Charakterisierung der DNA-Methylierung geprägter Gene im
Kontext physiologischer und gestörter Entwicklung und
somatischer Differenzierung
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
vorgelegt von
Julia Kolarova
Kiel, 2015
Erster Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Manuela Dittmar
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. med. Reiner Siebert
Tag der müdlichen Prüfung: 21.07.2015
Zum Druck genehmigt: 21.07.2015
Gez. der Dekan Prof. Dr. rer. nat. Wolfgang J. Duschl
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Expression von Genen in Abhängigkeit von der elterlichen Herkunft des Allels wird als Imprinting
(“Prägung“) bezeichnet. Diese Eltern-spezifische Expression wird u.a. durch die Allel-spezifische DNAMethylierung differenziell methylierter Regionen (DMRs) reguliert. Dabei liegt eine DMR in der Regel
auf einem der beiden elterlichen Allele methyliert und auf dem anderen Allel unmethyliert vor. Da
viele geprägte Gene in Wachstums- und Differenzierungsprozesse eingebunden sind, ist die korrekte
Regulation der Expression geprägter Gene wichtig für die physiologische Entwicklung. Eine gestörte
DNA-Methylierung von DMRs kann die aberrante Expression elterlich geprägter Gene bewirken.
Konstitutionelle Störungen der elterlichen Prägung sind sowohl mit klassischen Imprintingsyndromen
als auch mit Multi-Locus Methylierungsdefekten (MLMD) assoziiert. DNA-Methylierungsstörungen
geprägter Gene werden aber auch bei benignen und malignen somatischen Erkrankungen
beschrieben und können zu deren Krankheitsentstehung und Progression beitragen.
Ausgangspunkt für die vorliegende Arbeit waren, bis auf die IG-DMR auf Chromosom 14q32.2,
sämtliche 34 somatisch und 20 Plazenta-spezifisch geprägten DMRs des Menschen. Da diese DMRs
z.T. erst jüngst beschrieben wurden, sind zu vielen keine systematischen DNA-Methylierungsdaten
zur physiologischen Entwicklung oder zu pathologischen Prozessen publiziert. Deshalb war das Ziel
dieser Arbeit, die physiologische DNA-Methylierung dieser geprägten DMRs in pränatalen und
postnatalen Normalgeweben auch unter Berücksichtigung des Einflusses der Gewebefixierung zu
charakterisieren. Weiterhin sollte die DNA-Methylierung dieser DMRs im Kontext benigner und
maligner somatischer Erkrankungen, konstitutioneller Störungen und in Patienten-spezifischen
induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSZ) analysiert werden.
Analysiert wurden DNA-Proben von 2 pränatalen Geweben und 4 normalen postnatalen Geweben,
von Leberproben von Patienten mit einer nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) vor und
nach Therapie sowie von Normal- und Tumorgewebeproben von Patienten mit Dickdarmkrebs (CRC).
Weiterhin wurden DNA-Proben von Patienten mit verschiedenen Arten einer Entwicklungsstörung
(zu klein und/oder zu leicht für Geburtsalter und Geschlecht geboren, Blasenekstrophie, mentale
Retardierung), von Patienten mit MLMD und Patienten-spezifische iPSZ analysiert.
Insgesamt wurden 517 Hybridisierungen auf Infinium HumanMethylation450 BeadChips prozessiert.
Weiterhin wurden Daten von 171 bereits vorhandenen Hybridisierungen auf Infinium
HumanMethylation27
bzw.
Infinium
HumanMethylation450
BeadChips
für
die
Analysen
herangezogen. Die Verifizierung ausgewählter Ergebnisse erfolgte mittels Bisulfit-Pyrosequenzierung
und Methylierungs-spezifischer multiplex-ligationsabhängiger Probenamplifikation. Zur Abklärung
einer aberranten DNA-Methylierung wurden Mikrosatelliten- und SNP-Array Analysen durchgeführt.
