UE Biochemie II: Flow Cytometry

UE Biochemie II: Flow Cytometry
Lerninhalt: Grundlagen der Durchflußzytometrie: Forward Scatter, Side Scatter,
Fluoreszenzintensität; FACS; Lymphozytenpräparation über Ficoll;
Hintergrund:
Siehe Vorlesung
Zeitplan:
Die Übungsteile werden je nach Gruppe in folgender Reihenfolge durchgeführt:
Gruppen 1-4: Teil 1, Teil 2, Teil 3B, Teil 3A, Teil 4
Gruppen 5-8: Teil 1, Teil 3A, Teil 2, Teil 3B, Teil 4
Aufgabenstellung des Versuches:
1. Übung am FACS Simulator
Am virtuellen FACS sollen Sie sich mit den Einstellungen der Detektoren und der
Kompensation vertraut machen. Simuliert wird ein FACS mit 3 Farben (FL1 = FITC,
FL2 = PE, FL3 = PerCP/Cy5.5). Als Proben werden zum Einstellen der Kompensation
verschieden markierte Beads simuliert, sowie eine lysierte Vollblutprobe und eine Ficoll
gereinigte Blutprobe lysiert. Diese Proben werden Sie später im Praktikum auch selber
herstellen und am echten Gerät messen.
a. In PLUSonline können Sie unter interaktive Beispiele/Experimente einen
FACS Simulator herunterladen. Speichern Sie das Verzeichnis „FACS
Simulator“ auf Ihren Laptop und starten Sie das Programm durch
anklicken der Datei „FACS_Simulator.html“. Es ist keine Installation
erforderlich.
b. Arbeiten Sie die Übungsbeispiele Schritt für Schritt durch. Die Tutoren
werden Ihnen dabei helfen.
c. Zeigen Sie die Ergebnisse jeder Aufgabe dem Tutor.
2. Lymphozytenpräperation
Sie sollen mittels einer isopyknischen Dichtegradientenzentrifugation die Lymphozyten
aus einer Milzzellsuspension reinigen. Dazu erhalten Sie von den Tutoren 300µl
Milzzellsuspension.
a. In ein 1.5ml Eppi werden 500µl Ficoll vorgelegt
b. Ficoll vorsichtig mit 500µl Milzzellsuspension überschichten
c. Anschließend werden die Proben 25min bei 2200rpm (1000g) in einem
Ausschwingrotor zentrifugiert
i.
Aufgrund ihrer höheren Dichte sammeln sich die Erythrozyten
und Granulozyten am Boden des Eppis
ii. Die Lymphozyten, Monozyten und NK-Zellen sammeln sich in
einer milchig trüben Interphase an
d. Interphase mit der Pipette aufsaugen und in ein 1.5ml Eppi transferieren
i.
Es macht nichts, wenn Sie von der oberen wässrigen Phase etwas
mit abheben. Vermeiden Sie aber, die unter Ficoll Phase
mitzunehmen!
e. Probe mit 1ml FACS-Buffer (PBS, 0.5% FCS, 2mM EDTA) auffüllen
(waschen)
f. 5min bei 2000rpm (300g) in Eppizentrifuge zentrifugieren
i.
Markieren Sie, welche Seite des Eppis nach außen zeigt (oder
besser: stellen Sie das Eppi so in die Zentrifuge, dass das
„Scharnier“ nach außen zeigt). Die Zellen kleben nach der
Zentrifugation im Festwinkelrotor auf der Seite des Eppis
und sind nicht unbedingt in einem Pellet am Boden.
g. Waschen 1 x wiederholen
h. Probe mit FACS-Buffer auf 200µl auffüllen und auf Eis stellen
3. Färbung für die Flow Cytometrie
Teil A)
Sie erhalten von den Tutoren 50µl heparinisiertes (verhindert die Blutgerinnung) Maus
Vollblut. Das Verhältnis der im Vollblut enthaltenen enthaltenen B- bzw. T-Zellen soll
mittels Flow-Cytometry bestimmt werden. Außerdem sollen die Subtypen der T-Zellen
bestimmt werden (CD4 = T-Helferzellen; CD8 = cytotoxische T-Zellen). Dazu werden
die entsprechenden CD Antigene mit fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern
markiert (CD3 = alle T-Zellen; CD19 = alle B-Zellen). Vor der Analyse müssen noch die
Erythrozyten durch Lyse mittels eines hypotonen Puffers (FACS-Lyse) entfernt werden.
