) Die normierte Intensitätskorrelationsfunktion Fc (∆t ) wird der Einfachheit halber nun im folgenden als Funktion der Zeit τ geschrieben, Fc (τ ) . Das Ergebnis wird in dem oberen rechten Fenster angezeigt. In einem weiteren Schritt kann an die berechnete Korrelationsfunktion entweder eine Exponentialfunktion Fc (τ ) = A + B ⋅ e − kτ (12) oder eine gestreckte Exponentialfunktion b Fc (τ ) = A + B ⋅ e − (kτ ) (13) angepasst (gefittet) werden. Über die Tasten [fit start + -] bzw. [fit end + -] kann der Bereich der Korrelationsfunktion bestimmt werden, an den die analytische Funktion angefittet werden soll. Das Ergebnis des Fits wird in dem Fenster unten rechts angezeigt. Mit der Taste [save data] können die Korrelationsergebnisse (Korrelationsfunktion, Fitkurve und Fitergebnisse) gespeichert werden. Es wird ein ASCII-File mit dem Namen *_fiterg.dat erzeugt. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 31 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 5 Aufgabenstellung Für die Durchführung der Aufgaben ist es notwendig, die vorhergehenden Kapitel gelesen zu haben. Für die aktuellen Versuche wird als Anregungslichtquelle ein roter Diodenlaser (λ = 635nm) verwendet. Die Aufgaben teilen sich in zwei unterschiedliche Bereiche. Beachten Sie sämtliche Fragen und diskutieren Sie diese. 5.1 Bestimmung des räumlichen Auflösungsvermögen Das laterale Auflösungsverhalten des Mikroskops lässt sich am einfachsten mit einer Probe bestimmen, die stark fluoresziert und Strukturen aufweist, die kleiner sind als die mögliche Auflösung des Mikroskops. Wir verwenden in dem Versuch Polymerkugeln, die mit Farbstoffen markiert sind (Tetraspeck - Molecular Probes). Die Kugeln befinden sich auf einem Deckgläschen ohne weitere Matrix und haben einen Durchmesser von 100nm. (a) Setzen Sie eine Probe mit Tetraspeck-Kugeln in das Mikroskop ein. Hier ist äußerste Sorgfalt geboten, um das Mikroskopobjektiv nicht zu beschädigen. (b) Fokussieren Sie das Objektiv (siehe Bedienungsanleitung). (c) Scannen Sie die Probe so, dass Sie insgesamt mindestens 10 Polymerkugeln vollständig erfasst haben. Beginnen Sie dafür zuerst mit sehr niedriger Anregungsleistung und erhöhen Sie diese sukzessive, bis eine maximale Zählrate von 200 cts/5ms gemessen wird. Die Daten der gescannten Bilder sollen abgespeichert werden und mit der beschriebenen Software (IMAGE1) ausgewertet werden. Folgende Größen sollen bestimmt werden: - - maximale Intensität APD1 und APD2 (woher kann der Unterschied herrühren?) Breite der Spots : Als Ergebnis soll die mittlere FWHM für beide Kanäle und die Standardabweichung angegeben werden (Full Width at Half Maximum) Wie groß ist nun das optische Auflösungsvermögen des Mikroskops? Welche Rolle spielt die Größe der untersuchten Teilchen bei der Berechnung der Auflösung? Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 32 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 5.2 Untersuchung von Terrylendiimid (TDI) Dieser Farbstoff zeichnet sich u.a. durch seine sehr hohe Photostabilität aus. Absorptions- und Emissionsspektren sind in der folgenden Abbildung gezeigt. In dem Praktikumsversuch wird er mit einem Diodenlaser (nominell 635nm) angeregt. Die Fluoreszenz wird über einen Bandpass von der Anregungswellenlänge getrennt. Das emittierte Licht wird polarisationsaufgelöst mit zwei Detektoren aufgezeichnet (siehe Bedienungsanleitung) . (a) Setzen sie ein Probengläschen mit TDI in PMMA in das Mikroskop ein. (b) Fokussieren sie das Objektiv. (c) Stellen Sie die Laserleistung auf einen Wert ein, der vom Assistenten während des Versuchs genannt wird. Die Leistung muss höher als bei der Untersuchung der Polymerkugeln sein. Warum? (d) Scannen Sie ein Bild, wählen Sie dazu einen geeigneten