Eine Feedback-Schleife durch Makrophagen schützt das Gewebe in der bakteriellen Infektion vor ungezielter Zerstörung durch neutrophile Granulozyten
Weisheit C1, Schiwon M2, Dixit A2, Hoeft A1, Baumgarten G1, Kurts C2, Engel D2
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Klinik für Anästhesiologie und Operative Intensivmedizin, Universitätsklinikum Bonn, 2Institut für Experimentelle Immunologie, Universitätsklinikum Bonn
Fragestellung: In der Bekämpfung bakterieller Infektionen spielen Makrophagen und
Neutrophile eine Schlüsselrolle1. Makrophagen sind dabei wichtige Phagozyten und
stellen eine Quelle für die Freisetzung der chemotaktischen Neutrophilenlockstoffe
dar. Neutrophile wiederum, können die Bakterien sowohl phagozytieren als auch
durch die Freisetzung toxischer Substanzen töten2. Ein Nebeneffekt dieser Degranulationsprozesse ist die massive Zerstörung des umgebenden Gewebes3. Unsere
Ausgangshypothese war, dass Makrophagen und Neutrophile in der Infektion kooperieren und kommunizieren und führte zu der Frage: Wie werden die Gewebemigration und die Effektorfunktion der Neutrophilen in der bakteriellen Infektion reguliert?
Methoden: Es wurde ein murines Harnwegsinfektionsmodell mit uropathogenen E.
coli Bakterien (Stamm 536) angewendet. Zur Zellanalyse erfolgten durchflusszytometrische und histologische Untersuchungen von Harnblasengewebe aus weibl.
C57Bl/6 (Wt-), Tnf–/–-, Tnfr–/–- und Cxcr2-/–-Mäusen. Außerdem wurde die Funktion
verschiedener Zytokine durch adoptiven Transfer von Neutrophilen, die lokale Gabe
von TNF und CXCL2, sowie die Generierung knochenmarkschimärer Mäuse charakterisiert und eine Analyse der Zellproliferation mittels BrdU Assay durchgeführt. Die
statistische Auswertung erfolgte mit dem Mann-Whitney oder Kruskal-Wallis Test mit
Dunn’s post-hoc Testung, die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und ein p<0.05 galt als statistisch signifikanter Unterschied (Software: Graphpad Prism). Die Tierversuche waren durch das LANUV NRW genehmigt.
Ergebnisse: Im Blasengewebe gesunder Mäuse fanden sich hauptsächlich residente
Ly6C--Makrophagen. Bereits zwei Stunden nach bakterieller Infektion stieg die Anzahl an Neutrophilen und Ly6C+-Makrophagen signifikant an und erreichte 24 Stunden nach Infektion ihr Maximum. Die massive Zunahme dieser Phagozyten war nicht
durch lokale Proliferation im Gewebe erklärbar, da mittels BrdU-Assay nur sehr vereinzelt proliferierende Leukozyten nachweisbar waren. Beide Zellgruppen wurden
somit aus der Zirkulation rekrutiert. Die Untersuchung des Chemokin- und Zytokinprofils zeigte einen signifikanten Anstieg in der Gewebekonzentration von CXCL1
und MIF als neutrophilenspezifische chemotaktische Lockstoffe und einen für die
Rekrutierung der Makrophagen verantwortlichen Anstieg der CCL2-Konzentration.
Die chemotaktisch rekrutierten Phagozyten verteilten sich nach der Extravasation in
der Lamina propria und dem Epithel. Die Neutrophilen waren in Gruppen im Uroepithel zu finden. Dort phagozytierten sie einen großen Teil der Bakterien. Eine fehlende Infiltration der Neutrophilen, führte zu einer signifikant erhöhten Bakterienkonzentration in der Harnblase (Wt: 1,1x1070,3x107 vs. Cxcr2-/-: 2,2x1070,6x107
UPEC/Blase). Eine zellspezifische Untersuchung der Chemokin- und Zytokinexpression mittels FACS-Analyse ließ eine hohe TNF-Produktion in Ly6C+ Makrophagen
nach Infektion erkennen. Die Unterbrechung des TNF-Signalwegs führte ebenfalls zu
einer signifikanten Zunahme der Bakterienkonzentration (Tnfr-/-: 2,7x107 0,6x107 UPEC/Blase).
Histologische
+CXCL2
– CXCL2
***
Neutrophile / mm 2
Tnf - / + CXCL2
Tnf - / - CXCL2
DAPI + Ly6G
Untersuchungen zeigten, dass
1500
24h
1000
Neutrophilen in Tnfr–/–-Mäusen
500
nicht in das Uroepithel ein-
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Abbildung 1: Durch die Gabe von CXCL2 wird die epitheliale Migration von
Neutrophilen in TNF-defizienten Mäusen wiederhergestellt; Diagramm: n=3
Tnf -/- -CXCL2, n=5 Tnf -/- +CXCL2; bei drei unabhängigen
Versuchswiederholungen; ***p<0.001.
Basallamina verblieben. Ein
direkter Effekt von TNF auf die
epitheliale Migration und die
Effektorfunktion der Neutrophi-
len konnte nicht nachgewiesen werden. Allerdings führte ein Fehlen des TNFSignalwegs zu einer signifikant reduzierten Konzentration von CXCL2, das durch die
Ly6C- Helfermakrophagen ausgeschüttet wurde. Ohne CXCL2 konnten die
Neutrophilen ebenfalls nicht in das Uroepithel einwandern. Durch die lokale Gabe
von CXCL2 wurde die epitheliale Migration jedoch wiederhergestellt (Abb.1). Es zeigte sich, dass Neutrophile ohne CXCL2 nicht in der Lage waren, ausreichend aktiviertes MMP9 zur Denaturierung der Basalmembran freizusetzen, um in das Uroepithel
einzuwandern. Interpretation: Die Migration und konsekutive antimikrobielle Funktion
von Neutrophilen in der akuten bakteriellen Infektion wird durch die Kooperation zwischen Wächter- und Helfermakrophagen reguliert.
Literatur: 1Soehnlein O und Lindbom L. Phagocyte partnership during the onset and resolution of inflammation. Nat. Rev. Immunol. 2010; 10: 427–439.
2
Amulic B, Cazalet C, Hayes GL, Metzler KD, and Zychlinsky A. Neutrophil function: from mechanisms
to disease. Annu. Rev. Immunol. 2012; 30: 459–489.
3
Segel GB, Halterman MW and Lichtman MA. The paradox of the neutrophil's role in tissue injury,
Journal of Leukocyte Biology 2011; 89 no. 3: 359-372.
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