Um exakte Werte zu erhalten wird zusätzlich mit einem Marker für alle weißen
Blutkörperchen (CD45) gefärbt. So kann der prozentuelle Anteil der Einzelnen
Zellklassen an der Gesamtmenge der Leukozyten bestimmt werden
a. Sie erhalten von den Tutoren in FACS-Buffer vorverdünnte Antikörper:
i.
anti-CD3-FITC + anti-CD19-PE + anti-CD45-PerCp-Cy5.5
jeweils 1:50 verdünnt
ii. anti-CD4-FITC + anti-CD8-PE + anti-CD45-PerCp-Cy5.5
jeweils 1:50 verdünnt
b. Blutprobe resuspendieren und auf 2 x 20µl in frische Eppis aufteilen
c. Eine Probe mit 20µl CD3/CD19/CD45 Färbemix mischen, die andere mit
20µl CD4/CD8/CD45 mix. ( Endkonzentration der Antikörper 1:50)
d. Proben 15min auf Eis inkubieren
e. Röhrchen mit 1ml FACS-Buffer auffüllen (waschen)
f. 5min bei 2000rpm (300g) in Eppizentzrifuge zentrifugieren
g. Überstand vorsichtig abheben und Pellet in 200µl FACS-Lyse
resuspendieren. Das Pellet muss völlig gelöst sein, es dürfen keine Reste
an der Eppiwand kleben!
i.
FACS-Lyse ist eine hypotone Salzlösung. Dadurch nehmen die
Zellen Wasser auf und die Erythrozyten platzen auf. Die
Leukozyten schwellen auch an, zerplatzen aber nicht.
h. 10min bei RT inkubieren. Erythrozyten lysieren, und die Probe wird klar.
i. Röhrchen mit 1ml FACS-Buffer auffüllen (waschen)
j. 5min bei 2000rpm (300g) in Eppizentzrifuge zentrifugieren
k. Überstand vorsichtig abheben und Pellet in 200µl FB resuspendieren
l. Probe auf Eis stellen
m. Auswertung am Flow-Cytometer:
i.
Die Kompensationseinstellungen am Gerät sind bereits richtig
voreingestellt.
ii. Nehmen Sie einen USB-Stick mit. Sie erhalten ihre Daten und
können sie selber mit der WinMDI Software auswerten
(Punkt 4).
Teil B)
Die in Punkt 2 gereinigten Leukozyten werden wie in Punkt 3A analysiert.
a. Sie erhalten von den Tutoren in FACS-Buffer vorverdünnte Antikörper:
i. anti-CD3-FITC + anti-CD19-PE + anti-CD45-PerCp-Cy5.5 jeweils
1:50 verdünnt
ii. anti-CD4-FITC + anti-CD8-PE + anti-CD45-PerCp-Cy5.5 jeweils
1:50 verdünnt
b. Probe resuspendieren und auf 2 x 20µl in frische Eppis aufteilen
c. Eine Probe mit 20µl CD3/CD19 Färbemix mischen, die andere mit 20µl
CD4/CD8 mix. ( Endkonzentration der Antikörper 1:50)
d. Proben 15min auf Eis inkubieren
e. Röhrchen mit 1ml FACS-Buffer auffüllen (waschen)
f. 5min bei 2000rpm (300g) in Eppizentrifuge zentrifugieren
g. Überstand vorsichtig abheben und Pellet in 200µl FB resuspendieren
h. Probe auf Eis stellen
i. Auswertung am Flow-Cytometer:
i. Die Kompensationseinstellungen am Gerät sind bereits richtig
voreingestellt.
ii. Nehmen Sie einen USB-Stick mit. Sie erhalten ihre Daten und
können sie selber mit der WinMDI Software auswerten (Punkt
4).
4. Auswertung mittels WinMDI
Mittels der Freeware Software WinMDI können Sie Ihre Daten selber auswerten. Machen
Sie sich mit der Software vertraut. Die Tutoren helfen Ihnen dabei.
a. In PLUSonline können Sie unter interaktive Beispiele/Experimente die
WinMDI Software herunterladen. Speichern Sie das Verzeichnis
„WinMDI 2.9“ auf Ihren Laptop und starten Sie „SETUP.exe“ um die
Software zu installieren.
i.
