Entwicklung einer innovativen DNA-Chip

Entwicklung einer innovativen DNA-Chip-Technologie zur
industriellen Herstellung rekombinanter Proteine mit dem Ziel
hoher Raum/Zeit-Ausbeuten sowie optimalen Ressourceneinsatzes
(AZ 13040/16)
Projektbeginn:
01.05.2000
Laufzeit:
3,5 Jahre
Ort:
Hamburg
Jahr:
2004
Inhaltsverzeichnis
1. Kurzfassung des Projektes
1.1 Zusammenfassung
1.2 Verwendete Methoden
2. Ziele und Ergebnisse
1.3 Teilprojekt: Herstellung und Einsatz von DNA-Chips für die Genomweite Expressionsanalyse im Modellorganismus Escherichia coli
1.4 Teilprojekt: Etablierung eines Oliognukleotid-Chips zur
Kontaminationskontrolle in der Lebensmittelindustrie
1.5 Teilprojekt: Entwicklung eines voll-parallelisierten DNAReplikationssystems in Mikrosystemtechnik
1.6 Wirtschaftliche Umsetzung der mikrosystemtechnischen
Projektergebnisse
3. Diskussion
4. Literatur/Präsentationen/Patente
5. Anlagen
2
1. Kurzfassung des Projektes
Projektleiter:
Prof. Dr. J. Müller, TU Hamburg-Harburg
Projektpartner: Prof. Dr. H. Sahm, Dr. V. Wendisch, Dr. T. Polen,
Institut für
Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich.
Prof. Dr. G. Antranikian, Dr. K. Sahm, Dipl.-Biol. D. Weber, Arbeitsbereich
Technische Mikrobiologie, Technische Universität Hamburg- Harburg.
Prof. Dr. J.Müller, Dipl.-Phys. T. Injinaash, Dipl.-Ing. K. Dembowski,
Arbeitsbereich Mikrosystemtechnik, Technische Universität HamburgHarburg.
Dipl.-Phys. U. Lehmann, SLS MicroTechnology GmbH, Hamburg.
1.1 Zusammenfassung
Im Jülicher Teilprojekt gelang die Etablierung und Optimierung von DNA-Fragment-Chips
für die genomweite Expressionsanalyse. Zunächst wurde die Analysetechnik für den
Modellorganismus Escherichia coli validiert und lieferte sowohl innerhalb dieses
Teilprojektes als auch projektübergreifend zu neuen Ansätzen für die Optimierung der
Stoffwechselleistung dieses Bakteriums im Hinblick auf seine biotechnologische Anwendung.
Ziel des Teilprojekts der Technischen Mikrobiologie war die Entwicklung eines
Oligonukleotid-Chip, zur mikrobiellen Kontaminationskontrolle in der Lebensmittelindustrie.
Der entwickelte Oligonukleotid-Chip-Prototyp ist in der Lage die zwölf relevanten
bierkontaminierenden
Mikroorganismen
der
Gattungen
Lactobacillus,
Pediococcus,
Pectinatus und Megasphaera zu detektieren und zu identifizieren. Parallel wird zwischen
aktiven, d.h. teilungsfähigen und toten, d.h. nicht-teilungsfähigen Mikroorganismen
differenziert. Nach der Entwicklung vom Prototyp zum Gebrauchsfertigen Endprodukt soll
der Oligonukleotid-Chip die momentan obligatorischen und zeitaufwendigen Methoden der
Kultivierung und der anschließenden Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ersetzen.
Ziel des Teilprojektes der Mikrosystemtechnik ist ein schnelles und Rohstoffeinsatz
verminderndes Drucksystem für DNA-Chips zu entwickeln. Dafür sollen mit Hilfe der in der
Mikrosystemtechnik etablierten Methoden ein multifunktioneller Druckkopf und ein
dazugehöriger Basis-Chip mit modifizierter Oberfläche hergestellt werden.
Es wurden die plasmapolymerisierten Schichten für hydrophobe Oberflächen aus
Tetrafluorethylen getestet und für den Einsatz auf Basis-Chip (Glas) optimiert. Die
Strukturierung der Schicht für übersprechfreie Medienübertragung ist gelungen. Durch ein
3
neues, gemeinsam mit Fa. SLS konzipiertes und im AB Mikrosystemtechnik realisiertes
thermopneumatisches Antriebsprinzip wurde eine signifikante Miniaturisierung und die
komplette Integration der einzelnen elektrischen und Fluidik- Komponenten des DruckkopfChips als ein einheitliches System erreicht. Das Druckkopf-Konzept eines Zwei-FluidiknetzSystems erwies sich als nichtinvarsiv gegenüber des DNA enthaltendes Mediums.
1.2 Verwendete Methoden
Im Zentrum des Teilprojektes von Jülich stand die Etablierung der DNA-Chip-Technik für die
genomweite Analyse der Expression des Modellorganismus Escherichia coli. Diese moderne
Technik beinhaltet die Verwendung einiger weiterer molekularbiologischer Methoden, z.B.
zur Reinigung von mRNA und zur Fluoreszenzmarkierung der mRNA duch reverse
Transkription, sowie bioinformatischer Methoden, z.B. der Speicherung und Auswertung von
Expressionsdaten in Datenbanksystemen, hierarchische Clusteranalysen und statistische
Verfahren zur Signifikanzanalyse.
Im Teilprojekt der Technischen Mikrobiologie standen neben der Herstellung der
Oligonukleotid-Chips
(Beschichtung
der
Glasträger
und
Nachbehandlung),
die
Hybridisierung und Waschung der Oligonukleotid-Chips und die Kultivierung der
Mikroorganismen
unter
aeroben
und
anaeroben
Bedingungen,
vor
allem
molekularbiologische Methoden wie DNA-Isolation, DNA-Amplifikation mittels PCR, RNAIsolation, RNA-Amplifikation mittels Reverser Transkriptase (RT) und anschließender PCR,
Fluroreszenzmarkierung der Nukleinsäuren, im Mittelpunkt.
