thesis LF - ETH E

DISS. ETH NO. 23036
Genetic and BRAF inhibition-induced
vulnerability to transcription inhibitors in
malignant melanoma
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
Dr. med. Lukas Alexander Frischknecht
Medizinisches Staatsexamen 2010, University of Zurich
born on 05.02.1986
citizen of
Schwellbrunn AR
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Wilhelm Krek
Prof. Dr. Josef Jiricny
Prof. Dr. med. Reinhard Dummer
2015
Abstract
In recent years the therapeutic landscape of advanced melanoma has
changed dramatically. Several new drugs, either activating the anti-melanoma
immune response or targeting the oncogenic activated ERK-signaling
cascade, have revolutionized the therapy and improved patient outcome
significantly. Thanks to these great successes, melanoma has become a
‘paradigm’ for modern cancer medicine. Nevertheless, as predictive markers
for the response to immunotherapy are missing and responses to targeted
therapies are of limited duration, there is a need to further increase the
therapeutic options in case of resistance to the established therapies.
Genome instability is a general feature of cancer cells and frequently causes
deletions of regions containing tumor suppressor genes. This loss of tumor
suppressors creates a selective growth and/or survival advantage for the cell
clones affected. However, usually it also causes a copy loss of several
flanking genes. This “wasteful” loss of genes involved in normal cellular
functions might cause cancer specific vulnerabilities.
With the help of the Achilles database (http://www.broadinstitute.org/achilles),
containing information from a loss-of-function screen in 216 cancer cell lines,
we identified a network of genes involved in transcription, whose depletion
caused differential dependencies across cancer cell lines.
The observed increased dependency on transcription of certain cancer cell
lines could be predicted by the copy number of twelve genes with a central
role in gene expression, in combination with the transcriptional burden of the
cell.
We detected several genes encoding RNA polymerase subunits to be
frequently deleted in melanoma as they are flanking the most important
melanoma tumor suppressors. These deletions, if around the twelve
predictive genes, caused a reduced availability of RNA polymerase
holoenymes and an increased sensitivity to drugs inhibiting the transcription
machinery.
The assembly of RNA polymerase holoenzymes plays a central role in
determining the transcription capacity of a cell. Several chaperone proteins
are critically involved in this process. In this study we present evidence for a
critical involvement of oncogenic activated ERK-signaling in the process of
chaperone-mediated assembly of RNA polymerase II. Treatment with a small
III
molecule inhibitor of BRAFV600, the most frequently activated oncogene in
melanoma, caused a strong reduction in the availability of assembled RNA
polymerase II holoenzymes and thereby increased the sensitivity to
transcription inhibition.
In summary, our results propose RNA polymerases as interesting novel
therapeutic targets for cancers that have developed a dependency on
transcription. This transcription dependency can either be an intrinsic feature
of cancer cells caused by genetic deletions or it can be induced exogenously
by inhibiting key oncogenic signaling pathways.
IV
Zusammenfassung
In den letzten Jahren hat sich das therapeutische Spektrum für
fortgeschrittene Melanome radikal verändert. Mehrere neue Medikamente, die
entweder die anti-Tumor Immunantwort stimulieren oder den durch Onkogene
aktivierten ERK-Signalweg inhibieren, haben die Therapie revolutioniert und
das Patientenüberleben signifikant verbessert. Trotz all diesen Erfolgen gibt
es bisher keine Möglichkeit, das Ansprechen auf eine Immuntherapie
vorherzusagen und gegen die zielgerichtete Therapie entwickeln sich in der
Regel nach kurzer Dauer Resistenzen. Dies macht es nötig, die vorhandenen
Therapieoptionen zu erweitern, um im Falle von Resistenzen Alternativen zur
etablierten Therapie zur Verfügung zu haben.
Genomische Instabilität ist ein Merkmal fast aller Krebszellen und führt häufig
zur
Deletion
von
Tumorsuppressorgenen.
Dieser
Verlust
von
Tumorsuppressoren verleiht den betroffenen Zellklonen einen Wachstumsund/oder Überlebensvorteil, kann jedoch auch zum Verlust von benachbarten
Genen führen. Dieser „verschwenderische“ Verlust von Genen, die in normale
zelluläre Prozesse involviert sind, kann zu einer Schwachstelle für den
jeweiligen Tumor werden.
Mit Hilfe der Achilles Datenbank (http://www.broadinstitute.org/achilles), die
Information von einem RNA-Interferenz Screen in 216 Krebszelllinien enthält,
haben wir ein Gen-Netzwerk identifiziert, von dem die untersuchten Zelllinien
in unterschiedlichem Ausmass abhingen.
Diese erhöte Transkriptions-Abhängigkteit gewisser Krebszelllinien, konnte
vorhergesagt werden mit Hilfe der Information über die Anzahl der Kopien von
zwölf Genen, die eine zentrale Funktion in der Gen Expression innehaben,
sowie der Transkriptions-Arbeit die eine Zelle erledigen muss.
Es zeigte sich, dass RNA-Polymerase Untereinheiten codierende Gene im
Melanom häufig einen Verlust einer Kopie aufwiesen. Diese Deletierung
konnte in der Regel durch den Verlust eines benachbarten
Tumorsuppressorgenes begründet werden. Wenn dieser Verlust eine Kopie
eines der zwölf Gene betraf, die eine Transkriptions-Abhängigkeit
verursachen, erhöhte dies die Sensitivität gegenüber einem RNA-Polymerase
Inhibitor.
Um in einer Zelle genügend RNA-Polymerase Moleküle zur Verfügung zu
haben spielt deren Zusammenbau eine wichtige Rolle. Verschiedene
V
sogenannte Chaperon-Proteine sind in den Prozess des Zusammenbaus von
RNA-Polymerasen aus den jeweiligen Untereinheiten involviert. In unserer
Studie konnten wir aufzeigen, dass der Zusammenbau von RNA-Polymerase
II Komplexen vom ERK-Signalweg beeinflusst werden kann. Der ERKSignalweg ist in 90% aller Melanome konstitutiv aktiviert. Am häufigsten
geschieht dies durch eine aktivierende BRAFV600-Mutation. Wurden nun
BRAFV600-mutierte Melanomzellen mit einem BRAFV600-spezifischen Inhibitor
behandelt, konnten sie nur noch wenig RNA-Polymerase II Komplexe
zusammenbauen. Dies machte die Zellen empfindlich auf die Behandlung mit
einem RNA-Polymerase II Inhibitor.
Zusammengefasst zeigen unsere Resultate, dass RNA-Polymerasen ein
interessanter neuer Therapieansatzpunkt für Tumoren sein können, die eine
starke Transkriptions-Abhängigkeit aufweisen. Diese Abhängigkeit von RNAPolymerasen kann dabei entweder intrinsisch durch genetische
Veränderungen der Tumorzellen bedingt sein oder exogen durch Hemmer
von onkogenen Signalwegen induziert werden.
VI