Die Software läuft NICHT auf 64-bit Betriebssystemen
b. Im Verzeichnis „Demofiles“ finden Sie Beispieldateien mit den
entsprechenden Proben/Färbungen, so wie Sie sie auch im Praktikum
durchführen.
c. Sie können Ihre Daten als „Dotplot“ (jeder Punkte ist ein „Event“, bzw.
eine Zelle), oder als „Density“ bzw. „Contour“ Plot anzeigen lassen (die
Verteilung der Zellen wird farblich, bzw. durch „Höhenlinien“
dargestellt).
d. Die wichtigsten Funktionen:
i.
Mit der rechten Maustaste auf einen Plot klicken: Untermenü
erscheint.
ii. Unter „Regions“ können Sie verschiedene Regionen definierten.
iii. Unter „Quadrant“ können Sie den Plot in 4 Regionen
(Quadranten) aufteilen.
iv.
Unter Gate, können Sie auswählen, dass nur Zellen dargestellt
werden, die innerhalb einer bestimmten Region liegen.
v.
Unter Stats wird angezeigt, wieviele Events (Zellen) in der
jeweiligen Region, bzw. im jeweiligen Quadranten liegen.
e. So werten Sie z.B. eine CD4/CD8 Färbung aus:
i.
Öffnen sie das File als Dotplot und stellen Sie FSC auf der XAchse und SSC auf der Y-Achse dar (beides linear)
ii. Öffnen Sie das File ein zweites Mal als Dotplot und stellen Sie
auf der X-Achse FL1 (CD4-FITC) und auf der Y-Achse FL2
(CD8-PE) dar (beides logaritmisch).
iii. Zeichnen Sie im FSC/SSC Plot eine Region R1 um die
Lymphozyten.
iv.
Aktivieren Sie im FL1/FL2 Plot die Region R1 als Gate. D.h.
dass nur die Zellen die im FSC/SSC Plot innerhalb von Region
R1 liegen (die Lymphozyten) im FL1/FL2 Plot dargestellt
werden.
Das Ergebnis sollte ungefähr wie folgt aussehen:
Side Scatter
Granularität der Zellen
Eosinophile
Granulozyten
Neutrophile
Granulozyten
Debris – Bruchstücke
toter Zellen, Reste von
Erythrocyten, „Dreck“
Monozyten
Gate auf
Lymphozyten
Lymphozyten
(B- und T-Zellen)
Forward Scatter
Größe der Zellen
Die Zellen im Lymphozytengate, werden dann weiter analysiert. In diesem Beispiel
auf CD4 und CD8:
CD8 positive Zellen
(Cytotoxische T Zellen)
Extrathymische
CD4+CD8+ Zellen
CD4/CD8 negative
Zellen aus dem
Lymphozytengate
(müssen daher BZellen sein)
CD4 positive Zellen
(Helferzellen)
Auswertung Ihrer Daten:
Ein noch besseres Ergebnis erhalten Sie, wenn Sie vorher noch auf die gesamt
Leukozyten gaten. So vermeiden Sie, dass Kontaminationen wie Zellreste, verbliebene
Erythrozyten, etc. in die Auswertung mit einfließen.
Ermitteln sie folgende Daten aus Ihren Proben, bzw. aus den Demoproben.
1) Vollblutprobe
Anteil der folgenden Zellpopulationen an den gesamten Leukozyten:
Demoprobe
Eigene Probe
Lymphozyten
Neutrophile
Monozyten
Anteil der T- bzw. B-Zellen an den Lymphozyten:
Demoprobe
Eigene Probe
T-Zellen
B-Zellen
Anteil der CD4+ bzw. CD8+ T-Zellen an den Lymphozyten:
Demoprobe
Eigene Probe
CD4+ T-Zellen
CD8+ T-Zellen
1) Ficoll gereinigte Milzzell Probe
Anteil der folgenden Zellpopulationen an den gesamten Leukozyten:
Demoprobe
Eigene Probe
Lymphozyten
Neutrophile
Monozyten
Anteil der T- bzw. B-Zellen an den Lymphozyten:
Demoprobe
Eigene Probe
T-Zellen
B-Zellen
Anteil der CD4+ bzw. CD8+ T-Zellen an den Lymphozyten:
Demoprobe
CD4+ T-Zellen
CD8+ T-Zellen
Eigene Probe