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Zusammenfassung
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen zeigten, dass die Standard-Formalin Fixierung
von Gewebeproben zu DNA-Methylierungsveränderungen im Vergleich zu kryokonservierten und
HOPE fixierten Gewebeproben führt. Die Analysen zur physiologischen DNA-Methylierung Plazentaspezifisch geprägter DMRs ergab nur in DNA-Proben aus Chorionzotten eine, wie bei geprägten
Genen zu erwartende, Hemi-Methylierung (41 % - 77 %). In anderen Geweben waren die drei
Genorte GPR1-AS, ZFAT und MIR512-1 cluster immer hoch (87 %, 89 %, 90 %), LIN28B immer
intermediär (30 %) und die restlichen Genorte immer niedrig methyliert (6 % - 15 %). Die
physiologische DNA-Methylierung der somatisch geprägten Genorte zeigte, bis auf den Genort
BLCAP/NNAT, in allen untersuchten Normalgeweben eine DNA-Methylierung zwischen 40 % und
67 %. Die DNA-Methylierung des Genorts BLCAP/NNAT betrug in DNA-Proben aus peripherem Blut
63 %, in den anderen Normalgeweben zwischen 78 % - 84 %. Auch in pathologisch veränderten
Geweben
zeigten
die
Plazenta-spezifisch
geprägten
Genorte
ein
einheitliches
DNA-
Methylierungsmuster wie in den Normalgeweben. Die Außnahme bildeten DNA-Proben von
Tumoren, welche für die Genorte FAM196A/DOCK1, RGMA, FAM20A und CABIN1 DNAMethylierungswerte zwischen 13 % und 31 % aufwiesen (umgebendes Normalgewebe 6 % - 14 %).
Der Genort LIN28B zeigte in Kolontumor- (59 %) und Normalgewebe (47 %) höhere DNAMethylierungswerte als in den anderen untersuchten Normalgeweben (30 %). Die Analysen zu
pathologischen Veränderungen der somatisch geprägten Genorte ergaben aberrante DNAMethylierungswerte in DNA-Proben von Patienten mit CRC, NAFLD und konstitutionellen
Erkrankungen. Sehr viel häufiger betroffen waren somatisch geprägte Genorte, die bis jetzt keinem
klassischen Imprintingsyndrom zugeordnet sind, als Genorte, die einem solchen Syndrom zugeordnet
sind. Bei Patienten mit verschiedenen Entwicklungsstörungen war die DNA-Methylierung des
Genorts ZNF331
am
häufigsten verändert
(16/200). Drei der mit einem klassischen
Imprintingsyndrom assoziierten Genorte (MEG3, MEG8: Temple Syndrom, PLAGL1: Transienter
Neonataler Diabetes Mellitus) waren bei insgesamt 3/200 Patienten aberrant methyliert. Die iPSZ
Analysen ergaben für viele der somatisch geprägten Genorte eine Hypomethylierung.
Insgesamt zeigten die DNA-Methylierunganalysen der Plazenta-spezifisch geprägten Genorte ein
stabiles DNA-Methylierungsmuster, welches nur in Tumorgewebeproben Änderungen zum
physiologischen Muster aufwies. Die somatisch geprägten Genorte hingegen wiesen sowohl eine
Gewebespezifität als auch Veränderungen der DNA-Methylierung in allen analysierten krankhaft
veränderten DNA-Proben auf. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind einerseits für die Planung
von vergleichenden DNA-Methylierungsstudien geprägter Gene an menschlichem Gewebe von
Bedeutung. Andererseits können sie als Basis für die Interpretation von physiologischen und
pathologischen DNA-Methylierungsbefunden an DMRs geprägter Gene zukünftiger Studien dienen.
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Summary
Summary
The term parental imprinting describes the expression of genes dependend of the parental origin of
the alleles. This parental-specific expression is regulated amongst others by allele-specific DNAmethylation of differentially methylated regions (DMRs). In general, the DMR on one of the two
parental alleles is methylated while the other is unmethylated. Due to the involvement of imprinted
genes in growth and differentiation processes the accurate regulation of imprinted gene expression
is important for the physiological development. A disturbed DNA-methylation at a DMR can cause
the aberrant expression of parent-specific imprinted genes. Constitutional disturbances of the
parental imprinting are associated with classical imprinting disorders as well as with multi locus
methylation defects (MLMD). Moreover, aberrant DNA-methylation of imprinted genes has also been
described in benign and malignant somatic diseases and may contribute to their development and
progression.
