MMP-1 Expression in Melanomen von Schimmeln

1
Aus dem Department für
der Veterinärmedizinischen Universität Wien
(Departmentsprecher: Univ.-Prof. Dr.med.vet. Florien Jenner Dipl.ACVS Dipl.ECVS)
Fach: Pferdechirurgie
„MMP-1 Expression in Melanomen von Schimmeln“
Diplomarbeit
zur Erlangung des akademischen Grades
Magistra medicinae veterinariae
der Veterinärmedizinischen Universität Wien
vorgelegt von
Julia Andrea Eichberger
Wien, im September 2013
2
Betreuerin
Dipl.-Ing. Dr. Sabine Brandt
Klinik für Pferde, Pferdechirurgie, Forschungsgruppe Onkologie
1. Gutachterin
Dipl.-Ing. Dr. Sabine Brandt
Klinik für Pferde, Pferdechirurgie, Forschungsgruppe Onkologie
2. Gutachterin
Ao.Univ.-Prof. Dr.med.vet. Miriam Kleiter Dipl.ACVR-RO
Dipl.ECVIM-CA (Oncol)
Klinik für Interne Medizin Kleintiere, Onkologie
3
DANKSAGUNG
Ohne die professionelle Unterstützung folgender Personen wäre das Erstellen dieser
Diplomarbeit nicht möglich gewesen:
Zu Beginn möchte ich mich bei meiner Betreuerin Dipl.-Ing. Dr. Sabine Brandt, die mir im
Rahmen meiner Arbeit immer beratend zur Seite stand, und Ihrem Team für die herzliche
Aufnahme in die Forschungsgruppe Onkologie bedanken.
Des Weiteren möchte ich mich bei Mag. rer. nat. Dr. rer. nat. Barbara Pratscher bedanken, die
mir das wissenschaftliche Arbeiten näher brachte und einen Einblick in die Forschung
ermöglichte. Sie stand mir immer mit Rat und Tat zur Seite, motivierte mich bei so mancher
Durststrecke und bewies Ihre schier endlose Geduld bei der Korrektur meiner Arbeit.
Außerdem ein großes Dankeschön an alle weiteren Laborkollegen und Laborkolleginnen für
deren Hilfe, das angenehme Arbeitsklima und die schönen Stunden.
Auf privater Seite möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, für Ihre unentwegte
Unterstützung
und
Liebe,
die
sie
mir
stets
entgegen
gebracht
haben.
4
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ......................................................................................................................... 6
1
2
EINLEITUNG & FRAGESTELLUNG ..................................................................................................... 8
1.1
DAS MELANOM ..................................................................................................................................... 8
1.2
MATRIX – METALLOPROTEINASEN EXPRESSION IM TUMOR ................................................................. 8
1.3
FRAGESTELLUNG .................................................................................................................................. 9
LITERATURÜBERSICHT ...................................................................................................................... 10
2.1
MELANOZYTÄRE TUMOREN ................................................................................................................ 10
2.2
DAS EQUINE MELANOM ...................................................................................................................... 11
2.2.1
Epidemiologie ................................................................................................................................. 11
2.2.2
Dispositionen .................................................................................................................................. 11
2.2.3
Pathologische Einteilung ................................................................................................................ 13
2.2.4
Dignität ........................................................................................................................................... 15
2.2.5
Klinik............................................................................................................................................... 16
2.2.6
Metastasierung................................................................................................................................ 17
2.2.7
Äthiologie und Pathogenese............................................................................................................ 17
2.2.8
Diagnostik....................................................................................................................................... 18
2.2.9
Therapie .......................................................................................................................................... 19
2.2.10 Prognose ......................................................................................................................................... 23
2.3
2.3.1
Einteilung........................................................................................................................................ 24
2.3.2
Struktureller Aufbau........................................................................................................................ 25
2.3.3
Regulation....................................................................................................................................... 26
2.3.4
Funktionen ...................................................................................................................................... 28
2.3.5
MMPs im Melanom......................................................................................................................... 28
2.4
3
MATRIX – METALLOPROTEINASEN ..................................................................................................... 24
MATRIX – METALLOPROTEINASE – 1 .................................................................................................. 30
2.4.1
Funktion .......................................................................................................................................... 30
2.4.2
Hochregulierung im Tumor ............................................................................................................ 30
MATERIAL & METHODEN................................................................................................................... 33
3.1
ETHISCHE GENEHMIGUNG ................................................................................................................... 33
3.2
MATERIAL........................................................................................................................................... 34
3.3
PATIENTEN .......................................................................................................................................... 35
3.4
METHODE ........................................................................................................................................... 44
3.4.1
RNA–Isolierung .............................................................................................................................. 44
5
4
3.4.2
DNase-Verdau ................................................................................................................................ 44
3.4.3
Clean up.......................................................................................................................................... 45
3.4.4
RNA – Konzentrationsbestimmung und Überprüfung der Reinheit ................................................ 46
3.4.5
Reverse Transkription / cDNA Synthese ......................................................................................... 47
3.4.6
9DOLGLHUXQJGHUF'1$PLWWHOVȕ-Aktin PCR.................................................................................... 48
3.4.7
Primer Effizienz .............................................................................................................................. 50
3.4.8
qPCR............................................................................................................................................... 52
ERGEBNISSE............................................................................................................................................ 54
4.1
KONZENTRATION & QUALITÄT DER RNA........................................................................................... 54
4.2
Ǻ-AKTIN PCR...................................................................................................................................... 55
4.3
PRIMER EFFIZIENZ .............................................................................................................................. 56
4.4
QPCR .................................................................................................................................................. 60
4.4.1
Messergebnisse der Melanom-, Zellkultur- und Hautproben ......................................................... 60
4.4.2
Auswertung im Arithmetischen Mittelwertvergleich ....................................................................... 62
4.4.3
Relative Quantifizierung mittels kompaUDWLYHUǻǻ&T Methode....................................................... 63
4.5
ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE ............................................................................................... 64
5
DISKUSSION............................................................................................................................................. 65
6
ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................................................... 68
7
EXTENDED SUMMARY ......................................................................................................................... 69
8
LITERATURVERZEICHNIS.................................................................................................................. 70
9
ABBILDUNGS-, FORMEL- UND TABELLENVERZEICHNIS ......................................................... 76
9.1
ABBILDUNGSVERZEICHNIS .................................................................................................................. 76
9.2
FORMELVERZEICHNIS.......................................................................................................................... 77
9.3
TABELLENVERZEICHNIS ...................................................................................................................... 78
6
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
A.D.
Aqua bidestillata
ASIP
Agouti signalisierendes Protein
bp
Basenpaare
cDNA
komplementäre Desoxyribonukleinsäure
CT
cycle threshold
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxyribonukleosidtriphosphate
DOPA
Dihydroxyphenylalanin
DTT
Dithiothreitol
ECM
Extrazelluläre Matrix
EGF
Epidermaler Wachstumsfaktor
EtOH
Ethanol
FAM
6-Carboxy-Fluorescein
NTC
non template control
MGB
minor groove binder
MgCl2
Magnesiumchlorid
min.
Minute(n)
ml
Milliliter
mM
Millimol
MMP
Matrix – Metalloproteinasen
MMP-1
Matrix – Metalloproteinase – 1
mRNA
messenger ribonucleic acid
MT–MMP
Membran – ständige Matrix - Metalloproteinase
NFQ
nicht fluoreszierender Quencher
PCR
Polymerasekettenreaktion
PGDF
Platelet-derived growth factor
qPCR
quantitative Real-Time-PCR
7
RECK
reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs
RPS–13
Ribosomal Protein S-13
sec.
Sekunde(n)
TAE
Tris-Acetat-EDTA
UMM
Universal Master Mix
VEGF
vascular endothelial growth factor
VIC
Fluoreszenzfarbstoff
°C
Grad Celsius
μg
Mikrogramm
μl
Mikroliter
8
1 EINLEITUNG & FRAGESTELLUNG
1.1 Das Melanom
Melanome sind von Melanozyten ausgehende Tumoren (SELTENHAMMER, 2000;
PSCHYREMBEL, 2012) und gehören in die Gruppe der Rundzelltumoren (MISCHKE, 2005).
In der Humanmedizin werden Melanome, auch bekannt als „schwarzer Hautkrebs“, immer
unter den malignen Neoplasien aufgelistet (SELTENHAMMER, 2000) und sind nicht nur in
Österreich,
wie
die
Statistik
Austria
in
ihrer
Publikation
„Krebsinzidenz
und
Mortalitätsinziden“ bekanntgab, unter den am häufigsten diagnostizierten Hauttumoren
verbucht (STATISITIK AUSTRIA, 2012), sondern auch die WHO verzeichnete eine weltweit
steigende Inzidenz mit annähernd gleichbleibend hoher Letalität, welche in etwa 0,1% der
globalen Mortalität entspricht (GIRICZ et al., 2010).
Aber auch in der Veterinärmedizin sind Melanome weltweit bei den verschiedenen Tierarten
zu finden. Nicht nur bei Säugetieren, wie z.B. dem Hund, der Katze, dem Schwein (MEUTEN,
2002) und dem Pferd, wurden Melanome unterschiedlicher Dignität beschrieben (SCOTT u.
MILLER, 2003), auch bei anderen Wirbeltieren treten diese in Erscheinung, beispielsweise
dem Zahnkarpfen Xiphophorus, der als ältestes Tiermodell für die Melanomentstehung
beschrieben wird (HENGGE u. DUMMER, 2006).
