Charakterisierung der zellulären Immunantwort gegen die Hepatitis

Aus der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik
Abteilung Innere Medizin II
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Charakterisierung der zellulären Immunantwort gegen die
Hepatitis-Delta-Antigene nach DNA-Immunisierung in der Maus
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Vorgelegt 2003
von Christian Mauch
geboren in Saarbrücken
Dekan: Prof. Dr. med. M. Schumacher
Erster Gutachter: PD Dr. M. Geißler
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. med. H. Pircher
Jahr der Promotion: 2003
Danksagung
Zuerst möchte ich mich an dieser Stelle bei meinem Doktorvater Herrn PD Dr. M. Geißler
für die Überlassung des Themas und seine ausgezeichnete intensive praktische und
theoretische Betreuung der Arbeit bedanken.
Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. H. Blum danke ich für die herausragenden Arbeitsbedingungen in
seiner Abteilung.
Mein besonderer Dank gilt meinem Kommilitonen und Freund Stephan Meckel sowie den
Doktoranden aus dem Labor B3 Christian Grimm und Tim Krohne.
Darüber hinaus danke ich allen übrigen Mitarbeitern des B3-Labors in der Medizinischen
Universitätsklinik Freiburg, namentlich Sabine Bleul und Frau Dr. D. Ortmann, herzlich
für die Unterstützung bei meiner Arbeit und die vielen anregenden Diskussionen.
.
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung
1
1.1
Das Hepatitis-D-Virus
1
1.1.1 Allgemeines
1
1.1.2 Molekularbiologie des Hepatitis-D-Virus
1
1.1.2.1 Struktur des Hepatitis-D-Virus
1
1.1.2.2 Genom
2
1.1.2.3 Transkription und Replikation
3
1.1.2.4 Die Delta-Antigene
4
1.1.3 Epidemiologie und Übertragung
5
1.1.4 Klinik und Pathogenese
7
1.1.5 Immunmechanismen und Therapie
9
1.2
10
Die DNA-Immunisierung
1.2.1 Einführung
10
1.2.2 Durch DNA-Immunisierung induzierte Immunantworten
13
1.2.3 Immunmodulatorische Faktoren
17
1.3
1.2.3.1 CpG-Motive und immunstimulatorische Sequenzen
18
1.2.3.2 Lokalisation des kodierten Antigens
19
1.2.3.3 Immunisierungsprotokolle
19
1.2.3.4 Zytokine
20
1.2.3.5 Kostimulatorische Moleküle
22
Aufgabenstellung
24
2.
Material und Methoden
25
2.1
Molekularbiologische Methoden
25
2.1.1 Elektrophoretische Auftrennung von DNA auf Agarosegelen
25
2.1.2 Polymerase-Kettenreaktion
26
2.1.2.1 Prinzip der PCR
26
2.1.2.2 Durchführung der PCR
27
2.1.3 Restriktionsverdau von doppelsträngiger DNA
29
2.1.4 Isolierung und Aufreinigung des PCR-Produktes (Gelextraktion)
30
2.1.5 Transformation von Bakterien
31
2.1.6 Vermehrung der Plasmid-DNA in flüssigen Medien
32
2.1.7 Plasmid-Isolierung und -Aufreinigung
32
2.1.8 Glycerolstock
33
2.1.9 Zellkultur
33
2.1.9.1 G8-Zellen
33
2.1.9.2 LMH-Zellen
33
2.1.9.3 Huh7-Zellen
34
2.1.9.4 P815-Zellen
34
2.1.10 Einfrieren von Zellen
35
2.1.11 Transiente Transfektion von Zellen
35
2.2
36
Expressionsexperimente
2.2.1 Proteinanalyse im Western Immunoblot
36
2.2.1.1 Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
36
2.2.1.2 Vorbereitung der SDS-Polyacrylamidgele
37
2.2.1.3 Durchführung der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
38
2.2.1.4 Transfer der Proteine vom SDS-Polyacrylamidgel auf
Nitrozellulose-Membranen und immunologische Detektion
der Proteine (Western Blot)
38
2.2.2 Immunfluoreszenz
39
2.2.3 Nachweis von Delta-Protein im Zellkulturüberstand
40
2.3
DNA-Expressionskonstrukte
41
2.3.1 Die DNA-Expressionskonstrukte pSS32 und pSS33
41
2.3.2 Die DNA-Expressionskonstrukte pSec32 und pSec33
41
2.3.3 Zytokinexpressionsvektoren
45
2.3.3.1 pApIL-12p70
45
2.3.3.2 pCl-1sIL-18
45
2.3.3.3 pRJB-GM
45
2.3.3.4 Expressionsstudien mit den Zytokin-Expressionsvektoren
46
DNA-Immunisierung von Mäusen
46
2.4
2.4.1 Intramuskuläre DNA-Immunisierung
47
2.4.2 Intradermale Applikation der Plasmid-DNA mittels Genkanone
47
2.4.3 Studienzeitplan der DNA-Immunisierung
49
2.5
2.4.3.1 Durchgang A
49
2.4.3.2 Durchgang B
50
Charakterisierung der Hepatitis-D-Antigen spezifischen Immunantwort
51
2.5.1 Narkose der Mäuse, Blutentnahme und Separation des Serums
51
2.5.2 Experimente zur Messung der Maus-T-Lymphozyten Funktionen
51
2.5.2.1 Präparation der Milz und Gewinnung der Effektorzellen für die
immunologischen Assays
52
2.5.2.2 Der T-Zellproliferationsassay
52
2.5.2.3 Der Zytotoxizitätsassay
53
2.5.2.3.1 In vitro Stimulation der zytotoxischen T-Lymphozyten
2.5.2.3.2
51
Cr-Release-Experiment zur Messung der CTL-Aktivität
53
54
2.5.3 Bestimmung von anti-Delta Antikörper im Serum immunisierter Mäuse
55
2.6
56
Etablierung eines syngenen murinen Tumormodells
2.6.1 Subkutane Tumorzellimplantation
56
2.6.2 Studienzeitplan
57
3.
Ergebnisse
59
3.1
In vitro Ergebnisse
59
3.1.1 Präparation der Plasmide pSS32 und pSS33
59
3.1.2
Charakterisierung der Expression des Delta-Antigens durch pSS32 und pSS33
60
3.1.3
Klonierung der Expressionsvektoren pSec32 und pSec33
64
3.1.4 Expressionsstudie mit den Plasmiden pSec32 und pSec33
66
3.1.5 Expression des Delta-Antigens in stabil transfizierten P815-Zellen
68
3.1.6 Expressionsstudien der Zytokin-Expressionsvektoren
69
3.2
69
In vivo Ergebnisse
3.2.1 DNA-Immunisierung
69
3.2.2 Humorale Immunantwort auf HDV Delta Proteine
70
3.2.3 Die T-Zellproliferationsantwort
71
3.2.4 HDV spezifische CTL-Antworten
71
3.2.5 Tumormodell
73
3.2.5.1 Tumorwachstum und Überlebensrate
74
3.2.5.2 Delta-Antigen-spezifische CTL-Aktivität der Tumormäuse
76
3.2.5.3 T-Zellproliferationsantwort der Tumormäuse
77
4.
Diskussion
78
5.
Zusammenfassung
94
6.
Literaturverzeichnis
95
1
1 Einleitung
1.1 Das Hepatitis-D-Virus
1.1.1 Allgemeines
Das Hepatitis-D-Virus (HDV) wurde 1977 von Mario Rizzetto in Patienten mit einer
chronischen Hepatitis-B-Virus-Infektion entdeckt. Anfangs hielt man es für ein neues
Antigen des Hepatitis-B-Virus (HBV) und bezeichnete es als Delta-Antigen. Später jedoch
stellte sich heraus, dass es sich um einen eigenständigen Erreger mit einem
einzelsträngigen RNA-Genom handelt, welcher für das Delta-Antigen kodiert. Man
ordnete dieses Virus als bisher einzigen bekannten Vertreter in das Genus Deltavirus ein.
Eine Infektion mit dem Hepatitis-D-Virus erfolgt nur zusammen mit einer akuten HBVInfektion (Koinfektion) oder in Patienten, die bereits eine chronische HBV-Infektion
entwickelt haben (Superinfektion) (201). HDV ist also nur in Kooperation mit dem
Hepatitis-B-Virus infektiös und benötigt für die Bildung infektiöser Nachkommenviren
bestimmte HBV-Strukturproteine dieses Erregers. Dabei wirkt das HBV als Helfervirus,
indem es die Oberflächenantigene (HBsAg) und die Membranhülle zur Verfügung stellt,
die dem HDV den Eintritt in die Zellen ermöglichen.
1.1.2 Molekularbiologie des Hepatitis-D-Virus
1.1.2.1 Struktur des Hepatitis-D-Virus
Das Hepatitis-D-Virus besitzt einen sphärischen Aufbau mit einem Durchmesser von 35
bis 41 nm. Die Partikel bestehen aus den Membranproteinen des HBV (kleines, mittleres
und großes HBs-Antigen), die zusammen mit zellulären Lipiden die Hüllmembran bilden
(12). Diese umschliesst das einzelsträngige, zirkuläre RNA-Genom des HDV, das mit dem
2
Hepatitis-Delta-Antigen zu einer Kernstruktur innerhalb des Virions komplexiert ist (187).
Das Hepatitis-Delta-Antigen, welches in einer kleinen (24 kD) und einer großen Form (27
kD) vorkommt, ist das einzige Genprodukt des Hepatitis-D-Virus.
Abb. 1-1 Schematische Darstellung des HDV. Das zirkuläre RNA-Genom und die Delta-Antigene bilden
die Kernstruktur. Die Hüllmembran wird durch die Membranproteine des HBV und zelluläre Lipide gebildet.
1.1.2.2 Genom
Das Genom ist eine zirkuläre, einzelsträngige RNA in negativer Orientierung und umfasst
je nach Isolat zwischen 1672 und 1683 Nukleotiden. Etwa 70 Prozent der RNA liegen in
intramolekularer Basenpaarung vor (30), was dem Genom eine hohe Stabilität verleiht. Die
Sequenz des Genoms ist hochvariabel; bei Isolaten aus unterschiedlichen geographischen
Regionen findet man Sequenzunterschiede von bis zu 21 Prozent. Drei unterschiedliche
Genotypen des Hepatitis-D-Virus mit unterschiedlicher geographischer Verteilung konnten
identifiziert werden.
In infizierten Zellen findet man außerdem eine zum Genom komplementäre RNA, welche
das Antigenom darstellt. Eine Besonderheit im HDV-Genom besteht darin, dass sowohl
Genom als auch Antigenom Sequenzfolgen besitzen, welche als Ribozyme mit
autokatalytischen Schneide- und Ligationseigenschaften wirken, was für die Replikation
des Virus von Bedeutung ist (siehe unten).
3
1.1.2.3 Transkription und Replikation
Da die Oberflächenkomponenten des Hepatitis-D-Virus identisch mit denen des HepatitisB-Virus sind, verwendet das HDV für die Infektion einer Zelle die gleichen Wege wie das
HBV. Dabei erfolgt die Anheftung des Virions an die Zelloberfläche über die Bindung der
prä-S1 Domäne des großen HBsAg an einen noch nicht identifizierten zellulären Rezeptor.
Das Genom gelangt im weiteren Verlauf in den Zellkern. Hier erfolgt zunächst durch die
RNA-Polymerase II die Transkription einer etwa 800 Basen langen mRNA, die für das
kleine Delta-Antigen kodiert. Wie später ausführlicher beschrieben, entsteht durch eine
spezifische posttranskriptionale RNA-Editierung im weiteren Verlauf eine zweite mRNA,
welche für das große Delta-Antigen kodiert.
Bei der Replikation wird zunächst das Genom durch die zelluläre DNA-abhängige RNAPolymerase II in ein komplementäres Antigenom überschrieben. Dies erfolgt unter
Umgehung der RNA-abhängigen RNA-Replikation in einem Prozess, der dem "rolling
circle"-Mechanismus ähnelt, wie man ihn bei der Vermehrung der Herpesvirus-DNA
während des lytischen Replikationszyklus findet. Dabei entstehen Konkatemere, die
vielfache Einheiten der Antigenome umfassen. Durch die Ribozyme, dessen Aktivität
durch die Hepatitis-Delta-Antigene verstärkt wird (97), werden diese an einer bestimmten
Sequenz geschnitten und anschließend wieder ligiert, so dass das zirkuläre komplementäre
Antigenom entsteht (119,195,196). Hierin ähnelt das Genom der Hepatitis-D-Viren den
pflanzenpathogenen Viroiden, die ebenfalls über eine autokatalytische Ribozymaktivität
verfügen. Die Schnittstellen der Endonukleasen befinden sich zwischen den Nukleotiden
685 und 686 des Virusgenoms bzw. 901 und 902 des Antigenoms. Die Endonuklease- und
Ligaseaktivtäten vermutet man in einer Region von etwa 85 Nukleotiden, welche die
Schnittstellen umgeben (154,201,209,231).
In einem Teil der Antigenome wird der Adenosinrest im Stopcodon (UAG) durch die
zelluläre Doppelstrang-RNA-Adenosindesaminase zu einem Inosin desaminiert (168).
Dieser Vorgang der spezifischen RNA-Editierung ist essentiell für die Bildung des großen
Delta-Antigens (24,241). Sowohl die editierten als auch die nicht-editierten Antigenome
werden durch die RNA-Polymerase II in genomische RNA-Stränge überführt, ebenfalls
nach
dem oben
beschriebenen
"rolling-circle"
Mechanismus. Von
den
RNA-
Genomsträngen, die von den editierten Antigenomen gebildet wurden, werden mRNAs
transkribiert, in welchen entsprechend der Nukleotidsubstitution das ursprüngliche
Stopcodon UAG in ein UGG, welches für die Aminosäure Tryptophan kodiert,
4
umgewandelt ist. Auf diese Weise werden 19 weitere Aminosäuren ansynthetisiert und es
entsteht das große Hepatitis-Delta-Antigen.
1.1.2.4 Die Delta-Antigene
In den infizierten Zellen findet man die Proteine ausschließlich im Zellkern (27). Beide
Formen des Hepatitis-Delta-Antigens sind phosphoryliert. Sie haben eine identische
Sequenz und unterscheiden sich nur durch 19 zusätzliche Aminosäuren und einem
Isoprenylationssignal am carboxyterminalen Ende des großen Delta-Antigens (LHDAg)
(75,91). Innerhalb der gemeinsamen Sequenz des kleinen (HDAg) und großen DeltaAntigens konnten verschiedene Domänen identifiziert werden. So liegt zwischen den
Aminosäuren 13 und 48 eine Domäne, die sich in eine "coiled coil"-Struktur faltet und
welche die intermolekulare Bindung zwischen den Monomeren des Delta-Antigens
vereinfacht (124,232). Im Anschluss daran befindet sich zwischen den Aminosäuren 69
und 88 das nukleäre Lokalisationssignal, welches von zwei Untereinheiten gebildet wird
(232). Daran schließen sich zwischen den Aminosäuren 97 und 143 zwei Arginin-reiche
Sequenzen an, die für die RNA-Bindung verantwortlich sind (125,130). Die Fähigkeit der
Delta-Antigene zur RNA-Bindung ist spezifisch für die HDV-RNA, ist aber auch abhängig
von deren "rodlike" Struktur (29); Transfektionsstudien konnten zeigen, dass die DeltaAntigene spezifisch die "rodlike" HDV-RNA erkennen (123). Zwischen den Aminosäuren
145 und 195 befindet sich eine Prolin- und Glycin-reiche Domäne.
Beide Formen des Hepatitis-Delta-Antigens interagieren mit den RNA-Genomen.
Während das kleine Delta-Antigen essentiell für die Genomreplikation ist (118), hemmt
das große Delta-Antigen diesen Prozess (29), wird aber für die Verpackung des RNAGenoms benötigt. Seine Interaktion mit dem HBV-Oberflächenantigen wird durch das
Isoprenylationssignal vermittelt und ist entscheidend für die Bildung von reifen HDVVirionen und von Bedeutung für die Sekretion der HDV-Partikel (91,127,186). LHDAg
bindet sich über die carboxyterminalen Aminosäuren an die verschiedenen HBsAghaltigen Moleküle, die im Verlauf der gleichzeitigen Replikation der Hepatitis-B-Viren in
intrazelluläre Membranen eingelagert werden. Die aus RNA und den Delta-Antigenen
bestehenden Komplexe werden so mit der HBsAg-haltigen Membran umgeben.
5
A
B
C
D
HDAg
N-1
13
48
69
88
97
143 145
195 214-C
LHDAg
A
B
C
D
E
Abb. 1-2 Schematische Darstellung der Aminosäure-Sequenz der Delta-Antigene. Die Sequenz der
beiden Formen des Delta-Antigens unterscheiden sich nur durch 19 zusätzliche Aminosäuren und einem
Isoprenylationssignal am carboxyterminalen Ende des großen Delta-Antigens. A: Dimerisation via coiled
coil B: nukleäres Lokalisationssignal C: RNA-Bindung via 2 Arginin-reiche Motive D: pro/gly-reich
E: 19aa mit Isoprenylationssignal
1.1.3 Epidemiologie und Übertragung
Die Übertragungswege des Hepatitis-D-Virus sind mit denen des Hepatitis-B-Virus
identisch. Dabei erfolgt die Übertragung parenteral; vor allem die Übertragung durch
kontaminiertes Blut spielt ein wichtige Rolle. Ebenso sind Drogenabhängige und Bluter
einem stark erhöhten Risiko ausgesetzt (179); auch die Übertragung durch Sexualverkehr
muss erwähnt werden (22), wobei dieser Übertragungsweg eine geringere Rolle als bei
HIV und HBV zu spielen scheint.
Eine Infektion mit HDV ist überall in der Welt beobachtet und dokumentiert worden; am
häufigsten kommt sie aber in bestimmten Regionen vor, so im Mittelmeerraum, im
Mittleren Osten, in West Afrika und in der Gegend des Amazonas (169,177,178).
Wie bereits erwähnt, existieren drei unterschiedliche Genotypen des HDV mit
unterschiedlicher geographischer Verteilung. Der Genotyp I überwiegt in den USA, in
Europa und im Mittleren Osten (25,153); der Genotyp II konnte in Japan und Taiwan
isoliert werden (92,230), und der Genotyp III konnte nur im nördlichen Südamerika isoliert
werden (84). Es scheint ein Zusammenhang zwischen dem HDV Genotyp und der Schwere
6
der Erkrankung und der Infektion zu bestehen (25,230). Es wird geschätzt, dass weltweit
mindestens 15 Millionen Menschen mit HDV infiziert sind.
Abb. 1-3 Weltweite Verteilung der HDV-Infektion, gemessen an der Prävalenz von HBsAg-positiven antiHDAg Trägern mit akuter oder chronischer Hepatitis.
Der wichtigste Faktor, der die Ausbreitung von HDV beeinflusst, ist die Rate der HBVInfektionen in einer Population. Allerdings ist die Relation zwischen der Prävalenz von
HBV und HDV nicht linear, die Prävalenz von HDV ist also nicht nur einfach das
Spiegelbild der korrespondierenden HBV-Prävalenz. So kommt beispielsweise eine HDVInfektion häufig in den tropischen Regionen von Afrika und Südamerika vor, in denen
HBV hyperendemisch ist (83,161), doch ist seine Prävalenz in Fernost und unter den
Eskimos Alaskas in der Regel trotz hoher lokaler Prävalenzen von HBV gering (159).
Deutliche Unterschiede werden auch in Regionen mit ähnlichen HBV-Raten beobachtet,
wie beispielsweise im Mittelmeerraum und in Japan; so lag in den achtziger Jahren in
Griechenland und Italien eine HDV-Infektion in 20% bis 30% von chronischen HBsAgpositiven Hepatitis Fällen vor (158,189), während es bei japanischen HBsAg Trägern mit
ähnlichen klinischen Charakteristika weniger als 3% waren (92). Zwar ist bis heute nicht
genau bekannt, von welchen Faktoren eine Ausbreitung von HDV abhängt, doch könnte
der HDV-Genotyp eine Rolle spielen. Auch Umweltfaktoren, die HDV-Empfänglichkeit
und das Zusammenspiel von HBV und HDV bei unterschiedlichen Genotypen werden als
7
mögliche Faktoren, welche die Ausbreitung von HDV beeinflussen, genannt (203).
Kürzliche Studien konnten zeigen, dass die HDV-Inzidenz in Italien zurückgeht (64).
1.1.4 Klinik und Pathogenese
Der klinische Verlauf einer Typ D Hepatitis ist variabel, aber häufig schwerwiegender als
bei
anderen
viralen
Hepatitiden.
Die
Manifestationsformen
variieren
von
asymptomatischen Verläufen bis hin zu fulminanten HBsAg-positiven Hepatitiden und der
Entwicklung einer Leberzirrhose. Nach einer Inkubationsperiode von 3 bis 7 Wochen
beginnt die Erkrankung mit unspezifischen Symptomen, gefolgt nach 3 bis 7 Tagen von
der ikterischen Phase mit den Symptomen, wie man sie auch bei anderen viralen
Hepatitiden vorfindet. Allerdings äußert sich die Erkrankung bei einer HDV-Infektion
zehnmal häufiger als bei den anderen viralen Hepatitiden mit den Symptomen einer
fulminanten Hepatitis, charakterisiert durch eine hepatische Enzephalopathie. Dies gilt vor
allem für die Superinfektion mit HDV; Koinfektionen von HBV und HDV sind in der
Regel akut, aber selbstlimitierend. Die Mortalität einer fulminanten Hepatitis liegt bei
80%.
Bei einer Typ D Hepatitis kommt es im Vergleich zu anderen viralen Hepatitiden häufiger
zu einem chronischen Verlauf. Während dreiviertel aller mit dem HDV überinfizierten
Patienten eine chronische Hepatitis entwickeln, beträgt diese Rate bei einer Koinfektion
weniger als fünf Prozent (140). Eine Besonderheit hierbei ist, dass der chronischen Typ D
Hepatitis in der Regel eine klinisch apparente akute Infektion vorausgeht. Etwa 60% bis
70% der Patienten mit einer chronischen Typ D Hepatitis entwickeln im weiteren Verlauf
eine Leberzirrhose (180), also dreimal häufiger als bei einer Typ B oder Typ C Hepatitis.
Auch das Risiko, ein hepatozelluläres Karzinom zu entwickeln, ist für Patienten, die
sowohl mit HBV als auch mit HDV infiziert sind, deutlich erhöht. Allerdings ist es
wahrscheinlicher, dass der Grund hierfür die häufiger auftretende Zirrhose, ein bekannter
Risikofaktor für die Entwicklung eines hepatozellulären Karzinom, ist, und nicht eine
mögliche direkt karzinogene Wirkung des HDV (9). Auch die Mortalitätsrate einer HDVInfektion ist mit 2% bis 20% zehnmal höher als bei einer reinen HBV-Infektion.
Nicht nur die Symptome, sondern auch die histologischen Veränderungen, die man bei
einer HDV-Infektion beobachtet, ähneln denen anderer viraler Hepatitiden; das
8
Vorkommen von Riesenkernen und die hohe Zahl an zweikernigen Hepatozyten scheinen
die einzigen Charakteristika einer Hepatitis-D-Infektion zu sein (150).
Es ist nicht ganz klar, ob die Zellen durch immunpathologische Mechanismen oder
vielleicht doch durch die Virusinfektion selbst geschädigt werden. Für einen direkten
zytopathischen Effekt der Hepatitis-D-Viren spricht unter anderem die Tatsache, dass die
Höhe der Hepatozyten-spezifischen Enzyme im Blut, als Ausdruck der Leberschädigung,
mit der Spitze der viralen Replikation und der Höhe der Expression des Delta-Antigens
korreliert. Außerdem kommt es während einer Hepatitis-D-Infektion zu morphologischen
Veränderungen in den Zellkernen der Hepatozyten. Welche viralen Komponenten diese
Zellveränderungen induzieren könnten, ist jedoch unklar. Ein direkt zytopathischer Effekt
des kleinen Delta-Antigens in Abwesenheit einer Replikation des HDV-Genoms konnte in
der Zellkultur beobachtet werden. Das kleine Delta-Antigen kann theoretisch mit
zellulären RNAs und Proteinen wechselwirken; so könnte deren Funktion beeinflusst
werden. Allerdings konnten diese Beobachtungen nicht durch Leberbiopsie-Befunde
bestätigt werden (37,150). Auch die Tatsache, dass im HDV-Genom Sequenzen enthalten
sind, die komplementär zur zellulären 7SL RNA sind, einer Komponente des
zytoplasmatischen Signalerkennungspartikels, welches in die Proteinsekretion involviert
ist, unterstützt die These eines direkt zytopathischen Effekts des HDV auf die Zelle: eine
Interaktion zwischen dem HDV-Genom und der 7SL RNA könnte zu einer Dysfunktion
letzterer
führen
und
damit
eine
Unterbrechung
des
normalen
Proteintranslokationsprozesses und Störung der Synthese zellulärer Membranproteine zur
Folge haben (149). Allerdings konnte auch diese Hypothese durch keine Studie bestätigt
werden.
Gegen einen direkten zytopathologischen Effekt des Hepatitis-D-Virus spricht die
Beobachtung, dass Delta-Antigen transgene Mäuse, die das Protein in der Leber
exprimieren, keine Erkrankung der Leber entwickeln (82). Auch in anderen transgenen
Mausmodellen konnten trotz Nachweis einer HDV-Replikation und Proteinexpression
keine zytopathologischen Veränderungen in den betroffenen Geweben nachgewiesen
werden (166). Des weiteren existieren auch Zelllinien, die das Hepatitis-D-Genom in Form
einer im Zellgenom integrierten cDNA enthalten und ohne erkennbare Veränderungen
kontinuierlich Virus-RNA und Delta-Antigene synthetisieren (31).
Auch die Tatsache, dass die Lebererkrankung bei HBV-Trägern nach einer HDVSuperinfektion, bei Anwesenheit einer deutlichen Infiltration des Lebergewebes mit
9
mononukleären Zellen,
progressiver und schwerer verläuft, lässt vermuten, dass die
Leberschädigung bei einer HDV-Infektion immunpathologisch bedingt ist (111,148). Der
histologische Nachweis von Lymphozyten-Infiltraten in der Leber und das Auftreten einer
humoralen Immunantwort nach einer Infektion mit HDV spricht ebenfalls für eine
immunbedingte Pathogenese.
Ebenso weisen die Beobachtungen, dass die Zellveränderungen in der Leber meist erst
dann auftreten, wenn die Virusreplikation bereits abgeklungen ist und eine Immunantwort
gegen das Hepatitis-Delta-Antigen nachweisbar ist, auf eine Mitbeteiligung des
Immunsystems bei der Schädigung der Hepatozyten hin (78).
1.1.5 Immunmechanismen und Therapie
Es gibt einige Beobachtungen, die darauf hindeuten, dass eine spezifische Immunantwort
eine wichtige Rolle nicht nur in der Pathogenese der Lebererkrankung, sondern auch beim
Schutz gegen eine HDV-Infektion spielt. So konnte an Schimpansen gezeigt werden, dass
eine HDV-Reinfektion von HBV-Trägern nach Erholung einer abgelaufenen HDVInfektion durch eine signifikant reduzierte HDV-Replikation charakterisiert war (151).
Dies lässt vermuten, dass der erste Kontakt mit diesem Virus zu einer partiellen Immunität
führt, die in der Lage ist, die virale Aktivität zu kontrollieren. Allerdings konnte, obwohl
im Blut von Patienten regelmäßig Antikörper gegen das Delta-Antigen nachweisbar sind,
keine einzige Studie einen protektiven Effekt dieser Antikörper nachweisen. Sie sind weder
virusneutralisierend, noch schützen sie vor einer Reinfektion, da das Delta-Antigen nicht
an der Oberfläche der Viruspartikel exponiert ist. Dagegen kann aus ihrem Profil
diagnostische Information gewonnen werden: so verschwinden bei Patienten mit einer
selbst-limitierenden Infektion die Immunglobulin M Antikörper gegen das Delta-Antigen
(IgM anti-HD) sehr rasch, während sie bei Patienten, deren Infektion progressiv und
chronisch verläuft, über diese Zeit persistieren (2,202). Transversale Studien haben
gezeigt, dass in HBsAg-Trägern mit einer chronischen Typ D Hepatitis durch den
Nachweis von IgM anti-HD diejenigen mit einer aktiven HDV-Infektion von solchen mit
einer inaktiven HDV-Infektion unterschieden werden können (52,55).
Hinweise dafür, dass T-Zellen eine entscheidende protektive Rolle bei einer Infektion mit
HDV spielen, konnten sowohl in Tiermodellen als auch in Beobachtungen am Menschen
gewonnen werden. Es konnte gezeigt werden, dass mit dem Woodchuck Hepatits Virus
10
(WHV) infizierte Woodchucks, in Abwesenheit jeglicher detektierbarer humoraler
Immunantwort, zumindest partiell vor einer nachfolgenden Infektion mit HDV geschützt
waren, wenn sie mit dem kleinen Hepatitis-Delta-Antigen, exprimiert durch rekombinante
Vacciniaviren, immunisiert waren (105). Auf eine wichtige Rolle der T-Zellen bei der
Kontrolle einer HDV-Infektion deutet außerdem die Beobachtung hin, dass in HIVinfizierten Patienten, die eine reduzierte Anzahl an zirkulierenden CD4+ T-Zellen
aufweisen, eine HDV Virämie deutlich verstärkt ist (182).
Es existiert zur Zeit keine antivirale Therapie gegen das Hepatitis-D-Virus. Die
Behandlung der Patienten mit immunsuppressiv wirkenden Therapeutika hat keinen
Einfluss auf den Krankheitsverlauf. So waren Therapien mit Steroiden, Thymosin,
Levamisol und Ribavarin erfolglos (4,20,65,180).
1.2 Die DNA-Immunisierung
1.2.1 Einführung
Die DNA-Immunisierung, auch bekannt als genetische oder Polynukleotid-Immunisierung,
stellt einen neuen Ansatz in der Entwicklung von Vakzinen dar.
Schon seit 1990 ist bekannt, dass die Injektion von unverpackter nackter Plasmid-DNA,
welches das Gen für ein bestimmtes Protein enthält, in den Muskel einer Maus zu einer
Genexpression des durch das Plasmid kodierten Proteins in vivo führt (228). Es dauerte
jedoch bis 1992/93, bis die ersten Studien die Bedeutung dieses Ansatzes in der
Entwicklung von Vakzinen und Immuntherapeutika aufzeigten.
Das Prinzip der DNA-Immunisierung beruht auf der Injektion von gereinigter nackter
DNA eines nicht replikationsfähigen Expressionsplasmids, das Protein-kodierende
Sequenzen und notwendige regulatorische Elemente für deren Expression enthält. Die
applizierte DNA wird von den Wirtszellen aufgenommen, und das Gen, welches für ein
11
bestimmtes Antigen kodiert, wird intrazellulär exprimiert. Das endogen produzierte Protein
kann so in die zytosolische Prozessierung eingeschleust werden und dem Immunsystem
adäquat präsentiert werden und eine spezifische Immunantwort induzieren. Durch die
endogene Synthese und zytosolische Prozessierung ist eine Präsentation der generierten
Peptide im Kontext von MHC-Klasse I Molekülen möglich, was für eine Aktivierung von
CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten über den T-Zellrezeptor notwendig ist. Je nach
Proteintyp kann das Protein aber auch konformationell intakt von der Zelle sezerniert
werden.
Diese
extrazellulär
freigelassenen Antigene
induzieren
eine
humorale
Immunantwort, wie auch eine T-Helferzellantwort über eine MHC-Klasse II restringierte
Antigen-Präsentation durch Antigen-präsentierende Zellen (APC), die das Fremdantigen
aufgenommen haben.
Abb. 1-4 Prinzip der DNA-Immunisierung. Nach Aufnahme der applizierten Plasmid-DNA von
ortsständigen Wirtszellen, wie z.B. Myozyten, Keratinozyten und antigenpräsentierenden Zellen, erfolgt die
intrazelluläre Expression, Prozessierung und MHC-Klasse I/II restringierte Präsentation der Peptide direkt
vor Ort und in regionalen und entfernten Lymphknoten. Je nach Proteintyp kann das Protein auch
konformationell intakt von der Zelle sezerniert werden und über eine MHC-Klasse II restringierte AntigenPräsentation durch APCs, die das Fremdantigen aufgenommen haben, eine T-Helferzellantwort und eine
humorale Immunantwort induzieren. Weiterhin können die sezernierten Antigene von APCs aufgenommen
und MHC I restringierte CD8+ CTL-Antworten induzieren (Cross-Prinzip).
12
Die DNA-Immunisierung bietet die gleichen immunologischen Vorteile wie die
Immunisierung mit lebenden attenuierten Vektoren, jedoch ist die injizierte DNA nicht
replikationsfähig, und somit bleibt das Risiko der unkontrollierten Verbreitung von DNA
durch diese Methode auch in immundefizienten Personen minimal.
Es waren zunächst Tang et al., die 1992 entdeckten, dass durch Injektion von PlasmidDNA eine Antikörperantwort auf das kodierte Protein induziert werden kann (208). Bald
entdeckte man, dass durch diese Immunisierungstechnik eine breite Immunantwort sowohl
auf humoraler als auch auf zellulärer Ebene gegen verschiedene virale, bakterielle und
parasitäre Proteine erreicht werden kann.
So konnte bereits früh demonstriert werden, dass DNA-Impfstoffe humorale und zelluläre
Immunantworten gegen Proteine des Influenzavirus (63,219), des HIV-1 (223) und des
Hepatitis-B-Virus (46) induzieren können.
Im weiteren Verlauf konnte in verschiedenen Tiermodellen eine protektive Immunität
gegen Malaria-Sporozoiten (141), Mykoplasmen (121), Leishmanien (236), gegen das
Virus der lymphozytären Choriomeningitis (LCMV) (137), gegen Influenza- (226), Herpes
simplex- (14,136), Rabies- (235) und Zytomegalieviren (76) sowie gegen Ebola (237)
erzeugt werden.
Der
Vorteil
dieser
Immunisierungstechnik
gegenüber
herkömmlichen
Immunisierungsverfahren mittels rekombinanter Proteine ist die Erzeugung einer
zytotoxischen T-Lymphozyten- und inflammatorischen T-Helferzell-Antwort, welche für
die Eradizierung verschiedenster viraler Infektionen unerläßlich ist.
So wurde nicht nur in verschiedenen Modellen von Infektionskrankheiten die protektive
Wirkung der Vakzinen untersucht, sofern die ausgewählte Tierart permissiv für eine
Infektion mit dem relevanten Erreger war; auch wurde in einigen Studien die DNAImmunisierung in transgenen Modellen und bei persistierenden Infektionen eingesetzt, um
seine
Wirksamkeit
als
therapeutische
Vakzine
bei
chronisch-persistierenden
Virusinfektionen zu testen (134,137,183).
Ein weiterer Vorteil der genetischen Immunisierung besteht darin, dass mit dieser Technik,
im Gegensatz zu Peptidimmunisierungen, wo nur eine begrenzte Anzahl von antigenen
Peptiden zur Verfügung steht, das gesamte antigene Peptidrepertoire eines Proteins,
welches von T-Zellrezeptoren aktivierter Lymphozyten erkannt wird, für die Erzeugung
einer breiten Immunantwort ausgenutzt werden kann. Es konnte gezeigt werden, dass der
Ansatz der DNA-Immunisierung auch gegen Tumorwachstum sowohl in protektivem als
auch therapeutischem Kontext wirksam ist (8,16,73,94).
