Die lipolytischen Enzyme LipA und LipB von Bacillus subtilis

INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG............................................................................
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
Charakteristika von Lipasen.....................................................................................
Kinetik der Lipolyse – Enzymaktivität an Grenzflächen.........................................
Molekulare Struktur und katalytischer Mechanismus von Lipasen und Esterasen..
Lipolytische Enzyme der Gattung Bacillus..............................................................
Die Lipase LipA aus Bacillus subtilis......................................................................
Industrielle Biokatalyse............................................................................................
Entwicklung neuer Biokatalysatoren mit gerichteter Evolution...............................
Ziele dieser Arbeit....................................................................................................
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MATERIAL UND METHODEN..................................................
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2.1
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2.4
2.5
2.6
2.7
Chemikalien und Enzyme.........................................................................................
Bakterienstämme und Plasmide................................................................................
Oligonukleotide........................................................................................................
Anzucht und Lagerung von Bakterien......................................................................
Isolierung von Nukleinsäuren...................................................................................
Gelelektrophorese von Nukleinsäuren......................................................................
Identifikation von Transkriptionsstartpunkten mittels „Primer-extension“Analyse.....................................................................................................................
2.8 In vitro Rekombination von DNA............................................................................
2.9 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA....................................................
2.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)...........................................................................
2.10.1 Standard-PCR-Reaktion....................................................................................
2.10.2 Ortspezifische Mutagenese................................................................................
2.10.3 Sättigungsmutagenese.......................................................................................
2.10.4 Zufallsmutagenese.............................................................................................
2.11 „DNA-Shuffling“ zur in vitro-Rekombination von DNA-Sequenzen....................
2.12 Herstellung von lip-Deletionsmutanten in Bacillus subtilis....................................
2.13 Nukleinsäure-Hybridisierungen..............................................................................
2.14 Sequenzierung von DNA.........................................................................................
2.15 Bestimmung von Proteinkonzentrationen...............................................................
2.16 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)............................................
2.17 Chromatographische Reinigung der Proteine LipA und LipB aus B. subtilis.........
2.17.1 Reinigung der Proteine LipA und LipB nach Überexpression im homologen
Wirt B. subtilis...................................................................................................
2.17.2 Reinigung der LipB-Variante A76G nach Überexpression im heterologen
Wirt E. coli........................................................................................................
2.18 Aminoterminale Sequenzierung des LipB-Proteins................................................
2.19 Herstellung eines LipB-spezifischen „polyklonalen Antiserums“..........................
2.20 Immunologischer Nachweis von Proteinen.............................................................
2.21 Fraktionierung von Bacillus subtilis Zellen............................................................
2.22 Bestimmung von Enzymaktivitäten........................................................................
2.22.1 Spektroskopische Methoden zur Bestimmung von Lipase-/Esterase-Aktivität
2.22.2 Titrimetrische Methode zur Bestimmung von Lipase-/Esterase-Aktivität........
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I
INHALTSVERZEICHNIS
2.22.3 Monolayer-Assay zur Bestimmung von Lipase-/Esterase-Aktivität.................
2.22.4 Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität......................................................
2.23 Bestimmung von Enantioselektivitäten...................................................................
2.24 Bestimmung der pH- und Thermostabilität von LipA und LipB............................
2.25 Nachweis der Fettsäurezusammensetzung bakterieller Membranen.......................
2.26 Computerprogramme und Online-Datenbanken.....................................................
3
ERGEBNISSE...........................................................................
Klonierung, Überexpression, Reinigung und immunologischer Nachweis der in
vivo Lokalisation von LipB aus Bacillus subtilis....................................................
3.1.1 Spezifische Amplifikation der lipB-Gensequenz aus B. subtilis mittels PCR..
3.1.2 Überexpression des lipB-Gens im homologen Wirt B. subtilis und chromatographische Reinigung des korrespondierenden Proteins...................................
3.1.3 Charakterisierung eines LipB-spezifischen polyklonalen Antiserums.............
3.1.4 Nachweis der ausschließlich extrazellulären Lokalisation des LipB-Proteins
in B. subtilis.......................................................................................................
3.2
Biochemische Charakterisierung der lipolytischen Enzyme LipA und LipB aus
Bacillus subtilis.......................................................................................................
3.2.1 Identifizierung der katalytisch aktiven Aminosäurereste von LipB durch Sequenzvergleiche mit Lipasen der Homologiefamilie I.4...................................