Der Schwerpunkt des Teilprojektes von Mikrosystemtechnik und Fa. SLS war die
Entwicklung eines DNA-Chip Drucksystems, das einen Druckkopf und ein Basis-Chip mit
aktivierter Oberfläche beinhaltet. Um eine feldförmige Anordnung der hydrophoben und
hydrophilen Bereichen auf dem Basis-Chip zu erreichen, wurde
ein
PECVD
(PlasmaEnhancedChemicalVapourDeposition) Verfahren, Plasmaunterstützte Abscheidung
aus Dampfphase-Verfahren, zur Abscheidung der teflonartigen Schicht und
ein
Photolithographieverfahren zur Strukturierung der Schicht verwendet. Die hydrophobe
Teflonschicht wurde in Lift-Off-Technik zu dem gewünschten Array geformt. Als
Schutzmaske für dieses Verfahren dient ein Photoresist. Die kleinste Strukturgröße ist
hauptsächlich durch den Photoresisttyp und Aspektverhältnis zwischen der Schichtdicke des
Photoresists und des zu strukturierenden Filmes beschränkt. In geg. Fall liegt die
Strukturgenauigkeit
Mikrometern
mit
den
typisch
für
den
Photolithographieverfahren
wenigen
weit höher als die benötigte Arrayrasterdichte von über 30µm. Die
Herstellungsschritte für den Injektionschip beinhalten eine große Anzahl an den in
4
Mikrosystemtechnik
verwendeten
Beschichtungs-,
Strukturierungs-
sowie
Verbindungsprozessen. Die Strukturen im Siliziumsubstrat wurden durch plasmaunterstützte
Ätztechniken RIE (Reactive Ion Etching) und nasschemisches Ätzverfahren in 40% Kalilauge
erreicht. Als Maskenmaterial dienen für RIE-Prozesse unterschiedliche Photoresiste und in
Kathodenzerstäubngs-Verfahren
abgeschiedene Metallschichten, für die nasschemische
Strukturierung in KOH in LPCVD (Low Pressure Chemical Vapour Deposition)-Verfahren
abgeschiedene Siliziumnitrid Schicht. Mit Kathodenzerstäbungsprozess wurden ebenfalls die
Chrom- und Platinschichten für Heizdrähte auf Pyrexsubstrat abgeschieden. Die auf der
Kapillarwirkung beruhende Düsenstruktur im Siliziumsubstrat wurde durch eine im
Arbeitsbereich Mikrosystemtechnik der TU optimierte Plasmaätztechnik mit SF6 , CHF3 und
O2 Gasen realisiert . Die Strukturen in Pyrex wurden hauptsächlich durch nasschemisches
Ätzverfahren in Flusssäure erzielt. Das feldunterstützte Bondverfahren wurde verwendet, um
eine gasdichte Verbindung zwischen den Silizium und Pyrexsubstraten zu erreichen.
Weiterhin wurde ein Kathodenzerstäubungsprozess zur Abscheidung dünner Pyrex-Schichten
entwickelt, die als Zwischenschicht beim Bondverfahren von Siliziumschichten miteinander
verwendet werden konnten. Damit ist eine weitere Miniaturisierung des Druckkopf-Chips
erzielt worden.
2. Ergebnisse
2.1 Herstellung und Einsatz von DNA-Chips für die Genom-weite
Expressionsanalyse im Modellorganismus Escherichia coli
Ziel des Jülicher Teilprojektes ist die Genom-weite Analyse der Expression des
Modellorganismus Escherichia coli mit DNA-Chips zur Identifikation von Genen, die bei
Überflußmetabolismus im Vergleich zur Kohlenstoff-Limitierung in ihrer Expression
verändert sind. Es konnten E. coli-DNA-Chips und Protokolle zur RNA-Isolierung und Markierung sowie zur DNA-Chip-Hybridisierung und -Auswertung erstellt und für globale
Genexpressionsanalysen validiert werden (Polen et al., 2003). In Anwesenheit des
Überflußmetaboliten Acetat zeigten erstens die Chemotaxis- und Flagellengene erhöhte
Expression (siehe Abbildung 1 und 2).
5
Abbildung 1.:
Cluster-Analyse der Gene mit veränderter Expression von E. coli nach Wachstum auf
LB-Medium mit 20 mM neutralisiertem Natriumacetat bzw. mit 20 mM neutralisiertem
Natriumpropionat.
6
Abbildung 2.:
Mobilität
von
E.
coli
MG1655
auf
LB-Weichagarplatten.
Mittlere
Schwimmkoloniedurchmesser aus je dreimal 10 Bestimmungen nach 18 Stunden
Inkubation bei 37°C auf LB bzw. LB mit 20 mM neutralisiertem Natriumacetat bzw.
mit 20 mM neutralisiertem Natriumpropionat.
Zweitens war die Expression von Genen, die für die Kohlenstoffquellen-Verwertung wichtig
sind, verringert (siehe Abbildung 1). Schließlich wiesen auch einige Gene der generellen
Streßantwort
eine
erhöhte
Expression
auf
(siehe
Abbildung
1).
Die
Genexpressionsveränderungen, die schon in Anwesenheit von Acetat auftreten, können also
nicht für die Auslösung des Überflußmetabolismus verantwortlich sein. In einer Reihe von
Chemostat-Kultivierungen zeigte sich, dass schon ein geringer Glucose-Überschuß unter
Stickstoff-limitierten Bedingungen zur Acetatbildung im Überflußmetabolismus führt. Bei
Überfluß-Metabolismus war die Expression von Genen des Tricarbonsäurecyclus, des
Glyoxylatcyclus und der NADH-Dehydrogenase I der Atmnugskette verringert. Die daraus
resultierende verringerte Kapazität des TCA-Cyclus könnte die Acetatbildung im
Überflußmetabolismus erklären.
Die projektübergreifende Kooperation innerhalb des Verbundes mit Prof. Dr. Bott und Dipl.
Biol. Tanja Gerharz (AZ 13040-05, Brenztraubensäure-Produktion) zur Charakterisierung
Pyruvat-abhängiger Genexpressionsveränderungen konnte erfolgreich abgeschlossen werden.
7
2.2 Etablierung eines Oliognukleotid-Chips zur Kontaminationskontrolle in
der Lebensmittelindustrie
In Kooperation mit der Brauerei Beck & Co in Bremen wurde der Bedarf eines
Oligonukleotid-Chip zur Kontaminationskontrolle festgestellt und die wesentlichen Kriterien
für eine solchen Methode festgelegt. Es wurde ein Oligonukleotid-Chip-Prototyp entwickelt,
der die Detektion und Identifikation der zwölf relevanten bierkontaminierenden Bakterien der
Gattungen Lactobacillus, Pediococcus, Pectinatus und Megasphaera ermöglicht. Dabei
wurden die erzielten Ergebnisse des vorhandenen Basissystems der Technischen
Mikrobiologie für den Modellorganismus E.coli auf den Oligonukleotid-Chip übertragen. Das
Basissystem ist gekennzeichnet durch drei wesentliche Kriterien: hohe Signalintensität,
geringes
Hintergrundsignal
und
hohe
Stringenz
(Diskriminierung
von
einer
Basenfehlpaarung). Die Entwicklung wurde durch die Optimierung der verschiedenen
Protokolle für die Beschichtung der Glasträger, der Markierung der RNA mit
Fluoreszenzfarbstoffen,
der
Oligonukleotid-Chip-Hybridisierung
und
der
stringenten
Waschung erreicht. Mittels eines kommerziell erhältlichen Kits zur Fluoreszenzmarkierung
der RNA konnte die Signalintensität gegenüber der Markierung durch cDNA-Synthese, um
ein vielfaches gesteigert werden. Die Markierungseffizienz wurde dabei von 20% (cDNAMarkierung) auf etwa 95% (RNA-Markierung) erhöht.