Der hohe Malignitätsgrad, die annähernd konstante Mortalitätsrate und die limitierten
Therapiemöglichkeiten im fortgeschrittenen Stadium sind Einschränkungen, welche die
Melanomforschung im human- als auch im veterinärmedizinischen Bereich vorantreiben. Es
gibt zahlreiche wissenschaftliche Veröffentlichungen, die sich mit Melanomen und deren
Therapien befassen, jedoch wenig Information zu prognostischen Biomarkern.
1.2 Matrix – Metalloproteinasen Expression im Tumor
Die Karzinogenese und Metastasierung des Melanoms ist äußerst komplex und ein
mehrstufiger Prozess (HOFMANN et al., 2005). Der Abbau der Basalmembran und der
extrazellulären Matrix (ECM) durch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) spielen neben
verschiedenen anderen proteolytischen Enzymen bei der Migration, Invasion und
Metastasierung von kutanen Melanomen eine essenzielle Rolle (HOFMANN et al., 2000).
9
Eine Vielzahl von MMPs und ihrer Gewebsinhibitoren (TIMPs) werden von Melanomzellen
exprimiert, welche die Invasion und das Wachstum des Tumors fördern (HOFMANN et al.,
2000; BOURBOULIA u. STETLER-STEVENSON, 2010).
1.3 Fragestellung
Grundlage für die vorliegende Diplomarbeit waren erste, noch nicht veröffentlichte
Ergebnisse einer RNA-Sequenzierungsanalyse von Schimmelmelanome und makroskopisch
unveränderter Haut. Durchgeführt wurde diese Studie von der Forschungsgruppe Onkologie
der Pferdeklinik der Veterinärmedizinischen Universität Wien unter der Leitung von Dipl.-Ing.
Dr. Sabine Brandt im Jahr 2012. Diese ersten Ergebnisse zeigten eine geringgradige
Hochregulation der MMP-1 Expression im Melanom im Vergleich zu unveränderter Haut.
Sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin ist eine vermehrte Expression von
MMP-1 im Tumor bekannt (NIKKOLA et al., 2002; HOFMANN et al., 2005; PARADO u.
SELMAN, 2005; BOURBOULIA u. STETLER-STEVENSON, 2010; YUAN et al.2010,
FOLEY et al., 2012; LIU et al., 2012). Daraus ergab sich die Hypothese dieser
Forschungsarbeit, die wie folgt lautet:
„Die Transkription von MMP-1 ist im Schimmelmelanom hochreguliert.“
10
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Melanozytäre Tumoren
Die Nomenklatur melanozytärer Hautveränderungen ist durchwegs komplex und verwirrend,
da diese in verschiedenen Publikationen unterschiedlich interpretiert werden (SCOTT u.
MILLER, 2003).
Um Verwirrungen vorzubeugen seien zu Beginn dieser Arbeit einige Termini definiert:
Melanozytäre
Tumoren
melaninproduzierenden
umfassen
Zellen,
eine
Gruppe
sogenannten
von
Neoplasien,
Melanozyten,
welche
zusammengesetzt
aus
sind.
Melanozyten sind dendritische Zellen, die von neuroektodermalen Melanoblasten abstammen
und im Laufe der Embryogenese zur Epidermis, Dermis und anderen Zielorten, wie etwa in
die Haarfollikel, die Meningen, die Nebennieren und in die Intima des Herzens, wandern. Sie
sind zwischen den Basalzellen in der dermoepidermalen Junktionszone angeordnet
(SELTENHAMMER, 2000; MEUTEN, 2002; SMITH et al., 2002; ROWE u. SULLINS,
2004; PSCHYREMBEL, 2012). Das Pigment Melanin, ein komplex und hoch inhomogenes
Polymer bestehend aus monometrischen Einheiten von DOPA und / oder Cysteinyl - DOPA,
gelangt über dendritische Fortsätze der Melanosomen, dem Syntheseort des Melanins, zu den
Keratinozyten. Die Hauptaufgabe des Melanins ist der Schutz der epidermalen Zellen vor
Schäden durch UV-Bestrahlung (ECKHART et al., 2000; SELTENHAMMER, 2000;
MEUTEN, 2002; SMITH et al., 2002; ROWE u. SULLINS, 2004).
Melanozytäre Tumoren spielen bei Equiden, vor allem aber bei Schimmeln, eine besondere
Rolle (SCHONIGER u. SUMMERS, 2009).
11
2.2 Das Equine Melanom
Melanome werden schon seit vielen Jahrhunderten, bei Pferden aller Farben, beschrieben. Es
handelt sich dabei um eine Neoplasie neuroektodermaler Herkunft (ROWE u. SULLINS,
2004) an der Haut und selten an der Schleimhaut, der Uvea, den Konjunktiven und den
Hirnhäuten (PSCHYREMBEL, 2012).
2.2.1 Epidemiologie
Neben Sarkoiden und Plattenepithelkarzinomen zählen Melanome zu den 3 häufigsten
Tumoren bei Pferden (FOY et al., 2002). Ihre Inzidenz unterscheidet sich je nach Autor und
Publikation. Sie beträgt 3% (ROONEY u. ROBERTSON, 1996) bis 18,7% aller equinen
Neoplasmen (SELTENHAMMER et al., 2003; SCOTT u. MILLER, 2003) und circa 6%
(SELTENHAMMER, 2000) bis 15% aller equinen Hauttumoren (SELTENHAMMER, 2000;
SMITH et al., 2002). Diese durchwegs weite Spanne lässt darauf schließen, dass die
Dunkelziffer weit größer ist. Dies beruht unter anderem darauf, dass kleine Tumore von
Tierbesitzern nicht erkannt werden oder dem Melanom aufgrund seines protrahierten
Krankheitsverlaufs beim Schimmel als gutartig erscheinender Tumor geringe Beachtung
geschenkt wird (SELTENHAMMER, 2000). Dies wiederum spiegelt die nur seltene
histologische Untersuchung (MACGILLIVRAY et al., 2002; SCOTT u. MILLER, 2003) und
Dokumentation der kutanten Umfangsvermehrungen wieder (RONNEY u. ROBERTSON,
1996; SCOTT u. MILLER, 2003).
2.2.2 Dispositionen
2.2.2.1 Genetische Disposition
Melanome werden bei Pferden jeder Fellfarbe beschrieben. Zweifellos besteht hierbei eine
Korrelation zwischen Fellfarbe des Pferdes und Tumorhäufigkeit. Schimmel sind im
Vergleich zu Pferden mit anderer Fellfarbe deutlich überrepräsentiert. Schätzungsweise 80%
aller Schimmel, die 15 Jahre und älter sind, weisen klinisch ein Melanom auf (ROONEY u.
ROBERTSON, 1996; FOY et al., 2002; SELTENHAMMER et al., 2003; KNOTTENBELT,
2009; MOORE et al., 2012).
12
Es ist bekannt, dass das phänotyische Schimmelaussehen autosomal dominant vererbt wird.
PIELBERG et. al. zeigten 2008 in ihrer Arbeit, dass das Ergrauen mit dem Alter auf einer
4,6kb – Duplikation im Intron 6 des Syntaxin 17-Gens (STX17) basiert. Sowohl das
mutationtragende Gen als auch dessen Nachbargen NR4A3 sind bei Schimmelmelanomen
überrepräsentiert.
Außerdem
weisen
Schimmel,
welche
einen
mutationsbedingten
Funktionsverlust des Agouti signalisierenden Proteins (ASIP) tragen, eine höhere Inzidenz für
Melanome auf. Dieser Funktionsverlust von ASIP basiert auf einer vermehrten Signalwirkung
des Melanocortin-1 Rezeptors, welcher die Entwicklung von Melanomen fördert (PIELBERG
et al., 2008). Pferde, welche homozygote Mutationen tragen, depigmentieren schneller als
Schimmel mit heterozygotem Genotyp. Homozygote Individuen weisen darüber hinaus eine
höhere Inzidenz für Melanome und Vitiligo-ähnliche Depigmentierung auf (CURIK et al.,
2013). Darüber hinaus wird angenommen, dass jeder Schimmel, wenn er nur alt genug wird,
klinisch Melanome vorweisen kann (MOORE et al., 2012).
2.2.2.2 Pferdrassen bedingte Disposition
Zu den häufigsten betroffenen Rassen zählen Araber, Lipizzaner, Percheron (FOY et al. 2002;
SCOTT u. MILLER, 2003) sowie aus diesen Rassen gezüchtete oder gekreuzte Nachkommen
(SCOTT u. MILLER, 2003). Es wird vermutet, dass die erhöhte Inzidenz bei Schimmeln
möglicherweise auf genetischen Prädispositionen beruht (KNOTTENBELT, 2009), siehe
Kapitel 2.2.2.1. Mehrfach beschrieben ist, dass bis zu 80% aller Schimmel, die älter als 15
Jahre sind, Melanome entwickeln, worunter die Mehrheit benignes Verhalten aufweist
(ROONEY u. ROBERTSON, 1996; SCOTT u. MILLER, 2003; MACGILLIVRAY et al.,
2002; BURDEN, 2012; MOORE et al., 2012).
2.2.2.3 Geschlechtliche Disposition
Es
gibt
weder
eine
geschlechtliche
Disposition
noch
geschlechtsspezifische
Prädilektionsstellen (FOY et al. 2002; SCOTT u. MILLER, 2003; SELTENHAMMER et al.,
2003; KNOTTENBELT, 2009; MOORE et al., 2012), noch hat sich bis jetzt erwiesen, dass
die Kastration einen eindeutigen Effekt auf die Entwicklung und/oder die Progression des
equinen malignen Melanoms hätte (SELTENHAMMER, 2000; MOORE et al., 2012).
