Isoenzyme der Malat-Dehydrogenase in - ETH E

Diss. Nr. 5129
Isoenzyme der Malat-Dehydrogenase
in
Schizosaccharomyces pombe
Regulatorische
und
physikalisch-chemische Eigenschaften
ABHANDLUNG
zur
Erlangung
des Titels eines Doktors der Naturwissenschaften
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
vorgelegt
von
URS FLURY
dipl. Biol.
geboren
von
Universität Bern
am
8. Februar 1946
Luterbach
(Kt. Solothurn)
Angenommen auf Antrag
von
Prof. Dr. A. Fiechter, Referent
Prof. Dr. H. Zuber, Korreferent
Juris Druck
+
Verlag Zürich
1973
-70-
E.
Das Wachstum
von
Schizosaccharomyces pombe
medium unter aeroben
zeichnet.
Wert
Sacch.
Bedingungen
Glucose wird unter
metabolisiert.
nen
ZUSAMMENFASSUNG
von
(RQ
10).
=
durch einen
Energiegewinnung
Nach
Erschöpfung
ist in
synthetischem
Glucose-
einphasigen Verlauf gekenn¬
zu
Aethanol, Biomasse
der Glucose sinkt der
RQ auf ei¬
0, 7 ab. In dieser respirativen Phase konnte im Gegensatz
cerevisiae kein Wachstum auf Aethanol
scheinlich besitzt diese Spalthefe keinen
festgestellt
werden.
und CO
zu
Sehr wahr¬
funktionsfähigen Glyoxylsäurezyklus.
Die
spezifische Aktivität der Malat-Dehydrogenase (MDH) erhöht sich in die¬
ser
respirativen Phase
heit des
zu
um
das
löfache. Diese
ca.
Proteinsynthesehemmers Cycloheximid
Erhöhung
nicht auf.
tritt in Anwesen¬
Nach
Glucosezugabe
respirativen Zellen erfolgt eine rasche Inaktivierung der MDH.
Das
Enzym
wurde
fermentativen wie auch
aus
aus
respirativen Zellen durch
Ammoniumsulfatfällung, Aethanolfraktionierung, Calcium-Phosphat-Gel Adsorp¬
tion und
Elution,
DEAE-Cellulose-Chromatographie
filtration je 600fach
dem Rohextrakt
aus
Präparate erwiesen sich
wicht) konnten je 3,
noch in
Die
Bestimmung
te der beiden
des
Isoenzyme
Enzyme
Enzyme
mung durch
sind somit aus
Beide
In beiden
physio¬
an
Die beiden
mit der
Das
Gelfiltrationsmethode ergab
Molekulargewicht
SDS-Gel-Elektrophorese
K
zu
Polypeptidket¬
32'000 bestimmt.
Die
katalytischen Eigenschaften
sind sehr ähnlich.
Die MDH
aus
respirativen Zellen be¬
Reaktionsgeschwindigkei¬
unterscheiden sich weiterhin in ihren
schaften. Während für die MDH
beider MDH
-Werte, Aktivierungsenergie, Substrathem¬
höhere Werte für die maximalen
Enzyme
der
zwei, bezüglich ihres Molekulargewichtes iden¬
aufgebaut.
Oxalacetat)
jedoch deutlich
60'000.
von
wurde mit der
(pH-, Temperatur-Optimum,
ten.
%).
kg Zellen (Nassge¬
der MDH konnten weder in fermentativen
Molekulargewichtes
tischen Untereinheiten
sitzt
Aus 1
respirativen Zellen nachgewiesen werden.
für beide MDH einen Wert
Beide
gereinigt (Ausbeute
elektrophoretisch rein.
G-100 Gel¬
20-27
sind somit dieselben intrazellulären Konzentrationen
Protein vorhanden.