Amplifikation der Intergenic Spacer Regions (ISR)
Für
die
bierbrauende
Industrie
sind
ausschließlich
aktive,
d.h.
teilungsfähige
Mikroorganismen von Interesse, da diese zu einer Trübung des Biers und somit zu einem
Qualitätsverlust des Produkts führen. Da sämtliche kontaminierenden Stämme nicht pathogen
sind, stellt das Vorhandensein von toten, d.h. nicht-teilungsfähigen Organismen keinen
Qualtitätsverlust dar. Ziel der Technischen Mikrobiologie war es, mit dem OligonuleotidChip-Prototypen diese bierkontaminierenden Stämme zu detektieren und eindeutig zu
identifizieren, sowie zusätzlich eine parallele Differenzierung zwischen aktiven und nichtaktiven Mikroorganismen zu ermöglichen. Diese Differenzierung erfolgt auf der Basis der
16S rRNA und der ISR rRNA (Intergenic Spacer Regions). Bei den ISR handelt es sich um
Regionen, die zwischen der 16S und 23S, sowie zwischen der 23S und 5S rRNA Sequenz
lokalisiert sind und tRNA-Gene beinhalten können (siehe Abbildung 3).
8
16S
ISR
TCTA
23S
5S
tRNA
tRNA
Abbildung 3:
ISR
GGT
Schematischer Aufbau der Intergenic Spacer Regions (ISR). Bei den Sequenzen TCTA
und GGT handelt es sich um die 3´- und 5´- Enden der ISR.
Während des RNA-processing wird bakterielle rRNA durch Spaltung aus einem
gemeinsamen Vorläufer (prä-rRNA) freigesetzt. Die relevanten rrn-Gene der prä-rRNA
liegen in der Anordnung 16S-23S-5S vor. Das Operon wird in einer einzigen prä-rRNA
transkribiert, aus der die reifen rRNA-Moleküle (16S, 23S, 5S), ebenso wie die tRNAs, durch
Spaltung freigesetzt werden. Die übrigen Bereiche der ISR werden zu Nukleotiden abgebaut.
Dieser Abbau der ISR findet ebenso nach dem Absterben der Mikroorganismen statt. Die
Entleerung des ISR-Pools beginnt unmittelbar nach Eintritt des Zelltods und bereits nach vier
Stunden sind die ISR nicht mehr nachweisbar. Die 16S rRNA hingegen bleibt über einen
Zeitraum von über 24 Stunden stabil und detektierbar. Die ISR stellen demzufolge eine
effektive Möglichkeit zum Nachweis von aktiven Mikroorganismen dar, da sie einerseits
speziesspezifische Bereiche aufweisen und andererseits die Vitalität der Organismen weitaus
eindeutiger widerspiegeln, als es die 16S rRNA vermögen.
Die ISR (16S-23S) aller relevanten bierkontaminierenden Mikroorganismen sind mittels PCR
amplifiziert worden (siehe Abbildung 4). Dabei gelang es, einen Forwardprimer zu
entwickeln, der in der Lage ist in Kombination mit einem Reverseprimer, die ISR aller zwölf
relevanten Stämme zu amplifizieren. Dies war mit den in der Literatur beschriebenen Primern
nicht möglich, diese waren bestenfalls in der Lage, stammspezifische ISR-Bereiche zu
amplifizieren.
M
1
2
3
4
5
6
M
7
8
9
10
11
12
9
700bp
600bp
Abbildung 4:
Agarosegelbild der ISR-PCR. M: 50bp-Marker, Spur 1: L. brevis, Spur 2: L. casei, Spur
3: L. corynformis, Spur 4: L. lindneri, Spur 5: L. parabuchneri, Spur 6: L. paracasei, Spur
7: L. perolens, Spur 8: P. damnosus, Spur 9: P. inopinatus, Spur 10: M. cerevisiae, Spur
11: P. cerevisiiphilus, Spur 12 P. frisingensis.
Deutlich sind in allen Spuren mehrere unterschiedlich große ISR-Fragmente zu erkennen,
deren Größenunterschied in etwa jeweils 75bp beträgt. Die kleinsten Fragmente werden als
short spacer bezeichnet, alle größeren als long spacer. Die short spacer der aeroben Stämme
(Lactobacillus und Pediococcus) haben eine Größe von etwa 600bp, die der anaeroben
Stämme (Pectinatus und Megasphaera) eine Größe von etwa 700bp. Die Größenunterschiede
zwischen den einzelnen ISR eines Stamms beruhen auf dem Vorhandensein von tRNAs in
den long spacer-Regionen. Dies zeigt sich anhand der Größe (75bp entsprechen der
ungefähren Länge einer tRNA). Zudem konnten die tRNA-Sequenzen für Alanin und
Isoleucin in den long spacer-Sequenzen nachgewiesen werden (Daten sind nicht gezeigt).
Alignments der long spacer und der short spacer zeigen, dass sich die Sequenzen der
einzelnen ISR nicht voneinander unterscheiden. Der einzige Unterschied ist das
Vorhandensein von ein bzw. zwei tRNAs in den long spacern.
Alle short spacer wurden komplett sequenziert. Es konnten fünf noch nicht beschriebene ISR
(16S-23S) eindeutig indentifiziert werden. Dabei handelt es sich um die ISR-Sequenzen der
Stämme: L. corynformis, L. lindneri, L. parabuchneri, L. perolens, und M. cerevisiae.
Alignments der sequenzierten short spacer-Fragmente zeigen eindeutig, dass sie zum Design
spezifischer Sonden geeignet sind, da sie deutliche Sequenzunterschiede aufweisen (siehe
Abbildung 5).
10
Abbildung 5:
Alignment ISR-Sequenzen der zwölf relevanten bierkontaminierenden Bakterienstämme.
Mittels entsprechender Software wurden auf Grundlage der Alignments sequenzspezifische
Sonden, für die ISR der einzelnen Stämme entwickelt, dies geschah parallel zum Design von
spezifischen 16S-Sonden auf Grundlage der in Datenbank vorhandenen 16S-Sequenzen. ISRund 16S-Sonden wurden sowohl für RNA, als auch für DNA als Ziel entwickelt, um
Nachweise beider Nukleinsäuren zu ermöglichen.
Methode zur RNA-Isolierung und RNA-Amplifikation
Um eine hohe Sensitivität zu erreichen ist es notwendig, bei geringer Ausgangsmenge
(Geringe RNA-Konzentration aufgrund geringer Zellzahl) ausreichend Nukleinsäure für die
Markierung und anschließender Hybridisierung bereitzustellen. Aus diesem Grund standen
zwei Methoden im Mittelpunkt der Experimente: die RNA-Isolation und die RNAAmplifikation mittels Reverser Transkriptase (RT) in Kombination mit der PolymeraseKetten-Reaktion (PCR): RT+PCR.
Da der Abbau der ISR zügig abläuft, zeigte sich, dass handelsübliche Kits nicht in der Lage
waren, die ISR rRNA in ausreichendem Maß zu isolieren. Auch war die Ausbeute an 16S
rRNA nicht zufrieden stellend. Zu diesem Zweck wurde eine RNA-Isolierungsmethode
etabliert, die diesem besonderen Fall Rechnung trägt. Dabei handelt es sich um eine den
Bedingungen angepasste Phenol-/Chloroform-Aufreinigung. Mittels dieser Methode liegt
11
ausreichend RNA, die sowohl 16S als auch ISR beinhaltet vor, die für die anschließende
RT+PCR-Methode bestens geeignet ist, da sie frei von DNA-Kontaminationen ist, so dass
eine anschließende zusätzliche DNase-Behandlung wegfällt.