13
Zur Zeit werden bereits die ersten humanen Studien mit DNA-Immunisierung bei HBV-,
HIV-Infizierten und an Malaria erkrankten Patienten durchgeführt (21,225).
1.2.2 Durch DNA-Immunisierung induzierte Immunantworten
Durch DNA-Immunisierung lässt sich ein breites Spektrum zellulärer und humoraler
Immunreaktivitäten gegen sezernierte, membranständige oder intrazelluläre Antigene
spezifisch induzieren. Vom Aspekt der Antigenpräsentation mit Erzeugung einer MHCrestringierten Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) und T-Helferzellen
(Th-Zellen) scheint diese Immunisierungstechnik zumindest teilweise eine Immunantwort,
die durch eine virale Infektion hervorgerufen wird, zu imitieren.
T-Lymphozyten kommt eine zentrale Bedeutung für die Regulation der Immunantwort und
für die Erkennung und Eliminierung von virusinfizierten oder Tumorzellen aus dem
Organismus zu. Die spezifische Erkennung veränderter Zellen erfolgt über den TZellrezeptor, einem Proteinkomplex, der in der Zytoplasmamembran der T-Lymphozyten
verankert ist. Mit dem T-Zellrezeptor ist der CD3-Proteinkomplex verbunden. Als weitere
Proteine sind mit dem T-Zellrezeptor entweder CD4- oder CD8-Rezeptoren assoziiert. Ihr
Vorhandensein gliedert die T-Lymphozyten in die Untergruppen der CD4-positiven THelferzellen und der CD8-positiven zytotoxischen T-Zellen. Sie vermitteln bei der
spezifischen Fremderkennung die Interaktion der T-Zellen entweder mit MHC-Klasse II
oder mit MHC-Klasse I Antigenen.
Die CD8-positiven CTLs erkennen über ihren T-Zellrezeptor auf MHC-Klasse I Molekülen
geladene Peptide und sind somit in der Lage, die virusinfizierte Zelle zu lysieren.
Einerseits können die CTLs eine Fas-vermittelte Apoptose bei solchen Zielzellen
induzieren (18a,50,103), andererseits geben sie zytotoxische Faktoren, Radikale und
Perforine frei. Letztere oligomerisieren unter dem Einfluss von Ca2+-Ionen und werden in
die Membran der als fremd erkannten Zelle eingelagert, durchsetzen sie mit Poren und
lysieren sie (198). Vorrausetzung für diesen Vorgang ist, dass die entsprechenden TLymphozyten durch Zytokine wie IL-2 und Interferon-γ stimuliert worden sind, die von
Th1-Zellen sezerniert werden. Auch Zytokine, wie IL-1, TNF-α und Interferon-α, die von
Zellen des unspezifischen Immunsystems, zum Beispiel von aktivierten Makrophagen,
abgegeben werden, erhöhen die Aktivität der CTLs. Über sie besteht also eine enge
14
Verbindung der unspezifischen Immunreaktion mit der spezifischen zytotoxischen TZellantwort.
Wie bereits erwähnt, kann genetische Immunisierung zu einer starken MHC-Klasse I
restringierten CTL-Antwort führen. Dabei werden für die effektive Aktivierung von
Antigen-spezifischen CTLs zwei Signale benötigt: hierzu zählt zum einen die Erkennung
der an MHC-Klasse I gebundenen Peptide an der Zelloberfläche durch die Lymphozyten
und zum anderen das Vorhandensein von kostimulatorischen Molekülen, wie CD80/B7.1,
CD86/B7.2 und CD40 (93,96,101). Während nahezu alle Gewebe MHC-Klasse I Moleküle
exprimieren, befinden sich diese kostimulatorischen Moleküle (in der Regel) nur auf
professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APC). In einer Reihe von experimentellen
Systemen wurde gezeigt, dass die Antigen-Präsentation durch nicht-professionelle APCs,
die nicht über diese kostimulatorischen Faktoren verfügen, eher zu einer Toleranz als zu
einem Priming der Immunantwort führt (98,145,171). Aus den genannten Gründen musste
daher die frühere Hypothese, dass nach Transfektion mit Plasmid DNA nichthämatopoetische Zellen wie Myozyten und Keratinozyten in APCs umgewandelt werden
können und über eine kontinuierliche Produktion und Prozessierung von Antigen eine
CD8+ CTL-Antwort induzieren können, verworfen werden.
Vielmehr deutet einiges darauf hin, dass nach DNA-Immunisierung aus dem Knochenmark
stammende professionelle APCs wie Dendritische Zellen oder Makrophagen für die
Induktion einer CTL Antwort verantwortlich sind. Pardoll und Beckerleg (160) haben zwei
Hypothesen aufgestellt, welche die Mechanismen für das Entstehen einer solchen
Immunantwort erklären. Der erste Mechanismus setzt voraus, dass eine kleine Anzahl
dieser professionellen APCs direkt mit der injizierten DNA transfiziert wird. Diese Zellen
wandern dann zu den regionalen Lymphknoten, wo sie CD8+ und CD4+ T-Zellen wie auch
B-Zellen aktivieren können. Professionelle Antigen-präsentierende Zellen in Form von
Langerhans Zellen befinden sich in großen Mengen in der Haut. Tatsächlich konnte gezeigt
werden, dass bei Applikation der DNA mittels Genkanone die dendritischen Zellen direkt
transfiziert werden (40).
Dagegen spricht die relativ geringe Dichte an Dendritischen Zellen und Makrophagen im
Muskel gegen die Theorie, dass nach intramuskulärer DNA-Immunisierung direkt
transfizierte APCs für die Induktion einer CTL-Antwort verantwortlich sind. Allerdings
konnte an Knochenmark-chimerischen Mäusen gezeigt werden, dass auch nach
intramuskulärer DNA-Immunisierung aus dem Knochenmark stammende APCs sowohl für
15
die MHC-Klasse I Präsentation als auch für die Kostimulation verantwortlich sind (42,53).
Die zweite Hypothese besagt nun, dass nach intramuskulärer DNA-Immunisierung
zunächst die Myozyten transfiziert werden und von diesen aus antigenetisches Material zu
professionellen APCs transferiert wird, die den Muskel als Teil einer inflammatorischen
Antwort auf die Immunisierung hin infiltriert haben. Das transferierte Protein wird dann in
den MHC-Klasse I restringierten Prozessierungsweg eingeschleust, wodurch den APCs die
Induktion einer CTL-Antwort ermöglicht wird. Das initiale Priming der Immunantwort
findet demnach also in den drainierenden lymphatischen Geweben durch APCs aus dem
Knochenmark statt. Dies würde gegen das konventionelle Dogma sprechen, dass nur
Peptide von intrazellulär synthetisierten Proteinen auf MHC-Klasse I Molekülen geladen
werden können. Aber auch andere Studien haben gezeigt, dass auch exogen produzierte
Proteine durch APCs aufgenommen, im Kontext mit MHC-Klasse I Molekülen präsentiert
werden können und somit eine MHC-Klasse I restringierte Antwort primen können
(113,176). Außerdem konnte in Experimenten demonstriert werden, dass transfizierte
Myozyten in der Lage sind, Proteine zu APCs zu transferieren (217,218). Der
Mechanismus dieses als "cross-priming" bekannten Immunphänomens ist allerdings
ungeklärt (100) (siehe auch Abb. 1-4).
Durch DNA-Immunisierung kommt es ebenfalls zur Aktivierung von T-Helferzellen, die
Peptide im Kontext mit MHC-Klasse II Molekülen, welche nur auf der Oberfläche von
potentiell antigenpräsentierenden Zellen vorkommen, erkennen. T-Helferzellen werden
nach dem Muster der Zytokine, die sie produzieren, in Th1- und Th2-Zellen unterteilt.
Nach einem ersten Kontakt mit dem Antigen gehen sie aus Th0-Zellen, einem unreifen
Vorstadium der T-Helferzellen, hervor. Dabei spielt das Zytokinmilieu bei der
Differenzierung von naiven T-Helferzellen in einen bestimmten Subtyp eine entscheidende
Rolle: während IL-4 eine Differenzierung in Th2-Zellen induziert (207), besitzt IL-12 eine
wichtige Funktion in der Induktion von Th1-Zellen (132,194). Th2-Zellen produzieren IL4, IL-5, IL-6 und IL-10 und stimulieren die Proliferation und Differenzierung von Prä-BZellen zu antikörperproduzierenden Plasmazellen mit Sekretion von Maus-IgG1Antikörpern (143,162,205) und aktivieren außerdem eosinophile Granulozyten (54). Eine
Aktivierung von Th2-Zellen führt also zu einer vorwiegend humoralen Immunität, bei der
die Elimination des Pathogens aus der Blutbahn im Vordergrund steht. Dagegen fördern
Th1-Zellen durch Produktion der Zytokine IL-2 und Interferon-gamma (IFN-γ) vor allem
16
die Aktivierung weiterer T-Helferzellen sowie diejenige von CD8+ zytotoxischen T-Zellen,
Makrophagen, Natürlichen Killerzellen und die Produktion von Maus-Antikörpern des
IgG2a- und IgG3-Isotyps und führen somit überwiegend zu einer zellvermittelten
Immunität (1,144,162).
Nach DNA-Immunisierung von Mäusen findet man je nach Immunisierungsprotokoll
CD4-positive Zellen sowohl vom Th1- als auch vom Th2-Phänotyp vor. Intramuskuläre
Immunisierung führt überwiegend zu einer Th1-Antwort mit hohen Interferon-γ-Spiegeln
und zu einer erhöhten IgG2a:IgG1-ratio; solch Immunantworten vom Th1-Typ konnten
beispielsweise in DNA-Immunisierungsmodellen mit dem HBV-Oberflächenantigen (227),
dem HIV gp120 (199) und dem Leishmania major gp63 (236) identifiziert werden. Es
konnte auch gezeigt werden, dass der Effekt der DNA-Immunisierung dominant ist: durch
Vorimmunisierung mit Plasmid-DNA konnte nicht nur die durch Protein-Immunisierung
induzierte IgE Antikörper Antwort und die Th2-Zell-Aktivierung unterdrückt werden, auch
wurde
eine
präexistierende
antigenspezifische
IgE-Antwort
reduziert.
Diese
Beobachtungen könnten einen therapeutischen Ansatz bei der Behandlung von allergischen
Erkrankungen darstellen. Tatsächlich konnten in verschiedenen Allergie-Modellen in der
Maus bzw. Ratte gezeigt werden, dass die DNA-Immunisierung eine allergische Antwort
verhindert (89).
Durch die epidermale Applikation von Plasmid-DNA mit der Genkanone kommt es
dagegen zur Aktivierung einer Th2-Immunantwort mit der Erzeugung von überwiegend
IgG1 Antikörpern (59).
Die Gründe für die Erzeugung unterschiedlicher T-Helferzell-Profile durch verschiedene
Immunisierungsmethoden sind nicht geklärt. Möglicherweise spielt die bei DNAImmunisierung eingesetzte DNA-Menge eine Rolle. Bei der Immunisierung mit DNA
beschichteten Goldpartikeln wird im Vergleich zur intramuskulären Immunisierung
weniger als ein Hundertstel der DNA-Menge eingesetzt. Wie weiter unten ausführlich
geschildert, sind im bakteriellen Plasmid-Vektor Th1-induzierende immunstimulatorische
Sequenzen (ISS) enthalten. Die bei der Nadel-Injektion in großen Mengen applizierte DNA
und die damit verbundene hohe Anzahl an ISS könnten ein Grund dafür sein, warum nach
intramuskulärer Immunisierung eine Th1-Antwort induziert wird, während die bei
intradermaler Applikation mit der Genkanone eingesetzten Mengen wahrscheinlich nicht
für eine adäquate Th1-Induktion ausreichen. Diese Hypothese wird durch eine Studie von
Barry and Johnston (6) unterstützt, die zeigen konnten, dass beim Gebrauch von nur
17
wenigen Mikrogramm DNA sowohl bei der intramuskulären Nadel Injektion als auch beim
Einsatz der Genkanone eine Th2-Antwort mit überwiegend IgG1 Antikörpern induziert
wird, während beim Gebrauch von 50µg DNA beide Methoden eine Th1-Antwort mit
IgG2a Antikörpern induziert haben (217). Aber auch andere Faktoren, wie beispielsweise
der Haplotyp des Empfängers oder die Natur des prozessierten Antigens könnten einen
Einfluss auf das T-Helferzell-Profil ausüben.
Die primäre Immunisierungsmethode scheint in manchen Fällen das Profil der THelferzellantwort irreversibel festzulegen, während nachfolgende Immunisierungen mit
einer anderen Methode keine Verschiebung des ursprünglich induzierten Th-Profils
bewirken (59,164,173). Allerdings kann dieses Profil durch die Koadministration von
Genen, die für bestimmte Zytokine kodieren, beeinflusst werden. So konnten Prayaga et al.
(170) demonstrieren, dass das Th-Profil nach epidermaler Immunisierung mit der
Genkanone, welches normalerweise vom Th2-Typ ist, nach Koimmunisierung mit IL-2,
IL-7 oder IL-12 kodierenden Plasmiden einem Th1-Charakter entspricht. Der genaue
Einfluss der Zytokine auf die Immunantwort im Kontext der DNA-Immunisierung wird im
nachfolgenden Kapitel ausführlich dargelegt.
Die durch DNA-Immunisierung induzierte humorale Immunantwort ist im Vergleich zur
Protein-Immunisierung in der Regel niedriger. Wahrscheinlich ist die in vivo produzierte
Menge an Genprodukt (pg ml-1 bis ng ml-1) für eine adäquate optimale B-Zell-Stimulation
zu klein. Trotzdem erscheinen T-Zell-abhängige Antikörper der IgG Klasse nach DNAImmunisierung regelmäßig, und der Serumtiter dieser Antikörper hat die Tendenz, über
Wochen zu steigen (11,70).
1.2.3 Immunmodulatorische Faktoren
Wie bereits geschildert, kann die Immunantwort nach DNA-Immunisierung durch Wahl
einer bestimmten Applikationsmethode oder des Injektionortes moduliert werden. Weitere
wichtige
Faktoren,
die
Einfuß
auf
die
Immunantwort
nehmen,
sind
die
immunstimulatorischen Sequenzen (ISS) im Vektor, die "Form" des kodierten Proteins
oder die Wahl des Immunisierungsprotokolls. Außerdem besteht in der Koadministration
18
von Zytokinen, Chemokinen oder kostimulatorischen Molekülen die Möglichkeit, die
Immunantwort in eine bestimmte Richtung zu beeinflussen oder zu verbessern.
1.2.3.1 CpG-Motive und immunstimulatorische Sequenzen
Ein Aspekt der genetischen Immunisierung, dem erst seit kurzem Aufmerksamkeit
geschenkt wird, ist die immunstimulatorische Aktivität der DNA selbst. Es ist bekannt,
dass bakterielle DNA im Gegensatz zu DNA von Vertebraten eine nicht-spezifische
Immunantwort induzieren kann (114). Man nimmt heute an, dass die Ursache hierfür in der
unterschiedlichen
Anzahl
an
nicht-methylierten
Cytosin-Phosphat-Guanin
(CpG)
Dinukleotiden in den beiden Genomen liegt. Während dieses Dinukleotid in bakterieller
DNA in einer Frequenz von 1:16 vorkommt, liegt die Frequenz in der DNA von
Vertebraten um 10- bis 20fach niedriger, ein Phänomen, welches auch "CpG Suppression"
genannt wird. In Vertebraten enthält ein Großteil dieser Dinukleotide ein methyliertes
Cytosin, während es in Bakterien unmethyliert ist (114). Krieg et al. konnten zeigen, dass
Oligonukleotide, die ein oder mehrere solcher CpG-Dinukleotide enthalten, eine B-ZellProliferation und eine Immunglobulin-Sekretion triggern können (115).
Bakterielle DNA kann ebenfalls Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und über eine
Induktion von inflammatorischen Zytokinen wie Interferone und IL-12 die zelluläre
Immunität stimulieren (114). Die Relevanz dieser Kenntnis für die DNA-Immunisierung
wurde in einer Studie deutlich, die zeigte, dass eine DNA-Vakzine, dessen Plasmid CpGISS enthält, eine wesentlich stärkere Antikörper- und CTL-Antwort induziert als eine
Vakzine mit einem Plasmid ohne ISS, trotz einer höheren Genexpression durch letztere
(192). Nachfolgende Studien haben bestätigt, dass CpG-Motive die Immunantwort nach
DNA-Immunisierung verstärken können (109,126) und haben auch gezeigt, dass diese die
Immunantwort durch präferentielle Induktion einer Th1-Antwort qualitativ modifizieren
können. Oligonukleotide und Plasmide, die ISS enthalten, induzieren die Produktion von
IL-2, IFN-γ und IL-12, erhöhen das IgG2a:IgG1 Verhältnis zu Gunsten des IgG2a und
verringern die Produktion von IgE Antikörpern, all dies Charakteristika einer Th1-Antwort
(109,126,184,192). Sogar die Immunantwort nach Protein-Immunisierung lässt sich durch
Koimmunisierung mit ISS-enthaltender DNA in Richtung einer Th1- oder Th0-Antwort
mit vermehrter IgG2a- und IFN-γ-Produktion beeinflussen (126,184).
19
Die CpG-Motive scheinen nach neuesten Erkenntnissen ihre Wirkung über den "toll-like"Rezeptor (TLR 9) zu vermitteln (86).
1.2.3.2 Lokalisation des kodierten Antigens
Ein weiterer Parameter, der Einfluss auf die Stärke und Orientierung der Immunantwort
nehmen kann, ist die Lokalisation des kodierten Antigens. Nach DNA-Immunisierung
konnten Immunantworten sowohl gegen Proteine, die zytoplasmatisch lokalisiert (z.B. βGalaktosidase), als auch gegen solche, welche membrangebunden sind (z.B. G-Protein des
Rabies-Virus) oder sezerniert werden (z.B. HBsAg) induziert werden. Es ist möglich, dass
eine bestimmte Form eines Proteins geeigneter für die Induktion einer Immunantwort ist
als eine andere; so könnte man annehmen, dass ein sezerniertes Antigen effektiver sein
kann, eine Antikörper- und CD4+ T-Helferzell-Antwort zu induzieren als eine nichtsezernierbare Form des gleichen Antigens. Hier gibt es abweichende Ergebnisse: in einer
Studie konnte diese Hypothese nicht belegt werden: die sezernierte Form des G-Proteins
des Rabies-Virus induzierte keine stärkere humorale oder zelluläre Immunantwort als die
membrangebundene Form (234). Dagegen konnte gezeigt werden, dass die mutierte
sezernierte Form des großen Hüllproteins des HBV nach DNA-Immunisierung wesentlich
stärkere Immunantworten sowohl auf humoraler als auch auf zellulärer Ebene induzieren
kann als die natürliche nicht-sezernierte Form (69).
1.2.3.3 Immunisierungsprotokolle
Bisher konnte kein optimales Immunisierungsprotokoll (Dosis der administrierten DNA,
Anzahl und Frequenz der Immunisierungen) zur Erzielung einer möglichst starken Immunantwort aufgestellt werden. Booster-Immunisierungen verstärken vor allem die Antigenspezifischen Antikörperantworten. Dagegen haben sie keinen signifikanten Einfluss auf die
Stärke einer CTL-Antwort gegen Fremdantigene wie z.B. Virusantigene. Gegen
Selbstantigene (z.B. Tumorantigene oder transgene Virusantigene) gerichtete CTLAntworten bedürfen dagegen repititiver Vakzinierungen, um sie aufrecht zu erhalten.
20
1.2.3.4 Zytokine
Zytokine sind essentiell für die Regulation und die Koordination der zellulären und
humoralen Immunantwort (siehe oben). 1993 konnten Raz et al. zeigen, dass nach
Injektion von Zytokingenen in den Muskel die Zytokine ihre charakteristischen Aktivitäten
in vivo entfalten und die Immunantwort auf ein Protein verstärken können (174). Seitdem
wurde in vielen Studien demonstriert, dass die spezifische Immunantwort nach DNAImmunisierung durch Koinjektion eines Plasmids, welches das Gen für ein bestimmtes
Zytokin enthält, moduliert werden kann.
So erhöht beispielsweise die Koinjektion von IL-2 kodierenden Plasmiden sowohl die
humorale als auch die zelluläre Immunität und verstärkt die Produktion von Th1-Zytokinen
(70). Dies sind Beobachtungen, die mit den Funktionen von IL-2 als potentem Stimulator
der zellulären Immunität, der die Proliferation und Differenzierung von T-Zellen ebenso
wie das B-Zell- und NK-Zell-Wachstum induziert (204), vereinbar sind.
IL-4 induziert die Differenzierung von Th0-Zellen in den Th2-Subtyp, verstärkt das BZellwachstum und vermittelt ein IgG Klassen switching. Dementsprechend wird bei der
DNA-Immunisierung durch Koinjektion von IL-4 die humorale Immunantwort verstärkt
(70,174). Allerdings limitiert die relative Hemmung einer Th1-vermittelten Antwort mit
verringerter CTL-Aktivität seinen Gebrauch als Adjuvanz von viralen Vakzinen oder
Immunotherapien.
Auch der Effekt der in dieser Arbeit eingesetzten Zytokine GM-CSF, IL-12 und IL-18 auf
die Immunantwort nach DNA-Immunisierung wurde untersucht und soll nachfolgend
genauer besprochen werden.
IL-12, ein proinflammatorisches und immunmodulatorisches Zytokin, welches in erster
Linie von APCs produziert wird, spielt eine wichtige Rolle in der zellvermittelten
Immunität. So fördert es die Differenzierung von naiven T-Helferzellen in den Th1-Subtyp.
Eine weitere wichtige Funktion von IL-12 ist seine Fähigkeit, die Produktion von großen
Mengen IFN-γ in ruhenden und aktivierten T- und NK-Zellen zu induzieren. Dies stellt die
Grundlage für die meisten Effekte von IL-12 dar, wenn es in vivo verabreicht wird und
verleiht IL-12 eine wichtige Rolle sowohl in der unspezifischen als auch in der adaptiven
Immunabwehr. Außerdem verstärkt IL-12 die lytische Aktivität von NK-Zellen und
21
Lymphokin-aktivierten Killerzellen und fördert zudem durch Steigerung der CTL-Aktivität
eine spezifische CTL-Antwort.
In einigen Maus-Modellen konnte demonstriert werden, dass rekombinantes IL-12 starke
therapeutische Effekte bei der Behandlung von infektiösen Krankheiten (68,85,206) oder
auch Tumoren (18,147) besitzt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde begonnen, in
klinischen Studien der therapeutische Effekt von IL-12 bei Patienten mit chronischer
viraler Hepatitis, Tumor-Patienten und HIV-infizierten Patienten zu untersuchen (66),
allerdings mit wechselndem Erfolg.
Im Kontext der DNA-Immunisierung wurde bereits in einigen Studien der Effekt einer
Koadministration von IL-12 kodierenden Plasmiden auf die Immunantwort untersucht. Wie
zu erwarten, konnte durch IL-12 eine Th1-typische Antwort mit erhöhter T-ZellProliferation und eine deutlich verstärkte CTL-Antwort gegen die untersuchten Antigene
induziert werden (106). Iwasaki et al. konnten zeigen, dass durch Koimmunisierung mit
IL-12 kodierenden Plasmiden ein schwaches Plasmid-DNA-Immunogen in ein eine starke
CTL-Antwort induzierendes Immunogen umgewandelt werden kann (96). Auch andere
Gruppen haben bestätigt, dass IL-12 als Adjuvanz in der DNA-Immunisierung ein starker
Induktor der zellvermittelten Immunität ist (35,133,156,214,216).
Auch IL-18 spielt eine wichtige Rolle in der Th1-Antwort, in erster Linie durch seine
Fähigkeit, eine IFN-γ-Produktion in T-Zellen und NK-Zellen zu induzieren und wurde
daher in dieser Arbeit als Adjuvanz in der Immunisierung der Mäuse eingesetzt.
IL-18 wird durch aktivierte Makrophagen und Kupferzellen produziert (74,79,157). Einige
seiner biologischen Aktivitäten ähneln denen von IL-12, obwohl die primären Strukturen
der beiden Zytokine keine Homologie aufweisen. Der größte Unterschied zu IL-12 besteht
darin, dass IL-18 nicht in der Lage ist, die Differenzierung von CD4 positiven T-Zellen in
Th1 Zellen zu induzieren (181). Auch kann IL-18 allein keine IFN-γ Produktion durch TZellen oder B-Zellen induzieren, da sein Rezeptor erst durch IL-12 hochreguliert werden
muss. Allerdings kann es trotz Vorliegen von gesättigten IL-12 Mengen als
kostimulatorischer Faktor die IFN-γ Produktion durch anti-CD3-stimulierte T-Zellen oder
anti-CD40-stimulierte B-Zellen weiter erhöhen und besitzt somit einen synergistischen
Effekt zu IL-12 (238). IL-18 allein besitzt die Fähigkeit die murine und humane NK-ZellZytotoxizität zu verstärken (220) und die Fas-Liganden Expression auf Th1-Zellen und
NKs und somit ihre Fas-vermittelte Zytotoxizität zu erhöhen (44,215). Auch kann IL-18
22
andere Th1-Klone zur Proliferation und IL-2- und GM-CSF-Produktion stimulieren,
besitzt aber keinen Effekt auf die Proliferation von Th2-Zellen (110).
Allerdings konnte bisher in einer Studie nur gezeigt werden, dass durch Koadministration
von IL-18 kodierenden Plasmiden vor allem die Antikörper- und T-Helferzell-Antwort
deutlich erhöht wird, während nur eine moderate Erhöhung der CTL-Aktivität zu
beobachten war (106,108).
Als weiteres Zytokin für die Koimmunisierung wurde GM-CSF gewählt, da man von
diesem Zytokin weiß, dass es durch die Aktivierung und Rekrutierung von professionellen
APCs die Induktion einer primären Immunantwort begünstigt (61,87,142). Theoretisch
müsste die Koexpression von GM-CSF und einem Plasmid kodierten Antigen die
Immunantwort des Wirtes gegen das Antigen durch Vergrößerung des Pools an aktivierten
APCs an der Injektionsstelle verstärken. Tatsächlich konnten Xiang et Ertl zeigen, dass
durch Koinokulation von Mäusen mit Plasmiden, die für GM-CSF und das Glykoprotein
des Rabiesvirus kodieren, die Antikörper-Antwort dosisabhängig erhöht und die THelferzell-Antwort im Vergleich zu der Gruppe, der allein das für das Glykoprotein
kodierende Plasmid injiziert wurde, deutlich verstärkt werden konnte (233). Auch
nachfolgende Studien haben den verstärkenden Effekt dieses Zytokins sowohl auf die
humorale als auch auf die zelluläre Immunantwort im Kontext der DNA-Immunisierung
bestätigt (70,96,106,200).
1.2.3.5 Kostimulatorische Moleküle
Eine andere Strategie, die Effektivität der DNA-Immunisierung zu erhöhen, besteht in der
Koadministration von Genen, die für kostimulatorische Moleküle wie B7.1 (CD80), B7.2
(CD86) und CD40 kodieren, mit dem Ziel, die Fähigkeit der Antigen-Präsentation durch
die
transfizierten
Zellen
zu
erhöhen.
Wie
bereits
geschildert,
spielen
diese
kostimulatorischen Moleküle eine wichtige Rolle in der Antigenpräsentation, da sie das
notwendige zweite Signal für eine effiziente MHC-restringierte T-Zell-Aktivität darstellen
(101).
Studien an Mäusen haben gezeigt, dass die intramuskuläre Injektion von B7.2
Genexpressionskassetten zusammen mit für das Nukleoprotein des Influenzavirus (96)
oder das HIV-1 Protein (107) kodierenden Plasmiden eine signifikante Verstärkung der
23
CTL-Antwort gegen das kodierte Antigen induziert. Dieser Effekt wurde beobachtet,
unabhängig davon ob das B7.2 Gen im gleichen Plasmid wie das Antigen oder in einem
separaten Plasmid injiziert wurde. Der Effekt von B7.1 ist weniger eindeutig. Obwohl die
Koadministration von B7.1 Plasmiden zusammen mit Plasmiden, die für die oben
genannten Antigene kodieren, nicht zu einer Verstärkung der Immunantwort geführt hat
(96,107), konnte in zwei Studien gezeigt werden, dass die B7.1-Koadministration mit
Tumor-assoziierten
Antigenen
zu
einem
verbesserten
Schutz
gegenüber
einer
nachfolgenden Tumor-Inokulation führt (41,43). Die Gründe für die Unterschiede in der
Aktivität der beiden kostimulatorischen Moleküle sind nicht geklärt; es wird jedoch
angenommen, dass diese beiden Moleküle die T-Zell-Reifung unterschiedlich in den Th1bzw. den Th2-Subtyp induzieren (116).
Auch der CD40-Ligand wurde im Kontext der DNA-Immunisierung untersucht. Dieser
wird transient auf T-Zellen exprimiert und induziert die Proliferation und Differenzierung
von CD40-tragende APCs. Es konnte gezeigt werden, dass die Koadministration eines
Plasmids, welches für den CD40-Liganden kodiert, mit einem DNA-Immunogen zu einer
Erhöhung der Antikörper und der CTL-Aktivität führt (138).
Es gibt also eine Reihe von Möglichkeiten, die Immunantworten auf ein bestimmtes
Protein nach DNA-Immunisierung in eine bestimmte Richtung zu beeinflussen. So könnte
in
Zukunft
für
jedes
Protein
und
Immunisierungsprotokoll geschaffen werden.
jede
Infektionskrankheit
ein
optimales
24
1.3 Aufgabenstellung
Es soll die zelluläre und humorale Immunantwort gegen das kleine und große DeltaAntigen nach DNA-Immunisierung im Mausmodell untersucht werden. Dabei sollen die
Immunantworten gegen die natürlichen Delta-Antigene mit denjenigen gegen mutierte
sezernierte Formen verglichen werden. Dazu müssen entsprechende Expressionsvektoren
kloniert werden.
Zur Erreichung optimaler Immunantworten gegen die Delta-Antigene müssen die DNAImmunisierungsprotokolle optimiert werden.
Wenn mit dieser Methode Immunantworten gegen die Delta-Antigene generiert werden
können, soll in einem Tumormodell der in vivo Effekt einer solchen Immunantwort
untersucht werden.
25
2 Material und Methoden
2.1 Molekularbiologische Methoden
2.1.1 Elektrophoretische Auftrennung von DNA auf Agarosegelen
Die Agarosegel-Elektrophorese wird sowohl zur analytischen als auch zur präparativen
Auftrennung von DNA bzw. DNA-Fragmenten verwendet. Agarose ist ein aus Seetang
gewonnenes Disaccharid, das in wässriger Lösung nach Aufkochen und anschließendem
Abkühlen eine Polymatrix bildet. Durch Anlegen einer Gleichspannung wird ein
elektrisches Feld erzeugt; die auf das Gel aufgetragenen negativ geladenen DNA-Moleküle
durchlaufen abhängig von ihrer Größe die Maschen der Polymatrix von der Kathode zur
Anode unterschiedlich schnell und können so aufgetrennt werden. Durch Hinzufügen von
Ethidiumbromid bei der Herstellung des Agarosegeles kann die DNA sichtbar gemacht
werden: Ethidiumbromid interkaliert zwischen die Basen der DNA und emittiert nach
Anregung durch elektromagnetische Wellen im UV-Bereich orangefarbenes Licht (197).
Zur
Auftrennung
der
DNA
wurden
in
der
vorliegenden
Arbeit
Gele
mit
Agarosekonzentrationen von 1,0-1,2% in TAE-Puffer (0,04 M Tris-acetate; 0,001 M
EDTA; pH 8,0) verwendet. Das Ehtidiumbromid wurde den noch flüssigen Gelen in einer
Konzentration von 1,0 µg/ml hinzugefügt. Die DNA wurde mit 6x Probenpuffer (0.25%
Bromphenolblau, 40% Saccharose) in dH2O versetzt, auf das Gel aufgetragen und bei
einem Spannungsgradienten von 5-15 Volt/cm laufengelassen. Zur Beurteilung der
Fragmentgröße dienten die Nukleinsäuren-Größenstandards II, III bzw. X der Firma
Boehringer.
26
2.1.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
2.1.2.1 Prinzip der PCR
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, engl. Polymerase Chain Reaction) ermöglicht die
spezifische Vermehrung (Amplifikation) definierter DNA-Fragmente durch wiederholte
Synthese mit einer thermostabilen DNA-Polymerase. In einem Restriktionsgemisch aus
Magnesiumchlorid, Desoxy-Nukleotiden und DNA-Polymerase hybridisieren zwei kurze,
einzelsträngige Oligonukleotide (Primer) an die beiden Enden des zu vermehrenden DNAFragmentes und starten den Einbau der Nukleotide durch die DNA-Polymerase. Die
beiden Primer müssen jeweils komplementär zu den 3‘-Enden des (+)- bzw. (-)-Stranges
des entsprechenden DNA Abschnitts sein und werden je nach ihrer Orientierung Senseoder Antisense-Primer genannt. Bei der Synthese der Primer ist darauf zu achten, daß ihre
Sequenzen nicht komplementär zu anderen Abschnitten der Template-DNA sind.
Außerdem lassen sich, vor dem Hintergrund, dass die Enden des amplifizierten Segmentes
durch die Sequenz der Oligonukleotide definiert ist, durch einzelne in die Oligonukleotide
eingebaute Mutationen im amplifizierten DNA-Segment Schnittstellen für bestimmte
Restriktionsenzyme einbauen, was eine nachfolgende Klonierung des DNA-Fragmentes in
einen Expressionsvektor wesentlich erleichtern kann. Dabei muss beachtet werden, dass
diese Schnittstellen mit Schnittstellen aus der Klonierungsstelle („multiple cloning site„)
des Expressionsvektors übereinstimmen.
Die PCR besteht aus drei sich zyklisch wiederholenden Schritten. Zunächst wird die
Ausgans-DNA (Template-DNA) durch Erhitzung auf 94ºC denaturiert, die beiden
Einzelstränge trennen sich. Nach Absenkung der Temperatur auf 40ºC bis 70ºC binden die
Primer an die Einzelstränge (Annealing) und bilden kurze Doppelstrang-Bereiche, deren
freie 3‘-Enden von der DNA-Polymerase erkannt werden. Diese Annealingtemperatur, die
bei beiden Oligonukleotiden annähernd gleich sein sollte, errechnet sich aus der
Zusammensetzung der Oligonukleotide: T = 2x(Anzahl von A+T) + 4x(Anzahl von G+C)
in ºC (95). Anschließend wird die Temperatur auf 72ºC, das Temperatur-Optimum der
DNA-Polymerase, erhöht, und es kommt, ausgehend vom 3‘-Ende der Primer-Hybride, an
beiden Einzelsträngen zur Synthese des Komplementärstranges. So entstehen in einem
Zyklus aus einem Ausgangs-Doppelstrang zwei neue, die je zur Hälfte de novo
synthetisiert wurden. Durch die zyklische Wiederholung dieses Vorgangs von
Denaturierung, Annealing und DNA-Synthese kommt es zu einer exponentiellen und
27
selektiven Vermehrung der durch die Oligonukleotide flankierten DNA-Sequenz. Am Ende
der PCR enthält das Reaktionsgemisch nach n Zyklen ein theoretisches Maximum von 2n
doppelsträngigen DNA-Moleküle, die Kopien der DNA-Sequenz zwischen den
angelagerten Primern darstellen und deren Enden durch die 5‘-Enden der Primer definiert
ist. Diese können anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt, dargestellt und analysiert
werden.