Ausschnitt. Als günstige Zeit pro Pixel (bin time) können 5ms gewählt werden. Warum ist das Signal-zuRausch-Verhältnis hier deutlich ungünstiger als bei den farbstoffmarkierten Polymerkugeln? (e) Werten Sie 2 Moleküle analog zu den Kugeln aus (Teil 1). Warum gibt es hier deutlich größere Unterschiede in den detektierten Intensitäten zwischen den beiden Detektoren APD1 und APD2? Was ist der Unterschied zwischen APD1 und APD2? (f) Nehmen Sie für 10 Moleküle eine Zeitspur mit einer Zeitauflösung von 10µs auf. A bzw. Ψem / willk. Einheiten Die notwendige Anregungsintensität und die Länge der Zeitspuren werden vom Assistenten angegeben. Bestimmen Sie mit Hilfe der Software TRACE1 die Triplettlebensdauern der TDI-Moleküle (Mittelwert, Standardabweichung). 1.0 Absorption Emission (λex = 600 nm) 0.8 TDI in Toluol O O N N O O 0.6 0.4 0.2 0.0 500 600 700 800 λ / nm Abbildung 22 : Absorptions- und Emissionsspektren von Terrylendiimid (TDI) Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 33 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Theoretische Grundlagen : In der folgenden Abbildung ist das Drei-Niveau-System des TDI mit den wichtigsten Übergängen gezeigt. Nach einer Anregung vom Grundzustand S 0 in den ersten angeregten Singulettzustand S1 kann mit einer kleinen Wahrscheinlichkeit auch der Triplettzustand T1 populiert werden. Während die Lebensdauer des S1 Zustandes nur etwas 3.5 ⋅ 10 −9 s beträgt, ist der Triplettzustand mit einer Lebensdauer von 50 − 100 ⋅ 10 −6 s wesentlich stabiler. Abbildung 23 : Das Drei-Niveau-System Für die weiteren Betrachtungen ist es notwendig, die zeitliche Entwicklung der Besetzungswahrscheinlichkeiten des angeregten Zustandes ρ2 zu kennen. Folgendes Gleichungssystem beschreibt die zeitliche Entwicklung d ρ1 = −k 12ρ1 + k 21ρ 2 + k 31ρ 3 dt (14) d ρ 2 = +k 12 ρ1 − k 21ρ 2 − k 23 ρ 2 dt (15) d ρ3 = +k 23 ρ 2 − k 31ρ3 dt (16) mit ρ1 + ρ2 + ρ3 = 1 . Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 34 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Nach Lösen des Gleichungssystems (gekoppelte Differentialgleichungen) erhält man [ ] ρ2 ∝ − (1 + Cm )e − ατ + Cme −βτ + 1 (17) α ≈ k 12 + k 21 (18) mit k 12k 23 k 12 + k 21 (19) k 12k 23 k 31 (k 12 + k 21 ) (20) β ≈ k 31 + C≈ Wie aus den Gleichungen zu erkennen ist, liefern die Zerfallskonstante β und der molekulare Kontrast C Informationen über die Intersystem-Crossing Rate k 31 und damit über die Triplett-Lebensdauer. Man nennt den Zustand, in dem ein Molekül in der Lage ist zu fluoreszieren, einen ‚An’-Zustand. Im ‚Aus’-Zustand befindet sich das Molekül im Triplett-Zustand und kann nicht fluoreszieren. Der Wechsel zwischen ‚An’ und ‚Aus’-Zuständen ist in den Zeitspuren als Wechsel zwischen Helligkeits- und Dunkelperioden zu sehen. Die Photonen werden nicht kontinuierlich, sondern meist in Bündeln, ’bunches’ emittiert. Der Einfachheit halber werden die Übergangsraten in diese Zustände mit k on und k off bezeichnet. Die Rate, mit der der Triplettzustand verlassen wird, ist k on = k 31 . Der ‚Aus’-Zustand wird aus dem Grundzustand S 0 über den ersten angeregten Zustand S1 erreicht, k off = k 12 k 23 , wobei angenommen wurde, dass die k 21 + k12 Anregungsrate wesentlich kleiner ist als die Fluoreszenzrate, k 12 << k 21 . Damit lässt sich Gleichung (19) schreiben als : β = k on + k off (21) k off k on (22) und C≈ Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 35 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie Hierbei wurde angenommen, dass die Intensitäten im ‚An’-Zustand wesentlich größer sind als im ‚Aus’-Zustand, Ion >> Ioff . Mit der Annahme, dass die Zeitauflösung einer Messung deutlich kleiner (geringer1) als die Fluoreszenzlebensdauern ist, erhält man aus der Autokorrelation