Die RT+PCR-Methode ist für diese Anwendung optimiert worden, da handelsübliche Kits
(One-Step-RT-PCR und Two-Step-RT-PCR) ebenso nicht den notwendigen Erfolg brachten,
d.h. es gelang eine schwache Amplifikation der 16S-rRNA, hingegen keine Amplifikation der
ISR rRNA. Durch Optimierung und anschließender Kombination beider Methoden ist es
gelungen, ausreichend Ausgangsmaterial für die Markierung und Hybridisierung zu erhalten
(siehe Abbildung 6).
M
1
Abbildung 6:
2
3
4
5
6
7
M
8
9
10
11
12
13
14
Agarosegelbild der kombinierten RT+PCR (M: 50bp-Marker, Spur 1-7: 16S-DNA, Spur
8-14: ISR-DNA). Spur 1: L. parabuchneri, Spur 2: L. paracasei, Spur 3: L. casei, Spur 4:
L. brevis, Spur 5: L.lindneri, Spur 6: L. perolens, Spur 7: L. coryniformis. Es sind jeweils
Doppelansätze gezeigt.
Die Amplifikation der ISR RNA ist generell schlechter als die der 16S RNA, da aber die
Sequenzen der amplifizierten ISR-Operons identisch sind, können alle amplifizierten ISRFragmente zur Markierung und anschließender Hybridisierung genutzt werden und müssen
nicht voneinander getrennt und aufgereinigt werden. Die deutlichen Unterschiede in den
Amplifikationsausbeuten der ISR zwischen den verschiedenen Stämmen sind auf den schnell
eintretenden und nicht gänzlich auszuschließenden Abbau der ISR rRNA zurückzuführen.
Die Nachweissensitivität des Oligonukleotid-Chips ist von den Möglichkeiten der RT+PCR
Methode abhängig. Experimente zeigen, dass die Primerpaare zwar in der Lage sind, bis zu
0,4pg Nukleinsäure an Ausgangsmaterial zu amplifizieren, da allerdings die RT-Reaktion
generell wenig effizient abläuft, ist von einem Ausgangsgehalt an Nukleinsäure von etwa 0,51,0 μg RNA als Nachweisgrenze auszugehen.
12
Oligonukleotid-Chips in der bierbrauenden Industrie
Abbildung
7
zeigt
den
prinzipiellen
Aufbau
eines
Oligonukleotid-Chips
zur
Kontaminationskontrolle in der bierbrauenden Industrie. Jede Sonde wird in mehrfacher
Wiederholung auf den Chip gespottet.
70 Replikate zum Nachweis
speziesspezifischer 16S rRNA
70 Replikate zum Nachweis
speziesspezifischer ISR rRNA
Oligonukleotid-Chip
mit 1400 Spots
Abbildung 7:
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
Prinzipieller Aufbau des eingesetzten Oligonukleotid-Chips mit 20 Sonden.
Einen Überblick über den Verlauf eines kompletten Oligonukleotid-Chip-Experiments im
Vergleich zu den momentan obligatorischen Methoden von der Probenentnahme bis zu dem
Erhalt der Ergebnisse zeigt Abbildung 8. Die Detektion mittels der zeitintensiven
Kultivierung dauert in Regel zwischen zwei und sieben Tage. Erst anschließend kann die
Spezifizierung durch die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) durchgeführt werden. Die
Kontaminationskontrolle mittels des Oligonukleotid-Chips ist zeitsparender, d.h. bis zur
Spezifizierung vergehen zum jetzigen Zeitpunkt in etwa zwei Tage. Durch die Entwicklung
vom Prototypen zum gebrauchsfertigen Endprodukt ist eine weitere Verkürzung der
13
Gesamtdauer (von der Probenentnahme bis zur Datenauswertung) auf bis zu einen Tag
möglich.
Datenauswertung
Kultivierung
Real-Time
PCR
Probenentnahme
rRNA
Isolation
RT+PCR
rDNA
Markierung
Hybridisierung
Stringente
Waschung
Scannen
Datenauswertung
Abbildung 8: Vergleich des bisherigen Verlaufs der Kontaminationskontrolle mittels Kultivierung und
PCR im Vergleich zur Kontaminationskontrolle mittels Oligonukleotid-Chip.
Insgesamt gesehen bietet die Oligonukleotid-Chip-Methode gegenüber den etablierten
Methoden einen Zeitvorteil, da eine Identifizierung der Kontaminanten mittels PCR erst nach
der tagelangen Kultivierung der Bakterien stattfinden kann.
2.3 Entwicklung eines voll-parallelisierten DNA-Replikationssystems in
Mikrosystemtechnik
Die Langzeitstabilität und dadurch auch die sicheren Haftungseigenschaften der hydrophoben
Schicht auf der Glasoberfläche wurden mit Hilfe eines Plasmapolymerisierungsprozesses für
hexamethylhaltige Zwischenschicht erreicht. Die Kontaktwinkelmessungen auf der ChipOberfläche mit destilliertem Wasser als Medium lieferten die Winkelwerte von 50° für Glas
und 108° für Teflonschicht. Die auf der Kapillarwirkung beruhende Druckdüsenstruktur
wurde durch plasmaunterstützte Ätztechnik realisiert und wurde bezüglich der konstanten und
nach geringerem Volumen orientierten Probenübergabemenge optimiert (siehe Abbildung 9).
14
Abbildung 9:
links: Die Ergebnisse der Messung von Kontaktwinkel auf der modifizierten BasisChipoberfläche.
In
der
Düsenbereichs.
Rechts:
Mitte:
REM-Aufnahme
Photo
eines
der
Heizelementes
Düsenstruktur
über
Aktuatormembran mit den seitlich eingeführten Fluidikkanälen
die
und
des
quadratische
bei Bildung einer
Dampfblase in Kammer.
Der Druckkopf kann in zwei Fluidnetzwerke unterteilt angesehen werden, die durch eine
Anordnung von Membranen in einer Siliziumschicht voneinander getrennt sind. Eines der
Netzwerksysteme besteht aus den Fluidikkanälen, getrennten Reservoiranschlüssen für
unterschiedliche Medien sowie den Austrittsdüsen und dient zur Beförderung der auf der
Basis-Chip anzubringenden DNA-Suspension. Der andere Fluidiknetz ist ein isoliertes
System von Fluidikkanälen, Heizelementen und elektrischen Anschlüssen, das mit einer
Aktuatorflüssigkeit gefüllt wird (siehe Abbildung 9, rechts). Ein thermopneumatischer Effekt
wurde zur Grunde gelegt um die Aktuatorflüssigkeit zur Expansion zu bringen und dadurch
eine Auslenkung der in Silizium strukturierten Membran zu bewirken (siehe Abbildung 10).
heating
element
heater
cavity
recess areas
pyrex cover
channel for
actuator liquid
pyrex layer
inlet for DNA
containing solution
silicon layers
orifice cavity
nozzle area with a
hydrophobic coating
Abbildung 10: Schema des Zwei-Fluidiknetz Druckkopfsystems
Ein Vorteil dieses Prinzips mit den Mikroheizelementen liegt in der Möglichkeit einer
homogenen Integration der Aktuatorelementen in das Fluidiknetz durch die etablierten
Strukturierungs-
und
Beschichtungsprozesse
in
der
Mikrosystemtechnik
wie
15
Photolithographie, plasmaunterstützte Ätzprozesse und die Kathodenzerstäubungsprozess der
Heizmaterialien in situ. Als ein weiterer Vorteil des thermopneumatischen Antriebs lässt sich
die wesentliche Miniaturisierung der Druckkopf-Dimensionen angeben, die dazu geführt hat,
dass die Anzahl der Düsen pro Fläche erhöht wurde.