2.1.2.2 Durchführung der PCR
In der vorliegenden Arbeit wurde die PCR eingesetzt für die Amplifikation des für das
kleine bzw. große Delta-Antigen kodierenden DNA-Segmentes aus den Plasmiden pSS32
und pSS33, mit dem Ziel, neue Expressionsvektoren für das Delta-Antigen zu klonieren.
Die PCR wurde mit dem ExpandTM High Fidelity PCR System von Boehringer
durchgeführt. Dieses System beinhaltet einen Enzym-Mix, bestehend aus der aus dem
Bakterium Thermus aquaticus isolierten thermostabilen Taq DNA Polymerase (190) und
der Pwo DNA Polymerase (5) und ist für die Amplifikation von DNA-Fragmenten mit
einer Länge bis zu 5 kb optimiert. Durch die 3‘-5‘ Exonuklease-Aktivität der Pwo DNA
Polymerase wird bei der PCR eine dreimal niedrigere Fehlerrate erzielt.
Aufgrund der Thermostabilität der Polymerasen reicht die einmalige Zugabe des
Polymerase-Mix zu Beginn der PCR für alle benötigten Zyklen aus. Die Verwendung
dieser hitzestabilen Polymerasen macht die Automatisierung der PCR im sogenannten
Thermocycler (PCR-Gerät) möglich, der die Änderungen von Denaturierungs- Annealingund Synthesetemperatur je nach vorheriger Programmierung steuert.
Als DNA-Template wurden die Plasmide pSS32 und pSS33, welche das zu amplifizierende
Delta-DNA-Segment enthalten, eingesetzt. Die als Primer dienenden Oligonukleotide
wurden durch die Fa. Birsner&Grob-Biotech GmbH synthetisch hergestellt. Die
Oligonukleotide wurden so entworfen, daß der Sense-Primer, der an das 3’-Ende des "-"Stranges der DNA-Template bindet, eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym Hind III
enthält, und im Antisense-Primer, der an das 3‘-Ende des "+"-Stranges bindet, eine
Schnittstelle für das Restriktionsenzym Xba I enthalten ist. Folglich ergab sich für die
Primer folgende Sequenz:
28
Sense-Primer:
CCT 27 (CCT CTA GCC AAG CTT AGC CGG TCC GAG)
Antisense-Primer:
GGC 27 (GGC GTA TCT AGA GGC CCT AGA TTC CGA)
Die Primer wurden als gefriergetrocknetes Pellet (lyophilisiert) geliefert, welches in dH2O
aufgelöst wurde. In der PCR wurden jeweils etwa 100 pg eingesetzt.
Die Desoxynukleotide waren dem PCR-Kit beigefügt und lagen in einer Konzentration von
2mM vor.
Alle Schritte wurden auf Eis und unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Reagenzien
wurden in spezielle PCR-Vials pipettiert, wobei die DNA-Template als vorletztes und der
Polymerase-Mix als letztes dazugegeben wurde.
Reaktionsansatz:
PCR-Puffer (10x)
10 µl
dNTP-Mix
10 µl
downstream-Primer
1,0 µl
upstream-Primer
1,0 µl
dH2O
73,5 µl
Template-DNA
1,0 µl
Polymerase-Mix
0,5 µl
Nach Ansetzen des Reaktionsgemisches wurden die gut verschlossenen Reaktionsgefäße in
den auf 94ºC vorgeheizten computergesteuerten Thermozykler gegeben. Dabei wurde der
Thermozykler auf folgende Temperaturen und Zeiten programmiert:
1. Initiale Denaturierung: 3 Minuten
2. 25 Zyklen von je:
94ºC
30 Sekunden 93ºC (Denaturierung)
20 Sekunden 58ºC (Annealing)
3. Terminale Extention:
1 Minute
72ºC (Extention)
7 Minuten
72ºC
29
Durch die initiale Denaturierung bei 94ºC werden die DNA-Stränge vollständig
voneinander getrennt. Die abschließende Extentionstemperatur wurde 7 Minuten gehalten,
um der DNA-Polymerase zu ermöglichen, unvollständig synthetisierte DNA-Stränge zu
komplettieren. Am Ende des Programms kühlt der Heizblock auf 4ºC ab; das Reaktionsprodukt ist bei dieser Temperatur stabil, und die Polymerase zeigt keine Aktivität.
Zur Analyse des PCR-Produktes wurde dieses nach Aufreinigung und Isolierung mit dem
PCR-Purification Kit von Qiagen (durchgeführt nach mitgeliefertem Protokoll) auf ein
1%iges Agarose-Gel aufgetragen.
2.1.3 Restriktionsverdau von doppelsträngiger DNA
Restriktionsenzyme gehören zur Klasse der Endodesoxyribonukleasen, die zirkuläre oder
linearisierte DNA innerhalb des Doppelstranges spalten. Es existieren drei Typen von
Restriktionsenzymen, wobei nur Restriktionsenzyme des Typ II in der Molekularbiologie
angewendet
werden.
Nukleotiden,
binden
Restriktionsenzyme
an
diese
erkennen
hochspezifisch
und
DNA-Sequenzen
spalten
die
von
DNA.
4-15
Diese
Erkennungsbereiche der DNA sind in der Regel durch spiegelbildsymmetrische Anordnung
der
Nukleotidsequenzen,
sogenannter
Palindromsequenzen,
charakterisiert.
Restriktionsenzyme des Typ II benötigen nur Magnesium-Ionen und werden hinsichtlich
des Spaltproduktes in zwei Untergruppen unterteilt: die einen spalten die DNA in der Mitte
der Erkennungsstelle senkrecht zur Längsachse der Palindromsequenz; es entstehen glatte
Enden, auch "blunt-ends" genannt. Restriktionsenzyme der zweiten Gruppe spalten
dagegen die DNA ein bis mehrere Nukleotide von der Mitte entfernt, so dass DNA
Fragmente mit 5´- oder 3´-endständigen kurzen einzelstängigen überhängenden Enden,
sogenannter "sticky-ends" entstehen. Dabei befindet sich am 5´-Ende immer eine
Phosphatgruppe und am 3´-Ende eine Hydroxyl-Gruppe.
Die Aktivität der Restriktionsenzyme wird in U/µl angegeben. Dabei ist eine Einheit als
diejenige Menge des Enzyms definiert, die 1 µg einer DNA in einer Stunde in einem
Restriktionsansatz 50 µl spaltet. Im Allgemeinen werden pro µg DNA 5-10 Einheiten des
Enzyms eingesetzt. Entsprechend der durch die Firma angegebenen Pufferkompatibilität
werden für jeden Restriktionsansatz ein bestimmter Puffer ausgewählt, wobei bei einem
30
gleichzeitigen Verdau einer DNA mit mehr als einem Enzym darauf geachtet werden sollte,
dass die für den Restriktionsverdau benötigten Puffer übereinstimmen, da die Effizienz der
DNA-Spaltung eines Restriktionsenzyms in hohem Maße von der Zusammensetzung des
Restriktionsmilieus abhängt. Weiter muss man beachten, dass die Glycerolkonzentration
des
Restriktionsansatzes
nicht
mehr
als
5%
beträgt,
da
bei
zu
hohen
Glycerolkonzentrationen die Enzyme eine unkontrollierte Aktivität entwickeln können,
d.h. sie schneiden die DNA nicht mehr hochspezifisch an ihrer entsprechenden Sequenz,
sondern willkürlich. In der vorliegenden Arbeit wurden Restriktionsenzyme der Firma
New England Biolabs eingesetzt.
2.1.4 Isolierung und Aufreinigung des PCR-Produktes (Gelextraktion)
Nach einer gelelektrophoretischen Auftrennung des Restriktionsansatzes muss das PCRProdukt für die nachfolgende Ligation aus dem Agarosegel isoliert und aufgereinigt
werden. Hierfür wurde das QIAquick Gel Extraction Kit von Qiagen verwendet, welches
für die Extraktion und Reinigung von DNA mit einer Größe von 70 bis 10000 Basenpaaren
(bp) aus Agarosegelen entworfen wurde.
Die Methode basiert auf den Beobachtungen, dass DNA in Suspension an eine spezielle
Silika-Matrix mit hoher Affinität binden kann (222). Somit kann die DNA leicht aus
Lösungen extrahiert werden, die unerwünschte Verunreinigungen wie Phenole, Salze,
Enzyme und Proteine enthalten und die nicht an die Silika-Membran binden.
Nach der präparativen Auftrennung des Verdaus auf einem Agarose-Gel wird das Fragment
mit der gewünschten Länge unter Durchleuchtung mit langwelligem UV-Licht aus dem
Gel herausgeschnitten und in dreifachem Volumen des Puffers QG aus dem Kit (Gewicht
des Gelstücks x 3) bei 50ºC für 10 Minuten geschmolzen. Dieser Puffer enthält einen pHIndikator, der anhand der Färbung der Lösung die Beurteilung des pH-Wertes erlaubt. Nur
bei pH-Werten von <7,5, die bei einer Gelbfärbung vorliegen, ist die Adsorption der DNA
an die Silika-Membran effizient. Nach Hinzufügen von einem 1-fachen Volumen
Isopropanol (Gewicht des Gelstücks x 1) wird die DNA durch Überführen der Probe in
spezielle QIAquick Säulen mit anschließender Zentrifugation an die Silika-Membran in
diesen Säulen gebunden. Nach einem Waschschritt mit Ethanol-enthaltendem PE-Puffer
zur Entfernung von Salzen kann das DNA-Fragment schließlich in dH2O eluiert werden
und einer nachfolgenden Ligation zugeführt werden.
31
2.1.5 Transformation von Bakterien
Um DNA effektiv zu vermehren, wird sie in kompetente Bakterien eingeführt. Die meisten
Methoden für die Transformation von Bakterien basieren auf den Beobachtungen von
Mandel und Higa (135), die zeigen konnten, dass Bakterien, die mit eisgekühltem CaCl2
behandelt und anschließend kurz erhitzt werden, mit Bakteriophagen-DNA transformiert
werden können. Die gleiche Methode wurde später eingesetzt, um Bakterien mit PlasmidDNA zu transformieren (36). In den folgenden Jahren wurden die Methoden weiter
variiert, mit dem Ziel, die Transformationseffizienz der Bakterien zu optimieren. Dabei
wurden durch Vorbehandlung der Bakterien mit DMSO oder reduzierenden Substanzen für
Transformationen kompetentere E.coli Stämme hergestellt. Der genaue Mechanismus,
durch den die Plasmid-DNA in kompetente E.coli Bakterien eindringen kann, ist bis heute
unbekannt.
Zur Plasmidvermehrung wurden in der vorliegenden Arbeit kommerziell erhältliche INVα
F’One ShotTM Zellen der Firma Invitrogen verwendet. Hierbei handelt es sich um
kompetente E.coli-Zellen mit einer sehr hohen Transformationseffizienz. Entsprechend
dem beiliegenden Protokoll wurden 5-50 ng DNA in einem Volumen von 1-20 µl zur
Transformation eingesetzt. Nach einstündiger Inkubation in einem Rotationsinkubator bei
37ºC wurden 100-200 µl der Bakteriensuspension auf mit einem entsprechenden
Antibiotikum versetzten Agarplatten (15 g/l Bactoagar in LB-Medium) ausgestrichen und
über Nacht bei 37ºC inkubiert. Entsprechend des im Expressionsvektor enthaltenden
Resistenzgenes waren die Agarplatten mit Ampicillin (50 µg/ml) versetzt. Nur die
transformierten Bakterien können sich auf den Agarplatten vermehren und Kolonien
ausbilden, da nur sie entsprechende durch die zugeführte Plasmid-DNA kodierte
Resistenzgene gegen das Antibiotikum enthalten. Die über Nacht ausgebildeten Kolonien
konnten am nächsten Tag mit einer sterilen Metallöse zum Anlegen von Flüssigkulturen in
Polystyrolröhrchen mit LB-Medium überführt werden.
2.1.6 Vermehrung der Plasmid-DNA in flüssigen Medien
Um größere Mengen eines Plasmids zu erhalten, müssen Flüssigkulturen von mit dem
Plasmid transformierten Bakterien angelegt werden. Hierfür wurde entweder eine nach
32
Transformation von kompetenten Bakterien über Nacht ausgebildete isoliert liegende
Kolonie mit Hilfe einer Metallöse in LB-Medium überführt oder es wurden in
Glycerolstocks
konservierte
Bakterien
aus
alten
Flüssigkulturen
für
die
Plasmidvermehrung verwendet. Die Bakterien wurden in vier ml LB-Medium (10 g NaCl,
10 g bacto-tryptone, 5 g Hefe-Extrakt pro Liter) unter Zugabe eines bestimmten
Antibiotikums, das nur die Vermehrung von mit dem entsprechenden Plasmid
transformierten Bakterien zulässt, in einem Rotationsinkubator mit 250 U/min bei 37ºC
inkubiert. Zur Vermehrung der Delta-Expressionsvektoren musste entsprechend dem im
Vektor enthaltenden Resistenzgen 100 µg/ml Ampicillin zugegeben werden,
Gemäß der Wachstumskurve für Bakterienkulturen beträgt die Inkubationszeit 12-16
Stunden, da unter den oben genannten Kulturbedingungen in der Regel in dieser
Zeitspanne die Plateauphase des Bakterienwachstums erreicht wird.
Zur Vermehrung des Plasmids in großem Maßstab wurden 1,5 ml der E.coli-Flüssigkultur
in
500
ml
LB-Medium
Erlenmeyerkolben
überführt
inklusive
und
eines
wiederum
geeigneten
bei
37ºC
Antibiotikums
über
Nacht
in
einen
in
einem
Rotationsinkubator inkubiert.
2.1.7 Plasmid-Isolierung und -Aufreinigung
Nach Vermehrung der Plasmid-DNA in Flüssigkulturen musste die DNA aus diesen isoliert
und aufgereinigt werden. Die Plasmid-Isolierung erfolgte dabei nach Methode der
alkalischen Lyse (10). Entsprechend der Menge der angelegten Flüssigkultur wurden für
die Plasmid-Extraktion aus transformierten Bakterien das QIAprep Mini-, Mega- oder
Gigaprep von Qiagen verwendet, dessen Prinzip auf der Methode der alkalischen Lyse mit
anschließender Adsorption der DNA auf Silica-Gel Membranen basiert (222). In einem
mitgelieferten Protokoll sind die einzelnen Schritte zur Plasmid-Isolierung genau
beschrieben.
Nach alkalischer Lyse der Bakterien in NaOH/SDS und Zerstörung der RNA durch die
Anwesenheit von RNase wurde die Plasmid-DNA über eine Säule an Silica-GelMembranen adsorbiert und so von RNA, zellulären Proteinen und Metaboliten isoliert.
Schließlich wurde die DNA nach mehreren Waschschritten in 0,15 molarer Tris/Cl (pH
8,5) eluiert und befand sich so gereinigt und konzentriert in Lösung.
33
2.1.8 Glycerolstock
Bakterien können in sogenannten Glycerolstocks bei –80ºC unbegrenzt lange
überlebensfähig konserviert werden. Dabei wurden 600 µl einer Flüssigkultur, die
transformierte Bakterien enthält, mit 600 µl einer 40%igen Glycerollösung gut vermischt,
nach Überführen in ein Gefrierröhrchen in mit Trockeneis eisgekühltem Ethanol
tiefgefroren und anschließend bei –80ºC gelagert.
2.1.9 Zellkultur
Für die in vitro Transfektionsstudien wurde mit unterschiedlichen Zelllinien gearbeitet:
2.1.9.1 G8- Zellen (ATCC No. CRL-1456)
Es handelt sich um fetale Myoblasten, die aus der Muskulatur der hinteren Extremitäten
eines Maus-Fetus gewonnen wurden. Sie wurden für den Nachweis von Delta-Protein nach
Transfektion mit den Delta-Expressionskonstrukten verwendet, um in vitro die
Bedingungen einer intramuskulären Injektion von Plasmid-DNA im Rahmen einer DNAImmunisierung zu simulieren. Allerdings besitzen diese Zellen nur eine sehr geringe
Transfektionseffizienz (ca. 5%). Die Zellen wurden in Dulbecco’s Medium der Fa. Gibco
mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und unter Zusatz von Penicillin/Streptomycin und
nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) kultiviert.
2.1.9.2 LMH-Zellen (ATCC No. CRL-2117)
Bei diesen Zellen handelt es sich um hepatozelluläre Karzinomzellen von Hühnern. Sie
eignen sich besonders für Transfektionsstudien, da die Transfektionseffizienz mit bis zu
85% ausgesprochen hoch ist. Die Zellen wurden In IMDM mit 8% FCS unter Zusatz von
Penicillin/Streptomycin und NEAA gehalten.
34
2.1.9.3 Huh7-Zellen
Es handelt sich hierbei um murine Hepatomzellen. Auch diese Zellinie wurde in
Transfektionsstudien eingesetzt. Wie die G8-Zellen wurden die Huh7-Zellen in Dulbecco’s
Medium der Firma Gibco mit 10% FCS und unter Zusatz von Penicillin/Streptomycin und
nicht-essentiellen Aminosäuren kultiviert.
2.1.9.4 P815-Zellen (ATCC No. TIB-64)
Es handelt sich um Mastozytomzellen der Maus, welche Balb/c- und DBA-2-Maus-syngen
sind, d.h. sie haben wie die Mäuse den Haplotyp H-2d.
Die das kleine und große Delta-Protein bzw. das große HBV-Hüllenprotein (LHBs) stabil
exprimierenden Mastozytomzellinien P815δ-32, P815δ-33 und P815-LS wurden
freundlicherweise
von
Dr.
M.
Geißler
zur
Verfügung
gestellt
und
in
den
Zytotoxizitätsexperimente sowie im Tumormodell eingesetzt. Die Zellen wurden in
Dulbecco’s Medium mit 10% FCS gehalten, dem zusätzlich als Selektionsantibiotikum G418-Sulfat der Firma PAA Laboratories GmbH in einer Konzentration von 1 mg/ml
hinzugefügt wurde. Hierbei inaktiviert die durch die als Selektionsmarker dienende
Neomycingen gebildete Neomycin-Phospho-Transferase das G418-Sulfat, so dass nur die
transfizierten Zellen resistent gegen das Antibiotikum sind und nur diese in der Kultur
überleben.
Außerdem
wurden
dem
Medium
ebenfalls
nicht-essentielle Aminosäuren
und
Penicillin/Streptomycin hinzugefügt.
Alle Zellen bildeten nach 3-4 Tagen einen einschichtigen konfluenten Zellrasen. Für das
Passagieren wurden die adhärent wachsenden G8-, Huh7- und LMH-Zellen nach Absaugen
des Mediums einmal mit PBS gewaschen und für 3 Minuten mit 3 ml einer Typsin/EDTALösung (0,025% Trypsin/0,05% EDTA in PBS) trypsiniert. Die abgelösten Zellen wurden
in 5 ml Medium+FCS aufgenommen, resuspendiert und auf neue Petrischalen in einem
Verhältnis von 1:10 verteilt.
Die nicht- bzw. semi-adhärent wachsenden P815-Zellen wurden mit einer 10ml-Pipette in
frischem Medium vorsichtig durch langsames auf- und abpipettieren vom Boden der
35
Petrischalen abgespült, resuspendiert und ebenfalls in einer 1:10-Verdünnung auf neue
Petrischalen übertragen.
Die Petrischalen wurden mit dem entsprechenden Medium aufgefüllt und im Brutschrank
bei 37ºC/5% CO2 aufbewahrt.
2.1.10
Einfrieren von Zellen
Wenn Zellen über eine längere Zeit nicht gebraucht wurden, wurden sie nach folgender
Methode eingefroren:
Nach Übertragen der Zellen in 15ml-Falcon-Röhrchen wurden diese bei 1200 U/min fünf
Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet in 2 ml auf -20ºC
vorgekühltem Einfriermedium (1,8 ml Kulturmedium+10% FCS ; 0,2 ml DMSO)
resuspendiert. Jeweils 1 ml wurden in ein entsprechend beschriftetes Kryo-Vial übertragen
und über Nacht bei -20ºC eingefroren. Nach 24 Stunden wurden die Zellen in einen
Stickstofftank gestellt und dort bei -160ºC aufbewahrt.
2.1.11
Transiente Transfektion von Zellen
Zur Charakterisierung der Expression des Delta-Proteins wurden G8-, Huh-7-, und LMHZellen nach dem Prinzip des Liposom-vermittelten Gentransfers mit den Plasmiden pSS32,
pSS33, pSec32 und pSec33 transfiziert (58). Dabei wurde das Lipofectamine Reagent der
Firma Life Technologies verwendet. Zur Beurteilung der Transfektionseffizienz wurden
die Zellen parallel mit dem Plasmid pEGFP-N1, welches das fluoreszierende EGFP
exprimiert, kotransfiziert.
In einem Experiment zur Ermittlung der optimalen Transfektionsbedingungen wurden die
einzelnen Inkubationszeiten und die einzusetzenden Plasmid- und Liposom-Mengen
ermittelt.
Nach Waschen mit PBS wurden die zu ca. 70% konfluenten Zellen mit 4 µg Plasmid-DNA
unter einem Liposom-DNA-Verhältnis von 5:1 in Serum-freiem Medium (Opti-MEM der
Firma Gibco) transfiziert. 2 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen erneut zweimal
mit PBS gewaschen und entsprechendes Kultur-Medium mit FCS hinzugefügt. Die Zellen
wurden 48 Stunden lang im Brutschrank bei 37ºC/5%CO2 aufbewahrt. Dann wurde der
36
Überstand entnommen und die Zellen in Core-Lysepuffer (150 mM NaCl + 1% NP 40 in
dH2O) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur lysiert. Überstand und Lysate wurden bei
-80ºC aufbewahrt.
Der Erfolg der Transfektion wurde durch Betrachtung der Zellen unter dem FluoreszenzMikroskop anhand des fluoreszierenden EGFP-Signals beurteilt.
2.2 Expressionsexperimente
2.2.1 Proteinanalyse im Western Immunoblot
2.2.1.1 Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)
Für die Auftrennung und den Nachweis von Proteinen bedient man sich der
Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Anwesenheit von SDS (Natiumdodcylsulfat). Dabei
werden die Proteingemische durch SDS und unter Hitze aufgetrennt, bevor sie auf das Gel
aufgetragen werden. Der hydrophobe Anteil des denaturierten Proteins bindet so an das
amphiphatische Molekül SDS, dass die hohe negative Ladung des Dodecylsulfates nach
außen gerichtet ist. Da die den Proteinen eigenen Ladungen im Vergleich zur Ladung des
Komplexes zu vernachlässigen sind und die Menge von gebundenem SDS dem
Molekulargewicht des Proteins nahezu proportional ist, ist auch die Gesamtladung des
Komplexes der Größe des Proteinmoleküls direkt proportional. In begrenzten
Molekülgewichtsbereichen bestehen lineare Beziehungen zwischen der Größe des
Moleküls und der Wanderungsgeschwindigkeit. Durch einen Marker bekannten
Molekulargewichts ist es nun möglich, die Größe des Proteinmoleküls annähernd genau
zu bestimmen.
Das SDS-Polyacrylamidgel besteht aus einem großporigen (sauren) Sammelgel, in
welchem die Proteine ankonzentriert und zu einer scharf begrenzten Zone gesammelt
37
werden. Das darunter liegende kleinporige (alkalische) Trenngel trennt die Proteine nach
Größe auf.
Das Trennvermögen beruht auf der Kombination eines Molekularsiebeffektes mit einem
Konzentriereffekt. Der letztere Effekt ergibt sich daraus, dass im Gel andere Ionen
(Leitionen: Chlorid) als im Elektrodengefäß (Folgeionen: Glycinat) vorliegen und der pHWert im Sammelgel saurer als im Elektrodenpuffer ist. Die effektive Beweglichkeit aller an
der Elektrophorese beteiligten Ionen verhält sich im Sammelgel folgendermaßen:
Leitionen > Proteine > Folgeionen. Beim Anlegen der Gleichspannung wandern die
Leitionen infolge der hohen Beweglichkeit voraus und hinterlassen eine Zone geringerer
Leitfähigkeit, die eine Steigerung der Feldstärke hervorruft.
Zwischen den Leitionen und den Folgeionen bildet sich eine Grenzschicht, die zwischen
der hohen und der niedrigen Feldstärke liegt. Hier entsteht eine schmale, hochkonzentrierte
Proteinschicht. Wandert diese Schicht in das Trenngel mit einem höheren pH-Wert, nimmt
die Beweglichkeit der Folgeionen durch die resultierende verstärkte Ionisation der
Glycinat-Ionen sehr stark zu, sie erreichen die Geschwindigkeit der Leitionen und wandern
mit diesen den Proteinen vorraus. Von diesem Punkt an unterliegen die Proteine einer
Zonenelektrophorese und werden in Abhängigkeit von den Molekularsiebeigenschaften
des Geles nach ihrer Größe und Ladung aufgetrennt.
2.2.1.2 Vorbereitung der SDS-Polyacrylamidgele
Die Glasplatten unterschiedlicher Größe (10,1x8,2 cm und 10,1x7,2 cm) wurden mit
70%igem Ethanol gereinigt. Zwischen die beiden Glasplatten wurde das 12%ige Trenngel
(pro Gel benötigt man ca. 10 ml: 3,3 ml dH2O ; 4,0 ml 30% Acrylamid-Mix ; 2,5 ml 1,5M
Tris (pH 8,8) ; 0,1 ml 10% SDS ; 0,1 ml 10% Ammoniumpersulfat ; 0,006 ml TEMED)
gegossen und mit dH2O überschichtet. Die Dicke des Geles wurde duch die seitlichen
Spacer (15mm) bestimmt. Nachdem das Trenngel polymerisiert war, wurde das Wasser
entfernt und das 5%ige Sammelgel (pro Gel werden ca. 3,0 ml benötigt: 2,1 ml dH2O ; 0,5
ml 30% Acrylamid-Mix ; 0,38 ml 1,0M Tris (pH 6,8) ; 0,03 ml 10% SDS ; 0,03 ml 10%
Ammoniumpersulfat ; 0,003 ml TEMED) gegossen und der Kamm (15 mm dick)
eingesetzt. Nach vollständiger Polymerisation der Gele wurde der Kamm wieder entfernt,
die vom Kamm gebildeten Taschen sorgfältig mit dH2O ausgewaschen und von
38
überschüssigem Acrylamid-Gel befreit. Die Gele wurden innerhalb ihrer Halterungen in
Kammern der Firma BIORAD eingesetzt.
2.2.1.3 Durchführung der SDS-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese
Jeweils 60 µl der zu untersuchenden Proben wurden mit 15 µl 5x SDS-Probenpuffer (60
mM TrisCl, pH 6,8; 25% Glycerol; 5% SDS; 0,1% Bromophenolblau; 14,4mM 2Merkaptoethanol) vermischt und für 10 Minuten auf 100ºC erhitzt. Als Molekulargewichtsmaker wurde der Protein-Molekulargewichtsmarker Low Standard (12-43 kD) der
Firma Gibco verwendet. Die Proben wurden dann auf die Gele übertragen und diese in
Laufpuffer (25mM Tris Base; 250mM Glycin, pH 8,3; 0,1% SDS) für 1,5 Stunden an eine
Spannung von 140mV angeschlossen.
2.2.1.4 Transfer der Proteine vom SDS-Polyacrylamidgel auf Nitrozellulose-Membranen
und immunologische Detektion der Proteine (Western Blot)
Die Technik des Western Blots ist hervorragend für die Identifikation und die
Quantifizierung von spezifischen Proteinen in komplexen Mischungen geeignet (211).
Zunächst wurden die auf dem Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch aufgetrennten Proteine
auf Nitrozellulose-Membranen übertragen. Hierfür wurde das Gel auf der NitrozelluloseMembran liegend zwischen zwei Whatman 3MM Papieren in eine entsprechende TransferAppartur der Firma BIORAD eingespannt, diese Appartur in eine mit Transfer-Puffer
(48mM Tris Base ; 39mM Glycin, pH 8,3 ; 0,037% SDS ; 20% Methanol) gefüllte
Kammer eingesetzt und für 1 Stunde an eine Spannung von 100 mV angeschlossen.
Unspezifische Bindungsstellen auf der Nitrozellulose-Membran wurden mit BlockierLösung (3% nonfat dried milk und 1% bovines Serum-Albumin in PBS) zwei Stunden lang
oder über Nacht blockiert, um eine Bindung der später verwendeten Antikörper an diese
unspezifischen Bereiche zu vermeiden. So kann die Hintergrundaktivität reduziert und
damit die Sensivität des Western Blots erhöht werden.
Die Nitrozellulose-Membran wurde dann zunächst mit einem polyklonalen anti-delta
Rabbit-Antiserum (in einer 1:7500-Verdünnung in Blockier-Lösung) und schließlich mit
39
einem horseradish Peroxidase markierten anti-Rabbit-Antikörper (in einer 1:3000Verdünnung in Blockier-Lösung) der Firma Amersham jeweils für 1 Stunde rollend in
einem 50ml-Falcon-Gefäß inkubiert.
Nach den beiden Antikörper-Inkubationen wurde die Nitrozellulose-Membran jeweils
dreimal für 10 Minuten in Waschlösung (PBS mit 0,2% Tween) gewaschen.
Die Darstellung der spezifischen Proteine erfolgte mittels Chemiluminiszenz (ECL
detection reagent 1 & 2; Amersham). Die Lösungen 1 und 2 wurden im Verhältnis 1:1
gemischt, und mit der so entstandenen Substratlösung wurde die Nitrozellulose-Membran
für eine Minute inkubiert.
Die zwischen zwei 3MM-Whatman-Papieren getrocknete Membran wurde schließlich zur
Autoradiographie mit Kodak-BMR-Röntgenfilmen bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Belichtungszeiten betrugen 10 Sekunden bis 5 Minuten.
2.2.2 Immunfluoreszenz
Für den Expressionsnachweis des Delta-Antigens mittels Immunfluoreszenz wurden G8und LMH-Zellen auf sterilen Deckgläsern (∅ 2 cm) mit den Plasmiden pSS32, pSS33,
pSec32 und pSec33 in doppelten Ansätzen nach Methode des liposomalen Gentransfers
transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach Transfektion wurden die auf den Deckgläsern
innerhalb der Vertiefungen der 6-well-Platten wachsenden Zellen zweimal mit PBS (0,2 g
KCl ; 0,2 g KH2PO4 ; 8,0 g NaCl ; 1,15 g Na2HPO4 ; pro 1 l H2O) gewaschen und für 2
Stunden bei -20ºC in 1 ml Fixierlösung (95% Ethanol/5% Essigsäure) fixiert. Nach
erneutem dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen zur Erhöhung ihrer
Permeabilität 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,05% Saponin in PBS inkubiert.
Die Blockierung unspezifischer Bindungsstellen erfolgte mit Blockierungs-Lösung (s.o.)
für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Nach Absaugen der Blockierungs-Lösung wurden die
Zellen zunächst mit 200 µl eines polyklonalen anti-delta Antikörper (1:1000 in PBS), bzw.
der parallele Ansatz mit einem anti-mAFP-Antikörper (1:240 in PBS) zur Negatikontrolle
für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Beide Antikörper waren aus derselben
Spezies, nämlich einem Kaninchen, gewonnen worden. Nach viermaligem Waschen mit
PBS folgte die Inkubation mit dem zweiten Antikörper, einem FITC-(FluorescinIsothiocyanat-) markierten anti-Kaninchen-Ig-Antikörper (Anti-Rabbit IgG-Fluorescein
40
(Goat) der Firma Boehringer Mannheim). Dabei wurden wieder 200 µl einer Verdünnung
dieses Antikörpers von 1:500 in PBS auf die Zellen gegeben, und die Zellen wurden eine
Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln, um der vorzeitigen Erschöpfung der
Lichtemission durch angeregtes Fluorescin vorzubeugen, inkubiert.
Nach erneutem viermaligem Waschen wurden die Deckgläser mit den darauf fixierten
Zellen mit einem Tropfen Antifade-Reagenz (Slowfade Light antifade Kit der Firma
Molecular Probes), welches die Abschwächung des fluoreszierenden Signals verlangsamen
soll, auf Objektträger transferiert und auf diesen mit Nagellack fixiert.
Die Betrachtung erfolgte unter einem Fluoreszenz-Mikroskop bei einer Wellenlänge von
525 nm.
2.2.3 Nachweis von Delta-Protein im Überstand
Für den Nachweis von Delta-Protein im Zellkulturüberstand wurde der Hepatitis-DAntigen-EIA der Firma Diasorin verwendet. Der Test wurde mit freundlicher
Unterstützung von Frau Dr. Hutzli, Universitätsklinik Freiburg, Institut für Virologie und
Mikrobiologie, durchgeführt.
Bei dieser immunenzymatischen Methode zur qualitativen Bestimmung des DeltaAntigens handelt es sich um einen direkten nichtkompetitiven Sandwich-Test. Mit anti-HD
IgG beschichtete Vertiefungen der Inkubationsstreifen wurden mit den Proben und den
Positiv- bzw. Negativkontrollen inkubiert. Als Enzymtracer diente Anti-HD Human-IgG,
konjugiert mit Meerettich-Peroxidase. Nach der Substratreaktion wurde die Extinktion der
Lösungen bei 450/630 nm gemessen. Bei der Durchführung des EIA wurde exakt nach
dem beiliegenden Protokoll gearbeitet.
Die Positiv-/Negativ-Entscheidung wurde mittels eines Grenzwertes getroffen, der sich
durch Addition von 0,150 zur mittleren Extinktion der negativen Kontrollen errechnet. War
die Extinktion der Probe gleich oder größer als der Grenzwert, so wurde der
Zellkulturüberstand als Delta-Antigen-positiv angesehen.
41
2.3 DNA-Expressionskonstukte
2.3.1 Die Expressionskonstrukte pSS32 und pSS33
Die Expressionsvektoren pSS32 und pSS33 wurden freundlicherweise von David Lazinski,
Tufts-University, Boston, USA, überlassen. Das Plasmid pSS32 exprimiert das kleine
Delta-Antigen, während pSS33 die große Form des Delta-Antigens exprimiert. Die für das
Delta-Antigen kodierende Sequenz stammt aus den Plasmiden pKW42 und pKW43. Für
die Klonierung von pSS32 und pSS33 wurde nach Restriktionsverdau des pcDNA3
Konstrukts mit den Enzymen Xmn I und Sca I das Neomycin enthaltende Fragment mit
den SpaI-ScaI Fragmenten der Plasmide pKW42/43 ligiert. So stammen in den
Expressionsvektoren pSS32 und pSS33 ein Teil des Ampicillin Resistenzgenes, der CMV
Promotor, der offene Leserahmen für das Delta-Antigen und das Polyadenylationssignal
von den Vektoren pKW42/43, während der Rest des Ampicillin Resistenzgenes und die
Neomycin Resistenzkassette aus dem Vektor pcDNA3 stammen. Der Start des offenen
Leserahmens vom Delta-Antigen befindet sich an Position 695. Die beiden Plasmide
pSS32 und pSS33 unterscheiden sich untereinander nur in einem einzigen Nukleotid:
während in pSS32 in Position 1280 das Triplet TAG und damit ein Stopkodon enthalten ist,
befindet sich an dieser Stelle in pSS33 das Triplet TGG, welches für die Aminosäure
Tryptophan kodiert. Erst 18 Triplets später liegt ein Stopkodon vor. Somit enthält das
Translationsprodukt des Plasmids pSS33 19 Aminosäuren mehr.
