1. Biochemie- Seminar – Proteine 1

1. Biochemieseminar – Proteine 1
Erarbeitet von Till Würdemann, Leif Wilm
1. Biochemie- Seminar –
Proteine 1
Aufbau und Struktur der Proteine
Aufbau
-
-
Proteine = lange unverzweigte Ketten aus 100+ Aminosäuren (meist ca. 200 – 600)
[2 – 99 Aminosäuren = Peptide, s.u.]
Aminosäuren sind über Peptidbindungen verbunden (Säure-Anhydrid-Bindung;
Carboxylgruppe + Aminogruppe unter Wasserabspaltung)
 partieller Doppelbindungscharakter schränkt Drehbarkeit ein („resonanzstabilisiert“)
o AS mit freier Aminogruppe = N-terminal
o As mit freier Carboxylgruppe = C-terminal
O- und H- Atome können mit anderen Peptidbindungen Wasserstoffbrücken bilden (wichtig
für Strukturbildung, s.u.)
Stabilität
- Hydrolyse von Peptidbindungen ist energetisch favorisiert aber sehr langsam;
katalysiert durch mineralische Säuren (z.B. HCL 6molar)
- enzymatische Spaltung durch z.B.
o Trypsin
(Endopeptidase)
(Lys, Arg)
o Chymotrypsin (Endopeptidase)
(Tyr, Trp, Phe, Leu)
o Thrombin
(Arg)
- chemische Spaltung durch z.B.
o Bromid
(Met)
Klassifizierung von Aminosäurestrukturen
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-
-
-
Größe
o
o
o
Form
o
bis 10 Aminosäuren: Oligopeptid
bis 100 Aminosäuren: Peptid
ab 100 Aminosäuren: Protein
globulär (kugelförmig)
 z.B. in Hämoglobin
 hydrophobe Seitenketten liegen innen ( Hydrophilie)
o fibrillär (länglich)
 z.B. in Kollagenen, Keratinen
 meist hydrophob
Löslichkeit
o je höher der Anteil an hydrophoben Aminosäuren desto hydrophober die Struktur
o sehr hydrophobe Proteine finden sich in der Plasmamembran
o [es gibt einen Hydrophobitätsindex]
Zusammensetzung
man unterscheidet Peptide und Proteine bei deren Hydrolyse
o nur Aminosäuren frei werden
o auch Nichtproteine frei werden wie z.B. Kohlenhydrate, Lipide, Metalle
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1. Biochemieseminar – Proteine 1
Erarbeitet von Till Würdemann, Leif Wilm
Struktur
-
bestimmt von nicht-kovalenten Kräften
o van-der-Waals
(zwischen unpolaren Molekülen; 0,4-4 kJ/mol)
o Wasserstoffbrücken (abhängig vom Abstand der Pole; 12-30 kJ/mol)
o Ionenbindung
(20 kJ/mol)
o hydrophobe Interaktionen
(hydrophobe Bereiche lagern beieinander unter
Wasserausschluss; < 40 kJ/mol)
Primärstruktur
- Abfolge der durch Peptidbindungen verknüpften Aminosäuren
o Peptidbindung  partieller Doppelbindungscharakter (Mesomeriezustände)
- bleibt bei Denaturierung erhalten
- Schlussfolgerung auf aus ihr gebildeten Strukturen (zur Zeit noch) nicht möglich
- Pathologie:
o Sichelzellenanämie
– 1 AS auf Hämoglobin-Seitenkette vertauscht (Glu6  Val6)
o Osteoarthritis
– 1 AS im Kollagenprotein vertauscht
Sekundärstruktur
- Strukturen die sich durch Wasserstoffbrücken zw. den Aminosäuren/ Peptidbindungen
bilden; Seitenketten können Einfluss haben, jedoch nie direkte Beteiligung
- α- Helix
o rechtsgängige Schraube (also im Uhrzeigersinn)
o 3,6 Aminosäuren pro Windung; Steigung pro Aminosäure 1,5 Å; Steigung pro
Windung demnach 5,4 Å;
o Aminosäuren- Seitenketten weisen nach außen
o Prolin ist ein „Helixbrecher“ da es kein an α-Aminosäure keine N-H-Gruppe für eine
Wasserstoffbrücke enthält
o amphipathische Helix mit einer hydrophoben und einer hydrophilen Seite (ASSeitenketten)  können besonders gut dimerisieren *s.o. „hydrophobe
Interaktionen“+
o Sonderfall: kollagene Helix
 gebildet aus 3 linksdrehenden Helices (also entgegen Uhrzeigersinn)
 jede 3. Aminosäure ist Glycin (aus sterischen Gründen); viel Prolin
- β- Faltblatt
o parallele (weniger stabil; AS-Abstand 3,25 Å) oder antiparallele (stabiler; AS-Abstand
3,46 Å) Anordnung von Proteinketten in einer Ebene
 Aminosäurereste ragen nach oben/unten aus der Ebene heraus
o Wasserstoffbrücken zwischen dem Proteinketten
- Schleifen (Loops/Turns)
o U- förmige Abschnitte der Aminosäurenkette
o verbinden α- Helices und β- Faltblätter eines Proteins
-
Supersekundärstruktur
o auch „Motiv“; definierte Kombination von α-Helix und β-Faltblatt
o sorgen für spezifische Funktionen von Proteinen
z.B. DNA-Bindung („Helix-Turn-Helix“) oder Ca2+-Bindung („EF-Hand“)
o scheinen besonders stabile Faltungselemente zu sein: lassen sich in vielen
unverwandten Proteinen finden
o nicht zu verwechseln mit Domänen!
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Erarbeitet von Till Würdemann, Leif Wilm
Tertiärstruktur
- räumliche Anordnung einer Aminosäurenkette und ihrer Reste
- wird stabilisiert durch nicht-kovalente Wechselwirkungen der Aminosäurenreste
- es bilden sich Domänen
o strukturelle Domänen: zusammenhängende Bereiche eine Proteins, die sich
unabhängig voneinander falten können
o funktionelle Domänen: Einheiten, die für bestimmte Proteinaktionen zuständig sind
Quartärstruktur
- nicht-kovalente Assoziation mehrerer in Primärstruktur identischer (=Homopolymere) oder
nicht-identischer (=Heteropolymere) Untereinheiten zu einer Funktionseinheit
- verleiht den Proteinen besondere funktionelle Eigenschaften
- Grundlage für Kooperativität von Proteinen (z.B. Myoglobin, Hämoglobin)
- Allosterie: Veränderung der Raumstruktur unter Beeinflussung des aktiven Zentrums/
Bindungszentrums durch Ligandenbindung
Denaturierung/ Renaturierung:
- Zerstörung der räumlichen Struktur ( Funktionsverlust)
- kleine Proteine können reversibel denaturiert und renaturiert werden
 Informationen für Ausbildung der Raumstruktur sind bereits in Primärstruktur vorhanden
-
irreversible Denaturierung meist durch chemische Prozesse, z.B. Desaminierung von
Asparagin, Glycosylierung von Lysinseitenketten
Faltung
- Proteine falten zum niedrigsten Energieniveau hin; lokales Energieminimum kann hierbei
Fortschritt zur Endformation verlangsamen
- Phasen der Faltung
1. schnelle, reversible Ausbildung von Sekundärstrukturen
2. Bildung von Domänen
3. Anordnung der Domänen zum nativen Protein (rel. langsam); danach Ausbildung von
Disulfidbrücken zur Stabilisierung
- Faltungshelfer
o Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) – katalysiert Reduktion von inkorrekten
Disulfidbrücken
o Peptidyl/Prolyl-cis/trans-Isomerase
o Chaperone – erkennen hydrophobe Regionen; binden Protein unter ATP-Verbrauch
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Eigenschaften der Proteine
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durch Peptidbildungen gebildetes „Rückrat“ ist bei allen Proteinen gleich
 spezielle Eigenschaften ergeben sich aus den Aminosäurenseitenketten
-
Monomer = 1 Polypeptidkette
Multimer = > 1 Polypeptidketten
-
fibrillär
o Polypeptide in langen Strängen oder Lagen
o wassunlöslich da viele hydrophobe AS
o stark aber flexibel
o Strukturproteine
globulär
o in sphärischer bzw. globulärer Form
o wasserlöslich (hydrophobe SK lagern nach innen, hydrophile nach außen)
o Variabilität der Sekundärstrukturen  funktionelle Variabilität (Enzyme,
regulatorische Proteine, etc.)