Um die gewünschten Funktionen des entwickelten Chips als Injektionssystems zu
gewährleisten musste zunächst ein Steuermodus ausgearbeitet werden, das die Bedingungen
wie geringer Leistungsverbrauch und höher Wirkungsgrad erfüllt werden können. Das
optimale Antriebmodus der Heizelemente wurde so gewählt, dass die Steuerspannung eine
Vorheizspannung beinhaltet, die mit einem steilen Rechteckimpuls für Erzeugung eines
320
300
vapour bubble diameter [µm]
vapour bubble diameter [µm]
Tropfens am Austritt einer Düse überlagert werden soll.
heating area 20µm×300µm
280
260
240
220
200
180
25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
390
330
300
270
240
210
0
power input [mW]
Abbildung 11:
heating area 10µm×450µm
360
5
10 15 20 25 30 35 40 45
power input [mW]
Blasenduchmesser als
Heizelementenflächen
Funktion
der
Heizleistung
bei
unterschiedlichen
Die effektiven Werte für die Steuerspannung mussten zunächst bestimmt werden. Es wurden
als
erstes
die
statischen
Messungen
mit
der
konstanten
Stromversorgung
des
thermopneumatischen Antriebes durchgeführt, um die optimale Geometrie der Heizelemente
zu finden sowie den optimalen Arbeitspunkt für den dynamische Betrieb zu ermitteln. Es
wurde die Abhängigkeit der Dampfblasengrößen in der Aktuatorflüssigkeit von der
Steuerspannung für Heizelemente mit unterschiedlichen Widerständen und Flächen
untersucht (siehe Abbildung 11). Die Werte für den elektrischen Widerstand einer
Heizstrecke können bei Erstellung der Photolithographiemasken durch Variation des
Länge/Breite-Verhältnisses eingestellt werden. Die Messungen ergaben, dass eine
spiralgeformte Heizstrecke mit einer effektiven Fläche von 10µm*450µm und einem
elektrischen Widerstand zwischen 50-100Ohm bei vorgegebener Leistung den größten
Wirkungsgrad aufweiste. Aus der Messung sind außerdem die Werte für die OffsetVorheizspannung ermittelt worden. Der Wert der statischen Heizungsspannung wird dabei so
gewählt, dass die Flüssigkeit am Heizelement kurz vor dem Verdampfen ist. Anschließend
16
wurde das statische Verhalten der Aktuatormembran bei einer Variation der elektrischen
Leistung untersucht, um die kleinstmögliche Größe und die optimale Stärke der Membran
festzulegen. Dafür wurde in einem Leistungsbereich bis zu 70mW die Auslenkung des
Mittelpunkts einer Membran mittels eines autofocus UBM-Profilometers gemessen. Die
Messungen sind für die unterschiedlichen Membrandicken und die planaren Abmessungen
durchgeführt worden (siehe Abbildung 12).
Aus den Ergebnissen von den vorangegangenen statischen Messungen wurden die ermittelten
Werte für das elektrische und mechanische Verhalten des Systems für die Untersuchung der
dynamischen Eigenschaften des Antriebs verwendet. Die dynamische Charakterisierung
diente zur Ermittlung des Profils der Steuerspannung. Dazu gehören die Werte für die
Amplitude des Rechtecksignals, dessen Dauer und die Abtastrate, sowie Deformations- und
Relaxationszeiten von Membranen.
Die Versuchsanordnung ist die gleiche wie beim statischen Messung, bis auf die
Einstellungen des angelegten Messsignals und der höheren Abtastfrequenz von UBMProfilometers (bis 1kH). Bei dem Meßsignal wird eine Rechteckspannung mit der bereits
ermittelten Gleichspannung überlagert. Durch Variation von Frequenz und Amplitude der
Rechteckspannung kann die Abhängigkeit der Membranauslenkung von diesen Parametern
membrane center deflection [µm]
bestimmt werden (siehe Abbildung 12).
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
20µm
30µm
100µm
0
10
20
30
40
50
60
70
power input [mW]
Abbildung 12:
Links: UBM-Aufnahme einer Membran im deformierten Zustand. Rechts: Die
Membranauslenkung in Abhängigkeit von der Heizleistung aufgetragen für
unterschiedliche Membrandicken
Mit den empirisch gewonnen Werten für die Ansteuerspannung, Geometrie der Heizelemente
sowie der Membran, die mechanischen und die elektrischen Zeitkonstanten wurde die
Testreihe mit dem Ausdrücken der Tropfen durchgeführt. Hierfür wurde zusätzlich zum
Versuchsaufbau eine CCD-Kamera verwendet, um die Bildung des Tropfens am Ausgang
17
optisch überwachen zu können. Durch zeitaufgelöste Kameraaufnahmen konnten die
Volumina der ausgedrückten Lösung rechnerisch bestimmt werden. . Das reproduzierbare
Tropfenvolumen liegt zwischen 300pL und 50picoliter, gemessen in einem Frequenzbereich
von 100mHz bis 3Hz mit einer Amplitude des Rechtecksignals von 7V und der
Vorheizspannung von 2.5 V. Die Abmessungen der Aktuatormembran
betrugen dabei
500µm*500µm*50µm.
Es wurde untersucht inwieweit sich ein Standard-Tintenstrahldrucker für den Einsatz zum
Drucken auf einen Objektträger mithilfe des entwickelten Druckkopf-Chips eignet. Hierfür
wurde ein HP-DeskJet 500 mit einer Auflösung von 300dpi verwendet. Der Vorteil dieses
Modells liegt in der stabil ausgeführten Mechanik und das keine elektrischen Informationen
über den Tintenfüllstand u.ä. an die Druckerelektronik gegeben werden, so dass die Steuerung
prinzipiell auch ohne Patrone (oder eben mit dem eigenen Typ) genutzt werden kann. Für die
center deflection [µm]
Positionssteuerung des Druckkopf-Chips wurde ein Programm in der Programmiersprache.
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
heating area: 10µm×450µm
membrane thickness: 20µm
0
1
2
3
4
5
6
frequency[Hz]
Abbildung 13:
Die Membranauslenkung in Abhängigkeit von der Frequenz der Rechteckspannung. Die
Abtastrate beträgt 20 %
Quick BASIC geschrieben und eine Drucktestreihe auf einem Objektträger durchgeführt. Den
Ausdrücken war zu entnehmen, dass die Genauigkeit der Positionssteuerung für die
Verwendung mit dem eigenen Druckkopf ausreichend ist. Für die elektronische Ansteuerung
des Druckkopfdüsen wurden die Signale direkt von der Steuerungsplatine des Druckers über
angelötete Stiftleisten abgenommen. Die Zuordnung der Düsen zur Elektronik und die
Kontakte des Druckkopfes wurden in umfangreichen eigenen Untersuchungen ermittelt.