-
Sephadex
0 mg reines MDH-Protein isoliert werden.
logischen Zuständen
MDH
als
und
aus
Ladungseigen»
respirativen Zellen ein Isoelektrischer
-71-
Punkt
von
5, 5 bestimmt wurde, besitzt das Enzym
len einen IEP
von
aus
fermentativen Zel¬
6, 4. Die Aminosäurezusammensetzungen der beiden En
voneinander.
zyme unterscheiden sich in 7 Aminosäureresten
geschlossen werden,
Schizosacch. pombe besitzt somit zwei
(Heterogenzyme).
der MDH
Die in fermentativen Zellen vorhandene Form wird
Glucose
nen
synthetisiert
oder eines ihrer
zugabe) inaktiviert,
Das andere
in
Gegenwart
von
Isoenzym wird hingegen durch Glu¬
Abbauprodukte reprimiert
wahrscheinlich durch eine
mische Modifikation.
nur
und nach Wachstumsstillstand wahrscheinlich durch ei¬
abgebaut.
Proteinturnover
cose
Daraus kann
dass die Primärstrukturen der beiden MDH durch zwei
verschiedene Gene kodiert werden.
Isoenzyme
-
und zusätzlich
(nach
Glucose-
enzymatisch-katalysierte
che¬
-72-
F.
The
SUMMARY
growth of Schizosaccharomyces pombe in synt hetic glucose limited
medium under aerobic conditions is characterized
Glucose
metabolized to biomass,
was
by
After exhaustion of this -hexose the RQ decreased to
on
ethanol
as
in
Saccharomyces cerevisiae,
phase. Enzymatic analyses had
cycle
The
Single growth phase.
a
ethanol and carbon dioxide
occurs
a
(RQ
value of 0, 7. No
during
shown that in this fission
this
10).
'=
growth
respiratory
yeast the glyoxylate
is absent.
specific activity of malate dehydrogenase (MDH) increases by
15 after the
consumption
of-cycloheximide,
thesis in yeast.
an
of
glucose.
This increase is blocked
by
respiring
cells
was
factor of
the presence
antibiotic agent which stops the cytoplasmic
Addition of glucose to
a
proteinsyn-
followed by
a
rapid
inactivation of MDH in vivo.
The enzyme
by
was
purified from fermenting
ammonium sulfate precipitation,
gel adsorption and elution,
(yield
cally homogeneous.
In both cases,
kg
of cell material
lar concentrations of MDH
ethanol
respiring
2 0-27
%). Both preparations
3 mg of pure
present in both
physiological
with
a
zymes
wejghtof 60'000 daltons
After sodium
molecular
are
K
sulfate
mesured
same
states.
fermenting
by gel
electrophoresis
The kinetic
was
as
isolated
intracellu-
Only
well
as
one
in
a
filtration for both
Single
en¬
band of protein
found, indicating that both
en¬
properties (pH- and temperature-
-values, activation energies, Substrate Inhibition by
very similar for both enzymes.
respiring cells exhibits
corresponding
was
of 32'000 daltons
contain two subunits.
oxaloacetate)
the
dodecyl
weight
optimums, apparent
from
were
cells.
A molecular
zymes.
Sephadex
electrophoreti-
were
(wet weight). Therefore, about the
are
and
MDH-protein
molecular form of the enzyme could be detected in
respiring
cells 600fold each,
fractionation, calcium-phosphate-
DEAE-cellulose-chromatography
G-100 gelfütration.
from 1
and
much
enzyme from
On the other hand the
enzyme
higher maximal
fermenting
cells.
reaction velocities than
-73-
Furthermore the two MDH1
enzyme from
from
respiring cells
an
IP of 5. 5
to the conclusion that the
different genes.
primary
pombe.
found,
protein
7 amino
isoenzymes
This
turnover.
in
The
is
repressed by glucose (or metabolites thereof)
inactivated after addition of this hexose,
chemical modification.
are
form is
probably by
are
cells is
by
exis-
synthe-
probably degraded
of the
other
and is furthermore
an
leads
coded
dehydrogenase
synthesis
respiring
a
signtficiant
finding
This
fermenting
isoenzymic
in
cells
acids).
of malate
existing
the
6.4, whereas for the MDH
Both enzymes show
structure of the two enzymes
The MDH
only in presence of glucose.
by
was
IP of
an
points:
in their isoelectric
markedly
composition (in
Therefore two
in Schizosacch.
sized
differ
fermenting cells possesses
differences in amino acid
ting
s
enzyme
isoenzyme
rapidly
catalysed