13
2.2.2.4 Altersbedingte Disposition
Nur sehr selten sind bereits kongenital Melanome vorhanden (SCOTT u. MILLER, 2003;
SELTENHAMMER et al. 2003). MOORE et al. berichteten 2012 über 3 kongenitale
Melanome wobei 2 von 3 Pferden durch chirurgische Exzision überlebten. Das 3. Pferd wurde
aufgrund des expansiven und infiltrativen Tumorwachstums und schon vorhandener
Metastasierung euthanasiert.
Klassischerweise kommt es zum Auftreten von Melanomen in einem Alter von über 2 Jahren
bis 15 Jahren (MOORE et al., 2012). FOLEY et al. (1991) beschäftigten sich mit dem
Auftreten und histologischen Erscheinungsbild von kongenitalen und erworbenen Melanomen
innerhalb der ersten 2 Lebensjahre. So wurden hier vier kongenitale Melanome, elf Melanome
innerhalb des 1. Lebensjahres und drei innerhalb des 2. Lebensjahres beschrieben. Diese
Melanome unterscheiden sich im Vergleich zum Melanom bei älteren Pferden nicht nur durch
das Alter des Auftretens selbst sondern auch durch ihre Lokalisation und epitheliale
Entwicklung. So waren diese Melanome junger Pferde solitär an den Beinen, dem
Körperstamm und am Unterlid lokalisiert, nicht eingekapselt und häufig ulzeriert (FOLEY et
al., 1991).
2.2.2.5 Häufige Lokalisationen
Charakteristische Lokalisationen für primäre Tumoren beim Schimmel sind vor allem die
Schweifrübenunterseite, die perineale und die anogenitale Region. Aber auch an Lippen,
Ohren, Augen und deren Umgebung, Luftsäcken, Euter sowie in der Parotisregion treten
Melanome häufig auf. An den Beinen sind Melanome weitaus seltener lokalisiert (ROONEY
u. ROBERTSON, 1996; SELTENHAMMER, 2000; FOY et al. 2002; MACGILLIVRAY et
al. 2002; SCOTT u. MILLER, 2003; KNOTTENBELT, 2009; BURDEN, 2012; MOORE et
al., 2012).
2.2.3 Pathologische Einteilung
Eine vielzitierte retrospektive Studie von VALENTINE (1995) unterteilt die melanozytären
Hautveränderungen beim Pferd nach ihren klinischen und pathologischen Verhaltensmustern
in die folgenden 4 Typen:
14
1. Melanozytäre Naevi
2. Anaplastisches malignes Melanom
3. Dermales Melanom
4. Dermale Melanomatose
2.2.3.1 Melanozytäre Naevi (Synonym: Melanozytoma)
Melanozytäre Naevi werden hauptsächlich bei jüngeren Schimmeln und nicht-pigmentierten
Pferden beobachtet und stellen sich meist als solitäre, nicht abgekapselte, stark pigmentierte
kutane, häufig ulzerierende Umfangsvermehrungen unterschiedlicher Größe dar, welche eher
selten an den typischen Lokalisationen zu finden sind. Weit häufiger sind sie an den Beinen,
im Nacken und am Rumpf lokalisiert. Histologisch sind diese in den oberen Schichten der
Dermis bis hin zur dermoepidermalen Grenze lokalisiert (ROWE u. SULLINS, 2004;
KNOTTENBELT, 2009; MOORE et al., 2012).
2.2.3.2 Anaplastisches malignes Melanom (Synonym: Melanosarkom)
Es handelt sich dabei um die aggressivste Form des Melanoms. Ihr histologisches
Erscheinungsbild ist durch eine Ansammlung von vielen pleomorphen Epithelzellen
gekennzeichnet, welche unterschiedlich stark pigmentiert sind und einen hohen Mitose-Index
aufweisen. Anaplastische maligne Melanome treten bei Pferden aller Rassen auf und sind
durch ein stark invasives, rasches und metastasierendes Wachstum gekennzeichnet, in ihrer
Häufigkeit des Auftretens aber durchwegs
selten (ROWE u. SULLINS, 2004;
KNOTTENBELT, 2009; MOORE et al., 2012).
2.2.3.3 Dermales Melanom & dermale Melanomatose
Das dermale Melanom und die dermale Melanomatose zählen zu den am häufigsten
vorkommenden Melanomtypen und sind histologisch nicht voneinander zu unterscheiden. Sie
präsentieren sich als undeutlich abgrenzbare, stark pigmentierte Tumorzellen in den tieferen
Schichten der Dermis. Sie unterscheiden sich durch ihr klinisches Erscheinungsbild. Während
das dermale Melanom solitär, multipel oder konfluierend an unterschiedlichen Stellen beim
alternden Schimmeln auftritt, findet man die dermale Melanomatose nur bei alten Schimmel
an der Schweifrübenunterseite, dem Perineum und den äußeren Genitalien und sie neigen zu
15
viszeraler Metastasierung (ROWE u. SULLINS, 2004; KNOTTENBELT, 2009; MORRE et
al., 2013).
Eine aktuellere Publikation von SCHÖNIGER u. SUMMERS (2009) beschreibt die
Ähnlichkeit von zwanzig Pferdemelanomen zum humanen Naevus und schlägt dabei eine der
Humanmedizin ähnlichen Einteilung in die folgenden Untergruppen vor:
1. Intradermale einfache melanozytäre Naevi
2. Zelluläre blaue Naevi
3. Kombinierte zelluläre blaue Naevus
Bei allen Melanomen handelte es sich um intradermale, verschiebliche, gut abgrenzbare, nicht
eingekapselte symmetrische Massen.
Ihre Unterteilung basiert im Unterschied, aber nicht im Widerspruch, zu VALENTINE (1995)
auf der zytomorphologischen Struktur von Melanomen, ihrer untypischen Lokalisation, der
Abwesenheit von erhöhter Tumorfrequenz bei grauen Pferden sowie der Ähnlichkeit zu den
Untergruppen des menschlichen Naevus (SCHONIGER u. SUMMERS, 2009).
2.2.4 Dignität
Das Melanom bei Menschen und Tieren ist, mit Ausnahme des Schimmels und
nichtpigmentierter Pferde, durch ein malignes Verhaltensmuster mit frühzeitiger Neigung zur
Metastasierung
auf
lymphogenem
und/oder
hämatogenem
Weg
gekennzeichnet
(SELTENHAMMER, 2000; FOY et al. 2002).
Über die klinische und pathologische Natur des Melanoms beim Schimmel wird schon seit
mehr als 200 Jahren diskutiert. Einerseits gibt es die Meinung, dass es sich bei Melanomen
entweder um eine nicht neoplastische, benigne pigmentierte Zelldysplasie oder eine
Pigmenteinlagerungskrankheit handelt. Demgegenüber werden Melanome als wahre
Neoplasie beschrieben (SCOTT u. MILLER, 2003; MOORE et al., 2012).
Heutzutage wird das Melanom beim Schimmel und nichtpigmentierten Pferd hinsichtlich
seiner Dignität als eine Neoplasie mit malignem Potential bis hin zu einer malignen Neoplasie
beschrieben (MOORE et al., 2012). Diese Melanome erfüllen aber eine Vielzahl benigner
16
Tumorkriterien, sind meist von einer Kapsel umgeben und kaum vaskularisiert und können
sich über viele Jahre in einer Art Ruhe-Stadium befinden (SELTENHAMMER et al., 2006).
KNOTTENBELT et al. beschreiben 2009, dass 95% der Melanome bei der Diagnosestellung
benign sind und davon circa 30% eine maligne Transformation durchmachen und auch
metastasieren. Im Gegensatz dazu behaupten SELTENHAMMER et al., (2003) und MOORE
et al., (2012), dass 66% eine maligne Transformation durchmachen. Darüber hinaus
beschreibt KNOTTENBELT et al., (2009) eine erhöhte Tendenz zur malignen Transformation
beim Nicht–Schimmel (FOY et al., 2002; KNOTTENBELT et al., 2009). Nichtsdestotrotz
handelt es sich beim equinen Melanom um einen multizentrischen Tumor mit der Neigung zu
infiltrativem Wachstum (MOORE et al., 2012). Unabhängig von der malignen
Transformationsrate beschreiben SELTENHAMMER et al., (2006) eine Metastasierungsrate
von 75-100% beim Schimmel.
2.2.5 Klinik
Melanome stellen sich meistens als unterschiedlich stark pigmentierte (schwarze, braune oder
graue), einzelne bis multiple, weiche bis harte, kuppeldachähnliche, kugelige oder flache,
lokal invasive oder nicht-invasive, gut abgegrenzte Knoten in der Haut oder Unterhaut dar,
welche sowohl gestielt als auch ungestielt auftreten und in ihrer Größe deutlich variieren
können. Häufig konfluieren kleinere Melanome zu einem Tumorkonglomerat, welches der
Haut ein kopfsteinpflasterartiges Aussehen verleiht, ohne das Allgemeinbefinden des Tieres
zu beeinträchtigen. Die darüberliegende Haut ist entweder intakt oder zeigt Alopezie, selten
kommt es zur Ulzeration und der Produktion von schwarzem, teerartigem Ausfluss
(ROONEY u. ROBERTSON, 1996; FOY et al., 2002; SCOTT u. MILLER, 2003;
SELTENHAMMER et al. 2003; KNOTTENBELT, 2009; BURDEN, 2012; MOORE et al.,
2012).
Die klinischen Symptome sind abhängig von der Lokalisation, der Größe und dem
Verhaltensmuster der Läsion (KNOTTENBELT, 2009)
Die Entstehung von Melanomen erfolgt ohne klinische Vorzeichen, jedoch beschreiben
SELTENHAMMER et al., 2003, dass vitiligoähnliche Depigmentierung als ein Vorzeichen
angesehen werden kann (SELTENHAMMER et al., 2003).