Prinzipiell ist auch die Verwendung der Druckkopfsteuerung für die Ausgabe der
Flüssigkeiten möglich. Da die elektrischen Eigenschaften der Druckkopfsteuerung bekannt
sind, kann ein (analoges) Interface zwischen der vorhandenen Elektronik und dem neuen
Druckkopf entwickelt werden, so dass sich dadurch von der Drucker- bzw. Software-Seite
18
keinerlei Veränderungen gegenüber einem üblichen Druckvorgang ergeben. Lediglich im
Anwender-Programm selbst sind entsprechende Anpassungen (Positionen, Druckzeichen etc.)
vorzunehmen.
Für den Probentisch mit variabel einstellbarem Temperaturgradienten wurde die mechanische
Anordnung aufgebaut. Die elektronische Schnittstelle zum Rechner und die Leistungsstufen
zum Betrieb der PeltierElemente sowie die Regelung auf Basis integrierter PTTemperaturfühler wurden fertiggestellt. Das Funktionstest des Temperaturgradienten zeigte,
dass die erforderliche Temperaturdifferenz sehr langsam angesteuert wird. Dies ist durch eine
zusätzliche Leistungsstufe zum Betrieb der leistungsgrößeren Peltier-Elemente zur
Einstellung des Gradienten zu beheben.
2.4
Wirtschaftliche
Umsetzung
der
mikrosystemtechnischen
Projektergebnisse
In konsequenter und enger Zusammenarbeit mit dem Arbeitsbereich Mikrosystemtechnik der
Technischen Universität Hamburg-Harburg wurde eine Fertigungslinie bei SLS MICRO
TECHNOLOGY GmbH aufgebaut, mit der eine industrielle Fertigung der modifizierten
Basischips und des Druckkopfes ermöglicht wird.
Dazu ist der plasmagestützte Abscheidungsprozess von PTFE-Schichten für die
Oberflächenmodifikation
der
Basischips
bzgl.
wirtschaftlicher
und
ökologischer
Gesichtspunkte optimiert und bei SLS in die Fertigungslinie integriert worden. Mit den
lithographischen Strukturierungstechniken ist ein kostengünstiger Herstellungsprozess für die
Fertigung von DNA-Basischips verfügbar.
Die mikrosystemtechnischen Herstellungsverfahren des Druckkopfes sind absolut kompatibel
mit den bei SLS zu diesem Zweck implementierten und angepassten Prozessen. Es kommt für
eine praktische Nutzung des Druckkopfes noch auf entscheidende Optimierungen an. Hierzu
zählt die Integrationsdichte der einzelnen Fluidikkanäle zu erhöhen, um eine größere
Düsenanzahl auf dichterem Raum zu realisieren. Es ist zudem ein handhabungsfreundlicheres
Verfahren für die Befüllung des Druckkopfes zu entwickeln, mit dem reproduzierbare
Ergebnisse im Fertigungsalltag beim DNA-Chip Hersteller erzielt werden können.
Mit einem optimierten Fine-Placer und dem an der TU Harburg am Arbeitsbereich
Mikrosystemtechnik entwickelten Gradientenheizer steht ein System bereit, welches als
Vorführmodell für Vertriebszwecke eingesetzt werden kann. Es hat sich im Rahmen der
19
Projektarbeit herausgestellt, dass eine Vermarktung des Gesamtsystems als Neuling im Markt
neben den anstehenden technologischen Optimierungsarbeiten als sehr problematisch
darstellt. Aus diesem Grund bleibt nur die Variante einer OEM-Lösung als gangbarer Weg für
die kommerzielle Umsetzung der Ergebnisse aus diesem Projekt übrig. Dies bedeutet, dass die
Einzelkomponenten von einem mikrosystemtechnischen Hersteller wie SLS gefertigt werden
und an bereits am Markt etablierte Anbieter von Micro Array Robotic Systemen zur
Weiterverarbeitung in deren Produkten geliefert werden. Diese Vorgehensweise hat sich bei
den heutigen Produkten von SLS als vorteilhaft herausgestellt, da man sich nicht der
unmittelbarer Konkurrenz mit den etablierten Anbietern aussetzt. Man kann auf diese Weise
sogar Partner gewinnen welche die abschließende Entwicklungsphase bis hin zur
Überführung in die Produktfertigung unterstützend mittragen. Bei dieser Lösung ist das
Know-how der strategischen Partner mit ihren bereits vorhandenen Robotiksystemen in denen
die Komponenten integriert werden uneingeschränkt verfügbar. So wäre z.B. der MicroGrid
von BioRobotics gerade zu geeignet für die Integration der hier entwickelten Komponenten.
In weiter führenden Arbeiten wird der Druckkopf und der Gradientenheizer in einem
kommerziell erhältlichen Robotiksystem zu integrieren sein, um mit einem solchen
Demonstrator die Funktion als OEM-Lösung bei potentiellen Partner zu präsentieren.
3. Diskussion
Im Jülicher Teilprojekt wurden die Ziele „Bereitstellung das gesamte E. coli-Genom
umfassender
DNA-Fragment-Chips“
und
„Validiertes
Protokoll
für
Genom-weite
Expressionsanalysen mit E. coli-DNA-Chips“ fristgerecht erreicht Es wurden E. coli-Gene
identifiziert,
deren
Expression
a)
bei
Kohlenstoff-Limiterung
oder
b)
bei
Überflußmetabolismus durch Phosphat-Limitation oder c) bei Überflußmetabolismus durch
Sulfat-Limitation verändert ist. Die Teilziele wurden im Wesentlichen erreicht und
darüberhinaus wurde das Acetat-Stimulon, d.h. die Gruppe an Genen, deren Expression durch
die Anwesenheit des Überflußmetaboliten Acetat verändert wird, identifiziert. Neue
Ansatzpunkte für die Stamm-Optimierung bei der Pyruvat-Produktion mit E. coli sind a)
Identifizierung von E. coli-Genen, deren Expression sich mit den Phasen der PyruvatProduktion verändert und b) Genom-umfassende Charakterisierung der Auswirkungen von
Gen-Inaktivierungen,
durchgeführt
die zum 'metabolic design' von Pyruvat-Produktionsstämmen
wurden.
Genexpressionsunterschiede
Innerhalb
dieser
zwischen
Zusammenarbeit
Stämmen,
die
gelang
sich
es
in
die
ihrer
20
Pyruvatproduktionskapazität unteschieden, zu identifizieren. Diese Arbeiten lieferten neue
Anhaltspunkte zur Optimierung der Pyruvatproduktion mit E. coli. Wie im Antrag geplant
gelang es die DNA-Chip-Technik für den Modellorganismus E. coli zu etablieren und zur
Charakterisierung des Acetatstresses und der aeroben Acetatbildung erfolgreich einzusetzen.
Ausserdem konnte die DNA-Chip-Technik anderen Projektpartnern zur Verfügung gestellt
werden.