2.3.2 Die Expressionskonstrukte pSec32 und pSec33
Um in den immunologischen Experimenten die Immunantworten in den Mäusen nach
DNA-Immunisierung gegenüber dem Wildtyp des Delta-Antigens zu optimieren, wurde
ein Expressionskonstrukt generiert, durch welches das Delta-Antigen sezerniert werden
kann. Hierfür wurde der Expressionsvektor pSecTag (Invitrogen) gewählt. Es handelt sich
um einen 5,2 kb großen Vektor, der speziell für eine hohe Proteinexpression in
Säugetierzellen konstruiert wurde und ein Sekretionssignal der V-J2-C-Region der murinen
42
Ig κ-Leichtkette besitzt. Durch den Vektor pSecTag exprimierte Proteine sind an ihrem Nterminalen Ende mit diesem Sekretionssignal fusioniert.
Abb. 2-1 Expressionsplasmid pSecTag. Um die cDNA eines bestimmten Proteins im korrekten Leseraster
dem Sekretionssignal folgen zu lassen, stehen die um jeweils eine Base verschobenen Formen A, B und C
zur Verfügung. Zur Klonierung der Delta-Plasmide wurde pSecTagB verwendet.
Die cDNA der kleinen bzw. großen Form des Delta-Antigens lag in den
Expressionsplasmiden pSS32 bzw. pSS33 vor. Da die beiden Plasmide sich nur in einem
einzigen Nukleotid unterscheiden, konnte die Klonierung der neuen Expressionskonstrukte
für das kleine und große Delta-Antigen unter den gleichen Bedingungen erfolgen. Durch
gezielte Mutagenese via PCR wurden die für das Delta-Protein kodierenden cDNAFragmente für die nachfolgende Klonierung vorbereitet: so wurde durch den Sense-Primer
CCT 27 (CCT CTA GCC AAG CTT AGC CGG TCC GAG) am 5‘-Ende des DNAFragmentes in Position 695 durch Mutation des Startkodons ATG und des vorangehenden
Triplets eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym Hind III eingebaut. Eine Mutation des
Startkodons war notwendig, da das Startkodon ATG bereits im Sekretionsvektor pSecTaq
vor dem Sekretionssignal enthalten ist (und eine mögliche spätere interne Translation
vermieden werden sollte.). Am 3‘-Ende wurde in Position 1516 durch eine gezielte
Mutation eine Xba I -Schnittstelle eingeführt. Der hierfür verwendete Antisense-Primer
hieß GGC 27 (GGC GTA TCT AGA GGC CCT AGA TTC CGA).
43
Die PCR wurde unter oben genannten Bedingungen durchgeführt (siehe Kap. 2.1.1.2). Mit
der Hind III- und Xba I -Schnittstelle enthielt das amplifizierte PCR-Fragment an seinen
Enden Schnittstellen, die auch in der Klonierungsstelle (multiple cloning site) des
Expressionsvektors pSecTaq vorkommen. Für die Klonierung musste pSecTaqB eingesetzt
werden, da nur so die Delta-cDNA im korrekten Leseraster dem Sekretionssignal folgt.
Nach Isolierung und Aufreinigung der beiden PCR-Fragmente mit dem PCR-Purification
Kit von Qiagen wurden die beiden Delta-Fragmente ebenso wie der Expressionsvektor
pSecTagB mit den Restriktionsenzymen Hind III und Xba I behandelt. Folgende
Restriktionsverdaus wurden für zwei Stunden in einem Wasserbad bei 37ºC angesetzt:
pSecTagB (5 µg)
PCR-Produkt
(jeweils
für
Delta32-/ Delta33-Insert)
DNA
3,4
50
Puffer II, 10x
6
8
Hind III
5
5
Xba I
5
5
BSA, 10x
6
8
H2O
24,6
4
Reaktionsvolumen
50
80
Alle Angaben in µl
Nach zwei Stunden wurde jeweils der gesamte Restriktionsansatz nach Zugabe des
adäquaten Volumens Probenpuffers in eine Tasche eines 1%igen Agarosegels gegeben.
Unter UV-Durchleuchtung wurden dann das 5090 bp lange pSecTagB-Fragment und die
beiden 824 bp langen Delta-Fragmente aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem Gel
Extraction Kit von Qiagen gereinigt.
Zur ungefähren Konzentrationsbestimmung der DNA-Fragmente für die nachfolgende
Ligationsreaktion wurden jeweils 4 µl der gereinigten DNA-Fragmente mit dem DNAGrößenmarker II auf eine Agarosegel aufgetragen und die Konzentrationen wie oben
beschrieben anhand der Bandenstärke bestimmt. Dabei ergaben sich folgende Werte:
pSecTagB: 25 ng/µl; Delta32-Insert: 17 ng/µl; Delta33-Insert: 6 ng/µl.
44
Für die Ligationsreaktion wurden drei verschiedene Ansätze angerichtet: es wurden Insert :
Vektor Verhältnisse von 1:1 molar, 3:1 molar und ein Verhältnis von 1:1 ihrer Massen (bp)
verwendet. Die Ausgangsmenge des linearisierten Vektors pSecTagB betrug 100 ng.
Jeweils 3 Units der T4 DNA-Ligase wurden in der Ligationsreaktion eingesetzt. Als
Negativkontrolle wurde der mit den Restriktionsenzymen Hind III und Xba I verdaute
Vektor pSecTagB ohne das PCR-Produkt inkubiert; als Positivkontrolle diente der nur mit
dem Restriktionsenzym Hind III linearisierte Vektor pSecTagB (Konzentration 0,1 µg/µl).
Folgende Ligationsansätze wurden angerichtet:
Verhältnis
Delta32-Insert
Delta32-Insert
Delta32-Insert
Delta33-
Insert : Vektor
1 : 1 molar
3 : 1 molar
1 : 1 Masse
Insert
1 : 1 molar
Vektor
4,0
4,0
4,0
4,0
Insert
1,0
2,9
5,9
2,6
Ligasepuffer, 10x
1,0
1,0
1,5
1,0
T4 DNA-Ligase
1,0
1,0
1,5
1,0
H2O
3,0
1,1
2,1
1,4
Gesamtvolumen
10,0
10,0
15,0
10,0
Verhältnis
Delta33-Insert
Delta33-Insert
Negativ-
Positiv-
Insert : Vektor
3 : 1 molar
1 : 1 Masse
Kontrolle
Kontrolle
Vektor
4,0
4,0
4,0
8,0
Insert
8,2
16,0
-
-
Ligasepuffer, 10x
2,0
2,5
1,0
1,0
T4 DNA-Ligase
2,0
2,5
1,0
1,0
H2O
3,8
-
4,0
-
Gesamtvolumen
20,0
25,0
10,0
10,0
Alle Angaben in µl
Die Ligationsansätze wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Zur Kontrolle der Ligation und zur Selektionierung eines positiven Klones wurden
kompetente E.coli mit den Ligationsansätzen transformiert und anschließend auf
Ampicillin-haltigen Agarplatten ausgestrichen. Das Transformationsvolumen betrug
45
jeweils 200 µl. Als Positivkontrolle für die Transformation diente der unverdaute Vektor
pSecTagB. Auch die Positiv- und Negativkontrollen der Ligation wurden transformiert.
Nach 24-stündiger Inkubation bei 37ºC wurden von den Agarplatten der Ligationsansätze
1:1 molar, auf denen die meisten Kolonien gewachsen waren, jeweils 8 Kolonien gepickt
und in 4 ml LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin gegeben. Auf den Agarplatten der
Negativkontrollen waren keine Kolonien gewachsen. Die Miniprepkulturen wurden für 15
Stunden im Rotationsinkubator bei 37ºC und 250 rpm inkubiert. Mit Hilfe des Miniprep
Kits von Qiagen wurde schließlich die Plasmid-DNA aus den Flüssigkulturen isoliert
und aufgereinigt. Nach einem Restriktionsverdau mit Hind III und Xba I wurden die
Proben auf einem 1%igen Agarosegel analysiert. Da diese beiden Enzyme das Insert aus
dem Vektor schneiden, sollten auf dem Gel eine etwa 5000 bp und eine etwa 800 bp große
Bande zu sehen sein. Diese Größen entsprechen den Größen des linearisierten Plasmids
pSecTagB (5090 bp) ohne Insert und dem Delta-Insert (824 bp).
2.3.3 Zytokin-Expressionsvektoren
2.3.3.1 pApIL-12p70
Dieses Plasmid exprimiert bipromotorisch das murine Interleukin-12 (mIL-12) und wurde
uns freundlicherweise von Dr. Zuravski, Apollon, Mavern, Ph, USA überlassen.
2.3.3.2 pCI-1sIL-18
Es handelt sich um ein Plasmid, welches eine sezernierbare Form des murine Interleukin18 (mIL-18) exprimiert. Es war ein Geschenk von Dr. R. Schirmbeck, Ulm, Deutschland.
2.3.3.3 pRJB-GM
Dieser Vektor exprimiert das murine GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen-Kolonien
stimulierender Faktor) (233).
46
2.3.3.4 Expressionsstudien mit den Zytokin-Expressionsvektoren
Die Expression der Zytokine IL-12, IL-18 und GM-CSF nach Transfektion von G8-Zellen
mit den oben genannten Expressionskonstrukten wurde in kommerziellen ELISAs
nachgewiesen. Dabei wurden folgende Tests verwendet:
IL-12:
InterTest-12XTM – mIL-12p70 ELISA Kit der Firma Genzyme, USA
IL-18:
Quantikine M – Mouse IL-18 Immunoassay der Firma R&D Systems,
Deutschland
GM-CSF: Mouse ELISA GM-CSF der Firma Endogen, USA
Die Durchführung dieser Tests erfolgte unter freundlicher Unterstützung der Technischen
Assistentin Frau Bleul.
2.4 DNA-Immunisierung von Mäusen
Für die DNA-Immunisierung wurden drei verschiedene Mausstämme verwendet, nämlich
Balb/c (immunologischer Haplotyp H-2d), DBA-2 (H-2d) und C57Bl/6N (H-2b). Es
handelte sich um weibliche Mäuse, die von Charles River Labs (Wilmington, MA, USA)
bezogen wurden. Die Mäuse wurden in den pathogenfreien Tierstallabteilungen des
Neurozentrums der Universitätsklinik Freiburg gehalten. Zum Zeitpunkt der ersten
Immunisierung waren alle Mäuse 6-12 Wochen alt.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Expressionskonstrukte durch intramuskuläre
Injektion, intradermal mittels Genkanone ("gene gun") oder durch Kombination beider
Verfahren appliziert.
47
2.4.1 Intramuskuläre DNA-Immunisierung
Die intramuskuläre Injektion der Plasmid-DNA erfolgte in den rechten oder linken M.
tibialis anterior der Mäuse. Fünf Tage vor Applikation der Expressionskonstrukte wurden
100 µl einer 0,25%igen Lösung des Lokalanästhetikums Bupivacain (Cabosthesin) in
verschiedene Abschnitte des o.g. Muskels der Maus injiziert. Durch Vorinjektion des
Lokalanästhetikums wird eine Muskelzellnekrose und sukzessiv eine Muskelregeneration
hervorgerufen, wodurch eine unspezifische Entzündungsreaktion induziert wird, im
Rahmen derer verschiedene Zellen des Immunsystems samt ihres immunmodulatorischen
Zytokinrepertoirs, wie beispielsweise Antigen-präsentierende Zellen, in das Muskelgewebe
einwandern. Dadurch entsteht ein immunologisch hochaktives Milieu, so dass die nach
DNA-Injektion
stattfindende
Antigenpräsentation
besonders
viele
Zellen
des
Immunsystems erreichen kann (45,48). Es konnte gezeigt werden, dass die intramuskuläre
DNA-Injektion in sich nach Bupivacain-Injektion regenerierenden Muskel im Vergleich
zur
DNA-Applikation
in
normalen
Muskel
zu
einer
etwa
80fach
höheren
Proteinexpression führt (221). Ferner wird angenommen, dass durch Bupivacain in den
Muskelzellen die MHC-Klasse II restringierte Präsentation eines Antigens induziert
werden kann, was die Immunantwort weiter unterstützt.
Fünf Tage nach Bupivacain-Injektion wurden die Expressionskonstrukte in insgesamt 100
µl einer 0.9%igen NaCl-Lösung in denselben Muskel wiederum an 5 verschiedenen Stellen
injiziert. Je nach Studiengruppe wurden dabei pro Maus 100-135 µg Plasmid-DNA
eingesetzt.
2.4.2 Intradermale Applikation der Plasmid-DNA mittels Genkanone
Die intradermale Applikation von Plasmid-DNA durch Beschuss mit kleinen
Goldpartikelchen, die mit der entsprechenden DNA zuvor beschichtet wurden, erfolgte in
der vorliegenden Arbeit mit Hilfe der Helios Gene Gun der Firma BIO-RAD. Diese
Technik wurde zum ersten Mal im Rahmen der Transformation von Pflanzenzellen
beschrieben. Kurz darauf konnte gezeigt werden, dass diese Art der Applikation von
genetischem Material auch auf Bakterienzellen und Eukaryoten in vitro und auch auf
intrazelluläre Organellen übertragbar ist. Heute können durch diese Methode die Zellen
48
nahezu jedes beliebigen Organs nach entsprechender Darstellung bzw. chirurgischer
Freilegung transfiziert werden (3,15,32,99,172). Das Organ der Wahl für die genetische
Immunisierung stellt die Haut dar.
Ein großer methodischer Vorteil gegenüber der intramuskulären DNA-Immunisierung
besteht in der wesentlich geringeren Menge der Plasmid-DNA, die für die Immunisierung
benötigt wird. So werden bei der intradermalen Applikation mittels Genkanone in der
Regel nur etwa 2 µg DNA, während bei der intramuskulären Injektion 100-150 µg DNA
pro Maus appliziert werden. Die Unterschiede zur intramuskulären DNA-Immunisierung
die Immunantwort betreffend wurden bereits in Kapitel 1.2.2 ausführlich geschildert.
Vor der intradermalen Applikation der DNA wurde die Plasmid-DNA an Goldpartikel
gebunden, und die so beschichteten Goldpartikel wurden auf die Innenseite eines dünnen
Teflonschlauches aufgebracht. Bei der Beschichtung der Goldpartikel mit DNA kommt es
im Reaktionsgemisch durch Anwesenheit des Polykations Spermidin und von CaCl2 zur
Präzipitation der in Lösung befindlichen Plasmid-DNA an der Oberfläche der Goldpartikel.
Hierfür wurden entsprechend den Angaben des Herstellers (gene gun optimazation kit,
BIO-RAD, München) 25 µg Goldpartikel mit einem Durchmesser von 1 µm in 100 µl
einer 0,05 M Spermidinlösung in 100% Ethanol resuspendiert. Danach wurden zunächst
100-150 µg DNA in einem Volumen von 100 µl dH2O, dann 100 µl einer 1 M CaCl2Lösung unter leichtem Schütteln hinzugegeben. Nach einer zehnminütigen Inkubation bei
Raumtemperatur wurde dieses Reaktionsgemisch zentrifugiert und die nun mit PlasmidDNA beschichteten Goldpartikel dreimal mit wasserfreiem Ethanol gewaschen. Schließlich
wurden diese Goldpartikel in 3 ml einer Polyvinylpyrrolidon- (PVP-)Lösung in 100%
Ethanol (17,7 µg/ml) resuspendiert. Die Verwendung von wasserfreiem Ethanol ist
essentiell, da die später erfolgende Bindung der Goldpartikel an die Innenseite der
Teflonschläuche durch die Anwesenheit von Wasser erheblich behindert werden würde.
Zur Bindung der Goldpartikel an die Innenseite der Teflonschläuche wurden
Teflonschläuche mit einem Innendurchmesser von 2 mm und einer Länge von 1 m mit der
hergestellten Goldpartikel-Suspension gefüllt, in eine spezielle Vorrichtung ("Tubing Prep
Station") eingespannt, um mittels Stickstoffperfusion getrocknet zu werden, und
schließlich in Stücke von etwa 1,5 cm Länge geschnitten. Die beschichteten
Teflonschlauchstücke wurden bis zur Anwendung bei 4ºC gelagert.
Bevor die an die Goldpartikel gebundene Plasmid-DNA intradermal mittels Genkanone
appliziert wurde, wurden die Mäuse intraperitoneal mit jeweils 75 µl einer
49
Ketamin/Xylazin-Lösung (Ketanest, Rompun) narkotisiert, wobei 100 mg/kg Ketamin
und 16 mg/kg Xylazin eingesetzt wurden. Anschließend wurde den Mäusen das Bauchfell
mittels einer Enthaarungscreme (Veet) entfernt. Die nun freiliegende Bauchhaut konnte
an zwei unterschiedlichen Stellen mit der Genkanone beschossen werden. Hierfür wurde
das Magazin der Genkanone mit den mit den entsprechenden Expressionskonstrukten
beschichteten Teflonschlauchstücken geladen. Per Knopfdruck entlädt sich der von der
Genkanone, welche mit einer Heliumflasche verbunden ist, aufgebaute Druck von 400 psi
(400 pounds per square inch = 276,13 N/cm2), wodurch sich die mit der Plasmid-DNA
beladenen Goldpartikel von der Innenseite der Teflonschläuche lösen und mit hoher
Geschwindigkeit in die Epidermis des freigelegten Bauches der Maus eindringen.
2.4.3 Studienzeitplan der DNA-Immunisierung
2.4.3.1 Durchgang A
In einem ersten Durchgang wurden Balb/c- und C57Bl/6N-Mäuse mit den Plasmiden
pSS32 und pSS33 immunisiert. Die Applikation der Expressionskonstrukte erfolgte
intramuskulär. Die Immunisierungen erfolgten an den Tagen 0 und 30.
Balb/c
C57Bl/6N
pSS32
5
0
pSS33
5
5
Mock-DNA
1
1
Da zum Zeitpunkt der Untersuchung der Mäuse dieses Durchgangs noch keine
Genehmigung für die Experimente mit
51
Cr vorlag, konnte nur die Immunantwort
hinsichtlich der Antikörper und der T-Zellproliferation untersucht werden.
50
2.4.3.2 Durchgang B
Hier erfolgte die Applikation der Plasmid-DNA in einem kombinierten Verfahren aus
intramuskulärer DNA-Immunisierung und intradermaler Applikation der DNA mittels
Genkanone. Die Immunisierungen erfolgten an den Tagen 0, 26 und 48, wobei bei der
ersten und dritten Immunisierung der DNA-Impfstoff intradermal appliziert wurde. Zur
Verstärkung der Immunantwort wurden die für die murinen Zytokine IL-12, IL-18 und
GM-CSF kodierenden Expressionsvektoren mit den Plasmiden pSS33 bzw. pSec33
koappliziert. Es wurden Gruppen zu je 5 Mäuse mit den entsprechenden DNA-Plasmiden
immunisiert. Zur Negativkontrolle wurden drei Balb/c- und zwei C57Bl/6N Mäuse mit
pcDNA3 immunisiert.
Balb/c
C57Bl/6N
pSS32
5
pSS33
5
Psec32
5
5
Psec33
5
5
pSS33 + pApIL-12p70 + pCI-sIL-18 + pRJB-GM
5
pSec33 + pApIL-12p70 + pCI-sIL-18 + pRJB-GM
5
pcDNA3
3
2
Aufgrund zu diesem Zeitpunkt der Arbeit unzureichender Mengen HDAg konnten die
Mäuse dieses Durchgangs nicht auf eine CD4+ T-Helferzell-Antwort untersucht werden.
51
2.5
Charakterisierung
Immunantwort
der
Hepatitis-D-Antigen
spezifischen
2.5.1 Narkose der Mäuse, Blutentnahme und Separation des Serums
Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse mit Isofluran (Forene®,
Abbott) anästhesiert und zur Blutentnahme retrobulbär punktiert. Auf diese Weise erhielt
man etwa 1 ml Blut pro Maus.
Nach einer 5-6stündigen Lagerung bei Raumtemperatur wurde das Blut zur Separation des
Serums von den korpuskulären Bestandteilen zweimal bei 10000 U/min und bei 4ºC für
jeweils 10 Minuten in einer Tischzentrifuge zentrifugiert und das Serum bei -20ºC
gelagert.
2.5.2 Experimente zur Messung der Maus-T-Lymphozyten Funktionen
Fremdantigene können eine spezifische T-Zellaktivierung induzieren. Diese lässt sich in
eine CD8+ T-Helferzell-Antwort und eine CD4+ zytotoxische T-Zell-Antwort unterteilen.
Während die T-Helfer-Funktion in Proliferationsassays charakterisiert werden kann,
bedient man sich zur Messung der CTL-Aktivität des Chromium-Release-Assays.
Hierbei wird die zytotoxische Aktivität in CTL-Precursor Zellen durch eine DNAImmunisierung induziert. Die Erzeugung einer CTL-Antwort in vitro geschieht durch
Kultivierung der in vivo sensibilisierten Effektorzellen inklusive der CTL-Precursor-Zellen
mit einer Population von syngenen Stimulatorzellen, welche das gewünschte Antigen
exprimieren. Die Zellteilung der Stimulatorzellen wird durch Bestrahlung blockiert. Nach
einer Inkubationszeit von 6 Tagen werden die CTLs geerntet; im Chromium-ReleaseAssay wird nun die CTL-Aktivität quantifiziert, wobei mit Chromium markierte
Zielzellen, welche das gewünschte Antigen exprimieren, durch die spezifischen
zytotoxischen Lymphozyten erkannt und lysiert werden. Das dabei durch die getöteten
Zielzellen in den Überstand freigesetzte Chromium wird in einem γ-Zähler registriert und
quantifiziert und die korrigierte prozentuale Lyse errechnet.
52
2.5.2.1 Präparation der Milz und Gewinnung der Effektorzellen für die immunologischen
Assays
Nach der Blutentnahme wurden die Mäuse durch eine Überdosisinhalation von Isofluran
getötet und in 70%igen Alkohol gelegt. Die Milz wurde unter sterilen Bedingungen durch
zwei Hautschnitte, einen längs zur Körperachse, den anderen längs zur Milzachse,
freipräpariert und durch Abtrennung des vorderen und hinteren Ligamentes entnommen.
Mittels eines Glasmörsers wurde aus der Milz eine Zellsuspension erstellt, wobei die
Zellen jeder Milz in jeweils 10 ml IMDM-10 aufgenommen wurden. Um aus dieser
Zellsuspension eine angereicherte Population von T-Lymphozyten zu erhalten, wurde diese
durch ein steriles Nylonnetz mit einer Maschenweite von 200 µm (200 µm-Siebgewebe
aus Polyamid der Firma Reichelt Chemietechnik Heidelberg) gegeben; diese Methode
basiert auf der Tatsache, dass B-Lymphozyten und Makrophagen im Gegensatz zu TLymphozyten an Siebgewebe adhärieren. Zur Vereinfachung der Auszählung der
Lymphozyten wurde, nach fünfminütiger Zentrifugation der Milzzellen bei 1200 UpM, das
Pellet in einem frisch hergestellten Erythrozyten-Lysepuffer (0,83% NH4CL/0,17M TrispH 7,5; beides kurz vor Gebrauch im Verhältnis 10:1 gemischt) resuspendiert und für 10
Minuten bei 37ºC im CO2-Brutschrank inkubiert. Nach zweimaligem Waschen in MEM
(minimum essentiel medium) wurden die nun separierten Leukozyten in 5 ml IMDM-10
aufgelöst. Durch Trypanblau-Färbung wurde die Vitalität der Zellen beurteilt und die
Zellzahl in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Lymphozyten-Zellsuspension
wurde schließlich auf 5x106 Zellen/ml verdünnt und in den nachfolgend beschriebenen
immunologischen Assays eingesetzt.
2.5.2.2 Der T-Zellproliferationsassay
Zur Induktion einer T-Zellproliferation wurden Zellen der Lymphozyten-Suspension mit
drei verschiedenen Delta-Antigen-Konzentrationen in 96-well-Platten mit U-förmigem
Boden für 48 Stunden inkubiert. Hierfür wurden jeweils 5x105 Effektorzellen in 100 µl
IMDM-10 in eine Vertiefung gegeben und rekombinantes Delta-Protein in 100 µl IMDM10 in Konzentrationen von 0 µg/ml, 0,3 µg/ml und 3,0 µg/ml dazupipettiert: für jede
Konzentration wurden Triplikate angesetzt. Schließlich wurde noch 2-Merkaptoethanol in
einer Endkozentration von 5x10-5 M pro Vertiefung hinzugegeben.
53
Nach 48stündiger Inkubation wurde in einem kommerziellen kolorimetrischen
Immunoassay (Cell Proliferation ELISA, BrdU; Boehringer Mannheim) die ZellProliferation quantifiziert. Das Prinzip dieses Tests basiert auf der Messung des an Stelle
des Thymidin in die DNA von proliferierenden Zellen eingebauten Thymidin-Analogons
5-Bromo-2‘-desoxyuridin (BrdU). Dazu wurde BrdU den Proliferations-Ansätzen
hinzugefügt. Nach einer 12stündigen Inkubations-Periode wurden die Zellen zehn Minuten
lang bei 1000 U/min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Mit einer FixierungsLösung aus dem Kit wurden die Zellen fixiert und die DNA denaturiert. Anschließend
wurden die fixierten Zellen mit anti-BrdU-POD, welches an das in die neu synthetisierte
zelluläre DNA inkorporierte BrdU bindet, für 90 Minuten inkubiert. Die Immunkomplexe
wurden in der anschließenden Substratreaktion detektiert und das Reaktionsprodukt nach
Hinzufügung einer 1 M Schwefelsäure als Stop-Lösung durch Messung der Absorption bei
einer Wellenlänge von 450nm in einem ELISA-Reader gemessen. Alle Messwerte wurden
als Mittelwert aus den Triplikaten angegeben. Die Hintergrund-Proliferationsaktivität
(gemessene Proliferation in Gegenwart von Medium alleine ohne Zellen) wurde jeweils
vom tatsächlichen Absorptionswert abgezogen.
2.5.2.3 Der Zytotoxizitätsassay
2.5.2.3.1 in vitro Stimulation der zytotoxischen T-Lymphozyten
Die in vivo durch die DNA-Immunisierung aktivierten zytotoxischen T-Lymphozyten
wurden in vitro durch Stimulationszellen stimuliert. Hierbei dienten als Stimulationszellen
P815δ33-Zellen, die das große Delta-Antigen stabil exprimieren. Das Verhältnis von
Effektorzellen zu Stimulationszellen betrug bei den Experimenten 4:1. Die Zellteilung der
bei der Stimulation der Lymphozyten eingesetzten Stimulationszellen wurde durch gammaBestrahlung bei 8000 rad gehemmt und somit eine unkontrollierte Proliferation verhindert.
Dabei wurde die Antigen-Präsentationskapazität dieser Zellen nicht beeintächtigt.
Die Stimulation der Effektorzellen erfolgte in 24-well-Platten. Hierbei wurden pro MausLymphozyten-Suspension zehn Ansätze angelegt: pro Vertiefung wurden 4x106 der zuvor
auf 5x106 verdünnten Effektorzellen mit 1x106 der auf 1x106 nach der Bestrahlung
verdünnten Stimulationszellen in einem Gesamtvolumen von 2 ml komplettem IMDM
54
gemischt. Auch hier wurde 2-Merkaptoethanol in einer Endkonzentration von 5x10-5 M
hinzugegeben. Außerdem wurde nach 24 Stunden zu jedem Ansatz 10 U/ml rekombinantes
Interleukin-2
der
Fa.
Boehringer
Mannheim
gegeben.
Insgesamt
wurden
die
Stimulationsansätze fünf Tage lang bei 37ºC in einem CO2-Brutschrank kultiviert.
2.5.2.3.2 Chromium-Release-Experiment zur Messung der CTL-Aktivität
Die Antigen-spezifische zytotoxische Aktivität der Lymphozyten wurde im ChromiumRelease-Experiment untersucht. In diesem Versuch wurden die Zielzellen mir 51Cr markiert
und
nach
mehreren
Waschschritten
mit
den
Effektorzellen
in
verschiedenen
Effektor:Zielzellen Verhältnissen gemischt. Schließlich wurde die in den Überstand durch
die getöteten Zielzellen abgegebene Menge an 51Cr quantifiziert. Durch Vergleich mit der
51
Cr-Freisetzung von Kontrollen wurde die korrekte prozentuale Lyse für jede
Konzentration von Effektorzellen errechnet.
Als Zielzellen dienten P815δ33-Zellen sowie zur Erfassung der unspezifischen Lyse
P815LS-Zellen, die das große Hüllprotein des Hepatitis-B-Virus stabil exprimieren. Nach
Aufnahme der Zellen in 150 µl IMDM-10 wurden diese für eine Stunde bei 37ºC im CO2Brutschrank mit 100 µl
51
Cr, bei einer Aktivität von 5 mCi/ml, inkubiert. Die Zielzellen
wurden zweimal gewaschen, schließlich in IMDM-10 resuspendiert und auf eine
Konzentration von 105 Zellen/ml eingestellt. Die Inkubation der mit
51
Cr-markierten
Zielzellen mit den Effektorzellen wurde in 96-well-Platten angesetzt. Dabei wurden
Effektor:Zielzellen-Verhältnisse von 20:1 und 5:1 gewählt und für jedes Verhältnis
Triplikate angesetzt. Dementsprechend mußten die Lymphozyten, nachdem alle zehn
Ansätze einer Mauslymphozyten-Suspension zusammengefügt worden waren, auf eine
Konzentration von 107 Zellen/ml eingestellt werden. Nun wurden in einer Vertiefung der
96-Well-Platte jeweils 104 Zielzellen mit der entsprechenden Menge an Effektorzellen,
also 0,2x106 bzw. 0,05x106 Lymphozyten in einem Gesamtvolumen von 200 µl gemischt.
Zur Ermittlung der spontanen Freisetzung von 51Cr aus den Zielzellen wurden diese ohne
weitere Zusätze in 200 µl IMDM-10 inkubiert. Eine maximale Freisetzung von 51Cr wurde
erreicht, indem die Zielzellen mit 5% Triton X-100 gemischt wurden. Um einen optimalen
Kontakt zwischen den Effektor- und Zielzellen zu gewährleisten, wurden die Ansätze für
einige Sekunden bei 1000 UpM zentrifugiert, und schließlich wurden die Platten im CO2Brutschrank für 5 Stunden inkubiert.
55
Nach dieser Inkubationsperiode wurden die Platten eine Minute lang bei 1000 U/min
zentrifugiert und jeweils 100 µl des Überstandes in gamma-Zähl-Röhrchen überführt. Die
51
Cr-Aktivität wurde schließlich in einem Gamma-Zähler bestimmt.
Die spezifische
51
Cr-Freisetzung, also die Prozentzahl der spezifischen Lyse, wurde nach
Ermittlung der Mittelwerte der angesetzten Triplikate folgendermaßen berechnet:
Spezifische 51Cr-Freisetzung =
(Experimentelle
51
Cr-Freisetzung - spontane
51
Cr-Freisetzung) : (maximale
51
Cr-
Freisetzung - spontane 51Cr-Freisetzung) x 100%.
Dabei repräsentiert die "experimentelle 51Cr-Freisetzung" die mittlere 51Cr-Freisetzung aus
den Zielzellen in Anwesenheit der Effektorzellen. Die "maximale
51
Cr-Freisetzung" stellt
die gemessene Radioaktivität nach Lyse der Zielzellen mittels 5% Triton X-100 dar und
mit "spontaner 51Cr-Freisetzung" wird die durch die Zielzellen allein ohne jegliche Zusätze
in den Überstand freigesetzte Radioaktivität bezeichnet.
2.5.3 Bestimmung von anti-Delta Antikörpern im Serum der immunisierten Mäuse
Zur qualitativen Bestimmung der Gesamt-Antikörper gegen das Delta-Antigen wurde ein
kommerzieller Enzymimmunoassay (Anti-Delta-EIA, Abbott) verwendet.
Es handelt sich hierbei um einen kompetitiven Enzymimmunoassay, bei dem mit DeltaAntigen beschichtete Kugeln mit dem Serum der Mäuse, bzw. mit geeigneten Kontrollen
und mit anti-Delta, das mit Meerettich-Peroxidase konjugiert ist, inkubiert werden.
Die Inkubationszeit betrug 20 Stunden. Durch Waschen der Kugeln mit dH2O mittels einer
Absaugvorrichtung der Fa. Abbott wurde ungebundenes Material entfernt. Im nächsten
Schritt wurde o-Phenylendiamin-Lösung (OPD), die Wasserstoffperoxid enthält, zu den
Kugeln hinzugegeben. Nach einer 25minütigen Inkubation wurde die Enzymreaktion
durch Zugabe von 1N Schwefelsäure der Fa. Abbott gestoppt und die Extinkton der
Kontrollen und Proben mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 492nm
bestimmt.
Die Extinktionswerte wurden mit einem Grenzwert verglichen: 4/10 des Mittelwertes der
Negativkontrollen plus 6/10 des Mittelwertes der Positivkontrollen. Dabei wurde als
56
Positivkontrolle rekalzifiziertes Humanplasma reaktiv für anti-Delta durch den Kit
bereitgestellt. Als Negativkontrolle wurden Seren von Mock-immunisierten Mäusen
verwendet. Proben mit Extinktionswerten größer als der Grenzwert wurden als anti-Deltanegativ betrachtet. Falls der Extinktionswert gleich oder kleiner als der Grenzwert war,
galt die Probe als anti-Delta-positiv.
Außerdem wurden die Seren der Mäuse in einem Western Blot gegen denaturiertes DeltaAntigen auf spezifische Antikörper hin untersucht.
2.6 Etablierung eines syngenen murinen Tumormodells
Das Tumormodell wurde in DBA-2-Mäusen mit Hilfe von H-2d-syngenen P815Mastozytomzellen etabliert. Wichtig hierbei war, dass die verwendeten Tumorzellen MHCKlasse I Moleküle ausreichend stark exprimieren, da ein Tumormodell im Rahmen der
genetischen Immunisierung, wo es vor allem auf die Aktivierung spezifischer
zytotoxischer T-Zellen ankommt, nur dann Sinn macht. Bei manchen Tumoren kann es
nämlich im Rahmen der immunologischen Tarnung zu einer Verminderung und sogar zum
vollständigen Sistieren der MHC-I-Expression durch die Tumorzellen kommen. Die MHCI-Expression der verwendeten P815-Zellen wurde mittels FACS-Analyse ("fluorescence
activated cell sorting") durch Tim Krohne überprüft. Hierbei konnte eine starke MHCKlasse I Expression in den P815δ32, P815δ33 und P815LS Zellen nachgewiesen werden.