17
Folgende drei Erscheinungsformen werden beschrieben (MEUTEN, 2002; SCOTT u.
MILLER, 2003; SELTENHAMMER et al., 2003):
(1) Langsames Wachstum über Jahre hinweg ohne jegliche Metastasenbildung: dies stellt
eine häufige Form des Melanoms dar. Sie ist sind von eher geringerer klinischer
Bedeutung, es sei denn die Tumoren behindern physiologische Prozesse wie den
Harn- oder Kotabsatz bzw. die Fortpflanzung (FOY et al., 2002).
(2) Ausbildung eines anfangs gutartigen Tumors, der bösartig wird: nach einem
langsamen Wachstum über viele Jahre hinweg kommt es zu einer schnellen
Wachstumsphase, welche mit einer malignen Transformation assoziiert ist, die lokal
invasives Wachstum und fortschreitende Metastasierung bedingt (FOY et al., 2002)
(3) In diese Gruppe fallen 30% der Tumore: Sie sind von Beginn an hoch malige, d.h.
invasiv wachsend und metastasierend und vergleichbar mit dem humanen malignen
Melanom (ROONEY u. ROBERTSON, 1996; FOY et al., 2002).
2.2.6 Metastasierung
Melanome metastasieren auf hämatogenem oder lymphatischem Weg in die regionalen
Lymphknoten, die Lunge, die Leber, die Milz, an seröse Oberflächen, die Nieren, das Gehirn,
die Knochen, das Herz, den Skelettmuskel und in und/oder an Blutgefäßen (FOY et al. 2002;
MACGILLIVRAY et al. 2002; KNOTTENBELT, 2009). Die in Folge auftretenden
klinischen Symptome sind abhängig von den betroffenen Organen, dem Infiltrationsausmaß
(FOY et al. 2002; MACGILLIVRAY et al. 2002) und der Wachstumsrate der
Tumormetastasen (ROONEY u. ROBERTSON, 1996).
2.2.7 Äthiologie und Pathogenese
In
der
Humanmedizin
ist
bereits
bekannt,
dass
gewisse
Risikofaktoren
zur
Melanomentstehung beitragen. Zu diesen zählen zum Beispiel exzessive UV–Strahlung
(SCOTT u. MILLER, 2003; PIELBERG et al., 2008; CURIK et. al., 2013), eine große Anzahl
melanozytärer Nävi, helle Haut- und Haarfarbe sowie fortschreitendes Alter und eine
18
genetische Prädisposition (PIELBERG et al., 2008; CURIK et. al., 2013) sowie die
chronische Exposition mit Insektiziden (SCOTT u. MILLER, 2003). In der Veterinärmedizin
hingegen gibt es die verschiedensten Theorien zur Pathogenese des Melanoms bei Pferd, die
Äthiologie ist jedoch bis heute ungeklärt (ROONEY u. ROBERTSON, 1996; FOY et al.
2002; SCOTT u. MILLER, 2003).
Es wird überlegt, ob das Auftreten von Melanomen beim alternden Schimmel aufgrund einer
Störung des Melaninmetabolismus zustande kommt. Einerseits anlässlich der Formation von
neuen Melanoblasten, anderseits durch die Aktivitätsabnahme von Melanoblasten, mit dem
Resultat einer fokalen Zone an Pigmentüberschuss in der Haut (FOY et al., 2002; SCOTT u.
MILLER, 2003).
Die UV-Exposition, welche in der Humanmedizin schon seit langem einen bekannten Faktor
für die Melanomentstehung darstellt, ist beim den Schimmel wohl kein Risikofaktor (FOY et
al., 2002; SCOTT u. MILLER, 2003; KNOTTENBELT, 2009), hingegen werden bei diesem
Melanome gehäuft an mukokutanen Übergängen bzw. haarlosen und sehr dünnen Hautstellen
beschrieben (BENGTSTRÖM, 2011).
2.2.8 Diagnostik
In der Humanmedizin wird die Auflichtmikroskopie und die exzisionale Biopsie mit
anschließender pathohistologischer Untersuchung als Goldstandard für Diagnose, Prognose
und Therapie angesehen wird (FERRONE ,2012; SHARFMAN u. ABRAHAM, 2012).In der
Veterinärmedizin wird bereits das äußerliche Erscheinungsbild beim Schimmel, auch wenn es
durchwegs variieren kann, sowie die typische Lokalisation meist schon als Pathognomon
anzusehen. Darüber hinaus kann die histologische Untersuchung einer Biopsie zur
Bekräftigung der Diagnose und genaueren Klassifizierung hinzugezogen werden (FOY et al.,
2002; KNOTTENBELT, 2009).
Auf Grund seiner lymphogenen und hämatogenen Metastasierungsaffinität ist eine rektale
Untersuchung vor allem bei der Diagnose von Primärläsionen im anogenitalen Bereich
indiziert, da Metastasen für Kot- und Harnabsatzstörungen mitverantwortlich sein können
(SCOTT u. MILLER, 2003; KNOTTENBELT, 2009).
19
2.2.9 Therapie
In der Literatur werden viele verschiedene Möglichkeiten zur Behandlung von Melanomen
beim
Pferd
beschrieben
jedoch
gibt
es
bis
heute
keine
weltweit
akzeptierte
Behandlungsmöglichkeit. Die Schwierigkeit in der Therapie liegt darin, dass bis heute viele
Effekte der Initiation und Progression des malignen Melanoms sowohl in der Tiermedizin als
auch in der Humanmedizin noch unbekannt sind (MOORE, 2012).
Während in der Humanmedizin die chirurgische Entfernung im beginnenden Stadium die
höchsten Aussichten auf Heilung bietet (FERRONE ,2012; SHARFMAN u. ABRAHAM,
2012) beschreiben FOY et al., (2002) und ROWE u. SULLINS (2004) dass kleinere equine
melanozytäre Tumore, sofern sie keine klinischen Symptome verursachen, noch keiner
Behandlung bedürfen. Bei Vergrößerung des Melanoms und Auftreten von klinischen
Symptomen ist jedoch ein therapeutisches Einschreiten notwendig (ROWE u. SULLINS,
2004). KNOTTENBELT (2009) hingegen empfiehlt eine frühzeitige Therapie.
2.2.9.1 Die chirurgische Exzision
Die chirurgische Exzision kann im Falle von kleineren, solitären Melanomen kurativ sein
(SCOTT u. MILLER, 2003). Hierbei sollte darauf geachtet werden, einen möglichst großen
Abstand zum Tumor und damit die Entfernung im gesunden Gewebe zu gewährleisten (FOY
et al. 2002; BURDEN, 2012). Die chirurgische Exzision stellt sich jedoch für bereits
metastasierende Melanome, ungünstige Lokalisationen, zunehmende Größe, konfluierende
Melanome oder lokale Invasion als unpraktisch bis unmöglich dar (SCOTT u. MILLER,
2003). Ausdrücklich zu erwähnen ist, dass eine nur zytoreduktive Chirurgie ohne sauberen
Schnittrand das Fortschreiten der Krankheit nicht verhindert (MOORE et al., 2012). Dies
basiert auf der Begründung, dass eine komplette Tumorentfernung im gesunden Gewebe an
Stellen um den Anus oder der Schweifrübenunterseite beinahe unmöglich ist und auf Grund
des erhöhten Infektionsdruckes im Anogenitalbereich mit einer verzögerten Wundheilung zu
rechnen
ist.
Des
Weiteren
schreiben
einige
Autoren
(VALENTINE,
1995;
SELTENHAMMER, 2000; ROWE u. SULLINS, 2004; BURDEN, 2012), dass eine
chirurgische Stimulation der abnormen Melanoblasten das Tumorwachstum und die
Metastasierung vorantreibt.
20
2.2.9.2 Die Kryotherapie
Bei der Kryotherapie handelt es sich um ein medizinisches Verfahren, welches abhängig von
der Tumorgröße sowohl als Monotherapie als auch als Kombinationstherapie mit einer
chirurgischen Exzision eingesetzt werden kann. Letztere wird meist hinzugezogen, wenn die
Rezidivgefahr durch wiederholte Kälteeinwirkung reduziert werden soll (FOY et al. 2002;
SCOTT u. MILLER, 2003; BURDEN, 2012).
2.2.9.3 Der Histamin – 2 – Rezeptor – Antagonist
Die anti-tumor Wirkung der oralen systemischen Applikation von Cimetidin, einem
Histamin–2–Rezeptor–Antagonisten,
basiert
je
nach
Autor
auf
unterschiedlichen
Wirkmechanismen. So sollen eine selektive Inhibierung von T-Suppressor-Zellen, eine
verbesserte Aktivität von natürlichen Killerzellen und ein antiinflamatorische Effekt zu einer
Reduktion von Tumorgröße und -anzahl führen. Die Publikationen darüber weisen
unterschiedlich erfolgreiche Resultate auf (FOY et al., 2002; SCOTT u. MILLER, 2003;
KNOTTENBELT, 2009; BURDEN, 2012; MOORE et al., 2012). FOY et al., (2002)
empfehlen, dass die Therapie, wenn sie innerhalb von 3 Monaten keine Tumor-Regression
zeigt, als ineffektiv anzusehen ist und abgesetzt werden soll. KNOTTENBELT (2009)
hingegen schildert, dass bei ausbleibendem Therapie-Erfolg, das Medikament schon nach 3–4
Wochen abgesetzt werden soll.