All 34 somatic, except for the somatic IG-DMR on chromosome 14q32.2, and 20 placental-specific
human imprinted genes were analysed in this study. Since these DMRs have been described just
recently DNA-methylation data concerning the physiological development or regarding pathological
processes have yet not been published. Therefore, the aim of this study was to characterize the
physiological DNA-methylation of these imprinted DMRs in prenatal and postnatal normal tissues.
Moreover, the influence of tissue fixation on DNA-methylation should be studied. Furthermore, the
DNA-methylation of these DMRs should be analysed in context of benign and malignant somatic
diseases, constitutional disorders and in patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSC).
The analyses were performed on DNA samples from two prenatal and four normal postnatal tissues,
on liver samples of patients with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) before and after therapy as
well as on normal and tumoral tissue of patients with colorectal cancer (CRC). Finally, DNA samples
of patients with different developmental disorders (small for gestational age, bladder extrophy,
mental retardation), of patients with MLMD and of patient-specific iPSC were analysed.
Overall 517 hybridizations were processed on Infinium HumanMethylation450 BeadChips.
Furthermore, 171 existing hybridization data from Infinium HumanMethylation27 BeadChips and
Infinium HumanMethylation450 BeadChips were used for the analyses. Verification of selected
results was performed by bisulfite pyrosequencing and methylation-specific multiplex ligationdependend probe amplification. The reasons for aberrant DNA-methylation were further
investigated by microsatellite and SNP-Array analyses.
Analyses of the influence of the tissue fixation revealed that formalin-fixed and paraffin-embedded
tissues showed different DNA-methylation levels at imprinted loci as compared to cryo-conserved
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Summary
and HOPE fixed tissues. Analyses of physiological DNA-methylation of placental-specific imprinted
genes revealed only in chorionic villi a hemi-methylation (41 % - 77 %), as expected for imprinted
genes. In contrast, the DNA-methylation values in the other analysed normal tissues were high for
GPR1-AS, ZFAT and MIR512-1 cluster (87 %, 89 %, 90 %), intermediate for LIN28B (30 %) and low for
the remaing gene loci (6 % - 15 %). The physiological DNA-methylation of somatic imprinted genes
showed DNA-methylation values between 40 % and 67 % in all analysed normal tissues. The
exception was the BLCAP/NNAT locus which showed in peripheral blood a DNA-methylation of 63 %
and in the other normal tissues between 78 % and 84 %. In almost all pathologically altered tissues
the DNA-methylation pattern of the placental-specific imprinted genes was consistent with the
pattern seen in normal tissue. However, the tumor samples showed DNA-methylation values for the
gene loci FAM196A/DOCK1, RGMA, FAM20A and CABIN1 between 13 % and 31 % (surrounding
normal colon tissue 6 % - 14 %). The gene locus LIN28B exhibited in colon tumor samples (59 %) and
in normal tissue samples (47 %) a higher DNA-methylation than in the other analysed normal tissues
(30 %). Analyses of the physiological DNA-methylation of somatic imprinted genes revealed aberrant
DNA-methylation in patients with CRC, NAFLD and constitutional disorders. These analyses
furthermore revealed that somatic imprinted genes, which have been so far not associated with one
of the classical imprinting disorders, are more commonly affected by aberrant methylation than
genes associated with such a syndrome. The ZNF331 locus was most frequently aberrantly
methylated in patients with different developmental disorders (16/200). Moreover three loci
associated with a classical imprinting disorder (MEG3, MEG8: Temple syndrome, PLAGL1: transient
neonatal diabetes mellitus) were aberrantly methylated in a total of 3/200 of these patients.
Analyses of DNA-methylation in iPSC revealed many hypomethylated somatic imprinted genes.
Altogether the DNA-methylation of placental-specific imprinted genes showed a stable DNAmethylation pattern, showing pathological DNA-methylation changes only in tumor samples.
However, the somatic imprinted genes showed tissue specificity as well as DNA-methylation changes
in all analysed diseased DNA-samples.
On the one hand the results obtained in the present study provide a basis for the planning of future
comperative DNA-methylation studies on human tissues. On the other hand they can also help in the
interpretation of physiological and pathological DNA-methylation findings on DMRs of imprinted
genes in future studies.
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