Im Teilprojekt der Technischen Mikrobiologie zeigt sich, daß durch die Entwicklung und
Etablierung des Oligonukleotid-Chip-Systems für den Organismus E. coli bereits in früher
Phase ein wichtiges Ziel erreicht werden konnte, das durch wesentliche Meilensteine
gekennzeichnet ist: „Auswahl einer geeigneten Chip-Oberfläche“, „Herstellung der
Oligonukleotid-Chips“ (in Zusammenarbeit mit dem Projektpartner Jülich) und „Optimierung
der Markierung der Ziel-RNA“. Wesentlicher Faktor dieses Teilprojektes ist der dynamische
Verlauf in der Entwicklung des Oligonukleotid-Chips, bedingt durch die Charakterisierung
des späteren Anwendungsgebietes. Durch die Kontaktaufnahme mit der Brauerei Beck & Co
in Bremen wurde der Bedarf eines Oligonukleotid-Chips als Kontaminationskontrolle
diskutiert und eine Zusammenarbeit vereinbart. Durch dieses spezifische Anwendungsfeld
änderten sich die zu erreichenden Meilensteine, insbesondere kamen neue hinzu.
Der Meilenstein „Schmelzkurven“ wurde nicht erreicht. Dies ist darin zu begründen, dass der
Probentisch in Zusammenarbeit mit der Mikrosystemtechnik zwar erfolgreich gebaut wurde,
doch aufgrund von erheblichen Softwareproblemen noch nicht die experimentelle Phase
erreichte. Die „Beacon-Methodik“ wurde zugunsten der besonderen Herausforderung in der
bierbrauenden Industrie, dem Nachweis aktiver Organismen, aufgegeben, denn der Nachweis
aktiver Bakterien ist von weitaus höherem Interesse. Dieser Nachweis umfasst wesentliche
Meilensteine, die im Verlauf des Projekts erreicht wurden: „Isolierung der 16S rDNA und
ISR rDNA“, „Amplifikation der 16S rDNA und ISR rDNA“ und „Sequenzanalysen der 16S
rDNA und ISR rDNA“. Die resultierenden Ergebnisse dienen dem „Design von
Oligonukleotid-Sonden“ zum Erkennen der speziesspezifischen Regionen der ISR und der
16S. Die beiden essentielle Meilensteine „Isolation der ISR rRNA und 16S rRNA“ und
„Amplifikation der ISR rRNA und 16S rRNA mittels RT+PCR“ wurden erfolgreich erreicht.
Die „Optimierung des Oligonukleotid-Chips als Kontaminationskontrolle“ stellt den
Abschluß des Teilprojekts und die Sicherung einer erfolgreichen Projektarbeit dar.
Während der gesamten Projektphase wurde versucht, den ökonomischen Aspekt in die
Experimente einfließen zu lassen. Dies ist zum Teil erfolgreich gelungen. So ist die
Beschichtung der Chips ein wesentlicher Punkt (mindestens 50% Kostenersparnis gegenüber
kommerziell erhältlichen Chips), ebenso ist die Verwendung von nichtmodifizierten
21
Oligonukleotiden an Stelle speziell für die Chiphybridisierung modifizierter Oligonukleotide
kosteinsparend (Einsparungen von ca. 25%).
Der in Zielsetzung für die Mikrosystemtechnik angegebene Meilenstein „Entwicklung und
Realisierung des Druckkopfs“ wurde erreicht, allerdings zu einem späteren Zeitpunkt als
vorgesehen. Ein thermopneumatisches Aktuatorprinzip mit den Mikro-Heizelementen und ein
Konzept von zwei Fluidiknetzwerken haben sich für ein Drucksystem auf die modifizierte
Glasoberfläche als geeignet herausgestellt. Außerdem ist durch diese neue Geometrie die
Miniaturisierung
und ein geringer Leistungsverbrauch erzielt worden, als bei dem
piezoelektrischen Antrieb zuvor. Die Untersuchungen an einem HP-Deskjet 500 Drucker
ergaben, dass er sich auf Grund seiner Präzision gut für die Positionssteuerung eines
speziellen Druckkopfes eignet. Allerdings ein einwandfreies Bedrücken des Basis-Chips mit
dem Drucker war nicht erreicht. Ein nicht vollständig luftblasenfreies Befüllen des
hergestellten Druckkopfs mit der Aktuatorflüssigkeit führte sporadisch zu einem Aussetzen
des Injektionsvorgangs an einigen Düsen oder zu einem geringerem Tropfenvolumen. Es ist
außerdem für den Druck auf einem Objektträger ist die Mechanik des Druckers noch
entsprechend zu verändern. Hierzu gehören insbesondere die genauere Anpassung des
Abstandes von der Glasoberfläche zur Stelle des Mediumaustritts. Die Protokolle für Vorund Nachbehandlung der Basis-Chipoberfläche wurden von der Technischen Mikrobiologie
erstellt und zur Verfügung an die Mikrosystemtechnik gestellt. In Zusammenarbeit mit der
Technischen Mikrobiologie wurden Hafteigenschaften von Oligonukleotiden auf dem BasisChip getestet.
Kooperationen
Eine intensive Zusammenarbeit zwischen Dr. Tino Polen (Jülich) und Daniel Weber
(Technische Mikrobiologie) gewährleistete, dass die Hamburger Gruppe ausreichend TestDNA-Chips für die Oligohybridisierung nutzen und mittels des Scanners auswerten konnte.
Eine projektübergreifende Zusammenarbeit ergab sich mit dem Projekt 'Fermentative
Produktion von Brenztraubensäure (AZ 13040/05)', das von Prof. Dr. Michael Bott in Jülich
koordiniert wurde. Besonders vorteilhaft war hierbei, dass die projektbearbeiter Dr. Tino
Polen und Dr. Tanja Gerharz in unmittelbarer Nachbarschaft ihre gemeinsamen Arbeiten
absprechen und zügig durchführen konnten.
Der Oligonukleotid-Chip zur Detektion und Identifikation bierkontaminierender Bakterien
wurde in Zusammenarbeit mit der Brauerei Beck & Co in Bremen entwickelt, die relevante
Mikroorganismen bereit stellte und zu speziellen Fragestellungen zur Verfügung stand. Bei
22
der Entwicklung des Temperaturgradienten und des Spotters arbeitete Tseren Injinaash
(Mikrosystemtechnik) und Daniel Weber (Technische Mikrobiologie) eng zusammen.
Die Zusammenarbeit mit Herrn Tseren Injinaash (Mikrosystemtechnik, TUHH) und der
Firma SLS MICRO TECHNOLOGY GmbH war sehr fruchtbar und stets durch ein
konstruktives Klima gekennzeichnet. Damit war es gelungen die notwendigen Technologien
in eine industrielle Umgebung einzubinden.
Die Treffen in Hamburg zur biocat 2002 sowie zu den projektübergreifenden Seminaren
wurden für die Koordinierung dieser Zusammenarbeit und den direkten Erfahrungsaustausch
genutzt.