2.2.9.4 Die intraläsional verabreichte Chemotherapie
Cisplatin (cis-diamminedichloroplatinum) ist eine der effektivsten Antitumor-Medikamente in
der Humanmedizin (LIPPERT, 1999). Auch in der Tiermedizin wurden beim Hund und bei
Equiden Therapierfolge mit diesem Zytostatikum nachgewiesen (SELTENHAMMER, 2000;
THÉON et al., 2007). Es eignet sich für die intratumorale und topische Anwendung da es
keine Gewebsnekrosen verursacht. Die Wirkung ist dosis- und zeitabhängig und seine
Zytotoxizität unabhängig von der Tumorwachstumsrate (THÉON et al. 2007). Des Weiteren
wird keine Resistenzentwicklung für Melanome beschrieben, was die Wiederholung des
Therapieprotokolls erlaubt (BURDEN, 2012).
21
Man unterscheidet bei dieser Therapie 2 unterschiedliche Ansätze (HEWES, 2007; THÉON et
al., 2007; BURDEN, 2012):
1. Die perkutane intraläsional verabreichte Injektion von Cisplatin ist sowohl alleine bei
kleineren Tumoren, als auch im Zusammenhang mit chirurgischer Entfernung
(perioperativ, intraoperativ als auch postoperativ) oder in Kombination mit
chirurgischer Entfernung und CO2–Laser bei größeren Tumoren als erfolgreich
anzusehen (FOY et al., 2002). Sie umfasst eine Serie von 4 intratumoralen
Applikationen einer Cisplatin-Öl-Emulsion, welche ihre Wirksubstanz langsam
freisetzt, im 2 Wochen Rhythmus (BURDEN, 2012).
2. Dem gegenüber steht die chirurgische Implantation von biologisch abbaubaren
Cisplatin haltigen Kügelchen, mit einem Durchmesser von 3mm, welche sich aus den
folgenden Komponenten zusammensetzen: Protein-Trägermatrix, Vasokonstriktor und
~ 1,6mg Cisplatin pro Kügelchen (HEWES, 2004). Es wird empfohlen präoperativ mit
einer Antibiose sowie einer anti-inflammatorischen Therapie zu starten (HEWES,
2004).
THÉON et al. (2007) berichtet von einer 81%igen Erfolgsrate bei der Behandlung von 16
subkutanen und dermalen melanzytischen Tumoren mit der perkutanen, intraläsionen
Applikation einer auf Sesamöl basierenden Cisplatinformulation in Kombination mit dem
Vasokonstrikor Epinephrin (THÉON et al., 2007; MOORE et al., 2012). Aber auch andere
Autoren (FOY et al., 2002) berichten von erfolgreich behandelten Melanomen mit dieser
intraläsionalen Behandlungsmethode.
Der Behandlungserfolg mit cisplatinhaltigen Kügelchen, sowohl als Monotherapie als auch in
Kombination mit chirurgischer Therapie oder CO2-Laser zeigten gute Erfolge nach 2 Jahren
(MOORE et al., 2012). HEWES (2004) berichtet, dass 93% seiner Patienten, welche alle
Schimmel waren und mit cisplatinhaltigen Kügelchen therapiert wurden, eine Rückbildung
der Tumorgröße aufwiesen (HEWES, 2004). Die therapeutische Implantation ermöglicht eine
Applikation von größeren Medikamentenkonzentrationen am Zielort, welche über eine
gewisse Zeitspanne ans Zielgewebe abgegeben wurden, womit eine geringere Gesamtmenge
22
des Chemotherapeutikums im Vergleich zur systemischen Verabreichung benötigt wird
(HEWES, 2007).
THÉON et al. (2007) und KNOTTENBELT (2009) beschreiben optimalere Ergebnisse bei
größeren Tumoren bei großflächiger Tumorentfernung mit anschließender Cisplatin Therapie
(THÉON et al., 2007).
2.2.9.5 Die Vakzinierung
Mittels
autochtoner
Melanomvakzinierung
wurden
im
Rahmen
einer
Vorstudie
erfolgversprechende Ergebnisse erzielt (FOY et al., 2002; KNOTTENBELT, 2009), so
beobachtete man bei elf von zwölf Pferden eine Tumorregression. Die hierfür verwendete
Vakzine enthielt vollständig autogene Tumorzellen sowie Adjuvanz, diese wurde subkutan
über die regionalen Lymphknoten appliziert (MOORE et al., 2012).
BERGMAN et al., (2003) berichten in ihrer Studie über die Vakzinierung mit humanen
Tyrosinase von malignem Melanom im fortgeschrittenen Stadium bei Hunden. Die
Ergebnisse der Studie machten deutlich, dass es sich um eine sichere und potentiell wirksame
Behandlung handelt, mit minimaler lokaler Toxizität und dem Ausbleiben der systemischen
Toxizität. Die Erfolge der Vakzinierung äußerten sich sowohl klinisch als auch mit einer
deutlich längeren Überlebenszeit der Tiere (BERGMAN et al., 2003). Erste Untersuchungen
zur Tyrosinaseexpression im Melanomen des Pferdes zeigen, dass diese Vakzine auch für das
Pferd von Interesse sein kann (PHILLIPS et al., 2012).
2.2.9.6 Toremifene
Toremifene, ein Triphenylethylen-Derivat, wird in der Humanmedizin bei Frauen mit
metastasierendem Brustkrebs eingesetzt (SHELLY et al., 2008). Basierend auf einer in vitroStudie, welche sich mit der Gewebskonzentration des Pharmakons bei einer melanozytären
Zelllinie beschäftigte, wurde ein Fallbericht von einem Pferd publiziert, welches nach
transdermaler topischer Behandlung eines nicht histologisch nachgewiesenen Melanoms eine
geringgradige Reduktion in der Tumorgröße zeigte (MOORE et al., 2012).
2.2.9.7 Immunotherapien
Der
Einsatz
unspezifischer
Immunmodulatoren
bei
Melanomen
wurde
in
der
Veterinärmedizin mit wechselnden Erfolgen verzeichnet. Zum Einsatz kamen unter anderem
23
mikrobiologische Wirkstoffe wie Coley´s toxin, Bacillus Calmette-Guérin (BCG) und
Corynebacterium parvum (FOY et al., 2002; KNOTTENBELT, 2009).
2.2.10 Prognose
Beim Pferd wird die Diagnose Melanom zumeist in einem fortgeschrittenen Stadium gestellt
in der eine chirurgische Exzision nur selten Heilung verschafft, da die Absiedelung von
Metastasen in die regionalen Lymphknoten meist schon stattgefunden hat. Aufgrund dessen
ist die Diagnose meist mit einer schlechten Prognose verknüpft (SMITH et al., 2002).
Obwohl die Mehrheit der equinen Melanome über lange Zeit ein gutartiges Verhalten
aufweist und fast jeder Schimmel mit zunehmendem Alter Melanome entwickelt, sollten diese
nicht unterschätzt und regelmäßig kontrolliert werden. Denn abhängig von ihrer Lokalisation,
der Größe und der möglichen Metastasierung sind klinische Symptome unterschiedlichen
Schweregrades zu erwarten, welche das Tier nicht selbst beeinträchtigen müssen, jedoch
einen Einsatz als Arbeits- und Sporttier verhindern können (SCOTT u. MILLER, 2003;
KNOTTENBELT, 2009).
24
2.3 Matrix – Metalloproteinasen
Matrix Metalloproteinasen (MMPs) gehören in die Familie der Zink-abhängigen
Endopeptidasen, welche eine wichtige Rolle in der Degradierung der einzelnen Komponenten
der extrazellulären Matrix (ECM) spielen (AYAD et al., 1998; PARDO u. SELMAN, 2005;
LIU et al., 2012). Neben der ECM sind MMPs auch in der Lage, Nicht-Matrix-Substrate zu
spalten (PARDO u. SELMAN, 2005).
2.3.1 Einteilung
Heute
existieren
zwei
verschiedene
Systeme,
um
die
Mitglieder
der
Matrix
Metalloproteinasen einzuteilen. Dem numerischen System, das fortlaufend die Enzyme nach
chronologischer Entdeckung nummeriert, steht die Einteilung nach der Spaltung des Substrat
(AYAD et al. 1998) und der zellulären Lokalisation (YUAN et al., 2010) gegenüber. Im
Laufe der Zeit erhielten einige MMPs zwei Nummern, da erst später erkannt wurde, dass es
sich um zwei identische MMPs handelt (AYAD et al. 1998). Zurzeit sind mindestens 24
MMPs bekannt (YUAN et al., 2010; FOLEY et al., 2012; LIU et al., 2012), welche nach
einem substratspaltenden und zelllokalisationsabhängigen System in die folgenden Gruppen
eingeteilt werden (BOURBOULIA u. STETLER-STEVENSON, 2010; YUAN et al., 2010):
x Collagenasen
x Gelatinasen
x Matrilysine
x Stromelysine
x Membran-ständige MMPs
25
2.3.2 Struktureller Aufbau
Der strukturelle Aufbau nahezu aller MMPs beinhaltet ein ähnliches Grundgerüst aus
(HOFMANN et al., 2005; PARDO u. SELMAN, 2005; BOURBOULIA u. STETLERSTEVENSON, 2010):
x einer Signal-Präpeptid-Domäne, welches das Protein durch das endoplasmatische
Retikulum leitet, bevor es sezerniert wird
x einer N-terminalen Propeptid–Domäne, welche die enzymatische Latenz und
Inaktivität durch Blockierung der katalytischen Domäne für aktivierende oder
hemmende Substanzen sicherstellt
x einer katalytischen Domäne mit Zn2+-Bindungsstelle, welche nach erfolgreicher
Abspaltung von Prä- und Propeptid ihre enzymatische Aktivität freisetzen
x einer Gelenkregion, welche die Verbindungsstelle zwischen der katalytischen Domäne
und der Hämopexin-Domäne darstellt, außer bei Matrilysinen
x einer COOH–terminalen Hämopexin–Domäne, an welche die N-terminale Region der
TIMPs bindt und die Aktivität der MMPs hemmt
Abbildung 1: Struktureller Aufbau von MMPs (modifiziert nach BOURBOULIA u.