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Funktionen der Proteine
-
Aufbau nahezu sämtlicher Strukturen von Zelle und Gewebe
Poren und Translokatoren der Plasmamembran
bilden Enzyme und Rezeptoren
geringe Pufferfunktion
Titrationskurven von Aminosäuren
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Aminosäuren sind Ampholyte
o Aminogruppen = schwache Basen
o Carbxylgruppen = schwache Säuren
o
pK von  10,5
pK von  4,5
bei α-Amino-Carbonsäuren liegen Aminosäure und Carboxylgruppe am selben CAtom  Wechselwirkungen  pK von  9-10,5 bzw. 1,7-2,4
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Henderson- Hasselbalch- Gleichung:
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isoelektrischer Punkt: pH an dem die Anzahl von positiven und negativen Ladungen eines
Moleküls gleich ist
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WICHTIG: Titrationskurven von Alanin, Glutaminsäure, Lysin
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Modifikation von Aminosäuren
- kovalente Modifikation
z.B. Phosphorylierung, hierbei wird auch eine Ladung eingefügt  Veränderung der
Eigenschaften
- Reaktion zur Schiff’schen Base
Reaktion von Aldehyd-oder Ketogruppe mit Aminogruppe unter Wasserabspaltung)
- ADP-Ribosylierung
hierbei wird ADP-Ribose von NAD+ auf eine N-H-Gruppe übertragen
- Disulfidbrücken
R-S-S-R
- Glykosylierung
N-glykosylierung: Zuckerrest wird auf einmal übertragen
(z.B. an Asparagin)
O-glykosylierung: Zucker werden Stück für Stück einzeln übertragen (z.B. an Serin)
- Decarboxylierung von Aminosäuren
es entstehen biogene Amine:
o Histidin
 Histamin
o Tryptophan
 Serotonin
o Tyrosin
 Dopamin, Noradrenalin, Adrenalin
o Glutamat
 γ-Aminobuttersäure (GABA)
Methoden zur Struktur- und Funktionsanalyse von Proteinen
Proteinreinigung (durch Säulenchromatographie)
-
-
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Ionenaustausch-Chromatographie
o Beads enthalten positive oder negative Ladung  verlangsamen Proteine mit der
gegengesetzten Ladung
o Wirkung ist abhängig von pH und Ladungsstärke der Protein-Lösung
Affinitäts-Chromatographie
o Beads sind an Moleküle gekoppelt, die mit gesuchtem Protein interagieren
(z.B. Antikörper, Enzymsubstrat) und binden so das jeweilige Protein
o „gefangene“ Proteine können mit Salzlösung oder pH-Veränderung wieder
ausgewaschen werden
Gelfiltrations-Chromatographie
o Beads enthalten Poren in denen sich Proteine verfangen; große Proteine gelangen
nicht in die Poren und werden zuerst ausgewaschen
Proteinanalytik
-
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
o negativ geladenes SDS (Natrium- Dodecylsulfat) lagert sich am Protein an; dessen
Ladung ist nun proportional zur Größe
o Protein wandert entsprechend seiner Größe und Ladung durch ein elektrisches Feld;
Vergleich mit Eichproteinen ergibt Rückschlüsse auf das Molekulargewicht
o für Aufteilung der Proteine nach ihrem isoelektrischem Punkt:
 Denaturierungsmittel wird zugesetzt
 Gel- Elektrophorese auf Polyacylamidgelstreifen mit pH-Gradient
 Protein wandert zum isoelektrischen Punkt
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Erarbeitet von Till Würdemann, Leif Wilm
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Edmann- Abbau
o geeignet bis ca. 40 Aminosäuren/ Zyklen (wegen Verunreinigungen)
o N-terminale Aminosäure eines Proteins wird mit PITC [Phenylisothiocyanat] markiert
und dieser Komplex dann chemisch abgespalten
o mittels Chromatographie wird eine Darstellung des Laufverhaltens möglich und die
komplexierte Aminosäure kann bestimmt werden
o Peptidkette wird hierdurch schrittweise abgebaut und die enthaltenen AS bestimmt
Massenspektroskopie
o 2002 Nobelpreis für Fenn/Tanaka
o Protein wird von Laser ionisiert und seine Fragmente durch ein el. Feld beschleunigt
o im Detektor wird aus Flugzeit das Masse/Ladungs-Verhältnis konstruiert 
Aufschlüsse über Zusammensetzung der Probe
Röntgenstrukturanalyse
o bestimmt die Struktur von Proteinen im kristallinen Zustand
 Protein muss als Einkristall vorliegen
o wird mit monochromatischer Rx- Strahlung bestrahlt (Wellenlänge < Auflösung)
o auf Kamerabild erscheinen tausende Reflexe die die Ortskoordinaten der Atome
bestimmen lassen
o Nachteile:
 kristalline Proteine haben leicht andere Struktur als im gelösten Zustand
 einkristalline Proteinpräparate sind sehr schwer herzustellen
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