2.6.1 Subkutane Tumorzellimplantation
Für das in vivo Tumor-Modell wurden Mastozytomzellen, die das HDAg bzw. LHDAg
stabil exprimieren (P815δ32 und P815δ33), verwendet. Als Negativkontrolle dienten
P815LS-Zellen, welche das große Hüllprotein des HBV stabil exprimieren.
Zunächst wurden die nicht- bzw. semi-adhärent wachsenden P815-Zellen mit einer 10 mlPipette in frischem Medium vorsichtig durch langsames auf- und abpipettieren vom Boden
der Petrischalen abgespült und durch Abzentrifugieren und Resuspendieren zweimal mit
57
serumfreien Medium gewaschen. Nach Auszählung der lebenden Zellen wurde in
serumfreiem DMEM-Medium eine Zellkonzentration von 105 Zellen/µl eingestellt. Von
dieser Zellsuspension wurden den Mäusen jeweils 10 µl, also 106 Tumorzellen, subkutan in
die rechte Flanke injiziert. Auf diese Weise konnte in 100% der Mäuse ein
Tumorwachstum induziert werden, wobei nach 10 Tagen der Tumor sichtbar war.
Durchschnittlich alle zehn Tage wurde die Tumor-Inzidenz überprüft und die Größe der
subkutan wachsenden Tumoren mit einer Präzisionsschieblehre bestimmt. Das Volumen
der Tumoren wurde nach Messen der ventrodorsalen (vd), laterolateralen (ll) und
kraniokaudalen (kk) Ausdehnung der Tumoren mit Hilfe der Volumenformel für
dreidimensionale Ellipsoide berechnet: Vol = 0,5 x vd x ll x kk. Eine Tumorgröße von etwa
3000 mm3, welche ohne spezifische DNA-Immunisierung durchschnittlich nach 40 Tagen
erreicht wurde, wurde als Endpunkt definiert, bei dem die Mäuse geopfert wurden.
2.6.2 Studienzeitplan
In dieser Versuchsreihe erfolgte die DNA-Immunisierung intramuskulär, es wurde eine
Booster-Immunisierung nach 14 Tagen durchgeführt. Es wurden zwei identische Kohorten
(a und b) von verschiedenen Gruppen (1-8) von DBA-2 Mäusen gebildet, wobei in jeder
Gruppe 5 Mäuse enthalten waren. Die Immunisierung erfolgte nach folgendem Schema:
Gruppe 1 a/b
Immunisierung mit rekombinantem Delta-Antigen (je 1 Maus)
Gruppe 2 a/b
75 µg pcDNA3 + 25 µg pRJB-GM + 25 µg pAp-IL18
Gruppe 3 a/b
75 µg pSS32 + 25 µg pRJB-GM + 25 µg pAp-IL18
Gruppe 4 a/b
75 µg pSS33 + 25 µg pRJB-GM + 25 µg pAp-IL18
Gruppe 5 a/b
75 µg pSec32 + 25 µg pRJB-GM + 25 µg pAp-IL18
Gruppe 6 a/b
75 µg pSec33 + 25 µg pRJB-GM + 25 µg pAp-IL18
Gruppe 7
75 µg pSS32 + 25 µg pRJB-GM + 25 µg pAp-IL18
Gruppe 8
75 µg pSec32 + 25 µg pRJB-GM + 25 µg pAp-IL18
Die Tumorzellen wurden 10 Tage nach der letzten Immunisierung injiziert, und zwar P815
δ32-Zellen (Kohorte a) und P815δ33-Zellen (Kohorte b) in die rechte Flanke der Mäuse
der Gruppen 1-6 und P815LS-Zellen in die rechte Flanke der Mäuse der Gruppen 7-8.
58
Entweder nach Erreichen der Tumorendgröße von 3000 mm3 oder spätestens nach 50
Tagen wurden die Mäuse getötet. Die Aufarbeitung des Serums, die Präparation der
Milzzellen und die anschließende Stimulation erfolgten nach den in Kap. 2.5 ausführlich
beschriebenen
Protokollen.
Die
Stimulation
Effektor:Zielzellen-Verhältnis von 20:1.
erfolgte
diesmal
nur
mit
einem
59
3 Ergebnisse
3.1 In vitro Ergebnisse
3.1.1 Präparation der Plasmide pSS32 und pSS33
In verschiedenen Ansätzen wurden insgesamt jeweils etwa 20 mg der Plasmide pSS32 und
pSS33 präpariert. Dabei wurden für jede neue Plasmid-Präparation in Glycerolstocks
gelagerte, mit den entsprechenden Plasmiden zu Beginn der Arbeit transformierte
Bakterien verwendet. Um die Spezifität der Plasmid-Präparation zu überprüfen, wurde
nach jeder Vermehrung der Plasmide pSS32 und pSS33 ein Restriktionsverdau mit dem
Enzym pVu I durchgeführt. Da dieses Enzym in beiden Plasmiden eine einzige
Schnittstelle besitzt und es somit zu einer Linearisierung der Plasmide kommt, konnte
durch Bestimmung der Größe des Fragmentes, die bei 5273 bp liegen sollte, in einer
Gelelektrophorese die korrekte Plasmid-Präparation verifiziert werden. In allen Fällen
ließen sich die Fragmente entsprechender Größe nachweisen. Die Gelelektrophorese der
linearisierten Plasmide pSS32 und pSS33 ist exemplarische in Abb. 3-1 dargestellt.
A
6108 bp
5090 bp
4072 bp
B
C
D
E
F
A:
B:
C:
D:
E:
F:
Molekularmarker X
pcDNA3 + pVu I
pSS32
pSS32 + pVu I
pSS33
pSS33 + pVu I
Abb. 3-1 Gelelektrophorese der Plasmide pSS32 und pSS33. Während die Spuren C und E die
unverdauten Plasmide zeigen, sind unter D und F die nach einem Restriktionsverdau mit dem Enzym pVu I
linearisierten Plasmide pSS32 und pSS33 dargestellt; die Banden liegen zwischen 5000 und 6000 bp, was
der Größe der Plasmide von 5273 bp entspricht. Spur B zeigt den Kontrollverdau von pcDNA3 mit pVu I.
60
Außerdem wurde der Anteil der geschlossenen zirkulären DNA an der Gesamtmenge der
Plasmid-DNA bestimmt. Da nur die geschlossene zirkuläre, auch "supercoiled" DNA für
effiziente Zelltransfektionen in vitro und in vivo geeignet ist, sollten mindestens 80% der
DNA-Präparation aus geschlossener zirkulärer DNA bestehen. Der Anteil an relaxierter
zirkulärer DNA sollte nicht größer als 15% sein. Bakterielle genomische DNA darf
überhaupt nicht nachweisbar sein. Wie in Abb. 3-1 zu sehen ist, beträgt der Anteil an
geschlossener zirkulärer DNA an der gesamten Plasmidmenge von pSS32 und pSS33
deutlich mehr als 90%. Daher konnte auf eine zusätzliche Aufreinigung der DNA über
einen CsCl-Gradienten verzichtet werden. Hochmolekulare DNA als Hinweis für eine
bakterielle Kontamination ist nicht sichtbar.
Als
Maß
für
die
Reinheit
der
Präparation
wurde
der
Quotient
aus
der
spektrophotometrischen Absorption bei 260 nm und bei 280 nm gebildet. Werte über 1,8
wurden als kontaminationsfrei angesehen. Die hergestellten Präparationen wiesen einen
Quotienten zwischen 1,823 und 2,069 auf, was auf die Gegenwart reiner Plasmid-DNA
hinweist.
3.1.2 Charakterisierung der Expression des Delta-Antigens durch pSS32 und
pSS33
Eine intrazelluläre Expression sowohl des kleinen als auch des großen Delta-Antigens
konnte nach Transfektion mit pSS32 bzw. pSS33 Konstrukten in G8-, Huh7- und LMHZellen mittels Western-Immunoblot Analyse und Immunfluoreszenz nachgewiesen werden.
Für den Expressionsnachweis im Western Blot wurden die Proteine nach Zelllyse und
Denaturierung mit Hilfe einer SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine Nitrozellulosemembran
übertragen und schließlich mit einem polyklonalen anti-Delta rabbit-Antikörper und einem
Peroxydase gekoppelten anti-rabbit Antikörper untersucht.
Wie die Abb. 3-2 zeigt, sind beide Formen des Delta-Proteins in den Zellysaten sowohl
von G8- als auch von Huh-7 Zellen nachweisbar. Deutlich zu sehen sind die der Größe der
beiden Proteine entsprechenden Banden bei 24 und 27 kD. Dagegen ist in der
Negativkontrolle (Mock), d.h. im Zelllysat der mit pcDNA3 transfizierten Zellen, keine
61
spezifische immunreaktive Bande zu sehen. Auch die Expression der beiden Plasmide in
LMH-Zellen konnte mit dieser Methode nachgewiesen werden (hier nicht abgebildet).
A
B
C
D
E
41 kD
A: Mock
B: pSS32 in G8
C: pSS32 in HUH-7
D: pSS33 in G8
E: pSS33 in HUH-7
29 kD
19 kD
15 kD
Abb. 3-2 Western-Immunoblot zum Nachweis der Delta-Proteine in Zelllysaten von transfizierten G8und Huh7-Zellen. Die immunreaktiven Banden kennzeichnen das große und das kleine Delta-Antigen. Als
Negativkontrolle (Mock) ist das Lysat von Zellen, die mit pcDNA3 transfiziert wurden, aufgetragen.
Zur Erstellung einer Expressionskinetik des Delta-Proteins wurden transfizierte G8- und
Huh7-Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten geerntet. Um die Menge an exprimiertem
Delta-Antigen in den unterschiedlichen Zelllysaten miteinander vergleichen zu können,
musste im Western Blot die gleiche Proteinmenge, was einer gleichen Zellzahl in den
Lysaten entspricht, verwendet werden. Daher wurden nach einer Proteinquantifizierung im
Bio-Rad
Protein
Assay
die
Lysate
zur
Erreichung
annähernd
gleicher
Proteinkonzentrationen entsprechend ihres Proteingehalts mit dH2O verdünnt. Die Abb. 33 zeigt deutlich, dass zwölf Stunden nach Transfektion Delta-Antigen noch nicht in den
Zellen nachweisbar ist. Danach scheint das Delta-Protein sowohl in seiner kleinen als auch
in seiner großen Form von den Zellen konstant exprimiert zu werden; auch nach 96
Stunden ist noch Delta-Antigen in den Zellen vorhanden. Nachfolgend ist exemplarisch die
Expressionskinetik in Huh7-Zellen abgebildet. Der Western-Immunoblot der G8-Zellen
zeigte ein vergleichbares Bild.
62
Mock
12 h
24 h
36 h
48 h
72 h
96 h
42 kD
29 kD
19 kD
15 kD
Abb. 3-3 Expressionskinetik des großen Delta-Antigens in Huh7-Zellen.
Mock
12 h
24 h
36 h
48 h
72 h
96 h
42 kD
29 kD
19 kD
15 kD
Abb. 3-4 Expressionskinetik des kleinen Delta-Antigens in Huh7-Zellen.
Auch mittels Immunfluoreszenz konnte die Expression der Delta-Antigene in G8- und
LMH-Zellen nachgewiesen werden. Nach Fixierung der transfizierten Zellen auf
Deckgläsern wurden diese mit einem anti-Delta rabbit-Antikörper und anschließend mit
einem FITC anti-rabbit Antikörper behandelt. In den Abb. 3-6 und 3-7 sind exemplarisch
mit dem Plasmid pSS33 transfizierte G8- und LMH-Zellen abgebildet. Deutlich ist die
zytoplasmatische Akkumulation des Delta-Antigens in den transfizierten Zellen zu sehen.
Dagegen war in den mit dem Plasmid pcDNA3 transfizierten Zellen kein spezifisches
Signal zu erkennen (hier nicht abgebildet).
63
Abb. 3-6 (links), 3-7 (rechts) Immunfluoreszenz von G8- (Abb. 3-6) und LMH-Zellen (Abb. 3-7) nach
Transfektion mit pSS33. Nach Transfektion von G8- und LMH-Zellen mit dem Plasmid pSS33 wurden
diese mit einem anti-Delta rabbit-Antikörper und anschließend mit einem FITC anti-rabbit Antikörper
behandelt.
Vor dem Hintergrund, in den immunologischen Studien eventuell Mäuse mit Plasmiden,
die für das kleine bzw. das große Delta-Antigen kodieren, kozuimmunisieren, um den
Effekt dieser Koimmunisierung im Vergleich zu einer Immunisierung mit einem Plasmid
allein auf die Immunantwort zu beobachten, wurden in den in vitro Experimenten G8- und
Huh7-Zellen mit pSS32- und pSS33-Konstrukten kotransfiziert.
A
41 kD
29 kD
B
C
D
E
F
A: Mock
B: pSS32
C: pSS33
D: pSS32 + pSS33 1:1
E: pSS32 + pSS33 3:1
F: pSS32 + pSS33 1:3
19 kD
15 kD
Abb. 3-8 Koexpression des kleinen und großen Delta-Antigens in G8-Zellen. G8-Zellen wurden mit
pSS32 (B) bzw. pSS33 (C) allein und mit den unter D-E angegebenen Verhältnissen kotransfiziert.
Anschließend wurden die Zelllysate in einem Western-Immunoblot untersucht.
Die Abb. 3-8 zeigt deutlich, dass - unabhängig von der eingesetzten Zelllinie - je nach
Verhältnis, mit dem die Zellen mit den beiden Plasmiden kotransfiziert wurden,
64
entsprechende Mengen Delta-Antigen in der kleinen bzw. großen Form exprimiert werden.
So sind nach Transfektion mit den beiden Konstrukten im Verhältnis 1:1 die Banden für
das kleine und große Delta-Antigen gleich groß. Die beiden Formen des Delta-Antigens
scheinen sich also nicht untereinander in ihrer Expression nach einer Kotransfektion in
vitro zu beeinflussen.
3.1.3 Klonierung der Expressionsvektoren pSec32 und pSec33
Als Ausgangsmaterial für die Amplifikation der Delta-Fragmente dienten die Plasmide
pSS32 und pSS33. Mittels PCR wurde die cDNA der kleinen bzw. großen Form des DeltaAntigens aus diesen Plasmiden herausamplifiziert. Die amplifizierten DNA-Fragmente
wurden mit Hilfe des PCR-Purification Kit isoliert und aufgereinigt. Abb. 3-9 zeigt ein
Kontrollgel der aufgereinigten Delta-Fragmente: in Spur B und C weisen die Banden auf
das Vorliegen der 824 bp großen Delta-Fragmente hin.
A
1804 bp
1584 bp
1387 bp
947 bp
831 bp
B
C
D
1636 bp
1018 bp
A: Molekularmarker III
B: Insert kleines Delta
C: Insert großes Delta
D: Molekularmarker X
517 bp
Abb. 3-9 Kontrollgel nach PCR. Am Bandenmuster erkennt man deutlich, dass die Delta-Fragmente
erfolgreich mittels PCR aus den Plasmiden pSS32 und pSS33 herausamplifiziert werden konnten.
Die beiden Delta-Fragmente wurden ebenso wie der Expressionsvektor pSecTagB mit den
Restriktionsenzymen Hind III und Xba I behandelt und nach elektrophoretischer
Auftrennung mit dem Gel-Extraction-Kit aus dem Agarosegel eluiert, aufgereinigt und als
HindIII-XbaI Fragment in die Klonierungsstelle des linearisierten Expressionsvektor
65
pSecTaqB ligiert. Die so neu entstandenen Expressionskonstrukte wurden als pSec32 und
pSec33 bezeichnet.
Nach Transformation von kompetenten E.coli Zellen mit dem Ligationsansatz wurden
jeweils acht Kolonien (siehe auch Kap. 2.1.3.2) gepickt, und in einem Miniprep wurde die
präparierte DNA nach einem Restriktionsverdau mit den Enzymen Hind III und Xba I
untersucht. Am charakteristischen Fragmentmuster konnte man deutlich erkennen, dass
alle Klone positiv waren.
Jeweils ein Klon für das kleine und das große Delta-Antigen wurde für die weitere
Plasmid-Präparation verwendet. Diese wurden zunächst durch Behandlung mit
verschiedenen Enzymen genau in Bezug auf die Insertion der Delta-Fragmente in den
Expressionsvektor pSecTagB untersucht.
A
B C
D
E
F
G H
I
J K
L M
6108 bp
5090 bp
1018 bp
A:
B:
C:
D:
E:
F:
G:
H:
I:
J:
K:
L:
M:
pSec32
pSec32 + Hind III
pSec32 + Xba I
pSec32 + Hind III + Xba I
pSec33
pSec33 + Hind III
pSec33 + Xba I
pSec33 + Hind III + Xba I
pSecTag
pSecTag + Hind III
pSecTag + Xba I
pSecTag + Hind III + Xba I
Molekularmarker X
Abb. 3-10 Gelelektrophorese der Plasmide pSec32 und pSec33 nach Klonierung. Der Restriktionsverdau der Plasmide pSec32 und pSec33 mit Hind III oder pVu I allein führt zu einer Linearisierung der
Vektoren. Nach Behandlung der Plasmide mit beiden Endonukleasen gemeinsam sind 2 Fragmente zu
erkennen, die zum einen den leeren Backbone-Vektor, zum anderen das 824 bp große Delta-Insert darstellen.
Auf den Spuren J-L ist als Kontrolle der mit den gleichen Restriktionsendonukleasen behandelte Vektor
pSecTagB zu sehen. Durch den Restriktionsverdau mit beiden Enzymen wird ein nur sehr kleines, etwa 40
bp großes Fragment herausgeschnitten, da Hind III und pVu I innerhalb der "multiple cloning site" von
pSecTagB entsprechend dicht beieinander liegen.
Die Abb. 3-10 zeigt die Gelelektrophorese des analytischen Restriktionsverdaus der beiden
neuen Expressionskonstrukte und bestätigt die korrekte Insertion der Delta-Fragmente.
Während der Restriktionsverdau der Plasmide mit der Restriktionsendonuklease Hind III
bzw. Xba I allein zu einer Linearisierung der 5914 bp großen Plasmide führt (Spuren B,C
66
und F,G), ergibt der analytische Verdau mit beiden Restriktionsendonukleasen zusammen
ein charakteristisches Fragementmuster: in Spur D und H spiegelt die untere
Fragmentgröße das 824 bp große Delta-Insert wider, während die obere den 5090 bp
großen, linearisierten Vektor pSecTagB ohne Insert darstellt. Außerdem weist die Spur mit
den unverdauten Plasmidpräparationen pSec32 und pSec33 (A,E) keine hochmolekularen
Banden auf und zeigt deutlich, dass über 90% der DNA in geschlossener zirkulärer Form
vorliegt, was, wie bereits oben erwähnt, für eine effiziente Zelltransfektion in vitro und in
vivo von Bedeutung ist.
Nach
Vermehrung
der
Plasmide
im
großen
Maßstab
zeigte
der
analytische
Restriktionsverdau das gleiche Bild. Die spektrometrische Konzentrationsbestimmung der
in 0,15 M Tris-Cl (pH 8,5) eluierten Plasmide ergab 4,31 µg/µl für pSec32 und 4,67 µg/µl
für pSec33. Der Quotient aus der spektrophotometrischen Absorption bei 260 nm und bei
280 nm von 1,90 (pSec32) und 1,89 (pSec33) wies auf die Gegenwart reiner Plasmid-DNA
hin.
Die erfolgreiche Klonierung der Expressionsplasmide pSec32 und pSec33 wurde durch
kommerzielle Sequenzierung beider Vektoren bestätigt. Dabei konnten für beide Vektoren
ein intakter ORF ohne Mutationen im Bereich der Aminosäure-Sequenz demonstriert
werden.
3.1.4 Expressionsstudie mit den Plasmiden pSec32 und pSec33
Auch die Expression des kleinen bzw. großen Delta-Antigens durch die neu klonierten
Konstrukte pSec32 und pSec33 in G8- und LMH-Zellen wurde im Western Immunoblot
Assay überprüft. Da durch diese Expressionsvektoren das Translationsprodukt auch
sezerniert wird, wurde der Überstand in einem Delta-Antigen spezifischen EIA auf
Vorhandensein der beiden Formen des Delta-Antigens untersucht.
Um festzustellen, ob die neu klonierten Konstrukte das Delta-Antigen auch korrekt
exprimieren, wurden LMH-Zellen mit diesen Plasmiden transfiziert. Nach 48 Stunden
wurde der Überstand gesammelt und die Zellen in Corelysis-Puffer lysiert. Ein Teil der
Lysate wurde im Western Blot auf das Delta-Antigen untersucht, während der andere Teil
67
der Lysate der LMH-Zellen mitsamt des Überstandes im EIA auf das Vorhandensein von
Delta-Antigen überprüft wurde.
Tatsächlich sezernierten die mit den Expressionskonstrukten pSec32 und pSec33
transfizierten LMH-Zellen große Mengen an Delta-Protein in den Überstand (Abb. 3-11).
Das Lysat und der Zellkulturüberstand von mit pSecmAFP transfizierten Zellen (Mock)
war negativ.
2,5
2
Extinktion
Überstand Mock
Überstand pSec32
1,5
Überstand pSec33
Lysat Mock
1
Lysat pSec32
Lysat pSec33
0,5
0
Abb. 3-11 Delta-Antigen spezifischer EIA zum Nachweis von Delta-Antigen im Lysat und Überstand
von LMH-Zellen nach Transfektion mit pSec32 bzw. pSec33. Als Negativkontrolle diente das Lysat und
der Überstand von LMH-Zellen, welche mit dem Plasmid pSecmAFP transfiziert wurden.
A
41 kD
B
A: pSec32
B: pSec33
29 kD
19 kD
Abb. 3-12 Western-Immunoblot zum Nachweis der Delta-Antigene in Lysaten von LMH-Zellen nach
Transfektion mit pSec32 und pSec33.
68
Der Western Immunoblot bestätigte die spezifische Expression der Delta-Antigene sowohl
in G8- als auch in LMH-Zellen. In Abbildung 3-12 sind in Spur A und B die spezifischen
immunreaktiven Banden für das kleine und große Delta-Antigen zu erkennen. Wie zu
erwarten sind die Proteine um den Anteil größer, der durch das Sekretionssignal gebildet
wird.
3.1.5 Expression des Delta-Antigens in stabil transfizierten P815-Zellen
Bevor die das Delta-Antigen stabil exprimierenden P815δ32- und P815δ33-Zellen in den
Zytotoxizitätsexperimenten zur Stimulation der in vivo aktivierten T-Lymphozyten und als
Zielzellen im Chromium-Release-Experiment eingesetzt wurden, wurde jedesmal im
Western Immunoblot die korrekte Expression des Delta-Antigens in diesen Zellen
verifiziert. Als Negativkontrolle dienten die mit dem großen Hüllprotein des HBV stabil
transfizierten P815LS-Zellen. In Abb. 3-13 ist die Expression des kleinen und großen
Delta-Antigens in P815-Zellen dargestellt.
A
B
C
42 kD
29 kD
A: Mock
B: P815-Delta33-14
C: P815-Delta32-14
19 kD
Abb. 3-13
Western-Immunoblot zum Nachweis von Delta-Antigen in Lysaten von P815δ32- und
P815δ33-Zellen. Nach stabiler Transfektion von P815-Zellen mit den Delta-Plasmiden pSS32 und pSS33
wurde im Western Blot die korrekte Expression verifiziert. Man erkennt die spezifischen Banden bei 27 kD
bzw. 24 kD.
Außerdem wurde zu Beginn der Arbeit eine Immunfluoreszenz der P815δ33-Zellen
angefertigt. Auch mit dieser Methode konnte die Expression des Delta-Antigens in den
stabil transfizierten Zellen nachgewiesen werden.
69
3.1.6 Expressionsstudien der Zytokin-Expressionsvektoren
Die mit den Plasmiden pApIL-12p70, pRJB-GM und pCI-sIL-18 transfizierten G8-Zellen
sezernierten große Mengen von p70-IL-12 Dimeren, GM-CSF und reifem IL-18 in das
Zellkultur-Medium, was mit spezifischen kommerziellen ELISAs determiniert wurde.
6
5
ng/ml
4
pCMV-EGFP
pApIL-12p70
3
pRJB-GM
pCI-sIL-18
2
1
0
Zytokin-Expressionsvektoren
Abb. 3-14 Expressionsnachweis der Zytokine IL-12, IL-18 und GM-CSF nach Transfektion von G8Zellen im Zellkulturüberstand. Verwendet wurden spezifische kommerzielle ELISAs.
3.2 In vivo Ergebnisse
3.2.1 DNA-Immunisierung
Alle immunisierten Mäuse tolerierten sowohl die intramuskuläre Bupivacain- als auch die
DNA-Injektionen ohne Probleme. Die Tiere waren bereits nach einigen Minuten wieder
mobil, und auch eine Beeinträchtigung des Gesundheitszustandes konnte nicht beobachtet
werden.
70
Ebenso haben die Mäuse die intraperitoneale Narkose mit der Ketamin/Xylazin-Lösung
und die Immunisierung mit der Genkanone gut überstanden. Die Narkose dauerte
durchschnittlich 30 Minuten. Die vollständige Erholung der Mäuse nach Narkose betrug
ein bis anderthalb Stunden. In dieser Zeit zeigten sich regelmäßig Störungen der
Koordination und Motilität. Danach war das Verhalten der Mäuse wieder normal, auch die
Nahrungsaufnahme stellte sich wieder ein. Ebenso wenig konnten längerfristige
Schädigungen beobachtet werden.
3.2.2 Humorale Immunantwort auf HDV Delta Proteine
Im Serum sowohl der Balb/c als auch der C57Bl/6 Mäuse konnten weder gegen das kleine
Delta- noch gegen das große Delta-Antigen nach genetischer Immunisierung Deltaspezifische Antikörper nachgewiesen werden. Auch nach Immunisierung mit den
Plasmiden pSec32 und pSec33, die für sezernierte Formen des HDAg bzw. LHDAg
kodieren, waren die Sera durchgehend negativ für anti-Delta Antikörper. Ebensowenig
konnte weder durch die Koimmunisierung mit den IL-12-, IL-18- und GM-CSFKonstrukten noch durch die intradermale Applikation der Plasmid-DNA mittels
Genkanone eine humorale Immunantwort induziert werden. Bei der qualitativen
Bestimmung der Gesamt-Antikörper gegen das Delta-Antigen mit Hilfe des hochsensiblen
Enzymimmunoassays von Abbott bewegten sich sämtliche Werte deutlich über dem
Grenzwert, womit die
Proben als anti-Delta-negativ betrachtet werden mussten. Um
konformationelle Veränderungen des durch die o.g. Plasmide kodierten Delta-Antigens
auszuschliessen, wurden die Seren der Mäuse auch in einem Western Blot gegen
denaturiertes Delta-Antigen auf spezifische Antikörper hin untersucht. Aber auch der
Western Blot gab keinerlei Hinweise auf das Vorhandensein von anti-Delta Antikörpern im
Serum der immunisierten Mäuse. Dagegen konnte mit dieser Methode ein Kaninchen-antiHD Antikörper, der als Positivkontrolle diente, nachgewiesen werden. Die Immunisierung
der Mäuse war jedoch erfolgreich, da alle Mäuse T-Helferzell- und CTL-Antworten gegen
das Delta-Antigen entwickelten (siehe unten). Auch konnte demonstriert werden, dass antiDelta Antikörper in den Mäusen induziert werden können: so wurden anti-HD Antikörper
in Balb/c Mäusen, die subkutan mit 10 µg rekombinantem Delta-Antigen in komplettem
Freud´schem Adjuvanz immunisiert wurden, mit einem Titer von 1:2000 nachgewiesen.
71
3.2.3 Die T-Zellproliferationsantwort
Die mit den Plasmiden pSS32 und pSS33 immunisierten Balb/c Mäuse entwickelten
signifikante CD4+ T-Helferzell-Antworten gegen das kleine Delta-Antigen. Dabei wurde
kein Unterschied in der Stärke der proliferativen T-Zellaktivität zwischen den beiden
Gruppen beobachtet. Auch die Immunisierung von C57BL/6 Mäusen mit pSS33 konnte
eine T-Zellproliferationsantwort induzieren. Diese fiel im Vergleich zu den Balb/c Mäusen
deutlich schwächer aus. Mangels Vorhandensein von LHDAg konnten proliferative
Antworten gegen das LHDAg nicht determiniert werden. Ebenso konnten leider aufgrund
unzureichender Mengen an rekombinantem HDAg die Mäuse des 2. Immunisierungdurchgangs (Durchgang B), also auch die mit den Sekretionsplasmiden immunisierten
BrdU-Inkorporation ( OD 450 nm)
Mäuse, nicht auf eine CD4+ T-Helferzell-Antwort untersucht werden.
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0,3 µg/ml
3,0 µg/ml
Mock/Balb/c
Abb. 3-15
pSS32/Balb/c
pSS33/Balb/c
Mock/C57Bl/6 pSS33/C57Bl/6
T-Zellproliferationsantwort in Balb/c und C57Bl/6 Mäusen nach Immunisierung mit
pSS32 und pSS33. Die Proliferationsaktivität wurde in einem kommerziellen kolorimetrischen
Immunoassay der Firma Boehringer Mannheim quantifiziert.
3.2.4 HDV spezifische CTL-Antworten
Da zum Zeitpunkt der Untersuchung der Mäuse des ersten Immunisierungs-Durchgangs
(Durchgang A) noch keine Genehmigung für die Experimente mit
51
Cr vorlag, konnte in
72
diesem Durchgang nur die Immunantwort hinsichtlich der Antikörper und der TZellproliferation untersucht werden.
Auf die Messung der Spontanaktivität der zytotoxischen T-Lymphozyten ohne
vorhergehende Stimulierung mit syngenen P815Delta-Zellen wurde verzichtet. Die
Effektorzellen wurden für 5 Tage mittels P815δ33-Zelllen, die das große Delta-Antigen
stabil exprimieren, stimuliert. Anschließend wurde die Delta-Antigen-spezifische
zytotoxische Aktivität der Lymphozyten anhand der Lyseraten der Zielzellen (P815δ33 und
als Negativkontrolle P815LS) im Chromium-Release-Experiment untersucht.
Nach Überführen von jeweils 100 µl des Überstandes der Ansätze des 51Cr-CTL-Assays in
gamma-Zähl-Röhrchen wurde die
spezifische
51
51
Cr-Aktivität in einem Gamma-Zähler bestimmt. Die
Cr-Freisetzung, also die Prozentzahl der spezifischen Lyse, wurde nach
Ermittlung der Mittelwerte der angesetzten Triplikate folgendermaßen berechnet:
Spezifische 51Cr-Freisetzung =
(Experimentelle
51
Cr-Freisetzung - spontane
51
Cr-Freisetzung) : (maximale
51
Cr-
Freisetzung - spontane 51Cr-Freisetzung) x 100%.
Die daraus resultierenden Werte bildeten die Werte für die Delta-Antigen spezifische CTLAktivität der Effektorzellen, die in Abb. 3-17 graphisch dargestellt sind.
In allen immunisierten Balb/c Mäusen konnten signifikante CTL-Antworten beobachtet
werden. Dabei war die CTL-Aktivität in den mit den Plasmiden pSS32, pSS33, pSec32
und pSec33 immunisierten Mäusen vergleichbar. Das große und das kleine Delta-Antigen
wie auch die sezernierte und nicht-sezernierte Form der Delta-Antigene bewirkten also
ähnlich starke CTL-Antworten. Eine deutlich stärkere CTL-Aktivität konnte in Mäusen,
die mit IL-12-, IL18- und GM-CSF-Expressionskonstrukten koimmunisiert wurden,
beobachtet werden. Auch hier konnte kein Unterschied in der Stärke der Immunantwort
zwischen den mit pSS33 und pSec33 immunisierten Mäusen beobachtet werden.
Mit einem Leervektor (pcDNA3) immunisierte Mäuse zeigten keine spezifische CTLAktivität; auch konnte nach Stimulation mit P815LS-Zellen bei den mit den DeltaPlasmiden immunisierten Mäusen keine LS-spezifische CTL-Antwort festgestellt werden.
Dies
belegt,
dass
die
beobachtete
CTL-Aktivität
in
den
mit
Expressionskonstrukten immunisierten Mäusen Delta-Antigen spezifisch war.
den
Delta-
73
60
P815delta33 (5:1)
50
P815-LS (5:1)
P815delta33 (20:1)
Lyse (%)
40
P815-LS (20:1)
30
20
10
0
Mock
pSS32
pSec32
pSS33
pSec33
pSS33+Cyt pSec33+Cyt
Abb. 3-16 CTL-Aktivität in Balb/c Mäusen nach genetischer Immunisierung. Nach fünf Tagen
Stimulation wurde die Lyserate der aufgearbeiteten Milzzellen der immunisierten Mäuse gegenüber
syngenen P815δ33- bzw. nicht das Delta-Antigen exprimierenden P815LS-Zellen im
51
Cr-Release-Assay
untersucht. Die gezeigten Werte repräsentieren die Mittelwerte inklusive ihrer Standardabweichungen der
mit der oben genannten Formel errechneten spezifischen
51
Cr-Freisetzung aller Mäuse einer
Immunisierungsgruppe.
Die CTL-Aktivität in C57BL/6 Mäusen konnte aufgrund fehlender syngener Zielzellen
nicht evaluiert werden.
3.2.5 Tumormodell
Der in vivo-Effekt einer Induktion einer zytotoxischen T-Zell- und T-Helferzellantwort
durch genetische Immunisierung wurde in einem syngenen Tumormodell untersucht.
Dabei waren zehn Tage nach DNA-Immunisierung DBA-2-Mäusen jeweils 106 P815δ32(Gruppen 1-6, Kohorte A), P815δ33- (Gruppen 1-6, Kohorte B) bzw. P815LS-Zellen
(Gruppen 7-8) subkutan in die rechte Flanke injiziert worden (Studienplan siehe auch Kap.
2.6.2).
74
3.2.5.1 Tumorwachstum und Überlebensrate
In Pilotexperimenten zeigte sich in 100% der unbehandelten Mäuse ein Tumorwachstum
nach subkutaner Implantation der P815-Zellen. Dabei war der Tumor nach durchschnittlich
10 Tagen sichtbar; nach durchschnittlich 40 Tagen hatte der Tumor eine Größe von 3000
mm3 erreicht.
Es konnte gezeigt werden, dass Mäuse, die mit den unterschiedlichen Formen der DeltaDNA immunisiert waren, in 80-100% vor einem Wachstum von Delta-Antigen
exprimierenden Tumoren geschützt waren (Abb. 3-18 und 3-19). Dabei schützte einerseits
die Immunisierung mit HDAg-cDNAs (pSS32 und pSec32) sowohl solche Tiere, die mit
P815δ32-, als auch jene, die mit P815δ33-Zellen beimpft waren, vor einem
Tumorwachstum. Andererseits wuchsen weder HDAg- noch LHDAg-exprimierende
Tumoren in mit LHDAg-cDNAs (pSS33 und pSec33) immunisierten Mäusen.