STETLER-STEVENSON, 2010)
26
Gelatinasen besitzen zusätzlich noch eine Fibronektin–Typ2-Domäne innerhalb der
katalytischen Domäne. MT-MMPs weisen hingegen noch eine transmembrane Domäne am Cterminalen Ende sowie eine intrazelluläre Domäne auf.
MMP-7 und MMP-26 hingegen sind kleiner als die anderen MMPs, da sie weder eine
hämopexinähnliche Domäne, noch eine Gelenksregion besitzen (HOFMANN et al., 2000;
BOURBOULIA u. STETLER-STEVENSON, 2010).
2.3.3 Regulation
Die Regulation der MMPs ist mitunter sehr komplex und erfolgt auf folgenden Ebenen (OH et
al., 2001; HOFMANN et al., 2005; PARDO u. SELMAN, 2005):
1. Synthese als inaktive Proform
2. Genexpression (transkriptionelle Regulation, post-transkriptionelle Regulation &
translationelle Regulation)
3. Inhibierung der enzymatischen Aktivität
MMPs werden als lösliche inaktive Proenzyme, auch Zymogene genannt, sezerniert. Die
extrazelluläre Aktivierung erfolgt durch proteolytische Abspaltung der N–terminalen
Propetidsequenz (PARDO u. SELMAN, 2005; LIU et al., 2012). Dieser Vorgang wird in der
Literatur als „Cystin-Switch“ bezeichnet (PARDO u. SELMAN, 2005). Nach erfolgter
Abspaltung der N–terminalen Propetid–Domäne erfolgt eine autolytische Spaltung der
Domäne. Für die Aktivierung sind einerseits die Interaktion einzelner MMPs miteinander
und/oder externe Stimuli erforderlich (HOFMANN et al., 2000).
27
Faktoren, welche auf die Expression von MMPs Einfluss haben (HOFMANN et al., 2005):
–
Zytokine
o expressionsfördernd: Interleukine IL-1 und IL-6, Tumornekrosefaktor TNF-Į)
o expressionshemmend: IL-4, IL-10, INF-ȖXQG7*)-ȕ
–
Wachstumsfaktoren (EGF, PGDF, VEGF)
–
Hormone
–
Onkogene
–
Tumorpromotoren
–
Aktivierungsprotein-1 (AP-1)
Eine Vielzahl von Molekülen können MMPs in ihrer Aktivität hemmen. Dies erfolgt primär
durch die Aktivität von Gewebsinhibitoren der Matrix-Metalloproteinasen (TIMPs), welche
einerseits am proMMP oder andereseits an der aktiven MMP-Form binden. Dadurch kommt
es zu einer Inhibierung der autokatalytischen Aktivität des Zymogens bzw. zur Inhibierung
der proteolytischen Kapazität der aktiven Proteinase (HOFMANN et al., 2005). TIMPs
umfassen das gesamte MMP Spektrum und unterscheiden sich lediglich in ihrer
Hemmaffinität (BOURBOULIA u. STETLER-STEVENSON, 2010). TIMPs werden außer
zur Inhibierung auch zur Aktivierung einiger MMPs genutzt (HOFMANN et al., 2005).
Die Hemmung von MMPs erfolgt aber auch durch reversion-inducing cysteine-rich protein
with Kazal motifs (RECK). Das Glykoprotein RECK, welches ein Molekularesgewicht von
110 kDa aufweist, enthält Serin-Protease-Inhibitor-ähnliche Domänen und ist mittels Cterminalen Gylcosylphosphatidylinosin (GPI) an der Zellmembran verankert. Es ist an vielen
humanen Zellen zu finden, wohingegen es in Tumorzelllinien nur in geringen Mengen bis gar
nicht nachweisbar ist. Untersuchungen ergaben eine negative Regualtion von MMP-9, MMP2 und MT1-MMP. Die Ergebnisse bekräftigen die modulierende Wirkung von RECK auf
MMPs sowie dessen Funktion als Inhibitior für Tumorangiogenese, - invasion und –
metastasierung (OH et al., 2001).
28
2.3.4 Funktionen
Die Proteine der MMP–Familie sind unter anderem in den Abbau der ECM bei
physiologischen Prozessen, beispielsweise der embryologischen Entwicklung und der
Remodellierung von Geweben bei der Wundheilung, beteiligt. Des Weiteren sind sie bei
pathologischen Prozessen aufzufinden, wie zum Beispiel bei Arthritis, Tumorentstehung und
Metastasierung (PARDO u. SELMAN, 2005.).
Es gibt mittlerweile viele Berichte, welche die komplexe Natur der Tumorgenese und die
damit in Beziehung stehende direkte Rolle der MMPs bei der Zelladhäsion, Migration,
Tumorangiogenese sowie den Einfluss proteolytischer Prozesse von Zytokinen, Chemokinen,
Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren beschreiben (BOURBOULIA u. STETLERSTEVENSON, 2010).
BOURBOULIA u. STETLER-STEVENSON (2010) beschreiben im Anschluss an die
proteolytische Matrix sowie die Degradierung und Spaltung der Zelladhäsionen die Migration
und Invasion des Tumors ins umliegende Gewebe. Die anschließende Tumorangiogenese
erfolgt durch die Spaltung und Migration von Endothelzellen in Richtung Tumor. MMPs
spielen durch den Abbau der ECM in diesem Schritt der Neoangiogenese eine wichtige Rolle
(OH et al., 2001; BOURBOULIA u. STETLER-STEVENSON, 2010).
2.3.5 MMPs im Melanom
Das Expressionsprofil von einigen MMPs sowie TIMPs und deren Beitrag zum invasiven
Verhalten wurde an humanen und murinen Zelllinien untersucht. Bisher konnte eine
Korrelation des Phänotyps mit der vermehrten Expression von MMP-1, auf welche im Kapitel
2.4 genauer eingegangen wird, sowie MMP-2 und MMP-9 aufgezeigt werden.
In Vitro wurde die vermehrte MMP-2 Expression mit der Progression des Melanoms
assoziiert, basierend auf einem MMP-2 Nachweis in hoch invasiven Zelllinien und der
Abwesenheit von MMP-2 in weniger invasiven. Dies wurde auch in vivo bestätigt. Die
modulierende Wirkung von MMP-2 auf die Zelladhäsion ermöglicht eine Streuung des
Tumors über die Komponenten der ECM hinaus.
MMP–9 zeigt in vitro nur bei Melanomzellen fortgeschrittenen Stadiums eine vermehrte
Expression. In Vivo zeigte eine Studie mit MMP-9-defizienten Mäusen, dass die Bildung von
Metastasen unterdrückt war. Hinweise lassen aber vermuten, dass nicht die Melanomzellen
29
selbst, sondern Tumorumgebende Zellen MMP-9 sezernieren und dies für die Bildung von
Metastasen ausschlaggebend ist (HOFMANN et al., 2005).
Die übereinstimmenden Ergebnisse der in vitro und in vivo Studien verdeutlichen, dass die
proteolytische Balance zwischen der Produktion von MMPs und TIMPs eine entscheidende
Rolle in der Kapazität der Metastasierung einnimmt. So wurde gezeigt, dass eine vermehrte
Expression von TIMPS eine Reduktion der Tumorgröße veranlasst und die Metastasierung
eindämmt.
Jedoch ist bis heute noch unklar, wie genau die spezifische Aktivierung in vivo abläuft und
wie sich die funktionell aktiven MMPs während der Migration von Melanomzellen verhalten
(HOFMANN et al., 2005).
30
2.4 Matrix – Metalloproteinase – 1
Die MMP-1, auch bekannt als „Interstitielle Kollagenase”, „Kollagenase-1“ und
„Fibroblastenkollagenase“, wurde 1962 von GROSS und LAPIERE in einer in vitro Studie
über die Degradierung von nativen Kollagenfibrillen bei der Metamorphose einer Kaulquappe
zum Frosch das erste Mal beschrieben. Darüber hinaus war die menschliche
Fibroblastenkollagenase die erste Wirbeltier-Kollagenase, welche als Protein gereinigt und als
cDNA vervielfältigt wurde. Während nachgewiesen wurde, dass MMP-1 in normalem
homöostatischen Gewebe oftmals nicht detektierbar ist, zeigte sich, dass MMP-1 bei diversen
physiologischen (z.B. Wundheilung, Embryogenese) und pathologischen Prozessen (z.B.
Tumorgenese, Entzündung) eine vermehrte Expression aufwies. Des Weiteren wurde
nachgewiesen, dass MMP-1 auch in vitro von einer Vielzahl von Zellen, unter anderem
Fibroblasten, Makrophagen, Endothel- und Epithelzellen produziert wird (PARDO u.
SELMAN, 2005).
2.4.1 Funktion
MMP-1 ist neben MMP-8, MMP-13 und MMP-14 im Stande, fibrilläre Kollagene (Kollagene
des Typs 1, 2 und 3) in seiner Trippelhelix hydrolytisch zu spalten (YUAN et al., 2010).
Zusätzlich ist es aber auch in der Lage, Zelloberflächenmoleküle und andere nicht-Matrix
Elemente zu spalten (PARDO u. SELMAN, 2005).
2.4.2 Hochregulierung im Tumor
Bisherige Studien konnten zeigen, dass ein Anstieg der Expression von MMP–1 Entwicklung,
Progression und Metastasierung von Melanomen beeinflusst, sowohl durch das Umformen
der ECM, als auch durch die Bildung bioaktiver Moleküle und die proteolytische Abtrennung
von Membranproteinen der extrazellulären Domänen (GIRICZ et al., 2010; LIU et al., 2012).