3.2.2 LipB-Varianten S78C, D134N und H157N sind katalytisch inaktiv................
3.2.3 Ca2+-Ionen haben keinen Einfluß auf die Enzymaktivität von LipA und LipB
3.2.4 LipA und LipB zeigen maximale Stabilität im alkalischen pH-Bereich...........
3.2.5 LipA und LipB sind bis 45°C thermostabil.......................................................
3.2.6 Aktivitätssteigerung von LipA und LipB durch Detergentien..........................
3.2.7 LipA und LipB haben unterschiedliche katalytische Spezifitäten....................
3.3
Die Bedeutung des Konsensusmotivs Ala-X-Ser-X-Gly der extrazellulären
Bacillus-Lipasen und Esterasen...............................................................................
3.3.1 Konstruktion des Lipase-Konsensusmotivs Gly-X-Ser-X-Gly in der LipBVariante A76G..................................................................................................
3.3.2 LipB-Variante A76G besitzt eine veränderte spezifische Enzymaktivität........
3.3.3 LipB-Variante A76G zeigt gesteigerte Stabilität bei pH 5................................
3.4
Regulation und physiologische Funktion der Gene lipA und lipB..........................
3.4.1 Konstruktion und Nachweis von lip-Deletionsmutanten in B. subtilis.............
3.4.2 Die Gene lipA und lipB von B. subtilis sind nicht essentiell.............................
3.4.3 LipA und LipB werden mediumabhängig gebildet...........................................
3.4.4 Unter Kulturbedingungen mit sinkendem pH-Wert wird enzymatisch inaktives LipA-Protein gebildet.................................................................................
3.4.5 In der spätlogarithmischen Wuchsphase ist die lipA- und lipB-Genexpression
maximal.............................................................................................................
3.4.6 Aminosäuren reprimieren die lipA-Transkription.............................................
3.4.7 Hydrophobe Substanzen steigern die lipB-Transkription im Biofilm...............
3.4.8 Identifizierung der Transkriptionsstartpunkte des lipA- und lipB-Gens...........
3.5
Gerichtete Evolution der Enantioselektivität von LipA und LipB..........................
3.5.1 Expressionssysteme für LipA und LipB zur Herstellung von Enzymbibliotheken im heterologen Wirt E. coli...................................................................
3.5.2 Heterologes LipA-Expressionssystem eignet sich für ein Hochdurchsatz-eeScreening mittels ESI-MS.................................................................................
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II
INHALTSVERZEICHNIS
3.5.3
3.5.4
3.5.5
3.5.6
3.5.7
Evolution der Enantioselektivität von LipA durch Zufallsmutagenese mittels
fehlerhafter PCR................................................................................................
Weitere Optimierung von LipA-Varianten durch Sättigungsmutagenese........
Rekombination der enantioselektiveren Mutanten in vitro mittels DNAShuffling............................................................................................................
Reversion der Enantioselektivität von LipA durch Kassettenmutagenese........
Aktivitäts- und Stabilitätsverluste bei LipA-Varianten mit gesteigerter Enantioselektivität.....................................................................................................
4
DISKUSSION............................................................................
4.1
Charakterisierung des LipB-Proteins von B. subtilis als extrazelluläres Enzym
mit lipolytischer Aktivität.......................................................................................
Vergleichende biochemische Charakterisierung von LipA und LipB....................
Alaninrest im LipB-Pentapeptid ist für Alkalistabilität des Enzyms essentiell......
Charakterisierung der lip-Deletionsmutanten.........................................................
LipA- und LipB-Enzymaktivität wird auf transkriptionaler und posttranslationaler Ebene reguliert.................................................................................
Regulation des lipolytischen Systems von B. subtilis – ein Ausblick.....................
Entwicklung einer enantioselektiven Lipase mit Hilfe der gerichteten Evolution..
Verbesserungen der Enantioselektivität hauptsächlich durch oberflächenlokalisierte Aminosäuresubstitutionen.............................................................................
Besonderheiten bei der gerichteten Evolution von LipA aus B. subtilis – Auswirkungen auf zukünftige Projekte.........................................................................
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4.7
4.8
4.9
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ZUSAMMENFASSUNG..............................................................
SUMMARY...............................................................................
LITERATUR.............................................................................
ANHANG..................................................................................
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III