Es bestanden keine Unterschiede in der CTL- oder CD4+ T-Zell-Antwort zwischen
Mäusen, die gegen HDAg immunisiert wurden und die geschützt waren gegen
Tumorwachstum im Vergleich zu Mäusen, die einen Tumor entwickelten.
Dagegen entwickelten sämtliche Mäuse, die mit einem Leervektor (pcDNA3) immunisiert
waren, einen Tumor. Auch bei jenen Mäusen, denen P815LS-Zellen zur Tumor-Induktion
injiziert wurden und die mit pSS32- bzw. pSec32-Konstrukten immunisiert waren, entstand
in 100% ein Tumor. Ebenso konnte die Immunisierung mit rekombinantem Delta-Antigen
in CFA die Tiere trotz der Anwesendheit einer humoralen Immunantwort vor einem
Tumor-Wachstum nicht schützen. 60-80% der ohne die Delta-Konstrukte behandelten
Mäuse hatte nach 40 Tagen den Endpunkt der Studie, definiert durch eine Tumorgröße von
3000 mm3, erreicht. Die anderen Mäuse wurden nach 50 Tagen getötet.
75
100
90
Überleben (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
Tage
rHDAg
pSec32
pcDNA3
pSec33
pSS32
pSS32/P815-LS
pSS33
pSec32/P815-LS
100
90
80
Überleben (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
Tage
rHDAg
pcDNA3
pSS32
pSS33
pSec32
pSec33
pSS32/P815-LS
pSec32/P815-LS
Abb. 3-17 (oben) 3-18 (unten) Überlebensraten der P815δ32 (Abb. 3-17) und P815δ33-Tumormäuse
(Abb. 3-18). 80-100% der Mäuse waren nach genetischer Immunisierung mit den Delta-Plasmiden vor
Tumorwachstum sowohl von HDAg- (Abb. 3-17) als auch von LHDAg-exprimierenden Tumoren (Abb. 318) geschützt. In beiden Abbildungen sind die Überlebensraten der das große HBV-Hüllprotein
exprimierenden Tumormäuse, immunisiert mit pSS32 bzw. pSec33, grafisch mitdargestellt.
76
3.2.5.2 Delta-Antigen-spezifische CTL-Aktivität der Tumormäuse
In sämtlichen Tumor-Mäusen, welche gegen HDAg oder LHDAg immunisiert waren,
konnte eine signifikante CTL-Aktivität gegen das Delta-Antigen nachgewiesen werden.
Dabei war die CTL-Aktivität in den mit den Plasmiden pSS32, pSS33, pSec32 und pSec33
immunisierten Mäusen vergleichbar, gleich ob sie mit dem kleinen Delta-Antigen (P815δ
32) oder dem großen Delta-Antigen (P815δ33) exprimierende Tumorzellen beimpft waren.
Dagegen war eine CTL-Antwort in Mäusen, die mit einem Leervektor (pcDNA3)
zusammen mit o.g. Zytokine exprimierende Vektoren koimmunisiert waren,
nicht
nachweisbar. Auch in mit rekombinantem Delta-Antigen immunisierten Mäusen konnte
keine CTL-Aktivität festgestellt werden.
50
P815delta33 (20:1)
45
P815-LS (20:1)
40
Lyse (%)
35
30
25
20
15
10
5
P815delta32-Tumormäuse
Abb. 3-19 CTL-Antwort der Tumormäuse. Die im
pSec33
pSec32
pSS33
pSS32
pcDNA3
rHDAg
pSec33
pSec32
pSS33
pSS32
pcDNA3
rHDAg
0
P815delta33-Tumormäuse
51
Cr-Release-Assay gemessene CTL-Aktivität ist
zwischen den beiden Gruppen Tumormäusen vergleichbar. Diese ist Delta-Antigen spezifisch, da zum einen
mit einem Leervektor (pcDNA3) immunisierte Mäuse keine spezifische CTL-Aktivität zeigten, zum anderen
konnte nach Stimulation mit P815LS-Zellen bei den mit den Delta-Plasmiden immunisierten Mäusen keine
LS-spezifische CTL-Antwort festgestellt werden.
77
3.2.5.3 T-Zellproliferationsantwort der Tumormäuse
Auch eine signifikante CD4+ T-Zell-Proliferationsantwort konnte in sämtlichen
Tumormäusen, die mit Delta-Antigen-Plasmiden immunisiert waren, detektiert werden.
Zwischen den einzelnen Gruppen gab es keine signifikanten Unterschiede. Dagegen war
eine solche T-Zell-Proliferationsantwort in Mäusen, die lediglich mit einem Leervektor
behandelt wurden, nicht nachweisbar.
BrdU-Inkorporation ( OD 450 nm)
1,6
1,4
1,2
1
0,3 µg/ml
0,8
3,0 µg/ml
0,6
0,4
0,2
0
BrdU-Inkorporation ( OD 450 nm)
rHDAg pcDNA3 pSS32
pSS33 pSec32 pSec33
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,3 µg/ml
3,0 µg/ml
0,8
0,6
0,4
0,2
0
rHDAg pcDNA3 pSS32
pSS33
pSec32 pSec33
Abb. 3-20 (oben); 3-21 (unten) T-Zellproliferationsantwort in P815δ32- (Abb. 3-20) und P815δ33Tumormäusen (Abb. 3-21). Nach Einbau des Thymidin-Analogons BrdU wurde in einem ELISA-Reader
die Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.
78
4 Diskussion
In den letzten Jahren wurde durch viele Studien das Wissen über die Struktur des HepatitisD-Virus und die molekularen Grundlagen seiner HBV-Abhängigkeit für den Ablauf seines
biologischen Zyklus enorm verbessert (29,224). Allerdings konnte bisher weder ein
geeigneter Therapieansatz gefunden werden noch ist bis heute die genaue Rolle des
Immunsystems bei der HDV-Pathogenese und bei einer HDV-Elimination bekannt.
Es gibt jedoch einige Beobachtungen, die darauf hindeuten, dass eine spezifische
Immunantwort eine wichtige Rolle sowohl beim Schutz gegen eine HDV-Infektion als
auch in der Pathogenese der Lebererkrankung spielt. So konnte gezeigt werden, dass eine
HDV-Reinfektion in chronisch HBV-infizierten Schimpansen, die von einer HDVInfektion geheilt waren, durch eine signifikant reduzierte HDV-Replikation charakterisiert
war (151). Dies lässt vermuten, dass durch einen ersten Kontakt mit HDV eine partielle
Immunität induziert wird, die in der Lage ist, die virale Aktivität zu kontrollieren.
Während einer HDV-Infektion können anti-Hepatitis-Delta Antikörper sowohl der IgM als
auch der IgG Klasse im Serum von infizierten Individuen nachgewiesen werden.
Allerdings konnte keine einzige Studie einen protektiven Effekt dieser Antikörper
nachweisen. Sie sind weder virusneutralisierend noch schützen sie vor einer Reinfektion.
Sie besitzen nur einen diagnostischen Wert: ein erhöhter anti-HD IgM-Titer korreliert
streng mit einer verstärkten HDV-Virämie und mit der Schwere der Lebererkrankung,
während isolierte anti-HD Antikörper der IgG-Klasse in Patienten mit einem günstigeren
Verlauf der HDV-Infektion gefunden werden. Bei Patienten mit einer selbst-limitierenden
Infektion verschwinden IgM anti-HD sehr rasch, während sie bei Patienten, deren
Infektion progressiv und chronisch verläuft, über diese Zeit persistieren (2,202).
Querschnittsstudien haben gezeigt, dass unter den HBsAg-Trägern mit einer chronischen
Typ D Hepatitis durch den Nachweis von IgM anti-HD diejenigen mit einer aktiven HDVInfektion von solchen mit einer inaktiven HDV-Infektion unterschieden werden können
(52,55).
Hinweise dafür, dass T-Zellen eine entscheidende protektive Rolle bei einer Infektion mit
HDV spielen, konnten sowohl in Tiermodellen als auch in Beobachtungen am Menschen
79
gewonnen werden. Es konnte gezeigt werden, dass mit dem Woodchuck Hepatits Virus
(WHV) infizierte Woodchucks zumindest partiell vor einer nachfolgenden Infektion mit
HDV geschützt waren, wenn sie mit dem kleinen Hepatitis-Delta-Antigen, exprimiert
durch rekombinante Vacciniaviren, immunisiert waren, und zwar in Abwesenheit jeglicher
detektierbarer humoraler Immunantwort (105). Die Hepatitis-Delta-Virämie war deutlich
vermindert, was auf die Induktion einer zytotoxischen T-Zellantwort zurückgeführt werden
könnte; die Virämie könnte also durch Lyse von Delta-Antigen exprimierenden
Hepatozyten kontrolliert werden. Diese Hypothese wird unterstützt durch die
Beobachtung, dass Woodchucks, die mit Cyclosporin A, einem spezifischen Inhibitor der
T-Zell-vermittelten Immunantwort, behandelt wurden, eine verstärkte Virämie zeigten
(104).
Auf eine wichtige Rolle der T-Zellen bei der Kontrolle einer HDV-Infektion deutet
außerdem die Beobachtung hin, dass in HIV-infizierten Patienten, die eine reduzierte
Anzahl an zirkulierenden CD4+ T-Zellen aufweisen, eine HDV Virämie deutlich verstärkt
ist (182).
Erste direkte Hinweise dafür, dass die zelluläre Immunantwort eine wichtige Rolle bei der
Kontrolle einer HDV-Infektion beim Menschen spielt, ergab die Studie von Nisini et al., in
der die Spezifität und Funktion der HDV-spezifischen T-Zellantwort in chronischen HBVTrägern mit einer HDV-Superinfektion untersucht wurde (155). Sie konnten zeigen, dass
der Nachweis einer HDAg-spezifischen T-Zellantwort im peripheren Blut von HDVinfizierten Patienten eng mit einer verminderten Aktivität der HDV-Infektion korreliert.
Alle von ihnen untersuchten Patienten, bei denen in vitro eine spezifische Proliferation von
peripheren mononukleären Zellen (PBMC) als Antwort auf das Delta-Antigen zu finden
war, zeigten Zeichen einer inaktiven Hepatitis, charakterisiert durch normale ALT-Spiegel
und das Fehlen von IgM anti-HD. Im Gegensatz dazu konnte bei sämtlichen Patienten mit
einer aktiven Hepatitis D keine spezifische T-Zellantwort nachgewiesen werden. Auf einen
direkten Bezug zwischen der Anwesenheit einer signifikanten HDAg-spezifischen TZellantwort und einer verminderten Aktivität der HDV-Erkrankung weist auch die
Beobachtung hin, dass in einem Patienten mit einer aktiven Hepatitis und ohne HDAgspezifische PBMC-Proliferation eine drastische Erhöhung der spezifischen peripheren TZellantwort mit dem Verschwinden von IgM und einer Normalisierung der ALT-Spiegel
verbunden war.
80
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei chronisch HDV-infizierten Individuen die
Qualität und Stärke der, wahrscheinlich zellulären, Immunantwort gegen HDV nicht
ausreicht, das Virus zu eliminieren und eine protektive Immunantwort zu erzeugen.
Auch bei einer HBV-Infektion konnte beobachtet werden, dass das spontane Verschwinden
von HBV-DNA aus dem Serum von chronisch HBV-infizierten Patienten häufig mit einer
erhöhten CD4+ T-Helferantwort assoziiert ist (13,102,213).
Es ist sehr wahrscheinlich, dass im Rahmen einer HBV-Infektion die zelluläre
Immunantwort sowohl für die Pathogenese der Lebererkrankung, einschließlich der
Entwicklung eines Hepatozellulären Karzinoms, als auch für die Bekämpfung und
Elimination des Virus von Bedeutung ist (34,146). Eine mögliche Hypothese für die
Entwicklung
einer
persistierenden
HBV-Infektion
besagt,
dass
HBV-spezifische
zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) nicht fähig sind, das Virus aus der Leber zu
eliminieren und zwar aufgrund von substantiell verminderten intrahepatischen CTLSpiegeln oder qualitativen Veränderungen in der CTL-Aktivität (175). Tatsächlich konnte
Guidotti zeigen, dass der adoptive Transfer von HBsAg-spezifischen CTLs in HBVtransgene Mäuse eine Zytokin-vermittelte Elimination von HBV aus der Leber zur Folge
hatte, und zwar ohne Zerstörung von Hepatozyten (80,81).
Da sowohl Pathogenese als auch Immunmechanismen einer HDV-Infektion denen einer
HBV-Infektion zu ähneln scheinen, ist es wahrscheinlich, dass auch im Rahmen einer
Infektion mit HDV CTLs eine wichtige Rolle bei der Elimination des Virus spielen, worauf
auch oben genannte Arbeiten hindeuten. Die Balance zwischen der Viruslast und der
Stärke der HDAg-spezifischen T-Zellantwort könnte entscheidend sein für die
präferentielle Etablierung entweder einer protektiven Immunität oder aber einer
chronischen Hepatitis (19,33,239,240).
Wie bei einer HBV-Infektion kann man auch bei HDV-infizierten Individuen eine spontane
Elimination des Virus aus dem Körper beobachten (139). Dies könnte darauf hindeuten,
dass eine suboptimale zelluläre Immunantwort reversibel ist. Daher könnten Strategien,
durch welche eine HDV-spezifische zelluläre Immunantwort verstärkt werden kann, zur
Eradikation einer chronischen HDV-Infektion beitragen.
81
Die Bedeutung der Entwicklung einer geeigneten Therapie der Typ D Hepatitis liegt vor
allem in der Tatsache, dass eine chronische HDV-Infektion im Vergleich zu einer
chronischen HBV-Infektion prognostisch wesentlich ungünstiger verläuft.
Im Vergleich zu einer isolierten HBV-Infektion entsteht wesentlich häufiger, nämlich in
etwa dreiviertel der Fälle, eine chronische Hepatitis, die oft auch schwerer und mit einer
rascheren Progression verläuft; etwa 60% bis 70% der Patienten mit einer chronischen Typ
D Hepatitis entwickeln im weiteren Verlauf eine Leberzirrhose, also dreimal häufiger als
bei einer Hepatitis B (39,57,77,180,188). Auch die Mortalität und das Risiko, ein
hepatozelluläres Karzinom zu entwickeln, ist für Patienten, die sowohl mit dem HepatitisB- als auch mit dem Hepatitis-D-Virus infiziert sind, deutlich erhöht.
Auch hat sich der Pool von HBV-Trägern, global gesehen, selbst durch die Einführung
effizienter prophylaktischer Vakzinierungsprogramme in einigen Populationen mit hohem
medizinischen Standard nicht positiv verändert (38). Des weiteren sprechen etwa 5% der
Menschen nicht auf die herkömmliche HBV-Vakzine an.
Zwar gibt es einige neue vielversprechende therapeutische Ansätze gegen die chronische
HBV-Infektion, doch scheinen diese Therapie-Formen gegen eine HDV-Infektion nicht
ähnlich effektiv zu sein.
Durch eine Therapie mit Interferon-α (INF-α) lässt sich bei etwa 30% der chronisch HBVinfizierten Patienten eine Serokonversion des HBeAg erzielen, dem Marker für die
Virusreplikation mit Bedeutung für die Prognose einer Typ B Hepatitis (49,152,229). Bei
diesen Patienten reflektiert die HbeAg-Serokonversion eine immunvermittelte Beseitigung
von infizierten Hepatozyten und ist assoziiert mit einer Kontrolle der viralen Replikation
und einer Remission der Lebererkrankung (165). Nachteile einer Interferon-Therapie
bestehen in häufigen Nebenwirkungen und der Tatsache, dass nur ein bestimmtes
Patientenkollektiv auf eine Therapie anspricht, nämlich Patienten mit niedrigem HBVDNA-Titer und hohen Serum-Transaminasen-Spiegeln (17,88,163). Für Patienten, die
diese Kriterien nicht erfüllen, beträgt die Ansprechrate weniger als 5% (131). Des weiteren
ist die Interferon-Therapie bei Patienten mit fortgeschrittener oder dekompensierter
Leberzirrhose kontraindiziert.
Die Interferon-Therapie einer chronischen Typ D Hepatitis scheint jedoch nicht
wirkungsvoll zu sein: es konnte zwar gezeigt werden, dass es zu einer Reduktion der
Aminotransferase-Spiegel, einer Verbesserung der Leberhistologie und teilweise auch zu
82
einer Hemmung der Virusreplikation kommt; im Gegensatz zu einer Interferon-Therapie
bei einer HBV-Infektion sind die Effekte, vor allem auf die Virusreplikation, jedoch nur
von transientem Charakter, und es konnte in der Regel keine dauerhafte Elimination von
HDV-RNA erreicht werden (56,185,210).
In den letzten Jahren wurde in Form der Nukleosid-Analoga eine weitere Substanzgruppe
in der Therapie der chronischen Hepatits B getestet. Vor allem Lamivudine scheint eine
vielversprechende Ergänzung bzw. Alternative zum Alpha-Interferon darzustellen. Es
hemmt durch Blockade der reversen Transkriptase die Synthese des HBV. Im Gegensatz
zur Interferon-Therapie hemmt Lamivudine unabhängig von prätherapeutischen Variablen
die HBV-Replikation; alle Patienten mit einer nachweisbaren viralen Replikation sind also
potentielle Kandidaten für eine Lamivudine-Therapie. Es ist oral einsetzbar und gut
verträglich. Problematisch ist allerdings zum einen die meist rasch wiedereinsetzende
HBV-Replikation nach Absetzen der Medikation (191), zum anderen die zunehmende
virale Resistenzentwicklung, die zu einem sekundären Therpieversagen mit schwerer
Reaktivierung der Hepatitis führen kann (129).
Auch bei der chronischen Hepatitis D wurde Lamivudine im Rahmen einer kleinen Studie
bereits getestet (122). Die Ergebnisse deuten allerdings darauf hin, dass nur geringe
Hoffnungen für eine effektive Therapie bestehen. Trotz einer deutlichen Reduktion der
Serumspiegel der HBV-DNA blieben sämtliche Patienten HDV RNA- und HBsAg-positiv.
Auch die Serumspiegel für die Transaminasen und die Leberhistologie verbesserten sich
nicht. Nach Beendigung der Therapie kehrten die HBV-DNA-Spiegel auf ihren
Ausgangswert zurück ohne dass eine Änderung in der Aktivität der Erkrankung zu
beobachten war.
Erfolgversprechende Ansätze in der HBV-Therapie sind also nicht ohne weiteres auf die
Therapie einer HDV-Infektion übertragbar. Dies könnte unter anderem daran liegen, dass
das Ansprechen einer Therapie im Rahmen einer chronischen Hepatitis B in der Regel
definiert ist als ein Verlust des HBeAg (229) und ein Abfall der Serum-HBV DNA-Spiegel
auf mit sensitiven molekularen Methoden nicht nachweisbare Werte (62). Entscheidend für
die Ausheilung einer chronischen Hepatitis D dürfte jedoch der Verlust von HBsAg sein
(7), da das HBsAg notwendig für die virale Verpackung, Ausschleusung und die
Ausbreitung der HDV-Infektion ist. Die HBV-Replikation an sich stellt keine
entscheidende Helferfunktion für HDV dar, da die HBsAg-Expression auch ohne
Virusreplikation vonstatten gehen kann.
83
Eine HBsAg-Serokonversion konnte jedoch nur bei etwa 8-10% der mit Interferon
behandelten HBV-infizierten Patienten beobachtet werden (23,152,229). Bei einer
Therapie mit Lamivudine ist die Serokonversionsrate von HBsAg noch niedriger bzw.
fehlte in manchen Studien völlig (51,191). In der Arbeit von Lau et al., in der der Effekt
einer Lamivudine-Therapie auf chronisch HDV-Infizierte untersucht wurde (122), blieb bei
fast allen Patienten der HBsAg-Spiegel auf den prätherapeutischen Werten. Lamivudine
hemmt die virale reverse Transkriptase, welche verantwortlich für die Synthese neuer
HBV-DNA von der prägenomischen mRNA-Template ist, besitzt aber keinen Effekt auf
die intrahepatischen Spiegel der kovalent geschlossenen zirkulären DNA (cccDNA) und
auf die Transkription der HBV-spezifischen RNA dieser cccDNA, wodurch die Synthese
viraler Proteine wie die des HBsAg unbeeinträchtigt bleibt (23,122). Dies erklärt zum
einen den fehlenden Einfluss von Lamivudine auf die HBsAg-Expression, zum anderen
aber auch das rasche Wiederauftreten der viralen Replikation nach Beendigung der
Therapie. Wenn das HBsAg das entscheidende Element der Helferfunktion von HBV
darstellt, wird die Ausbreitung des Hepatitis D Virus durch jedes antivirale Medikament
unberührt bleiben, welches nur die HBV-Polymerase hemmt.
Auch andere antivirale Therapieansätze, wie beispielsweise die Therapie mit Ribavirin
oder Levamisol, sind bei einer chronischen Hepatitis D ineffektiv (4,20,65).
Schlussfolgernd kann man sagen, dass es bis heute keine spezifische Therapie gegen die
Hepatitis D gibt. So bleibt vor allem im Hinblick auf die schlechte Prognose einer HDVSuperinfektion von chronisch HBV-Infizierten die Entwicklung einer effektiven Therapie
eine wichtige Aufgabe.
Ein ganz neuer Ansatz in der Therapie von chronischen Virusinfektionen stellt die auch in
dieser
Arbeit
verwendete
DNA-Immunisierung
dar.
Der
Vorteil
dieser
Immunisierungstechnik ist die Erzeugung einer zytotoxischen T-Lymphozyten- und
inflammatorischen T-Helferzell-Antwort, welche für die Eradizierung verschiedenster
viraler Infektionen unerlässlich ist. Vor dem Hintergrund, dass wie bei einer HBVInfektion auch bei einer HDV-Infektion eine ungenügende zelluläre Immunantwort für die
Etablierung einer chronisch persistierenden Infektion von Bedeutung ist und diese
suboptimale zelluläre Immunantwort möglicherweise reversibel ist, könnte mittels DNAImmunisierung eine HDV-spezifische zelluläre Immunantwort verstärkt und die Balance
84
zwischen den zytopathischen und den regulatorischen Komponenten der Immunantwort
verändert werden, um so zur Eradikation des HDV beizutragen.
Zunächst einmal aber stellt die DNA-Immunisierung ein ausgezeichnetes Modell dar, in
dem man die Strategie einer prophylaktischen oder therapeutischen Immunisierung
beurteilen kann und die Immunogenität verschiedener Antigene definieren kann. So konnte
gegen eine Reihe von viralen Antigenen in verschiedenen Tiermodellen eine humorale und
zelluläre Immunantwort induziert werden (128). Verschiedene Gruppen konnten
beispielsweise durch Anwendung dieser Technik zeigen, dass das Oberflächen-Antigen
und die Nukleokapsid-Antigene des HBV stark immunogen sowohl auf B- als auch auf TZell-Ebene sind (47,71,72,117,193).
Auch in der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Immunogenität des Delta-Antigens
nach DNA-Immunisierung definiert, da bis heute nicht bekannt ist, ob das kleine und große
Delta-Antigen ausreichend immunogen sind, eine starke zelluläre Immunantwort in vivo
zu generieren. Dafür wurde das murine Inbred-System gewählt, da Tiermodelle zum
experimentellen Studium immunologischer Mechanismen einer HDV-Infektion, bis auf das
Woodchuck-Modell, nicht verfügbar sind: HDV ist auf die Helferfunktion des HBV
angewiesen und HBV ist nur für Menschen und Schimpansen in vivo infektiös, nicht aber
unter in vitro Bedingungen. Bei Woodchucks, die mit WHV und nachfolgend mit HDV
infiziert werden können, handelt es sich um eine Outbred-Spezies, dessen Immunsystem
nicht
vollständig
charakterisiert
ist,
weshalb
keine
eindeutige
Analyse
und
Charakterisierung der zellulären Immunantworten gegen HBV- oder HDV-Antigene
gemacht werden können.
Um in den Experimenten zur Untersuchung der Immunogenität des Delta-Antigens eine
möglichst breite Immunantwort zu generieren, wurden Immunisierungsprotokolle
eingesetzt, die sowohl die humorale als auch die zelluläre Immunantwort verstärken. Zu
diesem Zweck wurden zusätzlich zur Grundimmunisierung zwei weitere BoosterImmunisierungen durchgeführt; dabei wurde der DNA-Impfstoff sowohl epidermal mittels
Genkanone, wodurch es zu einer Aktivierung einer Th2-Immunantwort mit einer
Erzeugung von überwiegend IgG1-Antikörpern kommt (6), als auch intramuskulär
appliziert, was überwiegend zu einer Th1-Antwort mit hohen Interferon-γ-Spiegeln und zu
einer erhöhten IgG2a:IgG1-Ratio führt (siehe auch Einleitung, Kap. 1.2.2).
85
Zwar scheint in manchen Fällen die primäre Immunisierungsmethode das Profil der THelferzellantwort irreversibel festzulegen, während nachfolgende Immunisierungen mit
einer anderen Methode keine Verschiebung des ursprünglich induzierten Th-Profils
bewirken können (59,164,173), doch kann dieses Profil durch die Koadministration von
Genen, die für bestimmte Zytokine kodieren, beeinflusst werden. So konnten Prayaga et al.
(170) demonstrieren, dass das Th-Profil nach epidermaler "gene gun"-Immunisierung,
welches normalerweise vom Th2-Typ ist, nach Koimmunisierung mit IL-2, IL-7 oder IL12 kodierenden Plasmiden einem Th1-Charakter entspricht. In den hier durchgeführten
Experimenten wurden die Mäuse mit IL-12-, IL-18- und GM-CSF-Plasmiden
koimmunisiert, da diese Plasmide Th1-Antworten verstärken können.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die DNA-Immunisierung von Mäusen mit
Plasmiden, welche für sezernierende und intrazelluläre Formen des kleinen und großen
Delta-Antigen kodieren, eine starke zelluläre Immunanwort induziert.
Unter anderem kommt es nach DNA-Immunisierung von Balb/c- und C57Bl/6-Mäusen zu
einer signifikanten CD4+ T-Zellproliferationsantwort gegen das Hepatitis-D-Antigen,
wobei die T-Zellproliferation in Balb/c-Mäusen deutlich stärker ist als in C57Bl/6-Mäusen.
Ursache hierfür ist möglicherweise der Effekt einer Haplotyp-assozierten AntigenRestriktion bei der Induktion von CD4+ T-Zellantworten über die MHC-Klasse-II
restringierte Präsentation des Delta-Antigens, was einen Einfluss auf die Stärke der CD4+
T-Zellantwort auf das Delta-Antigen haben könnte.
Die Differenzierung der T-Zellaktivität wurde im Rahmen dieser Arbeit zwar nicht
analysiert, jedoch deuten das Fehlen einer Antikörper-Antwort und Vorhandensein einer
starken CTL-Antwort darauf hin, dass es sich hierbei um eine für die Generierung einer
zellulären Immunantwort essentiellen Th1-Antwort handelt. Tatsächlich konnten bei einer
außerhalb dieser Arbeit im Rahmen des Tumormodells durchgeführten Untersuchung des
Zytokinprofils große Mengen an den Th1-Zytokinen IFN-γ und IL-2 nachgewiesen
werden. Eine solche Th1-Antwort spielt eine entscheidende Rolle bei der Etablierung einer
zellulären Immunantwort, was für die Bekämpfung von intrazellulären Pathogenen von
großer Bedeutung ist.
Eine der beiden Arbeiten, die bisher den Effekt einer DNA-Immunisierung auf die murine
zelluläre Immunantwort gegen das Hepatitis-D-Antigen genauer untersucht hat, ist die
86
Arbeit von Huang et al. (90). Auch in dieser Studie konnte eine CD4+ Th1-gewichtete
zelluläre
Immunantwort
mit
einem
entsprechenden
Zytokin-Expressionsmuster
nachgewiesen werden. Allerdings wurde hier nur die Immunantwort nach Immunisierung
mit Plasmiden, welche für das große Delta-Antigen kodieren, untersucht. In der
vorliegenden Arbeit konnte somit erstmalig gezeigt werden, dass auch das kleine DeltaAntigen
nach
DNA-Immunisierung
mit
entsprechenden
Plasmiden
eine
T-
Helferzellantwort induziert, die in ihrer Stärke mit der durch das LHD-Ag induzierten
Immunantwort vergleichbar ist. Dies deutet darauf hin, dass die entscheidenden durch
Maus-MHC-Klasse II restringierte CD4+ T-Zellen erkannten Delta-Antigen-Epitope im
Bereich der gemeinsamen Aminosäure-Sequenz der beiden Delta-Antigene liegen. Des
weiteren scheint die durch die Isoprenylierung bedingte Konformationsänderung des LHDAg keinen Einfluss auf die Antigenität des Delta-Antigens zu nehmen. Für eine genauere
Aussage wären weitere Untersuchungen zur Epitop-Feinspezifität erforderlich.
Nisini et al. berichten in der bis dato einzigen Studie am Menschen über spezifische TZellantworten vom CD4+-Typ gegen HDAg-Epitope bei chronisch HDV-infizierten
Patienten (155). Ihnen gelang es, die Spezifität einer HDV-spezifischen CD4+ TZellantwort mit synthetischen Peptiden und rekombinantem Antigen sowie durch die
Etablierung von HLA-restringierten T-Zellklonen zu demonstrieren. Durch eine ZytokinSekretions-Analyse konnten sie des weiteren eine Differenzierung der CD4+ TZellantworten vornehmen: sämtliche untersuchten CD4+ T-Zellklone sezernierten IFN-γ,
was auf das Vorliegen von Th1-Klonen hindeutet. Wichtig war die Beobachtung, dass der
Nachweis einer Delta-Antigen spezifischen T-Zellantwort im peripheren Blut von HDVinfizierten Patienten eng mit einer verminderten Aktivität der HDV-Infektion korrelierte,
was die Bedeutung einer CD4+ Th1-Zellantwort für die Kontrolle einer HDV-Infektion
aufzeigt.
In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine DNAImmunisierung im Mausmodell eine spezifische CD8+ CTL-Antwort gegen das DeltaAntigen erzeugt.
Dabei war die CTL-Aktivität in Mäusen immunisiert mit HDAg- und LHDAg-Konstrukten
vergleichbar. Wenn man die Ergebnisse des Tumormodells berücksichtigt, deuten diese
Daten darauf hin, dass es keine signifikanten immunodominanten H-2d restringierte CTL-
87
Epitope innerhalb des carboxyterminalen Endes der Sequenz des grossen Delta-Antigen
gibt.
Auch zwischen den intrazellulären und sezernierten Formen des Delta-Antigens gab es in
der Stärke der CTL-Antwort keine signifikanten Unterschiede. Durch die Koadministration
von Plasmiden, welche für die Zytokine IL-12, IL-18 und GM-CSF kodieren, konnte eine
signifikant stärkere CTL-Aktivität induziert werden. Dies deckt sich mit Beobachtungen
von Studien mit anderen Antigenen: beispielsweise konnten Kim et al. zeigen, dass durch
die Koapplikation von IL-12-Genen bei einer DNA-Immunisierung eine Th1-typische
Antwort mit erhöhter T-Zellproliferation und eine deutlich verstärkte CTL-Antwort auf alle
eingesetzten Antigene induziert wird (106). Auch andere Gruppen haben bestätigt, dass IL12 als Adjuvanz in der DNA-Immunisierung ein starker Induktor der zellvermittelten
Immunität ist (35,133,156,214,216). Ebenso konnte bei GM-CSF ein verstärkender Effekt
auf die zelluläre Immunantwort im Kontext der genetischen Immunisierung nachgewiesen
werden (70,96,106,200). Durch die Koadministration von IL-18 kodierenden Plasmiden
konnte allerdings eine nur moderate Erhöhung der CTL-Aktivität beobachtet werden, trotz
der Funktion von IL-18 als Th1-Zytokin (106,108).
In der vorliegenden Arbeit konnte die CTL-Aktivität nach DNA-Immunisierung mit den
Delta-Plasmiden in C57/BL6-Mäusen nicht gemessen werden, da syngene, das DeltaAntigen exprimierende Zielzellen nicht verfügbar waren. In der einzigen publizierten
Arbeit über die Induktion einer CTL-Antwort gegen das Delta-Antigen nach DNAImmunisierung waren Polo et al. nicht in der Lage, CTL-Antworten in C57BL/6-Mäusen
zu detektieren (167); allerdings verwendeten sie für die in vitro Stimulation und als
Zielzellen rekombinante Vacciniaviren, welche das Delta-Antigen exprimieren. Ihre
Beobachtung schließt nicht aus, dass auch in diesem Haplotyp nach DNA-Immunisierung
CTL-Antworten induziert werden und durch die Verwendung anderer Systeme
nachgewiesen werden können. Allerdings könnte eine MHC-Klasse I Restriktion einen
Einfluss auf die Ausbildung und Stärke einer CTL-Antwort gegen das Delta-Antigen
haben.
Dagegen konnten nach DNA-Immunisierung in keiner einzigen Maus Antikörper gegen
das Delta-Antigen nachgewiesen werden. Dabei spielte das Immunisierungsprotokoll keine
Rolle: weder nach i.m.-Injektion der Plasmid-DNA noch nach Immunisierung mittels
Genkanone und zweimaliger Boosterimmunisierung, noch im Tumormodell mit zweifacher
88
i.m.-Immunisierung waren Delta-spezifische Antikörper nachweisbar. Unabhängige
Experimente, welche außerhalb dieser Arbeit mit anderen Delta-Expressionskonstrukten
durchgeführt wurden, bestätigten diese Beobachtungen: weder nach intradermaler "gene
gun"- noch nach Cardiotoxin-assoziierter i.m-Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit dem
Konstrukt pcD/3HDAg konnte eine humorale Immunantwort induziert werden (Prof.
Roggendorf, Essen, persönliche Kommunikation). Dies sind überraschende Ergebnisse, da
die meisten viralen Antigene nach DNA-Immunisierung Antikörper-Antworten induzieren;
vor allem die epidermale Applikation der DNA mittels Genkanone begünstigt die
Aktivierung einer Th2-Immunantwort mit der Erzeugung von überwiegend IgG1Antikörpern (6). Zum anderen werden bei einer natürlichen HDV-Infektion des Menschen
in der Regel Antikörper sowohl der IgG- als auch der IgM-Klasse gegen das Delta-Antigen
in den humanen Seren gefunden. Möglicherweise liegt der Grund hierfür in der
unterschiedlichen Art der Präsentation des Antigens: bei einer natürlichen HDV-Infektion
werden die Delta-Antigene zusammen mit der RNA in Form von Komplexen mit einer
HBsAg-haltigen Membran umgeben, wodurch die reifen HDV Virionen aus der Zelle
sezerniert werden können. Auf diesem Weg kann das Delta-Antigen schliesslich als
exogenes Antigen dem Immunsystem des Wirtes präsentiert werden. Das HDAg in seiner
nativen Form wird in der Zelle zurückgehalten, da es kein Sekretionssignal besitzt. Aber
selbst nach Immunisierung mit einer sezernierten Form des Delta-Antigens in Form eines
Sekretionsplasmids konnten keine spezifischen Antikörper nachgewiesen werden, obwohl
sezernierte Formen von Antigenen besonders immunogen auf B-Zell-Ebene zu sein
scheinen (69). Allerdings konnten auch andere Arbeiten keine Verbesserung der humoralen
Immunantwort durch genetische Immunisierung mit einer sezernierbaren Mutanten eines
membrangebundenen Antigens erreichen (234). Es ist anzunehmen, dass das Helfervirus
HBV eine wichtige Rolle bei der Induktion einer humoralen Immunantwort gegen das
Delta-Antigen spielt. Auch könnte man vermuten, dass eine veränderte Konformation des
Proteins, bedingt durch die Expression des Delta-Antigens in der Muskelzelle bzw. durch
den möglichen Transfer des Proteins von der transfizierten Muskelzelle zu Antigenpräsentierenden Zellen (cross priming) eine Ursache für das Fehlen einer AntikörperAntwort ist. Da jedoch in den Seren weder durch den Western Immunoblot, in dem die
Seren
gegen
denaturiertes
Delta-Antigen
getestet
wurden,
noch
durch
eine
Immunpräzipitation gegen konformationell intaktes Delta-Antigen spezifische Antikörper
nachgewiesen werden konnten, scheint diese Theorie eher unwahrscheinlich. Da HDAg-
89
spezifische CD4+ T-Zellen nachgewiesen werden konnten, entfällt auch die Möglichkeit
einer fehlenden CD4+ T-Zell-Hilfe als Ursache für die fehlende Antikörper-Antwort.