Die vermehrte Expression von MMP-1 wird in der Humanmedizin mit vielen verschiedenen
Tumorarten assoziiert, wie etwa Lungen- und Brustkrebs und dem Melanom. Außerdem wird
die vermehrte Expression mit einer schlechten klinischen Langzeitprognose und hoher
Invasivität verknüpft (FOLEY et al., 2012)
31
2.4.2.1 MMP-1 in der Humanmedizin
MMP-1 ist am 11q22 – 23 Gen lokalisiert und 17kb lang. Es wird von vielen Zellen
exprimiert und mit einer Reihe von Erkrankungen in Zusammenhang gebracht, wie zum
Beispiel
Arthritis,
Autoimmunerkrankungen,
kardiovaskulären
und
fibrotischen
Erkrankungen, sowie Tumoren (NIKKOLA et al., 2002; PARDO u. SELMAN, 2005). Bei der
Progression von humanen Melanomen spielt eine Vielzahl von proteolytischen Enzymen eine
wichtige Rolle. Neben einem Teil des plasminogenaktivierenden Systems gehören auch
Mitglieder der Matrix-Metalloproteinasen dazu, wie z.B. MMP-1, -2, -9, -13 und MT-MMP
sowie TIMP-1, -2 und -3 (HOFMANN et al., 2000). Die Expression von MMP-1 moduliert
die Entwicklung, Progression und Metastasierung durch den Abbau der ECM. Speziell
Patienten mit Melanomen, welche eine vermehrte Expression von MMP1 aufweisen, haben
eine schlechtere Langzeitprognose (NIKKOLA et al., 2002).
2.4.2.2 MMP-1 in der Veterinärmedizin
Nicht nur in der Humanmedizin, sondern auch in der Veterinärmedizin wurde die MMP-1Expression in vitro, und zwar in Sarkoid–Fibroblasten beim Pferd nachgewiesen. YUAN et al.
(2010) bewiesen, dass eine Papillomvirusinfektion und die virale Genexpression zu einer
vermehrten Synthese der MMPs führen und infolgedessen für die Invasivitt der Fibroblasten
verantwortlich ist. Dies wurde einerseits mittels RT-qPCR an Sarkoiden und von diesen
abstammenden Sarkoid-Fibroblasten-Zelllinien, sowie an equinen embryonalen Fibroblasten
und physiologisch intakter Haut untersucht. Die Studie ergab eine deutliche Hochregulation
von MMP-1 in den von Sarkoiden abstammenden Zelllinien und eine moderat erhöhte
Expression in den Sarkoiden im Vergleich zur Haut und den equinen embryonalen
Fibroblasten, welche eine deutlich niedrigere MMP-1 Aktivität aufwiesen. Es bestand jedoch
keine direkte Relation zwischen den Tumorproben und den daraus kultivierten Zelllinien.
Desweiteren wurde mittels Zymographie die vermehrte MMP-1 Expression untersucht.
Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass sowohl die inaktiven Vorstufen, als auch die aktive
Form von MMP-1 in allen Tumorproben und Zelllinien deutlich detektierbar waren. Um zu
kontrollieren, ob die Hochregulation von MMPs für die Invasion bei Sarkoid-Fibroblasten
verantwortlich ist, zogen die Autoren YUAN et al. (2010) den MMP Inhibitor GM6001 heran.
Dieser stellte eine Inaktivierung von MMP-1, MMP-2 und MMP-9 erfolgreich her, was sich
durch eine reduzierte Invasion von Sarkoidzellen um 35-40% darstellte (YUAN et al., 2010).
32
Jedoch ist bis jetzt unbekannt, wie das Virus die Expression von MMP–1 reguliert (YUAN et
al., 2011).
33
3 MATERIAL & METHODEN
3.1 Ethische Genehmigung
Die vorliegende Arbeit wurde von der Ethik-Kommission der Veterinärmedizinischen
Universität Wien und vom zuständigen Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung
gemäß § 26 des Tierversuchsgesetz 2012, BGBl. I Nr.114/2012 genehmigt.
Die Bescheid - Nummer lautet: BMWF – GZ 68.205/0102 - II/3b/2013.
34
3.2 Material
Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden 9 Melanome, 1 primäre Melanomzellinie und 8
Hautproben von insgesamt 12 Pferden an der Veterinärmedizinischen Universität,
Pferdeklinik, Forschungsgruppe Onkologie, auf ihre MMP–1 Expression analysiert. Das
Gewebe wurde direkt nach der chirurgischen Exzision in circa 5x5mm große Stücke geteilt
und in TRI – Reagent® (Sigma, Österreich) bis zur weiteren Verarbeitung auf -20°C
eingefroren.
Tabelle 1: Proben – Umfang
Pferd
#1
#2
#3
#4
#5
#6
#7
#8
#9
# 10
# 11
# 12
Proben - Code
ARI
BT
CAL
CT
CH
DIN
DT
DH
DOL T
DOL H
DOL ZK 1
GT
GH
LT
LH
HAC
MIR
SCH
Proben – Typ
Melanom
Melanom
Melanom
Melanom
Haut
Melanom
Melanom
Haut
Melanom
Haut
Melanomzellen
Melanom
Haut
Melanom
Haut
Haut
Haut
Haut
35
3.3 Patienten
Die Patienten wurden im Vorfeld klinisch untersucht und anschließend erfolgte eine
Erfassung aller adspektorisch und palpatorisch detektierbaren Melanome durch einen Tierarzt.
Die adspektorische Untersuchung erfolgte vor allem an primären Prädilektionsstellen, aber
auch Lippen, Augenlider und die Parotis-Region wurden sowohl adspektorisch als auch
palpatorisch untersucht. Zum Schluss wurde die gesamte Hautoberfläche auf potentielle
Tumoren systematisch kontrolliert. Auf eine rektale Untersuchung musste verzichtet werden.
Pferde, die andersfarbig als Schimmel waren, wurden im Rahmen dieser Arbeit
ausgeschlossen.
Die 9 Melanomproben sowie die eine primäre Melanomzelllinie, welche im Rahmen dieser
Diplomarbeit untersucht wurden, stammten von 3 Stuten und 6 Wallachen unterschiedlicher
Rassen. Die Altersspanne der Tiere reichte von 3 Jahren bis 21 Jahre.
Die nachfolgenden Tabellen (Tabelle 2 - 13) und Abbildungen (Abbildungen 8 – 13) liefern
das Signalement sowie die Melanomlokalisation der einzelnen Patienten und entstammen zum
einen
aus
Aufzeichnungen
der
Forschungsgruppe
Onkologie
bzw.
Tierinformationssystem (TIS) der Veterinärmedizinischen Universität Wien.
aus
dem
36
Tabelle 2: Pferd # 1
Proben - Code
Rasse
Geschlecht
Alter
Farbe
Melanom Lokalisation
ARI
Deutsches Warmblut
Wallach
21 Jahre
Schimmel
Auf der rechten Thoraxseite befinden sich circa 2 Handbreit über
dem Sternum und 2 Finger breit hinter der Trizepsmuskulatur eine
breitbasig aufsitzende kugelige, circa bohnengroße derbe
Umfangsvermehrung, die gegenüber der Haut verschieblich,
gegenüber der Unterlage nicht verschieblich ist.
Sonografisch stellt sie sich als 7mm unter der Haut liegende, der
Faszie breit aufsitzende, homogen echoarme Masse dar, die
gegenüber der Muskulatur relativ gut abgegrenzt und 1,6x1cm groß
ist, ventral davon lassen sich entlang der Faszie noch mindestens
drei in einer Reihe angeordnete ca. 1mm große Massen darstellen
(Verdacht auf Absiedelung entlang der Lymphbahn).
37
Tabelle 3: Pferd # 2
Proben Code
Rasse
Geschlecht
Alter
Farbe
Melanom Lokalisation
BT
Lipizzaner
Stute
11 Jahre
Schimmel
multiple Melanome unterschiedlicher Größe (Durchmesser: 0,5 – 1
cm) an der Schweifrübenunterseite und den Anus umgebend.
Abbildung 2: Pferd # 2
Tabelle 4: Pferd # 3
Name
Rasse
Geschlecht
Alter
Farbe
Melanom Lokalisation
CAL
Österreichisches Warmblut
Stute
3 Jahre
Schimmel
Ein Melanom an Schweifrübe und Anus (11mm).
38
Tabelle 5: Pferd # 4
Name
Rasse
Geschlecht
Alter
Farbe
Melanom Lokalisation
CT & CH
Pony – Mix
Wallach
20 Jahre
Schimmel
Ein Melanom an der Schweifrübenunterseite mit einem
Durchmesser von 6mm.
Abbildung 3: Pferd # 4
Tabelle 6: Pferd # 5
Name
Rasse
Geschlecht
Alter
Farbe
Melanom Lokalisation
DIN
unbekannt
Wallach
unbekannt
Schimmel
Ein Melanom an der Schweifrübe.
39
Tabelle 7: Pferd # 6
Name
Rasse
Geschlecht
Alter
Farbe
Melanom Lokalisation
Abbildung 4: Pferd # 6
DT & DH
Trakehner
Wallach
15 Jahre
Schimmel
1 Melanom Bauch links, nähe Penisschaft 1,7cm
weitere multiple Melanome den Penisschaft umgebend, teilweise
konfluierend, circa faustgroß.
