Identifizierung und Differenzierung von Bakterienisolaten aus
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Kant. Laboratorium BS Seite 1 von 2 Identifizierung und Differenzierung von Bakterienisolaten aus Patienten- und Lebensmittelproben mittels DNA Sequenzierung und Fragment Analyse Ausgangslage Nach dem Genuss eines in einem Restaurationsbetrieb zubereiteten Lebensmittels waren mehrere Krankheitsfälle gemeldet worden. Bei einem davon konnte die Untersuchung der Stuhlprobe den Verdacht auf eine Salmonellen-Infektion durch Salmonella enterica ssp. enterica serovar enteritidis bestätigen. Daraufhin wurden im betroffenen Betrieb von diversen verdächtigen Speisen durch das Lebensmittelinspektorat Proben erhoben, und diese auf das Vorhandensein möglicher bakterieller Kontaminanten untersucht. Das dazu benutzte miniaturisierten Testsystem ergab, dass eine Speise (Pouletgeschnetzeltes; erhitzt) von Salmonellen der Gruppe D befallen war. Die im Nationalen Zentrum für enteropathogene Bakterien (NENT) erfolgte Bestätigung und Serotypisierung ergab ebenfalls S. enterica ssp. enterica serovar enteritidis. Damit stellte sich die Frage, ob die beim Patienten und aus dem Lebensmittel isolierten Salmonellenstämme identisch waren, und somit der durch die Anamnese erhärtete Verdacht des Ursprungs der Infektion im betroffenen Restaurationsbetrieb durch Analysen bestätigt werden konnte. Untersuchungsziele Die biochemische Identifizierung der Salmonellen mit Hilfe der käuflich erwerblichen, miniaturisierten Testsysteme ist nicht immer eindeutig und zudem war im vorliegenden Fall das Lebensmittel auch mit Proteus befallen. Aus diesem Grund sollte zum einen mit Hilfe einer weiteren unabhängigen Methode untersucht werden, ob es sich bei den Bakterienisolaten tatsächlich um Bakterien der Spezies Salmonella oder um Proteus oder Citrobacter handelt. Des Weiteren sollte abgeklärt werden, ob die aus dem Patienten und dem Lebensmittel isolierten Salmonellenstämme genetisch unterschieden werden können. Prinzip und Ausführung der DNA Sequenzierung Als erstes wurden die vom Patienten und aus dem Lebensmittel isolierten Stämme reingewonnen und die DNA extrahiert. Diese wurde dann mit dem 16S rRNA Sequenzierverfahren analysiert. Bei diesem Verfahren wird ein etwa 500 Basenpaar grosses Fragment des 16S rRNA (ribosomale Ribonukleinsäure) Genes sequenziert. Dieser DNA Abschnitt besitzt Nukleotid-Sequenzbereiche, welche für die meisten Bakterienarten einzigartig sind, und somit zur Identifikation verwendet werden können. Parallel zu den Stämmen aus den Proben ist auch ein Referenzstamm (S. enterica ssp. enterica serovar enteritidis) untersucht worden. Sämtliche resultierenden DNA Sequenzen wurden danach untereinander sowie mit der öffentlich zugänglichen DNA Datenbank (NCBI-Genbank® http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ) verglichen. Prinzip und Ausführung der Fragment Analyse Die zweite Untersuchungsmethode1 stützt sich auf die Tatsache, dass der DNA Bereich zwischen dem 16S und dem 23S rRNA Gen je nach Bakterienart und -Stamm erstens in unterschiedlicher Anzahl Kopien und zweitens in verschiedener Länge in den Bakterien vorkommt. Die Vervielfältigung dieses Abschnittes mit anschließender Auftrennung nach ihrer Grösse führt zu Stamm spezifischen Bandenmustern, die zur Unterscheidung herangezogen werden können. Zur Durchführung der Fragment Analyse wurde der entsprechende DNA-Abschnitt mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines Fluoreszenz-markierten 'Primers' (Startermolekül) vervielfältigt. Die so erhaltenen DNA Fragmente konnten danach mittels Kapillar-Gelelektrophorese nach ihrer Länge aufgetrennt und die Fragmentmuster der Proben miteinander verglichen werden. 1 Fragment Analyse Verfahren 'ribosomal intergenic spacer analysis' (RISA); vgl. Bericht Nr. 47 vom 15.12.2003. SequenzierungundFragmentanalyse.doc erstellt: 10.11.04 15:27 Kant. Laboratorium BS Seite 2 von 2 Ergebnisse Der Sequenzvergleich des Bakterienisolates aus dem Patienten mit den Isolaten aus dem Lebensmittel sowie dem Referenzstamm S. enterica ssp. enterica serovar enteritidis ergab eine 100%ige Übereinstimmung. Eine Gegenüberstellung der DNA Sequenzen der aus den Proben isolierten Stämme mit verschiedenen in der NCBI Gen-Datenbank hinterlegten 16S rRNA Gensequenzen lieferte weitere identische Sequenzen für S. enterica ssp. enterica des Serotyps typhimurium und enteritidis. Damit konnte bestätigt werden, dass es sich bei den vorliegenden Bakterienisolaten tatsächlich um Salmonellen und zwar der Subspezies enterica handelte. Der Serotyp konnte jedoch mittels der hier angewandten 16S rRNA Gensequenzierung nicht identifiziert werden, da die unterschiedlichen Serotypen für diesen Genomabschnitt gleiche Sequenzen aufwiesen. Referenzstamm Stuhlprobe Lebensmittel 1 Lebensmittel 2 Lebensmittel 3 Lebensmittel 4 Lebensmittel 5 Lebensmittel 6 Lebensmittel 7 Lebensmittel 8 Lebensmittel 9 11 GTTTGATCCT GTTTGATCCT GTTTGATCCT GTTTGATCCT GTTTGATCCT GTTTGATCCT GTTTGATCCT GTTTGATCCT GTTTGATCCT GTTTGATCCT GTTTGATCCT GGCTCAGATT GGCTCAGATT GGCTCAGATT GGCTCAGATT GGCTCAGATT GGCTCAGATT GGCTCAGATT GGCTCAGATT GGCTCAGATT GGCTCAGATT GGCTCAGATT GAACGCTGGC GAACGCTGGC GAACGCTGGC GAACGCTGGC GAACGCTGGC GAACGCTGGC GAACGCTGGC GAACGCTGGC GAACGCTGGC GAACGCTGGC GAACGCTGGC GGCAGGCCTA GGCAGGCCTA GGCAGGCCTA GGCAGGCCTA GGCAGGCCTA GGCAGGCCTA GGCAGGCCTA GGCAGGCCTA GGCAGGCCTA GGCAGGCCTA GGCAGGCCTA ACACATGCAA ACACATGCAA ACACATGCAA ACACATGCAA ACACATGCAA ACACATGCAA ACACATGCAA ACACATGCAA ACACATGCAA ACACATGCAA ACACATGCAA GTCGAACGGT GTCGAACGGT GTCGAACGGT GTCGAACGGT GTCGAACGGT GTCGAACGGT GTCGAACGGT GTCGAACGGT GTCGAACGGT GTCGAACGGT GTCGAACGGT 80 AACAGGAAGC AACAGGAAGC AACAGGAAGC AACAGGAAGC AACAGGAAGC AACAGGAAGC AACAGGAAGC AACAGGAAGC AACAGGAAGC AACAGGAAGC AACAGGAAGC Referenzstamm Stuhlprobe Lebensmittel 1 Lebensmittel 2 Lebensmittel 3 Lebensmittel 4 Lebensmittel 5 Lebensmittel 6 Lebensmittel 7 Lebensmittel 8 Lebensmittel 9 81 AGCTTGCTGC AGCTTGCTGC AGCTTGCTGC AGCTTGCTGC AGCTTGCTGC AGCTTGCTGC AGCTTGCTGC AGCTTGCTGC AGCTTGCTGC AGCTTGCTGC AGCTTGCTGC TTCGCTGACG TTCGCTGACG TTCGCTGACG TTCGCTGACG TTCGCTGACG TTCGCTGACG TTCGCTGACG TTCGCTGACG TTCGCTGACG TTCGCTGACG TTCGCTGACG AGTGGCGGAC AGTGGCGGAC AGTGGCGGAC AGTGGCGGAC AGTGGCGGAC AGTGGCGGAC AGTGGCGGAC AGTGGCGGAC AGTGGCGGAC AGTGGCGGAC AGTGGCGGAC GGGTGAGTAA GGGTGAGTAA GGGTGAGTAA GGGTGAGTAA GGGTGAGTAA GGGTGAGTAA GGGTGAGTAA GGGTGAGTAA GGGTGAGTAA GGGTGAGTAA GGGTGAGTAA TGTCTGGGAA TGTCTGGGAA TGTCTGGGAA TGTCTGGGAA TGTCTGGGAA TGTCTGGGAA TGTCTGGGAA TGTCTGGGAA TGTCTGGGAA TGTCTGGGAA TGTCTGGGAA ACTGCCTGAT ACTGCCTGAT ACTGCCTGAT ACTGCCTGAT ACTGCCTGAT ACTGCCTGAT ACTGCCTGAT ACTGCCTGAT ACTGCCTGAT ACTGCCTGAT ACTGCCTGAT 150 GGAGGGGGAT GGAGGGGGAT GGAGGGGGAT GGAGGGGGAT GGAGGGGGAT GGAGGGGGAT GGAGGGGGAT GGAGGGGGAT GGAGGGGGAT GGAGGGGGAT GGAGGGGGAT Sequenzvergleich aller Proben: Der Ausschnitt zeigt die Basen 11-150 des 500 Basenpaare umfassenden, sequenzierten Bereiches des 16S rRNA Genes der Bakterienstämme. Die RISA Fragment Analyse des Patientenisolates und der Stämme aus dem Lebensmittel ergab ein identisches Signalmuster. Im Vergleich mit dem parallel untersuchten Referenzstamm waren jedoch vier grössere Unterschiede feststellbar. Dieses Resultat konnte anhand einer anschliessend durchgeführten statistischen Auswertung (Cluster Analyse) bestätigt werden. Schlussfolgerungen Sämtliche Stämme konnten nach dem Standardverfahren der 16S rRNA Sequenzierung analysiert und als Salmonella enterica ssp. enterica identifiziert werden. Eine Bestimmung des Serotyps war jedoch aufgrund der sehr großen Homologie der 16S rRNA Gene innerhalb der Bakterienart der Salmonellen mittels dieser Sequenzierung nicht möglich. Die Signalmuster der anschliessend durchgeführten DNA Fragment Analyse war für alle Proben identisch. Dies lässt den Schluss zu, dass der Ursprung der Infektion sehr wahrscheinlich im betroffenen Restaurant zu orten ist. SequenzierungundFragmentanalyse.doc erstellt: 10.11.04 15:27