Die Ursache für den fehlenden Nachweis einer Antikörper-Antwort liegt auf jeden Fall
nicht am Fehlen von T-Helferzellen, da nach sämtlichen Immunisierungen, ob mit der
sezernierten oder intrazellulären Form des Delta-Antigens, CD4+ T-Helferzellantworten
nachweisbar waren.
Die Wahrscheinlichkeit, dass eine geringe Antigen-Menge bei schwacher Immunogenität
des Delta-Antigens für das Fehlen einer Antikörper-Antwort verantwortlich ist, ist eher
gering, da auch bei anderen schwach immunogenen Proteinen durch ein entsprechendes
Immunisierungsprotokoll, mit der Koadministration von Zytokinen wie GM-CSF und IL18 oder durch Mutation des Antigens in eine sezernierbare Form, humorale
Immunantworten induziert werden (6,69,106,108).
Die in dieser Arbeit erhobenen Daten werden auch durch Studien am Woodchuck Hepatitis
Virus/HDV-Infektionsmodell unterstützt: so konnten nach intradermaler genetischer
Immunisierung im Serum von mit dem WHV chronisch infizierten Woodchucks keine
messbaren anti-HDAg Antikörper gemessen werden. Dagegen konnte die Immunisierung
mit rekombinanten HDAg/CpG-Oligonukleotiden eine starke humorale Immunantwort
induzieren (60). Ebenso konnten nach Immunisierung von Woodchucks mit Baculo- und
Vacciniaviren, welche das Delta-Antigen exprimieren, keine humoralen Immunantworten
nachgewiesen werden (105).
Auch in der Studie von Kos et al. (112) konnten nach Immunisierung von Schimpansen mit
rekombinantem Delta-Antigen, exprimiert in einem Baculovirus-System, nur kurzlebige
und niedrige Antikörper-Titer induziert werden, welche 105 mal niedriger waren als solche
nach einer experimentellen Infektion mit dem Hepatitis-D-Virus.
Im Gegensatz zu den hier präsentierten Ergebnissen konnten in einer anderen Studie nach
genetischer Immunisierung von Bl/6-Mäusen mit einem Delta-Konstrukt hohe AntikörperTiter in den Mausseren gemessen werden (167). Der Grund für diesen unterschiedlichen
Befund ist nicht ganz klar, zumal auch der in dieser Studie eingesetzte Plasmidvektor den
CMV-Promotor enthält. Eventuell sind die Gründe hierfür in anderen Unterschieden
zwischen den beiden Expressionsvektoren oder aber auch in den verschiedenen
eingesetzten Testverfahren zur Bestimmung der Delta-Antikörper zu suchen: während Polo
et al. für ihren ELISA Delta-Antigen aus Insektenzellen isoliert haben, nachdem diese mit
90
einem das große Delta-Antigen exprimierendem rekombinantem Baculovirus infiziert
wurden, wurden in der vorliegenden Arbeit die Seren mit einem kommerziellen ELISA auf
Antikörper gegen das Delta-Antigen untersucht. Hierbei stammt das in diesem Verfahren
eingesetzte Delta-Antigen aus mit dem Hepatitis-D-Virus infizierten Murmeltieren.
Allerdings wurden die Seren aber auch in einem Western Immunoblot auf das
Vorhandensein von Delta-Antikörpern untersucht, um ein Nichtansprechen des
kommerziellen ELISAs auf murine Antikörper auszuschliessen. Auch hier liessen sich
keine spezifischen Antikörper nachweisen.
Ebenso konnten Huang et al. nach genetischer Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit
einem für das große Delta-Antigen kodierenden Plasmid humorale Immunantworten
nachweisen, wenn auch diese nur sehr schwach ausfielen (90).
Auch wenn die hier aufgeführten Unterschiede teilweise auf den Gebrauch
unterschiedlicher
Delta-Expressionskonstrukte,
Protein-Detektionssystemen
und
unbekannten, mit der intramuskulären Replikation des HDV assoziierten Faktoren
beruhen, deuten die in dieser Arbeit erhobenen Befunde darauf hin, dass es sich bei den
Delta-Antigenen um nur sehr schwache B-Zell-Immunogene handelt.
Da es zur Zeit mit Ausnahme für Woodchucks kein Tiermodell für die HDV-Replikation
und -Infektion gibt, wurde in dieser Arbeit überprüft, ob die durch die genetische
Immunisierung generierte zelluläre Immunantwort Mäuse gegen das Wachstum eines
syngenen, das Delta-Antigen exprimierenden Tumors schützt.
In sämtlichen mit den Delta-Plasmiden immunisierten Mäusen konnte bei Abwesenheit
einer humoralen Immunantwort eine starke zelluläre Immunantwort nachgewiesen werden,
wobei sich die Stärke der Th-Proliferationsantwort und der CTL-Aktivität zwischen den
einzelnen Gruppen nicht signifikant unterschied. Trotz der Anwesenheit des HDAgexprimierenden Tumors als ein immunologisches Gefahrensignal war die CTL-Aktivität in
den DBA-2 Tumormäusen nicht stärker als in den naiven Balb/c-Mäusen (ohne
Tumorimplantation). Dies könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass die P815Zielzellen syngen zu DBA-2-Mäusen, aber congen zu Balb/c-Mäusen sind: kleinere MHCDifferenzen zwischen den Lymphozyten der Balb/c-Mäuse und den P815-Zellen könnten
die Killing-Aktivität in den in vitro CTL-Experimenten erhöhen. Diese Hypothese wird
durch die Beobachtung unterstützt, dass die T-Zellproliferationsantwort bei den
Tumormäusen deutlich höher ausfiel als bei den Mäusen ohne Tumor (Durchgang B). Das
91
unterschiedliche Immunisierungsprotokoll dürfte für die scheinbar ähnlich starke CTLAktivität zwischen den beiden Gruppen keine Erklärung sein, da gerade beim
Tumormodell mit der zweifachen i.m.-Immunisierung in kurzem Abstand ein Protokoll
gewählt wurde, was besonders für die Verstärkung einer zellulären Immunantwort geeignet
ist.
80-100% der Mäuse konnten nach genetischer Immunisierung mit den Delta-Plasmiden
vor einem Tumorwachstum geschützt werden, was einen in vivo Effekt der zellulären
Immunantwort, induziert durch diese Immunisierungsmethode, beweist. Dagegen zeigte
sich bei sämtlichen Mäusen, die mit einem Leervektor immunisiert wurden, aber auch bei
den Mäusen, denen P815LS-Tumorzellen injiziert wurden und die mit den DeltaPlasmiden immunisiert wurden, ein Tumorwachstum. Dies bestätigt die Spezifität der
zellulären Immunantwort gegen das Delta-Antigen in den mit den Delta-Plasmiden
immunisierten Mäusen.
Wichtig ist auch die Beobachtung, dass Immunisierung mit rekombinantem Delta-Antigen
trotz der Ausbildung von Antikörper-Antworten, aber in Abwesenheit einer Delta-Antigen
spezifischen CTL-Aktivität, die Tiere nicht vor einem Tumorwachstum schützt. Dies
deutet darauf hin, dass eine antitumorale Immunität die Anwesenheit von CD8+ CTLs
benötigt. Tatsächlich konnte in einem Experiment, welches außerhalb dieser Arbeit
durchgeführt wurde, gezeigt werden, dass eine in vivo Depletion von sowohl CD4+ als
auch CD8+ T-Zellen in den mit den Delta-Konstrukten immunisierten Tumormäusen in
Tumorwachstum resultiert. Dies deckt sich mit Beobachtungen am Woodchuck-Modell:
zwar konnten nach Immunisierung von Woodchucks, die mit dem Woodchuck Hepatitis
Virus (WHV) infiziert waren, mit rekombinantem Delta-Antigen spezifische Antikörper
nachgewiesen werden, doch konnten diese die Tiere nicht vor einer nachfolgenden
Superinfektion mit HDV schützen. Dagegen waren mit dem WHV infizierte Woodchucks
zumindest partiell vor einer nachfolgenden Infektion mit HDV geschützt waren, wenn sie
mit dem kleinen Hepatitis Delta Antigen, exprimiert durch rekombinante Vacciniaviren,
immunisiert waren, und zwar in Abwesenheit jeglicher detektierbarer humoraler
Immunantwort (105). Auch die beim Menschen im Rahmen einer HDV-Infektion
nachweisbaren anti-Delta Antikörper besitzen weder einen protektiven Effekt noch haben
sie eine Kontrolle auf die Infektion.
92
Die Tatsache, dass in Mäusen, die mit Leerplasmiden zusammen mit den
Zytokinexpressionsplasmiden immunisiert wurden, keine CTL-Aktivität gegen das DeltaAntigen nachgewiesen werden konnte, beweist, dass die durch die DNA-Plasmide
produzierten Zytokine ohne spezifisches virales Tumorantigen nicht in der Lage sind, eine
protektive Immunität gegen HDAg-exprimierende Tumoren zu induzieren.
Die Mäuse waren, gleich ob mit HDAg- oder LHDAg-Konstrukten immunisiert, gegen das
Wachstum sowohl von HDAg als auch von LHDAg-exprimierenden Tumoren geschützt.
Da auch die Stärke der zellulären Immunantwort nach genetischer Immunisierung mit den
verschiedenen Delta-Plasmiden ähnlich stark ist, lassen diese Beobachtungen eine
vergleichbare in vivo Immunogenität zwischen den beiden Formen des Delta-Antigens
vermuten.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind mit zahlreichen anderen Studien in Einklang
zu bringen, in welchen nach DNA-Immunisierung eine protektive Immunität gegen eine
Reihe von Pathogenen erzielt werden konnte, unter anderem gegen Malaria-Sporozoiten
(141), Mykoplasmen (121), Leishmanien (236), gegen das Virus der lymphozytären
Choriomeningitis (LCMV) (137), gegen Influenza- (226), Herpes simplex- (14,136),
Rabies- (235) und Zytomegalieviren (76) und gegen Ebola (237). In HBsAg-transgenen
Mäusen als Tiermodell für die chronische Hepatitis B kam es nach genetischer
Immunisierung zur HBs-Serokonversion und teilweise sogar zum totalen Verlust der HBVmRNA in der Leber ohne Anzeichen eines zytopathischen Effekts.
Weitere Studien zur DNA-Immunisierung gegen HDV an Tiermodellen sind notwendig.
Zunächst könnte anhand dieses Tumormodells der therapeutische Effekt einer DNAImmunisierung gegen das Hepatitis-Delta-Antigen verifiziert werden. Hierzu müssten die
Tumorzellen vor der Immunisierung den Mäusen injiziert werden. Anschließend könnte
man überprüfen, ob es zu einer Verlangsam des Tumorwachstums oder gar zu einer
vollständigen Remission der Tumoren kommt. Bereits an anderen Infektions- und
Tumormodellen wurde die DNA-Immunisierung eingesetzt, um seine Wirksamkeit als
therapeutische
Vakzine
bei
chronisch-persistierenden
Virusinfektionen
oder
Tumorerkrankungen zu testen (8,16,94).
Des weiteren dürfte es auch von Bedeutung sein, in Zukunft antivirale Strategien zu
entwickeln, die auf die Eliminierung von HBV oder der Suppression der HBV-
93
Hüllenantigene und damit auf die Auslöschung der Helferfunktion des HBV für die
Bildung, den Export aus der Zelle und die Infektiosität des HDV zielen.
94
5 Zusammenfassung
Beobachtungen am Menschen und an Tiermodellen deuten darauf hin, dass eine
ungenügende zelluläre Immunantwort für die Etablierung einer chronisch persistierenden
HDV-Infektion von Bedeutung ist und dass diese suboptimale zelluläre Immunantwort
möglicherweise reversibel ist.
Diese Arbeit hat die Möglichkeiten der Induktion einer zellulären Immunantwort gegen
das Delta-Antigen in einem Tiermodell durch die DNA-Immunisierung aufgezeigt; am
wichtigsten ist die Beobachtung, dass eine spezifische CD8+ CTL-Antwort generiert
werden kann. Anhand des Tumormodells konnte des weiteren der in vivo Effekt einer
solchen Immunantwort nachgewiesen werden: nach Immunisierung mit den DeltaKonstrukten waren die meisten Tiere vor einem Wachstum eines syngenen, das DeltaAntigen exprimierenden Tumors geschützt. Dagegen konnten nach DNA-Immunisierung
keine Antikörper-Antworten gegen das Delta-Antigen nachgewiesen werden.
Basierend auf den Beobachtungen der klinischen Studien, welche die Bedeutung einer
zellulären Immunantwort gegen das Delta-Antigen für die Kontrolle der Aktivität der
Erkrankung demonstrierten, den Beobachtungen am Woodchuck-Modell und den hier
präsentierten experimentellen Ergebnissen, kann die DNA-Immunisierung mit für das
Delta-Antigen kodierenden Genen ein attraktiver Ansatz für die Entwicklung einer
therapeutischen Vakzine gegen HDV darstellen. Mittels DNA-Immunisierung könnte eine
HDV-spezifische zelluläre Immunantwort verstärkt und die Balance zwischen den
zytopathischen und den regulatorischen Komponenten der Immunantwort verändert
werden, um so zur Bekämpfung einer chronischen Hepatitis D beizutragen.
Das Fehlen einer detektierbaren Antikörperantwort gegen das Delta-Antigen in dieser
Arbeit schließt nicht die Möglichkeit aus, die DNA-Immunisierung auch für die
Entwicklung einer prophylaktischen, T-Zell-basierten Vakzine einzusetzen. Denn
entscheidend für die Entwicklung einer prophylaktischen Vakzine gegen HDV ist aller
Wahrscheinlichkeit nach nicht die Möglichkeit der Induktion einer humoralen Immunität.
Vielmehr dürfte aufgrund der hier dargelegten Ergebnisse und den Beobachtungen anderer
Studien die Entwicklung einer therapeutischen oder prophylaktischen Vakzine gegen das
HDV auf die T-Zell-Immunität fokussieren.
95
6 Literaturverzeichnis
1: Abbas AK, Murphy KM, Sher A (1996) Functional diversity of helper T lymphocytes.
Nature. 383:787-93.
2: Aragona M, Macagno S, Caredda F, Crivelli O, Lavarini C, Maran E, Farci P, Purcell
RH, Rizzetto M (1987) Serological response to the hepatitis delta virus in hepatitis D.
Lancet 1:478-80.
3: Armaleo D, Ye GN, Klein TM, Shark KB, Sanford JC, Johnston SA (1990) Biolistic
nuclear transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Curr Genet 17:97103.
4: Arrigoni A, Ponzetto A, Actis G, Bonino F (1983) Levamisole and chronic delta
hepatitis. Ann Intern Med. 98:1024.
5: Barnes WM (1994) PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high
yield from lambda bacteriophage templates. Proc Natl Acad Sci U S A 91:2216-20.
6: Barry MA, Johnston SA (1997) Biological features of genetic immunization. Vaccine
15:788-91.
7: Battegay M, Simpson LH, Hoofnagle JH, Sallie R, Di Bisceglie AM (1994) Elimination
of hepatitis delta virus infection after loss of hepatitis B surface antigen in patients with
chronic delta hepatitis. J Med Virol 44:389-92.
8: Benton PA, Kennedy RC (1998) DNA vaccine strategies for the treatment of cancer.
Curr Top Microbiol Immunol 226:1-20.
96
9: Beral V, Blum H, Duendia M-A (1994) Hepatitis viruses. IARC monographs on the
evaluation of carcinogenic risks to humans 59:223-253
10: Birnboim HC, Doly J (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res 7:1513-23.
11: Bohm W, Kuhrober A, Paier T, Mertens T, Reimann J, Schirmbeck R (1996) DNA
vector constructs that prime hepatitis B surface antigen-specific cytotoxic T lymphocyte
and antibody responses in mice after intramuscular injection. J Immunol Methods 193:2940.
12: Bonino F, Heermann KH, Rizzetto M, Gerlich WH (1986) Hepatitis delta virus: protein
composition of delta antigen and its hepatitis B virus-derived envelope. J Virol 58:945-50.
13: Bonino F, Rosina F, Rizzetto M, Rizzi R, Chiaberge E, Tardanico R, Callea F, Verme G
(1986) Chronic hepatitis in HBsAg carriers with serum HBV-DNA and anti-HBe.
Gastroenterology 90:1268-73.
14: Bourne N, Stanberry LR, Bernstein DI, Lew D (1996) DNA immunization against
experimental genital herpes simplex virus infection. J Infect Dis 173:800-7.
15: Boynton JE, Gillham NW, Harris EH, Hosler JP, Johnson AM, Jones AR, RandolphAnderson BL, Robertson D, Klein TM, Shark KB, et al (1988) Chloroplast transformation
in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science 240:1534-8.
16: Bright RK, Beames B, Shearer MH, Kennedy RC (1996) Protection against a lethal
challenge with SV40-transformed cells by the direct injection of DNA-encoding SV40
large tumor antigen. Cancer Res 56:1126-30.
17: Brook MG, Karayiannis P, Thomas HC (1989) Which patients with chronic hepatitis B
virus infection will respond to alpha-interferon therapy? A statistical analysis of predictive
factors. Hepatology 10:761-3.
97
18: Brunda MJ, Luistro L, Warrier RR, Wright RB, Hubbard BR, Murphy M, Wolf SF,
Gately MK (1993) Antitumor and antimetastatic activity of interleukin 12 against murine
tumors. J Exp Med 178:1223-30.
18a: Brunner T, Mogil RJ, LaFace D, Yoo NJ, Mahboubi A, Echeverri F, Martin SJ, Force
WR, Lynch DH, Ware CF, et al (1995) Cell-autonomous Fas (CD95)/Fas-ligand interaction
mediates activation-induced apoptosis in T-cell hybridomas. Nature 373:441-4.
19: Buchmeier MJ, Welsh RM, Dutko FJ, Oldstone MB (1980) The virology and
immunobiology of lymphocytic choriomeningitis virus infection. Adv Immunol 30:275331.
20: Buti M, Esteban R, Jardi R, Rodriguez F, Guardia J (1993) Ribavirin therapy in chronic
delta hepatitis. J Hepatol 19:318.
21: Calarota S, Bratt G, Nordlund S, Hinkula J, Leandersson AC, Sandstrom E, Wahren B
(1998) Cellular cytotoxic response induced by DNA vaccination in HIV-1-infected
patients. Lancet 351:1320-5.
22: Caredda F, Rossi E, d'Arminio Monforte A, Farci P, Lavarini C (1984) An outbreak of
delta agent among a group of drug addicts and their close contacts. J Infect Dis 149:286-7.
23: Carreno V, Castillo I, Molina J, Porres JC, Bartolome J (1992) Long-term follow-up of
hepatitis B chronic carriers who responded to interferon therapy. J Hepatol 15:102-6.
24: Casey JL, Bergmann KF, Brown TL, Gerin JL (1992) Structural requirements for RNA
editing in hepatitis delta virus: evidence for a uridine-to-cytidine editing mechanism. Proc
Natl Acad Sci U S A 89:7149-53.
25: Casey JL, Brown TL, Colan EJ, Wignall FS, Gerin JL (1993) A genotype of hepatitis D
virus that occurs in northern South America. Proc Natl Acad Sci USA 90:9016-20.
98
26: Cella M, Scheidegger D, Palmer-Lehmann K, Lane P, Lanzavecchia A, Alber G (1996)
Ligation of CD40 on dendritic cells triggers production of high levels of interleukin-12 and
enhances T cell stimulatory capacity: T-T help via APC activation. J Exp Med 184:747-52.
27: Chang MF, Baker SC, Soe LH, Kamahora T, Keck JG, Makino S, Govindarajan S, Lai
MM (1988) Human hepatitis delta antigen is a nuclear phosphoprotein with RNA-binding
activity. J Virol 62:2403-10.
28: Chao M, Hsieh SY, Taylor J (1991) The antigen of hepatitis delta virus: examination of
in vitro RNA-binding specificity. J Virol 65:4057-62.
29: Chao M, Hsieh SY, Taylor J (1990) Role of two forms of hepatitis delta virus antigen:
evidence for a mechanism of self-limiting genome replication. J Virol 64:5066-9.
30: Chen PJ, Kalpana G, Goldberg J, Mason W, Werner B, Gerin J, Taylor J (1986)
Structure and replication of the genome of the hepatitis delta virus. Proc Natl Acad Sci
USA 83:8774-8.
31: Chen PJ, Kuo MY, Chen ML, Tu SJ, Chiu MN, Wu HL, Hsu HC, Chen DS (1990)
Continuous expression and replication of the hepatitis delta virus genome in Hep G2
hepatoblastoma cells transfected with cloned viral DNA. Proc Natl Acad Sci USA
87:5253-7.
32: Cheng L, Ziegelhoffer PR, Yang NS (1993) In vivo promoter activity and transgene
expression in mammalian somatic tissues evaluated by using particle bombardment. Proc
Natl Acad Sci USA 90:4455-9.
33: Chisari FV (1996) Hepatitis B virus transgenic mice: models of viral immunobiology
and pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol 206:149-73.
34: Chisari FV, Ferrari C (1995) Hepatitis B virus immunopathogenesis. Annu Rev
Immunol 13:29-60.
99
35: Chow YH, Chiang BL, Lee YL, Chi WK, Lin WC, Chen YT, Tao MH (1998)
Development of Th1 and Th2 populations and the nature of immune responses to hepatitis
B virus DNA vaccines can be modulated by codelivery of various cytokine genes. J
Immunol 160:1320-9.
36: Cohen SN, Chang AC, Hsu L (1972) Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria:
genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA
69:2110-4.
37: Cole SM, Gowans EJ, Macnaughton TB, Hall PD, Burrell CJ (1991) Direct evidence
for cytotoxicity associated with expression of hepatitis delta virus antigen. Hepatology
13:845-51.
38: Coleman PJ, McQuillan GM, Moyer LA, Lambert SB, Margolis HS (1998) Incidence
of hepatitis B virus infection in the United States, 1976-1994: estimates from the National
Health and Nutrition Examination Surveys. J Infect Dis 178:954-9.
39: Colombo M, Cambieri R, Rumi MG, Ronchi G, Del Ninno E, De Franchis R (1983)
Long-term delta superinfection in hepatitis B surface antigen carriers and its relationship to
the course of chronic hepatitis. Gastroenterology 85:235-9.
40: Condon C, Watkins SC, Celluzzi CM, Thompson K, Falo LD Jr (1996) DNA-based
immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nat Med 2:1122-8.
41: Conry RM, Widera G, LoBuglio AF, Fuller JT, Moore SE, Barlow DL, Turner J, Yang
NS, Curiel DT (1996) Selected strategies to augment polynucleotide immunization. Gene
Ther 3:67-74.
42: Corr M, Lee DJ, Carson DA, Tighe H (1996) Gene vaccination with naked plasmid
DNA: mechanism of CTL priming. J Exp Med 184:1555-60.
43: Corr M, Tighe H, Lee D, Dudler J, Trieu M, Brinson DC, Carson DA (1997)
Costimulation provided by DNA immunization enhances antitumor immunity. J Immunol
159:4999-5004.
100
44: Dao T, Ohashi K, Kayano T, Kurimoto M, Okamura H (1996) Interferon-gammainducing factor, a novel cytokine, enhances Fas ligand-mediated cytotoxicity of murine T
helper 1 cells. Cell Immunol 173:230-5.
45: Davis HL, Demeneix BA, Quantin B, Coulombe J, Whalen RG (1993) Plasmid DNA is
superior to viral vectors for direct gene transfer into adult mouse skeletal muscle. Hum
Gene Ther 4:733-40.
46: Davis HL, Michel ML, Mancini M, Schleef M, Whalen RG (1994) Direct gene transfer
in skeletal muscle: plasmid DNA-based immunization against the hepatitis B virus surface
antigen. Vaccine 12:1503-9.
47: Davis HL, Michel ML, Whalen RG (1993) DNA-based immunization induces
continuous secretion of hepatitis B surface antigen and high levels of circulating antibody.
Hum Mol Genet 2:1847-51.
48: Davis HL, Whalen RG, Demeneix BA (1993) Direct gene transfer into skeletal muscle
in vivo: factors affecting efficiency of transfer and stability of expression. Hum Gene Ther
4:151-9.
49: de Jongh FE, Janssen HL, de Man RA, Hop WC, Schalm SW, van Blankenstein M
(1992) Survival and prognostic indicators in hepatitis B surface antigen-positive cirrhosis
of the liver. Gastroenterology 103:1630-5.
50: Dhein J, Walczak H, Baumler C, Debatin KM, Krammer PH (1995) Autocrine T-cell
suicide mediated by APO-1/. Nature 373:438-41.
51: Dienstag JL, Schiff ER, Wright TL, Perrillo RP, Hann HW, Goodman Z, Crowther L,
Condreay LD, Woessner M, Rubin M, Brown NA (1999) Lamivudine as initial treatment
for chronic hepatitis B in the United States. N Engl J Med 341:1256-63.
52: Dimitrakakis M, Waters MJ, Wootton A, Gust I (1986) Detection of IgM antibodies to
delta antigen after coinfection and superinfection with the delta virus. J Med Virol 20:30511.
101
53: Doe B, Selby M, Barnett S, Baenziger J, Walker CM (1996) Induction of cytotoxic T
lymphocytes by intramuscular immunization with plasmid DNA is facilitated by bone
marrow-derived cells. Proc Natl Acad Sci U S A 93:8578-83.
54: Drazen JM, Arm JP, Austen KF (1996) Sorting out the cytokines of asthma. J Exp Med
183:1-5.
55: Farci P, Gerin JL, Aragona M, Lindsey I, Crivelli O, Balestrieri A, Smedile A, Thomas
HC, Rizzetto M (1986) Diagnostic and prognostic significance of the IgM antibody to the
hepatitis delta virus. JAMA 255:1443-6
56: Farci P, Mandas A, Coiana A, Lai ME, Desmet V, Van Eyken P, Gibo Y, Caruso L,
Scaccabarozzi S, Criscuolo D, et al (1994) Treatment of chronic hepatitis D with interferon
alfa-2a. N Engl J Med 330:88-94.
57: Fattovich G, Boscaro S, Noventa F, Pornaro E, Stenico D, Alberti A, Ruol A, Realdi G
(1987) Influence of hepatitis delta virus infection on progression to cirrhosis in chronic
hepatitis type B. J Infect Dis 155:931-5.
58: Felgner PL, Ringold GM (1989) Cationic liposome-mediated transfection. Nature
337:387-8.
59: Feltquate DM, Heaney S, Webster RG, Robinson HL (1997) Different T helper cell
types and antibody isotypes generated by saline and gene gun DNA immunization. J
Immunol 158:2278-84.
60: Fiedler M, Lu M, Siegel F, Whipple J, Roggendorf M (2001) Immunization of
woodchucks (Marmota monax) with hepatitis delta virus DNA vaccine. Vaccine 19:461826.
61: Fischer HG, Frosch S, Reske K, Reske-Kunz AB (1988) Granulocyte-macrophage
colony-stimulating factor activates macrophages derived from bone marrow cultures to
synthesis of MHC class II molecules and to augmented antigen presentation function. J
Immunol 141:3882-8.
102
62: Fried MW (1996) Therapy of chronic viral hepatitis. Med Clin North Am 80:957-72.
63: Fynan EF, Webster RG, Fuller DH, Haynes JR, Santoro JC, Robinson HL (1993) DNA
vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations.
Proc Natl Acad Sci U S A 90:11478-82.
64: Gaeta GB, Stroffolini T, Chiaramonte M, Ascione T, Stornaiuolo G, Lobello S, Sagnelli
E, Brunetto MR, Rizzetto M (2000) Chronic hepatitis D: a vanishing Disease? An Italian
multicenter study. Hepatology 32:824-7.
65: Garripoli A, Di Marco V, Cozzolongo R, Costa C, Smedile A, Fabiano A, Bonino F,
Rizzetto M, Verme G, Craxi A, et al (1994) Ribavirin treatment for chronic hepatitis D: a
pilot study. Liver 14:154-7.
66: Gately MK, Renzetti LM, Magram J, Stern AS, Adorini L, Gubler U, Presky DH
(1998) The interleukin-12/interleukin-12-receptor system: role in normal and pathologic
immune responses. Annu Rev Immunol 16:495-521.
67: Gately MK, Wolitzky AG, Quinn PM, Chizzonite R (1992) Regulation of human
cytolytic lymphocyte responses by interleukin-12. Cell Immunol 143:127-42.
68: Gazzinelli RT, Hieny S, Wynn TA, Wolf S, Sher A (1993) Interleukin 12 is required for
the T-lymphocyte-independent induction of interferon gamma by an intracellular parasite
and induces resistance in T-cell-deficient hosts. Proc Natl Acad Sci U S A 90:6115-9.
69: Geissler M, Bruss V, Michalak S, Hockenjos B, Ortmann D, Offensperger WB, Wands
JR, Blum HE (1999) Intracellular retention of hepatitis B virus surface proteins reduces
interleukin-2 augmentation after genetic immunizations. J Virol 73:4284-92.
70: Geissler M, Gesien A, Tokushige K, Wands JR (1997) Enhancement of cellular and
humoral immune responses to hepatitis C virus core protein using DNA-based vaccines
augmented with cytokine-expressing plasmids. J Immunol 158:1231-7.
103
71: Geissler M, Gesien A, Wands JR (1997) Chronic ethanol effects on cellular immune
responses to hepatitis B virus envelope protein: an immunologic mechanism for induction
of persistent viral infection in alcoholics. Hepatology 26:764-70.
72: Geissler M, Tokushige K, Chante CC, Zurawski VR, Wands JR (1997) Cellular and
humoral immune response to hepatitis B virus structural proteins in mice after DNA-based
immunization. Gastroenterology 112:1307-20.
73: Geissler M, Wands G, Gesien A, de la Monte S, Bellet D, Wands JR (1997) Genetic
immunization with the free human chorionic gonadotropin beta subunit elicits cytotoxic T
lymphocyte responses and protects against tumor formation in mice. Lab Invest 76:859-71.
74: Ghayur T, Banerjee S, Hugunin M, Butler D, Herzog L, Carter A, Quintal L, Sekut L,
Talanian R, Paskind M, Wong W, Kamen R, Tracey D, Allen H (1997) Caspase-1 processes
IFN-gamma-inducing factor and regulates LPS-induced IFN-gamma production. Nature
386:619-23.
75: Glenn JS, Watson JA, Havel CM, White JM (1992) Identification of a prenylation site
in delta virus large antigen. Science 256:1331-3.
76: Gonzalez Armas JC, Morello CS, Cranmer LD, Spector DH (1996) DNA immunization
confers protection against murine cytomegalovirus infection. J Virol 70:7921-8.
77: Govindarajan S, Kanel GC, Peters RL (1983) Prevalence of delta-antibody among
chronic hepatitis B virus infected patients in the Los Angeles area: its correlation with liver
biopsy diagnosis. Gastroenterology 85:160-2.
78: Gowans EJ, Bonino F (1993) In: Hepatitis Delta Virus: Molecular Biology,
Pathogenesis and Clinical Issues. Hadziyannis SJ, Taylor JM, Bonino F (eds.) Wiley-Liss,
New York, pp. 125-130.
79: Gu Y, Kuida K, Tsutsui H, Ku G, Hsiao K, Fleming MA, Hayashi N, Higashino K,
Okamura H, Nakanishi K, Kurimoto M, Tanimoto T, Flavell RA, Sato V, Harding MW,
104
Livingston DJ, Su MS (1997) Activation of interferon-gamma inducing factor mediated by
interleukin-1beta converting enzyme. Science 275:206-9.
80: Guidotti LG, Ando K, Hobbs MV, Ishikawa T, Runkel L, Schreiber RD, Chisari FV
(1994) Cytotoxic T lymphocytes inhibit hepatitis B virus gene expression by a
noncytolytic mechanism in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA 91:3764-8.
81: Guidotti LG, Ishikawa T, Hobbs MV, Matzke B, Schreiber R, Chisari FV (1996)
Intracellular inactivation of the hepatitis B virus by cytotoxic T lymphocytes. Immunity
4:25-36.
82: Guilhot S, Huang SN, Xia YP, La Monica N, Lai MM, Chisari FV (1994) Expression
of the hepatitis delta virus large and small antigens in transgenic mice. J Virol 68:1052-8.
83: Hadler SC, Alcala de Monzon M, Bensabath G, Martinez Duran M, Schatz G, Fields
HA (1991) Epidemiology of hepatitis delta virus infection in less developed countries.
Prog Clin Biol Res 364:21-31.
84: Hadler SC, De Monzon M, Ponzetto A, Anzola E, Rivero D, Mondolfi A, Bracho A,
Francis DP, Gerber MA, Thung S, et al (1984) Delta virus infection and severe hepatitis.
An epidemic in the Yucpa Indians of Venezuela. Ann Intern Med 100:339-44.
85: Heinzel FP, Schoenhaut DS, Rerko RM, Rosser LE, Gately MK (1993) Recombinant
interleukin 12 cures mice infected with Leishmania major. J Exp Med 177:1505-9.
86: Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, Kaisho T, Sato S, Sanjo H, Matsumoto M, Hoshino
K, Wagner H, Takeda K, Akira S (2000) A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.
Nature 408:740-5.
87: Heufler C, Koch F, Schuler G (1988) Granulocyte/macrophage colony-stimulating
factor and interleukin 1 mediate the maturation of murine epidermal Langerhans cells into
potent immunostimulatory dendritic cells. J Exp Med 167:700-5.
105
88: Hoofnagle JH, Peters M, Mullen KD, Jones DB, Rustgi V, Di Bisceglie A, Hallahan C,
Park Y, Meschievitz C, Jones EA (1988) Randomized, controlled trial of recombinant
human alpha-interferon in patients with chronic hepatitis B. Gastroenterology 95:1318-25.
89: Hsu CH, Chua KY, Tao MH, Lai YL, Wu HD, Huang SK, Hsieh KH (1996)
Immunoprophylaxis of allergen-induced immunoglobulin E synthesis and airway
hyperresponsiveness in vivo by genetic immunization. Nat Med 2:540-4.
90: Huang YH, Wu JC, Tao MH, Syu WJ, Hsu SC, Chi WK, Chang FY, Lee SD (2000)
DNA-Based immunization produces Th1 immune responses to hepatitis delta virus in a
mouse model. Hepatology 32:104-10.
91: Hwang SB, Lee CZ, Lai MM (1992) Hepatitis delta antigen expressed by recombinant
baculoviruses: comparison of biochemical properties and post-translational modifications
between the large and small forms. Virology 190:413-22.
92: Imazeki F, Omata M, Ohto M (1990) Heterogeneity and evolution rates of delta virus
RNA sequences. J Virol 64:5594-9.
93: Inaba K, Witmer-Pack M, Inaba M, Hathcock KS, Sakuta H, Azuma M, Yagita H,
Okumura K, Linsley PS, Ikehara S (1994) The tissue distribution of the B7-2 costimulator
in mice: abundant expression on dendritic cells in situ and during maturation in vitro. J
Exp Med 180:1849-60.
94: Irvine KR, Rao JB, Rosenberg SA, Restifo NP (1996) Cytokine enhancement of DNA
immunization leads to effective treatment of established pulmonary metastases. J Immunol
156:238-45.
95: Itakura K, Rossi JJ, Wallace RB (1984) Synthesis and use of synthetic
oligonucleotides. Annu Rev Biochem 53:323-56.
96: Iwasaki A, Stiernholm BJ, Chan AK, Berinstein NL, Barber BH (1997) Enhanced CTL
responses mediated by plasmid DNA immunogens encoding costimulatory molecules and
cytokines. J Immunol 158:4591-601.
106
97: Jeng KS, Su PY, Lai MM (1996) Hepatitis delta antigens enhance the ribozyme
activities of hepatitis delta virus RNA in vivo. J Virol 70:4205-9.
98: Jenkins MK, Schwartz RH (1987) Antigen presentation by chemically modified
splenocytes induces antigen-specific T cell unresponsiveness in vitro and in vivo. J Exp
Med 165:302-19.
99: Johnston SA, Anziano PQ, Shark K, Sanford JC, Butow RA (1988) Mitochondrial
transformation in yeast by bombardment with microprojectiles. Science 240:1538-41.
100: Jondal M, Schirmbeck R, Reimann J (1996) MHC class I-restricted CTL responses to
exogenous antigens. Immunity 5:295-302.
101: June CH, Bluestone JA, Nadler LM, Thompson CB (1994) The B7 and CD28
receptor families. Immunol Today 15:321-31.
102: Jung MC, Diepolder HM, Spengler U, Wierenga EA, Zachoval R, Hoffmann RM,
Eichenlaub D, Frosner G, Will H, Pape GR (1995) Activation of a heterogeneous hepatitis
B (HB) core and e antigen-specific CD4+ T-cell population during seroconversion to antiHBe and anti-HBs in hepatitis B virus infection. J Virol 69:3358-68.
103: Kagi D, Ledermann B, Burki K, Zinkernagel RM, Hengartner H (1996) Molecular
mechanisms of lymphocyte-mediated cytotoxicity and their role in immunological
protection and pathogenesis in vivo. Annu Rev Immunol 14:207-32.
104: Karayiannis P, Goldin R, Luther S, Carman WF, Monjardino J, Thomas HC (1992)
Effect of cyclosporin-A in woodchucks with chronic hepatitis delta virus infection. J Med
Virol 36:316-21.
105: Karayiannis P, Saldanha J, Jackson AM, Luther S, Goldin R, Monjardino J, Thomas
HC (1993) Partial control of hepatitis delta virus superinfection by immunisation of
woodchucks (Marmota monax) with hepatitis delta antigen expressed by a recombinant
vaccinia or baculovirus. J Med Virol 41:210-4.
107
106: Kim JJ, Ayyavoo V, Bagarazzi ML, Chattergoon MA, Dang K, Wang B, Boyer JD,
Weiner DB (1997) In vivo engineering of a cellular immune response by coadministration
of IL-12 expression vector with a DNA immunogen. J Immunol 158:816-26.
107: Kim JJ, Bagarazzi ML, Trivedi N, Hu Y, Kazahaya K, Wilson DM, Ciccarelli R,
Chattergoon MA, Dang K, Mahalingam S, Chalian AA, Agadjanyan MG, Boyer JD, Wang
B, Weiner DB (1997) Engineering of in vivo immune responses to DNA immunization via
codelivery of costimulatory molecule genes. Nat Biotechnol. 15:641-6.
108: Kim JJ, Trivedi NN, Nottingham LK, Morrison L, Tsai A, Hu Y, Mahalingam S, Dang
K, Ahn L, Doyle NK, Wilson DM, Chattergoon MA, Chalian AA, Boyer JD, Agadjanyan
MG, Weiner DB (1998) Modulation of amplitude and direction of in vivo immune
responses by co-administration of cytokine gene expression cassettes with DNA
immunogens. Eur J Immunol 28:1089-103.
109: Klinman DM, Yamshchikov G, Ishigatsubo Y (1997) Contribution of CpG motifs to
the immunogenicity of DNA vaccines. J Immunol 158:3635-9.
110: Kohno K, Kataoka J, Ohtsuki T, Suemoto Y, Okamoto I, Usui M, Ikeda M, Kurimoto
M (1997) IFN-gamma-inducing factor (IGIF) is a costimulatory factor on the activation of
Th1 but not Th2 cells and exerts its effect independently of IL-12. J Immunol 158:154150.
111: Kojima T, Callea F, Desmyter J, Desmet VJ (1986) Immune electron microscopy of
hepatitis delta-antigen in hepatocytes. Lab Invest 55:217-25.
112: Kos T, Molijn A, Blauw B, Schellekens H (1991) Baculovirus-directed high level
expression of the hepatitis delta antigen in Spodoptera frugiperda cells. J Gen Virol
72:833-42.
113: Kovacsovics-Bankowski M, Rock KL (1995) A phagosome-to-cytosol pathway for
exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science 267:243-6.
108
114: Krieg AM (1996) An innate immune defense mechanism based on the recognition of
CpG motifs in microbial DNA. J Lab Clin Med 128:128-33.
115: Krieg AM, Yi AK, Matson S, Waldschmidt TJ, Bishop GA, Teasdale R, Koretzky GA,
Klinman DM (1995) CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature
374:546-9.
116: Kuchroo VK, Das MP, Brown JA, Ranger AM, Zamvil SS, Sobel RA, Weiner HL,
Nabavi N, Glimcher LH (1995) B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate
differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease
therapy. Cell 80:707-18.
117: Kuhober A, Pudollek HP, Reifenberg K, Chisari FV, Schlicht HJ, Reimann J,
Schirmbeck R (1996) DNA immunization induces antibody and cytotoxic T cell responses
to hepatitis B core antigen in H-2b mice. J Immunol 156:3687-95.
118: Kuo MY, Chao M, Taylor J (1989) Initiation of replication of the human hepatitis
delta virus genome from cloned DNA: role of delta antigen. J Virol 63:1945-50.
119: Kuo MY, Sharmeen L, Dinter-Gottlieb G, Taylor J (1988) Characterization of selfcleaving RNA sequences on the genome and antigenome of human hepatitis delta virus. J
Virol 62:4439-44.
120: Lai CL, Chien RN, Leung NW, Chang TT, Guan R, Tai DI, Ng KY, Wu PC, Dent JC,
Barber J, Stephenson SL, Gray DF (1998) A one-year trial of lamivudine for chronic
hepatitis B. Asia Hepatitis Lamivudine Study Group. N Engl J Med 339:61-8.
121: Lai WC, Pakes SP, Ren K, Lu YS, Bennett M (1997) Therapeutic effect of DNA
immunization of genetically susceptible mice infected with virulent Mycoplasma
pulmonis. J Immunol 158:2513-6.
122: Lau DT, Doo E, Park Y, Kleiner DE, Schmid P, Kuhns MC, Hoofnagle JH (1999)
Lamivudine for chronic delta hepatitis. Hepatology 30:546-9.
109
123: Lazinski DW, Taylor JM (1994) Expression of hepatitis delta virus RNA deletions: cis
and trans requirements for self-cleavage, ligation, and RNA packaging. J Virol 8:2879-88.
124: Lazinski DW, Taylor JM (1993) Relating structure to function in the hepatitis delta
virus antigen. J Virol 67:2672-80.
125: Lee CZ, Chen PJ, Lai MM, Chen DS (1994) Isoprenylation of large hepatitis delta
antigen is necessary but not sufficient for hepatitis delta virus assembly. Virology 199:16975.
126: Leclerc C, Deriaud E, Rojas M, Whalen RG (1997) The preferential induction of a
Th1
immune
response
by
DNA-based
immunization
is
mediated
by
the
immunostimulatory effect of plasmid DNA. Cell Immunol 179:97-106.
127: Lee CZ, Lin JH, Chao M, McKnight K, Lai MM (1993) RNA-binding activity of
hepatitis delta antigen involves two arginine-rich motifs and is required for hepatitis delta
virus RNA replication. J Virol 67:2221-7.
128: Lewis PJ, Babiuk LA (1999) DNA vaccines: a review. Adv Virus Res 54:129-88.
129: Liaw YF, Chien RN, Yeh CT, Tsai SL, Chu CM (1999) Acute exacerbation and
hepatitis B virus clearance after emergence of YMDD motif mutation during lamivudine
therapy. Hepatology 30:567-72.
130: Lin JH, Chang MF, Baker SC, Govindarajan S, Lai MM (1990) Characterization of
hepatitis delta antigen: specific binding to hepatitis delta virus RNA. J Virol 64:4051-8.
131: Lok AS, Weller IV, Karayiannis P, Brown D, Fowler MJ, Monjardino J, Thomas HC,
Sherlock S (1984) Thrice weekly lymphoblastoid interferon is effective in inhibiting
hepatitis B virus replication. Liver 4:45-9.
132: Macatonia SE, Hsieh CS, Murphy KM, O'Garra A (1993) Dendritic cells and
macrophages are required for Th1 development of CD4+ T cells from alpha beta TCR
110
transgenic mice: IL-12 substitution for macrophages to stimulate IFN-gamma production is
IFN-gamma-dependent. Int Immunol 5:1119-28.
133: Maecker HT, Umetsu DT, DeKruyff RH, Levy S (1997) DNA vaccination with
cytokine fusion constructs biases the immune response to ovalbumin. Vaccine 15:1687-96.
134: Mancini M, Hadchouel M, Davis HL, Whalen RG, Tiollais P, Michel ML (1996)
DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface
antigen chronic carrier state. Proc Natl Acad Sci USA 93:12496-501.
135: Mandel M, Higa A (1970) Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J Mol
Biol 53:159-62.
136: Manickan E, Rouse RJ, Yu Z, Wire WS, Rouse BT (1995) Genetic immunization
against herpes simplex virus. Protection is mediated by CD4+ T lymphocytes. J Immunol
155:259-65.
137: Martins LP, Lau LL, Asano MS, Ahmed R (1995) DNA vaccination against persistent
viral infection. J Virol 69:2574-82.
138: Mendoza RB, Cantwell MJ, Kipps TJ (1997) Immunostimulatory effects of a plasmid
expressing CD40 ligand (CD154) on gene immunization. J Immunol 159:5777-81.
139: Modrow S, Falke D (1997) In: Molekulare Virologie: Hepatitis-D-Viren. Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg, S. 354-357.
140: Moestrup T, Hansson BG, Widell A, Nordenfelt E (1983) Clinical aspects of delta
infection. Med J (Clin Res Ed) 286:87-90.
141: Mor G, Klinman DM, Shapiro S, Hagiwara E, Sedegah M, Norman JA, Hoffman SL,
Steinberg AD (1995) Complexity of the cytokine and antibody response elicited by
immunizing mice with Plasmodium yoelii circumsporozoite protein plasmid DNA. J
Immunol 155:2039-46.
111
142: Morrissey PJ, Bressler L, Park LS, Alpert A, Gillis S (1987) Granulocyte-macrophage
colony-stimulating factor augments the primary antibody response by enhancing the
function of antigen-presenting cells. J Immunol 139:1113-9.
143: Mosmann TR, Coffman RL (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of
lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 7:145-73.
144: Mosmann TR, Sad S (1996) The expanding universe of T-cell subsets: Th1, Th2 and
more. Immunol Today 17:138-46.
145: Mueller DL, Jenkins MK, Schwartz RH (1989) Clonal expansion versus functional
clonal inactivation: a costimulatory signalling pathway determines the outcome of T cell
antigen receptor occupancy. Annu Rev Immunol 7:445-80.
146: Nakamoto Y, Guidotti LG, Kuhlen CV, Fowler P, Chisari FV (1998) Immune
pathogenesis of hepatocellular carcinoma. J Exp Med 188:341-50.
147: Nastala CL, Edington HD, McKinney TG, Tahara H, Nalesnik MA, Brunda MJ,
Gately MK, Wolf SF, Schreiber RD, Storkus WJ, et al (1994) Recombinant IL-12
administration induces tumor regression in association with IFN-gamma production. J
Immunol 153:1697-706.
148: Negro F, Baldi M, Bonino F, Rocca G, Demartini A, Passarino G, Maran E, Lavarini
C, Rizzetto M, Verme G (1988) Chronic HDV (hepatitis delta virus) hepatitis. Intrahepatic
expression of delta antigen, histologic activity and outcome of liver disease. J Hepatol 6:814.
149: Negro F, Gerin JL, Purcell RH, Miller RH (1989) Basis of hepatitis delta virus
disease? Nature 341:111.
150: Negro F, Pacchioni D, Bussolati G, Ardeleanu C, Verme G, Rizzetto M, Bonino F
(1993) In: Hepatitis Delta Virus: Molecular Biology, Pathogenesis and Clinical Aspects.
Hadziyannis SJ, Taylor JM, Bonino F (eds.) Wiley-Liss, New York, S.155-160
112
151: Negro F, Shapiro M, Satterfield WC, Gerin JL, Purcell RH (1989) Reappearance of
hepatitis D virus (HDV) replication in chronic hepatitis B virus carrier chimpanzees
rechallenged with HDV. J Infect Dis 160:567-71.
152: Niederau C, Heintges T, Lange S, Goldmann G, Niederau CM, Mohr L, Haussinger D
(1996) Long-term follow-up of HBeAg-positive patients treated with interferon alfa for
chronic hepatitis B. N Engl J Med 334:1422-7.
153: Niro GA, Smedile A, Andriulli A, Rizzetto M, Gerin JL, Casey JL (1997) The
predominance of hepatitis delta virus genotype I among chronically infected Italian
patients. Hepatology 25:728-34.
154: Nishikawa S, Suh YA, Kumar PK, Kawakami J, Nishikawa F, Taira K (1992)
Identification of important bases for the self-cleavage activity at two single-stranded
regions of genomic HDV ribozyme. Nucleic Acids Symp Ser 27:41-2.
155: Nisini R, Paroli M, Accapezzato D, Bonino F, Rosina F, Santantonio T, Sallusto F,
Amoroso A, Houghton M, Barnaba V (1997) Human CD4+ T-cell response to hepatitis
delta virus: identification of multiple epitopes and characterization of T-helper cytokine
profiles. J Virol 71:2241-51.
156: Okada E, Sasaki S, Ishii N, Aoki I, Yasuda T, Nishioka K, Fukushima J, Miyazaki J,
Wahren B, Okuda K (1997) Intranasal immunization of a DNA vaccine with IL-12- and
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)-expressing plasmids in
liposomes induces strong mucosal and cell-mediated immune responses against HIV-1
antigens. J Immunol 159:3638-47.
157: Okamura H, Tsutsi H, Komatsu T, Yutsudo M, Hakura A, Tanimoto T, Torigoe K,
Okura T, Nukada Y, Hattori K (1995) Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma
production by T cells. Nature 378:88-91.
158: Papaevangelou G (1987) Benign and fulminant HDV hepatitis in Greece. In: The
Hepatitis Delta Virus and Its Disease. Rizzetto M, Gerin JL, Purcell RH (eds) Alan R.
Liss, New York, S.403.
113
159: Papaevangelou GJ (1987) Benign and fulminant HDV hepatitis in Greece. Prog Clin
Biol Res 234:395-402.
160: Pardoll DM, Beckerleg AM (1995) Exposing the immunology of naked DNA
vaccines. Immunity 3:165-9.
161: Parker C, Chaudhary R (1986) Delta infection in Canada. N Engl J Med 314:320-1.
162: Paul WE, Seder RA (1994) Lymphocyte responses and cytokines. Cell 76:241-51.
163: Perrillo RP, Schiff ER, Davis GL, Bodenheimer HC, Lindsay K, Payne J, Dienstag
JL, O'Brien C, Tamburro C, Jacobson IM, et al (1990) A randomized, controlled trial of
interferon alfa-2b alone and after prednisone withdrawal for the treatment of chronic
hepatitis B. The Hepatitis Interventional Therapy Group. N Engl J Med 323:295-301.
164: Pertmer TM, Roberts TR, Haynes JR (1996) Influenza virus nucleoprotein-specific
immunoglobulin G subclass and cytokine responses elicited by DNA vaccination are
dependent on the route of vector DNA delivery. J Virol 70:6119-25.
165: Pichoud C, Berby F, Stuyver L, Petit MA, Trepo C, Zoulim F (2000) Persistence of
viral replication after anti-HBe seroconversion during antiviral therapy for chronic
hepatitis B. J Hepatol 32:307-16.
166: Polo JM, Jeng KS, Lim B, Govindarajan S, Hofman F, Sangiorgi F, Lai MM (1995)
Transgenic mice support replication of hepatitis delta virus RNA in multiple tissues,
particularly in skeletal muscle. J Virol 69:4880-7.
167: Polo JM, Lim B, Govindarajan S, Lai MM (1995) Replication of hepatitis delta virus
RNA in mice after intramuscular injection of plasmid DNA. J Virol 69:5203-7.
168: Polson AG, Bass BL, Casey JL (1996) RNA editing of hepatitis delta virus
antigenome by dsRNA-adenosine deaminase. Nature 380:454-6.
114
169: Ponzetto A, Forzani B, Parravicini PP, Hele C, Zanetti A, Rizzetto M (1985)
Epidemiology of hepatitis delta virus (HDV) infection. Eur J Epidemiol 1:257-63.
170: Prayaga SK, Ford MJ, Haynes JR (1997) Manipulation of HIV-1 gp120-specific
immune responses elicited via gene gun-based DNA immunization. Vaccine 15:1349-52.
171: Quill H, Schwartz RH (1987) Stimulation of normal inducer T cell clones with
antigen presented by purified Ia molecules in planar lipid membranes: specific induction of
a long-lived state of proliferative nonresponsiveness. J Immunol 138:3704-12.
172: Rakhmilevich AL, Turner J, Ford MJ, McCabe D, Sun WH, Sondel PM, Grota K,
Yang NS (1996) Gene gun-mediated skin transfection with interleukin 12 gene results in
regression of established primary and metastatic murine tumors. Proc Natl Acad Sci USA
93:6291-6.
173: Raz E, Tighe H, Sato Y, Corr M, Dudler JA, Roman M, Swain SL, Spiegelberg HL,
Carson DA (1996) Preferential induction of a Th1 immune response and inhibition of
specific IgE antibody formation by plasmid DNA immunization. Proc Natl Acad Sci USA
93:5141-5.
174: Raz E, Watanabe A, Baird SM, Eisenberg RA, Parr TB, Lotz M, Kipps TJ, Carson DA
(1993) Systemic immunological effects of cytokine genes injected into skeletal muscle.
Proc Natl Acad Sci USA 90:4523-7.
175: Rehermann B, Chang KM, McHutchinson J, Kokka R, Houghton M, Rice CM,
Chisari FV (1996) Differential cytotoxic T-lymphocyte responsiveness to the hepatitis B
and C viruses in chronically infected patients. J Virol 70:7092-102.
176: Reis e Sousa C, Germain RN (1995) Major histocompatibility complex class I
presentation of peptides derived from soluble exogenous antigen by a subset of cells
engaged in phagocytosis. J Exp Med 182:841-51.
177: Rizzetto M, Ponzetto A, Forzani I (1991) Epidemiology of hepatitis delta virus:
overview. Prog Clin Biol Res 364:1-20.
115
178: Rizzetto M, Ponzetto A, Forzani I (1990) Hepatitis delta virus as a global health
problem. Vaccine 8 Suppl:10-4; discussion 21-3.
179: Rizzetto M, Purcell RH, Gerin JL (1980) Epidemiology of HBV-associated delta
agent: geographical distribution of anti-delta and prevalence in polytransfused HBsAg
carriers. Lancet 1:1215-8.
180: Rizzetto M, Verme G, Recchia S, Bonino F, Farci P, Arico S, Calzia R, Picciotto A,
Colombo M, Popper H (1983) Chronic hepatitis in carriers of hepatitis B surface antigen,
with intrahepatic expression of the delta antigen. An active and progressive disease
unresponsive to immunosuppressive treatment. Ann Intern Med 98:437-41.
181: Robinson D, Shibuya K, Mui A, Zonin F, Murphy E, Sana T, Hartley SB, Menon S,
Kastelein R, Bazan F, O'Garra A (1997) IGIF does not drive Th1 development but
synergizes with IL-12 for interferon-gamma production and activates IRAK and
NFkappaB. Immunity 7:571-81.
182: Roingeard P, Dubois F, Marcellin P, Bernuau J, Bonduelle S, Benhamou JP, Goudeau
A (1992) Persistent delta antigenaemia in chronic delta hepatitis and its relation with
human immunodeficiency virus infection. J Med Virol 38:191-4.
183: Rollier C, Sunyach C, Barraud L, Madani N, Jamard C, Trepo C, Cova L (1999)
Protective and therapeutic effect of DNA-based immunization against hepadnavirus large
envelope protein. Gastroenterology 116:658-65.
184: Roman M, Martin-Orozco E, Goodman JS, Nguyen MD, Sato Y, Ronaghy A,
Kornbluth RS, Richman DD, Carson DA, Raz E (1997) Immunostimulatory DNA
sequences function as T helper-1-promoting adjuvants. Nat Med 3:849-54.
185: Rosina F, Saracco G, Lattore V, Quartarone V, Rizzetto M, Verme G, Trinchero P,
Sansalvadore F, Smedile A (1987) Alpha 2 recombinant interferon in the treatment of
chronic hepatitis delta virus (HDV) hepatitis. Prog Clin Biol Res 234:299-303.
116
186: Ryu WS, Bayer M, Taylor J (1992) Assembly of hepatitis delta virus particles. J Virol
66:2310-5.
187: Ryu WS, Netter HJ, Bayer M, Taylor J (1993) Ribonucleoprotein complexes of
hepatitis delta virus. J Virol 67:3281-7.
188: Sagnelli E, Felaco FM, Filippini P, Pasquale G, Peinetti P, Buonagurio E, Aprea L,
Pulella C, Piccinino F, Giusti G (1989) Influence of HDV infection on clinical,
biochemical and histological presentation of HBsAg positive chronic hepatitis. Liver
9:229-34.
189: Sagnelli E, Stroffolini T, Ascione A, Bonino F, Chiaramonte M, Colombo M, Craxi A,
Giusti G, Manghisi OG, Pastore G, et al (1992) The epidemiology of hepatitis delta
infection in Italy. Promoting Group. J Hepatol 15:211-5.
190: Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich
HA (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA
polymerase. Science 239:487-91.
191: Santantonio T, Mazzola M, Iacovazzi T, Miglietta A, Guastadisegni A, Pastore G
(2000) Long-term follow-up of patients with anti-HBe/HBV DNA-positive chronic
hepatitis B treated for 12 months with lamivudine. J Hepatol 32:300-6.
192: Sato Y, Roman M, Tighe H, Lee D, Corr M, Nguyen MD, Silverman GJ, Lotz M,
Carson DA, Raz E (1996) Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective
intradermal gene immunization. Science 273:352-4.
193: Schirmbeck R, Bohm W, Ando K, Chisari FV, Reimann J (1995) Nucleic acid
vaccination primes hepatitis B virus surface antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in
nonresponder mice. J Virol 69:5929-34.
194: Seder RA, Gazzinelli R, Sher A, Paul WE (1993) Interleukin 12 acts directly on
CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes
interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci USA 90:10188-92.
117
195: Sharmeen L, Kuo MY, Dinter-Gottlieb G, Taylor J (1988) Antigenomic RNA of
human hepatitis delta virus can undergo self-cleavage. J Virol 62:2674-9.
196: Sharmeen L, Kuo MY, Taylor J (1989) Self-ligating RNA sequences on the
antigenome of human hepatitis delta virus. J Virol 63:1428-30.
197: Sharp PA, Sugden B, Sambrook J (1973) Detection of two restriction endonuclease
activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose--ethidium bromide
electrophoresis. Biochemistry 12:3055-63.
198: Shiver JW, Su L, Henkart PA (1992) Cytotoxicity with target DNA breakdown by rat
basophilic leukemia cells expressing both cytolysin and granzyme A. Cell 71:315-22.
199: Shiver JW, Perry HC, Davies ME, Freed DC, Liu MA (1995) Cytotoxic T lymphocyte
and helper T cell responses following HIV polynucleotide vaccination. Ann N Y Acad Sci
772:198-208.
200: Sin JI, Sung JH, Suh YS, Lee AH, Chung JH, Sung YC (1997) Protective immunity
against heterologous challenge with encephalomyocarditis virus by VP1 DNA vaccination:
effect of coinjection with a granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene.
Vaccine 15:1827-33.
201: Smedile A, Dentico P, Zanetti A, Sagnelli E, Nordenfelt E, Actis GC, Rizzetto M
(1981) Infection with the delta agent in chronic HBsAg carriers. Gastroenterology 81:9927.
202: Smedile A, Lavarini C, Crivelli O, Raimondo G, Fassone M, Rizzetto M (1982)
Radioimmunoassay detection of IgM antibodies to the HBV-associated delta (delta)
antigen: clinical significance in delta infection. J Med Virol 9:131-8.
203: Smedile A, Rosina F, Saracco G, Chiaberge E, Lattore V, Fabiano A, Brunetto MR,
Verme G, Rizzetto M, Bonino F (1991) Hepatitis B virus replication modulates
pathogenesis of hepatitis D virus in chronic hepatitis D. Hepatology 13:413-6.
118
204: Smith KA (1988) Interleukin-2: inception, impact, and implications. Science
240:1169-76.
205: Street NE, Mosmann TR (1991) Functional diversity of T lymphocytes due to
secretion of different cytokine patterns. FASEB J 5:171-7.
206: Sypek JP, Chung CL, Mayor SE, Subramanyam JM, Goldman SJ, Sieburth DS, Wolf
SF, Schaub RG (1993) Resolution of cutaneous leishmaniasis: interleukin 12 initiates a
protective T helper type 1 immune response. J Exp Med 177:1797-802.
207: Tanaka T, Hu-Li J, Seder RA, Fazekas de St Groth B, Paul WE (1993) Interleukin 4
suppresses interleukin 2 and interferon gamma production by naïve T cells stimulated by
accessory cell-dependent receptor engagement. Proc Natl Acad Sci USA 90:5914-8.
208: Tang DC, DeVit M, Johnston SA (1992) Genetic immunization is a simple method for
eliciting an immune response. Nature 356:152-4.
209: Thill G, Vasseur M, Tanner NK (1993) Structural and sequence elements required for
the self-cleaving activity of the hepatitis delta virus ribozyme. Biochemistry 32:4254-62.
210: Thomas HC, Farci P, Shein R, Karayiannis P, Smedile A, Caruso L, Gerin J (1987)
Inhibition of hepatitis delta virus (HDV) replication by lymphoblastoid human alpha
interferon. Prog Clin Biol Res 234:277-90.
211: Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl
Acad Sci USA 76:4350-4.
212: Trinchieri G, Scott P (1995) Interleukin-12: a proinflammatory cytokine with
immunoregulatory functions. Res Immunol 146:423-31.
213: Tsai SL, Chen PJ, Lai MY, Yang PM, Sung JL, Huang JH, Hwang LH, Chang TH,
Chen DS (1992) Acute exacerbations of chronic type B hepatitis are accompanied by
119
increased T cell responses to hepatitis B core and e antigens. Implications for hepatitis B e
antigen seroconversion. J Clin Invest 89:87-96.
214: Tsuji T, Hamajima K, Fukushima J, Xin KQ, Ishii N, Aoki I, Ishigatsubo Y, Tani K,
Kawamoto S, Nitta Y, Miyazaki J, Koff WC, Okubo T, Okuda K (1997) Enhancement of
cell-mediated immunity against HIV-1 induced by coinnoculation of plasmid-encoded
HIV-1 antigen with plasmid expressing IL-12. J Immunol 158:4008-13.
215: Tsutsui H, Nakanishi K, Matsui K, Higashino K, Okamura H, Miyazawa Y, Kaneda K
(1996) IFN-gamma-inducing factor up-regulates Fas ligand-mediated cytotoxic activity of
murine natural killer cell clones. J Immunol 157:3967-73.
216: Tuting T, Wilson CC, Martin DM, Kasamon YL, Rowles J, Ma DI, Slingluff CL Jr,
Wagner SN, van der Bruggen P, Baar J, Lotze MT, Storkus WJ (1998) Autologous human
monocyte-derived dendritic cells genetically modified to express melanoma antigens elicit
primary cytotoxic T cell responses in vitro: enhancement by cotransfection of genes
encoding the Th1-biasing cytokines IL-12 and IFN-alpha. J Immunol 160:1139-47.
217: Ulmer JB, Deck RR, Dewitt CM, Donnhly JI, Liu MA (1996) Generation of MHC
class I-restricted cytotoxic T lymphocytes by expression of a viral protein in muscle cells:
antigen presentation by non-muscle cells. Immunology 89:59-67.
218: Ulmer JB, Deck RR, Dewitt CM, Fu TM, Donnelly JJ, Caulfield MJ, Liu MA (1997)
Expression of a viral protein by muscle cells in vivo induces protective cell-mediated
immunity. Vaccine 15:839-41.
219: Ulmer JB, Donnelly JJ, Parker SE, Rhodes GH, Felgner PL, Dwarki VJ, Gromkowski
SH, Deck RR, DeWitt CM, Friedman A (1993) Heterologous protection against influenza
by injection of DNA encoding a viral protein. Science 259:1745-9.
220: Ushio S, Namba M, Okura T, Hattori K, Nukada Y, Akita K, Tanabe F, Konishi K,
Micallef M, Fujii M, Torigoe K, Tanimoto T, Fukuda S, Ikeda M, Okamura H, Kurimoto M
(1996) Cloning of the cDNA for human IFN-gamma-inducing factor, expression in
120
Escherichia coli, and studies on the biologic activities of the protein. J Immunol 156:42749.
221: Vitadello M, Schiaffino MV, Picard A, Scarpa M, Schiaffino S (1994) Gene transfer in
regenerating muscle. Hum Gene Ther 5:11-8.
222: Vogelstein B, Gillespie D (1979) Preparative and analytical purification of DNA from
agarose. Proc Natl Acad Sci USA 76:615-9.
223: Wang B, Boyer J, Srikantan V, Coney L, Carrano R, Phan C, Merva M, Dang K,
Agadjanan M, Gilbert L (1993) DNA inoculation induces neutralizing immune responses
against human immunodeficiency virus type 1 in mice and nonhuman primates. DNA Cell
Biol 12:799-805.
224: Wang KS, Choo QL, Weiner AJ, Ou JH, Najarian RC, Thayer RM, Mullenbach GT,
Denniston KJ, Gerin JL, Houghton M (1986) Structure, sequence and expression of the
hepatitis delta (delta) viral genome. Nature 323:508-14.
225: Wang R, Doolan DL, Le TP, Hedstrom RC, Coonan KM, Charoenvit Y, Jones TR,
Hobart P, Margalith M, Ng J, Weiss WR, Sedegah M, de Taisne C, Norman JA, Hoffman
SL (1998) Induction of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in humans by a malaria
DNA vaccine. Science 282:476-80.
226: Webster RG, Fynan EF, Santoro JC, Robinson H (1994) Protection of ferrets against
influenza challenge with a DNA vaccine to the haemagglutinin. Vaccine 12:1495-8.
227: Whalen RG, Leclerc C, Deriaud E, Schirmbeck R, Reimann J, Davis HL (1995) DNAmediated immunization to the hepatitis B surface antigen. Activation and entrainment of
the immune response. Ann N Y Acad Sci 772:64-76.
228: Wolff JA, Malone RW, Williams P, Chong W, Acsadi G, Jani A, Felgner PL (1990)
Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247:1465-8.
121
229: Wong DK, Cheung AM, O'Rourke K, Naylor CD, Detsky AS, Heathcote J (1993)
Effect of alpha-interferon treatment in patients with hepatitis B e antigen-positive chronic
hepatitis B. A meta-analysis. Ann Intern Med 119:312-23.
230: Wu JC, Choo KB, Chen CM, Chen TZ, Huo TI, Lee SD (1995) Genotyping of
hepatitis D virus by restriction-fragment length polymorphism and relation to outcome of
hepatitis D. Lancet 346:939-41.
231: Wu HN, Wang YJ, Hung CF, Lee HJ, Lai MM (1992) Sequence and structure of the
catalytic RNA of hepatitis delta virus genomic RNA. J Mol Biol 223:233-45.
232: Xia YP, Yeh CT, Ou JH, Lai MM (1992) Characterization of nuclear targeting signal
of hepatitis delta antigen: nuclear transport as a protein complex. J Virol 66:914-21.
233: Xiang Z, Ertl HC (1995) Manipulation of the immune response to a plasmid-encoded
viral antigen by coinoculation with plasmids expressing cytokines. Immunity 2:129-35.
234: Xiang ZQ, Spitalnik SL, Cheng J, Erikson J, Wojczyk B, Ertl HC (1995) Immune
responses to nucleic acid vaccines to rabies virus. Virology 209:569-79.
235: Xiang ZQ, Spitalnik S, Tran M, Wunner WH, Cheng J, Ertl HC (1994) Vaccination
with a plasmid vector carrying the rabies virus glycoprotein gene induces protective
immunity against rabies virus. Virology 199:132-40.
236: Xu D, Liew FY (1995) Protection against leishmaniasis by injection of DNA
encoding a major surface glycoprotein, gp63, of L. major. Immunology 84:173-6.
237: Xu L, Sanchez A, Yang Z, Zaki SR, Nabel EG, Nichol ST, Nabel GJ (1998)
Immunization for Ebola virus infection. Nat Med 4:37-42.
238: Yoshimoto T, Okamura H, Tagawa YI, Iwakura Y, Nakanishi K (1997) Interleukin 18
together with interleukin 12 inhibits IgE production by induction of interferon-gamma
production from activated B cells. Proc Natl Acad Sci U S A 94:3948-53.
122
239: Zinkernagel RM (1996) Immunology taught by viruses. Science 271:173-8.
240: Zinkernagel RM, Haenseler E, Leist T, Cerny A, Hengartner H, Althage A (1986) T
cell-mediated hepatitis in mice infected with lymphocytic choriomeningitis virus. Liver
cell destruction by H-2 class I-restricted virus-specific cytotoxic T cells as a physiological
correlate of the 51Cr-release assay? J Exp Med 164:1075-92.
241: Zheng H, Fu TB, Lazinski D, Taylor J (1992) Editing on the genomic RNA of human
hepatitis delta virus. J Virol 66:4693-7.