40
Tabelle 8: Pferd # 7
Name
Rasse
Geschlecht
Alter
Farbe
Melanom Lokalisation
Abbildung 5: Pferd # 7
DOL T, DOL H, DOL ZK 1
Islandpferd
Wallach
14 Jahre
Schimmel
3 linsengroße Melanome ventral Schweifansatz rechte Seite, links
dorsal unterhalb der Schweifrübe circa erbsengroßes Melanom,
rechts vom Anus circa auf 01:00 ein weiteres linsengroßes
Melanom, im Bereich der Anusöffnung (Rosette) zwei circa
erbsengroße Melanome palpierbar auf 11:00 und 05:00, im Bereich
der Schenkelspalte circa 15cm distal des Anus circa walnussgroßes
Melanom
41
Tabelle 9: Pferd # 8
Name
Rasse
Geschlecht
Alter
Farbe
Melanom Lokalisation
Abbildung 6: Pferd # 8
GT, GH
Shagya Araber
Stute
20+ Jahre
Schimmel
2 Melanome unter der Schweifrübe (beide circa 8mm im
Durchmesser)
42
Tabelle 10: Pferd # 9
Name
Rasse
Geschlecht
Alter
Farbe
Melanom Lokalisation
LT, LH
Welsh Mountain Pony
Wallach
19 Jahre
Schimmel
2 Melanome unter der Schweifrübe (4mm und 6mm Durchmesser)
Abbildung 7: Pferd # 9
Tabelle 11: Pferd # 10
Name
Rasse
Geschlecht
Alter
Farbe
HAC
Andalusier
Hengst
12 Jahre
Schimmel
43
Tabelle 12: Pferd # 11
Name
Rasse
Geschlecht
Alter
Farbe
MIR
Lipizzaner
Stute
16 Jahre
Schimmel
Tabelle 13: Pferd # 12
Name
Rasse
Geschlecht
Alter
Farbe
SCH
Connemara Pony
Stute
19 Jahre
Schimmel
44
3.4 Methode
Die Aufarbeitung der Melanom- und Hautproben, sowie der Zellen, erfolgte immer nach dem
gleichen, unten aufgelisteten Arbeitsschritten im Labor der Forschungsgruppe Onkologie.
3.4.1 RNA–Isolierung
Die in TRI-Reagent® (Sigma-Aldrich Handels GmbH, Österreich) eingefrorenen Tumor– und
Hautproben wurden auf Eis aufgetaut, in einer Petrischale manuell mit dem Skalpell
zerkleinert und mittels Ultra-Turrax T8 (IKA®-Werke GmbH & Co.KG, Deutschland) in 1ml
TRI-Reagent® auf Eis homogenisiert. Dazu wurden 0,2ml Chloroform pro ml TRI–Reagent®
gegeben, für 15 Sekunden geschüttelt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im
Anschluss wurde alles bei 12000xg für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die RNA
enthaltende wässrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß übergeführt und mit 0,5ml
Isopropanol per ml TRI Reagent® versetzt, mit der Hand geschüttelt und 10 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Proben bei 12000xg für 10 Minuten bei
4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das RNA-Pellet mit 1ml 75% Ethanol
gewaschen und nochmals bei 7500xg bei 4°C für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand
wurde abgehoben und erneut verworfen und das Pellet luftgetrocknet und in 5-20μl sterilem
Wasser gelöst.
3.4.2 DNase-Verdau
Im Anschluss an die RNA-Isolierung wurde ein DNase-Verdau durchgeführt. Verwendet
wurden hierfür die Reagenzien des RNeasy Mini Kit (250) (Qiagen, Deutschland)
entsprechend der Herstellerangaben. Alle Zentrifugierschritte wurden in einer Sigma1-15K
Zentrifuge (Sigma-Aldrich Handels GmbH, Österreich) bei maximaler Geschwindigkeit
durchgeführt.
45
Kurz zusammengefasst wurden ȝO57/VRZLHȝO(W2+SURReaktionsgefäß/Probe
hinzu pipettiert, in RNeasy Minisäulen überführt, 15 Sekunden zentrifugiert und der
'XUFKIOXVVYHUZRUIHQ3UR0LQLVlXOHZXUGHQȝO5:KLQ]XSLSHWWLHUWVHF]HQWULIXJLHUW
und der 'XUFKIOXVV ZLHGHU YHUZRUIHQ $OV QlFKVWHV ZXUGHQ ȝO 5'' VRZLH ȝO '1DVH ,
(Roche, Österreich) in einem separatem Röhrchen vorsichtig gemischt und ȝOSäule
aufgetragen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurden erneut
ȝO5:6lXOH hinzugefügt und 15 Sekunden zentrifugiert und der Durchfluss verworfen.
Im daraXI IROJHQGHQ 6FKULWW ZXUGHQ ]XHUVW ȝO 53( SUR 6lXOH KLQ]upipettiert und 15
Sekunden zentrifugiert und der Durchfluss wieder YHUZRUIHQ $QVFKOLH‰HQG ZXUGHQ ȝO
80% EtOH pro Säule hinzugefügt und 2 Minuten zentrifugiert, der Durchfluss verworfen und
zum Trocknen der Säule erneut für 5 Minuten zentrifugiert. Die RNA wurde dann mit 200μl
A.D. pro Säule in ein frisches Eppendorf eluiert LQ ZHOFKHV ȝO 51DVH287 (Life
Technologies, Österreich) vorlegt war. Nach abgeschlossenem DNase-Verdau wurde die
RNA im Eppendorf auf Eis zur weiteren Verwendung gelagert bzw. auf -20°C eingefroren.
3.4.3 Clean up
Mit Hilfe des Gene JET RNA Cleanup and Concentration Micro Kit (Thermo Fisher
Scientific, Österreich) erfolgte bei stark melaninhaltigen Proben eine Reinigung der RNA
nach dem DNase-Verdau. Für die Aufreinigung wurde die Probe mit 200μl nukleasefreiem
Wasser aufgefüllt und 100μl Bindungspuffer hinzugefügt und vorsichtig gemischt. Zusätzlich
wurden 300μl absolutes Ethanol hinzupipettiert und wiederholt gemischt. Das gesamte
Gemisch wurde in eine GeneJET RNA Purification Microsäule mit vormontiertem
Sammelröhrchen überführt und für 30 Sekunden bei 12000xg zentrifugiert. Der Durchfluss
wurde verworfen und 700 μl Waschpuffer 1 hinzugefügt und 30 Sekunden bei 12000xg
zentrifugiert. Der Durchfluss wurde wieder verworfen und zweimal infolge mit 700μl
Waschpuffer 2 gewaschen und 30 Sekunden bei 1400xg zentrifugiert. Im Anschluss wurde
erneut 1 Minute bei 12000xg zentrifugiert, um den restlichen Waschpuffer zu entfernen. Die
RNA wurde mit 10μl sterilem, nukleasefreiem Wasser in ein neues Röhrchen eluiert.
46
3.4.4 RNA – Konzentrationsbestimmung und Überprüfung der Reinheit
Die RNA Konzentration wurde photometrisch (U-3000 Spektrophotometer, Hitachi,
Österreich) unter Verwendung einer Quarzküvette (UV 6040, Hellma, Deutschland) im
Anschluss an eine Kalibrierung, bestimmt. Hierfür wurde eine 1:100 Verdünnung der Probe
mit RNase-freiem Wasser erstellt. Die Doppel-0HVVXQJHQ HUIROJWHQ EHL Ȝ QP und
280nm. Zur Berechnung der Konzentration an Nukleotiden wurde folgende Formel
herangezogen (MÜLHARDT, 2009):
Formel 1: Berechnung der RNA – Konzentration
c>PlRNA / ml @ ODO 260 * H 40 * VF100
C = Konzentration der Ausgangslösung [μl RNA/ml]
2'Ȝ = Absorption bei 260nm
İ = Extinktionskoeffizient für RNA = 40
VF100 = Verdünnungsfaktor
Für die weitere Verwendung wurde der arithmetische Mittelwert der RNA - Konzentration
beider Messungen berechnet.
Um die RNA–Reinheit zu ermitteln, erfolgte auch eine Messung GHU 9HUGQQXQJ EHL Ȝ 280nm, welche dem Absorptionsmaximum von Proteinen entspricht. Der Quotient zwischen
den beiden Absorptionswerten, welche pH abhängig sind, liefert Aufschluss über die RNA–
Reinheit (MÜLHARDT, 2009).
Für RNA gilt: OD260/280 = 2,0 Æ entspricht einer 100 %igen Reinheit
47
3.4.5 Reverse Transkription / cDNA Synthese
Für die reverse Tanskription der gereinigten RNA zu cDNA wurde ein SuperScript III–Kit
(Invitrogen by Life Technologies, Österreich).
Zu jeweils 5 μg RNA wurden 1μl random hexamers Primer (50ng/ μl), 1μl 10mM dNTP mix
hinzugefügt und auf 10μl mit sterilem Wasser aufgefüllt. Dieses Gemisch wurde für 5
Minuten bei 65°C inkubiert und daraufhin für mindestens 1 Minute auf Eis gekühlt. Die in
Tabelle 14 angeführten Komponenten wurden in ein nukleasefreies Reaktionsgefäß überführt
und vorsichtig gemischt.
Tabelle 14: cDNA - Synthese - Reaktionsgemisch
Substrat
10xRT Puffer
25mM MgCl2
0,1M DTT
RNaseOUTTM (40U/μl)
SuperScriptTM III RT (200U/μl)
™
Volumen pro Reaktion
2 μl
4 μl
2 μl
1 μl
1 μl
10 μl
Zu jedem RNA/Primer–Gemisch wurden 10μl des cDNA-Synthesemix hinzugefügt,
schonend gemischt und durch kurzes zentrifugieren am Boden gesammelt.
Das Gemisch wurde bei folgenden Temperaturen inkubiert:
Tabelle 15: Reaktionsbedingungen für Reverse Transkription
Reaktionsbedingungen
Anlagerung der Randomhexamer - