A close molecular look at SopE-dependent - ETH E
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Diss. ETH No 21121 A close molecular look at SopE-dependent Salmonella Typhimurium invasion into epithelial host cells. A dissertation submitted to ETH ZURICH for the degree of Doctor of Sciences presented by PASCALE VONAESCH MSc in Biology, Université Paris VII Denis Diderot, Paris, France Born 28th of May 1985, citizen of Strengelbach (AG) accepted on the recommendation of Prof. Dr. W.-D. Hardt (examiner) Prof. Dr. Markus Aebi (co-examiner) Prof. Dr. Klemens Rottner (co-examiner) 2013 Zusammenfassung Das Bakterium Salmonella enterica, subspecies enterica, serovar Typhimurium (S. Tm) verursacht weltweit jährlich Millionen von Erkrankungen und führt bei tausenden zum Tod. S. Tm wird über fäkal kontaminiertes Wasser oder Lebensmittel aufgenommen und kann im Darm die normalerweise nicht phagozytierenden Epithelzellen infizieren. Um dies zu erwirken, exprimiert das Bakterium ein Typ III Sekretionssystem (TTSS) und dazugehörige Effektorproteine. Mehrere von diesen Effektorproteinen beeinflussen entweder direkt oder indirekt das Aktin Cytoskelett und verleiten die Zelle dazu, ausgeprägte filamentöse Aktinstrukturen zu bilden, die zur Aufnahme der Bakterien in die Zelle führen. In der Zelle sind die Salmonellen in einer spezifischen Vakuole, der Salmonella enthaltende Vakuole (SCV), eingeschlossen und exprimieren ein zweites TTSS und dazugehörige Effektorproteine. Mit Hilfe der Effektorproteine, die durch diese Sekretionssysteme injiziert werden, reift die Vakuole und wird in eine juxtanukleäre Position transportiert. Dort beginnen sich die Bakterien in der Vakuole zu vermehren. In der vorliegenden Doktorarbeit habe ich die molekularen Mechanismen die dem Infektionsprozess der durch das Effektorprotein SopE verursacht wird, zu Grunde liegen, genauer analysiert. In einem ersten Teil wurde die Rolle der Wirtszellproteine im Invasionsmechanismus mit Hilfe einer Methode studiert, die jedes Gen im Genom einzeln evaluiert (Screen). Insbesondere konzentriert sich die vorliegende Arbeit auf das Studium eines der Gene, copG, welches für eine Untereinheit des COPI Proteinkomplexes kodiert und beschreibt eine neue Funktion des COPI Komplexes im vesikulären Transport von Cholesterin und Spingolipiden zur Plasmamembran. Zudem wird gezeigt, dass der Verlust von Cholesterin und Spingolipiden in der Plasmamembrane dazu führt, dass die beiden Rho GTPasen Rac1 und Cdc42 in der Zelle fehllokalisiert sind. Diese Fehllokalisation verursacht eine Verminderung der induzierten filamentösen Aktinstrukturen und verkleinert somit die Chance der Salmonellen, in die Wirtszellen einzudringen. Zellen, welche in Kultur gehalten werden, haben sehr unterschiedliche Formen und Zellstoffwechseleigenschaften. Da die Interaktionen der verschiedenen Proteine untereinander zusätzlich sehr komplex sind, ist es technisch äusserst schwierig und zeitaufwändig, die genaue Lokalisierung verschiedener Proteine in der Zelle und die Änderung dieser Lokalisierung während der Salmonelleninfektion zu bestimmen. Zudem ist es schwierig, diese Änderungen statistisch zu belegen. Um dieses Problem zu lösen, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit ein spezifisches, standardisiertes Infektionssystem entwickelt, welches es erlaubt Änderungen quantitativ zu studieren. Dieses System kann beliebig angepasst werden, um die Interaktion vieler verschiedener Pathogene mit ihren Wirtszellen zu studieren. Für das hier beschriebene Infektionssytem wurden Zellen verwendet, die auf 3 Deckgläschen wachsen, die mit einer apolaren Substanz überzogen sind und Mikrometer grosse, Fibronectin-beschichtete Strukturen aufweisen. Da die Zellen nur an die Fibronectinbeschichteten Mikrostrukturen binden können, nehmen sie alle die gleiche Form an und zeigen eine vergleichbare interne Organisation. Die Bilder von hunderten von Zellen können übereinander gelegt und die Lokalisierung spezifischer Proteine/ Kompartimente kann zwischen verschiedenen Gruppen statistisch verglichen werden. In der vorliegenden Arbeit präsentiere ich zum ersten Mal ein Infektionssystem, welches diese mikrostrukturierten Zellen zum Studium von Pathogen-Wirtszell-Interaktionen verwendet. Mit Hilfe des neu entwickelten Systems konnten kleinste Verschiebungen im Aktin Cytoskelett nachgeweisen und gezeigt werden, dass Salmonellen den löslichen G-Aktin Anteil der Zelle dazu benutzen, um neue filamentöse Aktinstrukturen zu bilden. Die schon vor der Infektion bestehenden filamentösen Aktinstrukturen bleiben während des ganzen Infektionsprozesses bestehen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Bindungsstellenpräferenz der Salmonellen auf rein physikalischen Gesetzten beruht und dass Salmonellen überall, wo sie binden, auch eine geeignete Invasionsstelle induzieren können. Diese zwei bemerkenswerten Eigenschaften von Salomonella Typhimurium könnten eine weitere Erklärung dafür sein, weshalb dieses Bakterium ein solch breites Wirtsspektrum aufweist. Im dritten Teil dieser Doktorarbeit wird die Dynamik, die intrazelluläre Lokalisierung und die Funktion des Effektorproteins SopE nach Injektion in die Wirtszelle analysiert. Verschiedene Forschungsgruppen beobachteten in der Vergangenheit unterschiedliche Dynamiken für SopE während des Infektionsprozesses: während eine Gruppe zeigte, dass SopE früh in der Infektion in der Zelle abgebaut wird, hat eine andere Gruppe SopE auf isolierten SCVs nachgewiesen, wo es die Fusion von Lysosomen mit der SCV verhindern soll. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass der grösste Teil des vorhandenen SopE und SopE2, einem Effektorprotein welches Homologie zu SopE aufweist, kurz nach der Infektion abgebaut wird, dass aber eine Subfraktion transient an die SCV lokalisiert und eine Rolle in der Bakterienvermehrung spielt. Zusammenfassend gibt die vorgelegte Doktorarbeit neue Einblicke in die molekularen Mechanismen der SopE-abhängigen Salmonelleninvasion und präsentiert ein neues Infektionssystem, um quantitative Beobachtungen über Pathogen-Wirtszell-Interaktionen zu erhalten. 4 Summary Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium (S. Tm) annually causes billions of infections and thousands of deaths worldwide. Once ingested with contaminated food or water, this bacterium mediates its entry into normally non-phagocytic epithelial cells of the intestine. To this purpose, it expresses a Type III secretion system (TTSS) and cognate effector proteins. Several of these effector proteins act, either directly or indirectly, on the host cell cytoskeleton inducing the formation of pronounced actin ruffles that promote the uptake of the bacteria. Once inside the cell, S. Tm is enclosed in a so called Salmonella containing vacuole (SCV). Inside this SCV, the bacterium expresses a second TTSS and cognate effector proteins. With the help of the effector proteins secreted through these two TTSSs, the vacuole undergoes maturation and travels towards a juxtanuclear position where the bacteria start to replicate. In this thesis I have investigated the molecular mechanisms underlying host cell invasion triggered by on one of the effector proteins secreted through the TTSS-1, SopE. In a first part, the role of host cell proteins in the SopE-dependent invasion process was studied by performing a genome-scale RNAi screen. The follow-up studies were focused on one of the candidate proteins, CopG, a subunit of the COPI complex. These studies delineated a new function of the COPI complex in trafficking of cholesterol and sphingolipids to the plasma membrane. Further, the lack of cholesterol and spingolipids in the plasma membrane leads to a mislocalization of the RhoGTPases Rac1 and Cdc42. As they are required for S. Tm invasion the mislocalization can explain why the COPI depletion inhibits ruffling. Due to the complexity of the interactions found in cells and due to the variability in morphology and physiology between individual cells, studying the role of host cell factors in the infection process is challenging. Further, it is far from trivial to perform a valid statistical analysis of these changes. In the second part of this thesis, a standardized and quantitative infection system for S. Tm which was developed which can be adapted to many other pathogens. To this purpose, cells which are grown on microfabricated coverslips, harboring micro-scale, fibronectin-coated patterns on an otherwise apolar substrate were used. As the cells can only bind to these patterns, they all adopt the same shape and internal organization. Therefore, micropatterned cells allow averaging the localization of proteins over hundreds of cells and comparing them in a statistically meaningful way. In this thesis, I present the first study that uses micropatterned cells as a tool in host-pathogen interactions. Taking advantage of the newly established model system, even subtle actin rearrangements could be detected and it could be shown that S. Tm uses the soluble G-actin pool to induce ruffles while the content of contractile F-actin bundles and other pre-existing F-actin structures remain constant throughout the infection. Further, it was discovered that S. Tm’s target finding on individual host cells depends on purely physical forces (near-surface swimming) and that S. 5 Tm can induce a permissive entry site wherever it binds to the cell. These two remarkable properties might provide an additional explanation for the broad host range of this pathogen. In the third part of this thesis, the dynamics, the localization and the role of the effector protein SopE at later time points of infection were analyzed. To date, the fate of SopE subsequent to entry is a matter of debate. It was described that SopE is degraded quickly upon infection; however, it was also observed that SopE might be localized to the SCV where it has a role in inhibiting SCV-lysosome fusion. In this thesis, I show that the bulk of SopE and its close homolog SopE2 is degraded quickly after degradation. However, a sub-fraction remains detectable on the SCV. This subpool localizes transiently to the SCV where it fosters replication. In conclusion, this work provides new insights into the molecular mechanisms of SopEdependent S. Tm infection and presents a new tool to quantitatively study host-pathogen interactions. 6