einer Zeitspur g(2) (τ) = 1 + C e −βτ (23) (Es handelt sich um eine Korrelationsfunktion 2. Ordnung) 1 Fluoreszenzlebensdauern liegen bei einigen ns, die Zeitauflösung der Messung beträgt einige µs Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 36 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 6 Fragen zur Vorbereitung • • • • • • • • Wodurch wird das räumliche Auflösungsvermögen eines Mikroskops bestimmt? Wie vergleicht sich ein konfokales Mikroskop mit einem (‚herkömmlichen‘) Weitfeldmikroskop? Was sind die Voraussetzungen, um einzelne Moleküle untersuchen zu können? Warum könnten Einzelmoleküluntersuchungen interessant sein? Welche Parameter können prinzipiell an einzelnen Farbstoffen untersucht werden? Welche Detektoren sind für die optische Einzelmolekülmikroskopie geeignet? Welche Informationen erhält man aus Korrelationsfunktionen? Welche Art von Korrelationsfunktion wird in dem vorliegenden Versuch bestimmt? Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 37 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 7 Literatur: Die folgende Liste wurde übernommen von http://www.olympusfluoview.com/books/index.html, Stand September 2011 - - - - - Handbook of Biological Confocal Microscopy - James B. Pawley (editor), Publisher: Springer; 2nd edition (March 31, 1995) , ISBN: 0306448262 Confocal Microscopy for Biologists - Alan R. Hibbs, Springer; 1 edition (August 4, 2004), ISBN: 0306484684 Cell Biological Applications of Confocal Microscopy - Brian Matsumoto (editor), Academic Press; 2 edition (December 24, 2002) , ISBN: 0125804458 Confocal Microscopy: Methods and Protocols - Stephen W. Paddock (editor), Humana Press; 1st edition (January 15, 1999) , ISBN: 0896035263 Confocal Laser Scanning Microscopy - Colin J. R. Sheppard and David M. Shotton, Springer; 1 edition (January 1997) , ISBN: 0387915141 Confocal and Two-Photon Microscopy: Foundations, Applications, and Advances - Alberto Diaspro (editor) Wiley-Liss; 1 edition (November 22, 2001) , ISBN: 0471409200 Confocal Microscopy (Methods in Enzymology - Volume 307) - P. Michael Conn (editor), Academic Press; 1 edition (September 7, 1999) , ISBN: 0121822087 Principles of Three-Dimensional Imaging in Confocal Microscopes - Min Gu, Wspc (July 29, 1996) , ISBN: 9810225504 Three-Dimensional Confocal Microscopy: Volume Investigation of Biological Systems - John K. Stevens, Linda R. Mills, and Judy E. Trogadis (editors), Academic Press; 1 edition (September 15, 1994) , ISBN: 0126683301 Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems Timothy R. Corle and Gordon S. Kino, Academic Press; 1 edition (September 12, 1996) , ISBN: 0124087507 Confocal Microscopy - Tony Wilson (editor), Academic Press (November 11, 1990) , ISBN: 0127572708 Selected Papers on Confocal Microscopy - Barry R. Masters and Brian J. Thompson (editors), SPIE Press (November 15, 1996) , ISBN: 0819423726 Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 38 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 8 Gefährdungsbeurteilung des Versuches Laserstrahlung kann potentiell schädlich für die Augen sein. Es sind die entsprechenden Sicherheitsbestimmungen einzuhalten. Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie Seite 39 Grundmodul Physikalische Chemie Konfokale Einzelmolekülmikroskopie 9 Tabellen für die Messwerte (A) räumliches Auflösungsvermögen # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 amp1 cts/5ms σ1 Pixel amp2 cts/5ms σ2 Pixel (B) Intensitätsfluktuationen, Autokorrelationfunktion # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A Johannes Gutenberg - Universität Institut für Physikalische Chemie B Seite 40 k Grundmodul Physikalische Chemie β 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1