4. Literatur/Präsentationen/Patente
Publikationen zum Projektthema ab 2001:
1. Wendisch V. F., D. P. Zimmer, A. B. Khodursky, B. J. Peter, N. Cozzarelli & S. Kustu
(2001) Anal. Biochem. 290: 205-213.
2. Lehnen D., Blumer C., Polen T., Wackwitz B., Wendisch V.F. & Unden G. (2002) Mol.
Microbiol. 45: 521-532.
3. Polen T., Rittmann D., Wendisch V.F. & Sahm H. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:
1759-1774.
4. Khodursky A.B, Bernstein J.A., Peter B.J., Rhodius V., Wendisch V.F. & Zimmer D.P.
(2003) Methods Mol. Microbiol. 224: 61-78
5. Polen T., & Wendisch V.F. (2004) Appl. Biochem. Biotechnol. accepted for publication
6. T.Injinaash, J.Müller Proceedings of the 11th International Conference Sensor, C7, pp379381, Nürnberg( 2003)
7. Wendisch V. F. (2001) BIOforum 7(2001): 471-473.
8. Polen T., Rittmann D., Wendisch V.F., Sahm H., Weber D.G., Sahm K., Antranikian G. &
Müller J. (2001) Biospektrum Sonderausgabe, Spektrum Akademischer Verlag, pp. 60-64.
9. Weber D.G., Injinaash T., Polen T., Dembowski K., Veit A., Lehmann U., Sahm K.,
Wendisch V.F., Antranikian G., Müller J. & Sahm H. (2003) transkript, Sonderausgabe
Biokatalyse (Eds. S. Heiden & R. Erb), pp. 63-66.
23
Folgende Publikationen sind in Vorbereitung:
-
Weber, D. G., Sahm, K., Antranikian, G.: „An oligonucleotide microarray for detection
and identification of viable beer spoiling bacteria“
-
Weber, D. G., Sahm, K., Antranikian, G.: „Combination of reverse transcription and
polymerase chain reaction to detect beer spoiling bacteria“
Vorträge zum Projektthema
1. Volker F. Wendisch (19.06.2001 in Zürich, Schweiz)
Mikrobiologisches Kolloquium der Eidgenössischen Technischen Hochschule
3. Volker F. Wendisch (20.3.2002 in Frankfurt)
Vortrag in der Abteilung Biotechnologie der Firma Aventis Pharma Deutschland
2 .Tino Polen, D. Rittmann, V.F. Wendisch, H. Sahm (31.7.2002 in Hamburg)
Vortrag auf der biocat 2002: International Congress on Biocatalysis
4. Volker F. Wendisch (17.02.2003 in Porto Alegre, Brasilien)
Vortrag im Departamento Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
5. Tino Polen, D. Rittmann, H. Sahm, V.F. Wendisch (24.03.2003 in Berlin)
Vortrag auf der VAAM Jahrestagung
6. Volker F. Wendisch (04.04.2003 in München)
Vortrag auf der DECHEMA Jahrestagung
7. Volker F. Wendisch (28.04.2003 in Trivandrum, Indien)
Vortrag auf der International Conference on Emerging Frontiers at the Interface of
Chemistry & Biology
8. Volker F. Wendisch (23.10.2003 in Seoul, Korea)
Vortrag im R&D Center Biotechnology der Firma CJ Corporation
9. Volker F. Wendisch (5.11.2003 in Leiden, Niederlande)
Vortrag bei der Biotechnologischen Forschung der Firma DSM
10. Daniel G. Weber, K. Sahm, G. Antranikian (12.11.2001): Vortrag bei der Fa. Brauerei
Beck & Co, Bremen
11. Daniel G. Weber, K. Sahm, G. Antranikian, (15.08.2002): Vortrag bei Fa. Dr. Weigert,
Hamburg
12. Tseren Injinaash, J. Müller, (2003): Vortrag bei 11 Internationale Kongress Sensor 2003,
C7, 375-379, Nürnberg.
24
Posterpräsentationen zum Projektthema ab 2001:
1. Polen T., Rittmann D., Wendisch V.F. & H. Sahm (2001)
DECHEMA-Seminar Chip-Technologie, Frankfurt, 22.-23. Januar 2001.
2. Polen T., Rittmann D., Wendisch V.F. & H. Sahm (2001)
VAAM Jahrestagung, Oldenburg, 25.-28. März 2001.
3. Sindelar G., Rittmann D., Wendisch V. F. & Sahm H. (2002)
DECHEMA-Seminar Chip-Technologie, Frankfurt, 21.-22 Januar 2002.
4. Weinhold S., Sindelar G., Hansner T., Wernet P., Wendisch V. F. & Uhrberg M. (2003)
DECHEMA-Seminar Chip-Technologie, Frankfurt, 24.-25 Januar 2003.
5. Injinaash, T., Weber, D. G., Müller, J., Antranikian, G. (2002)
biocat 2002: International Congress on Biocatalysis, Hamburg
Dissertationen
Dr. Tino Polen, dessen Promotion mit von der DBU gefördert wurde, wurde am 14.11.2003
mit dem Günther-Leibfried-Preis des Forschungszentrums Jülichs ausgezeichnet (s.
Pressemitteilung des Forschungszentrums Jülich vom 14.11.2003).
Dipl.-Biol. Daniel G. Weber promoviert im Rahmen des von der DBU unterstützten
Verbundprojektes „Biokatalyse“ bei Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian am Lehrstuhl für
Technische Mikrobiologie an der Technischen Universität Hamburg-Harburg.
Patente
Das Patent von Dipl.-Biol. Daniel G. Weber und Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian mit
dem Titel „ISR Sequenzen bierkontaminierender Bakterien“ ist in Vorbereitung.
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5. Anlage
Liste der Veröffentlichungen und Tagesbeiträgen in der Anlage
1. Wendisch V. F., D. P. Zimmer, A. B. Khodursky, B. J. Peter, N. Cozzarelli & S. Kustu
(2001) Anal. Biochem. 290: 205-213.
2. Lehnen D., Blumer C., Polen T., Wackwitz B., Wendisch V.F. & Unden G. (2002)
Mol. Microbiol. 45: 521-532.
3. Polen T., Rittmann D., Wendisch V.F. & Sahm H. (2003) Appl. Environ. Microbiol.
69: 1759-1774.
4. Khodursky A.B, Bernstein J.A., Peter B.J., Rhodius V., Wendisch V.F. & Zimmer
D.P. (2003) Methods Mol. Microbiol. 224: 61-78
5. T.Injinaash, J.Müller Proceedings of the 11th International Conference Sensor, C7,
pp375-379, Nürnberg( 2003)
6. Wendisch V. F. (2001) BIOforum 7(2001): 471-473.
7. Polen T., Rittmann D., Wendisch V.F., Sahm H., Weber D.G., Sahm K., Antranikian
G. & Müller J. (2001) Biospektrum Sonderausgabe, Spektrum Akademischer Verlag,
pp. 60-64.
8. Weber D.G., Injinaash T., Polen T., Dembowski K., Veit A., Lehmann U., Sahm K.,
Wendisch V.F., Antranikian G., Müller J. & Sahm H. (2003) transkript,
Sonderausgabe Biokatalyse (Eds. S. Heiden & R. Erb), pp. 63-66.
26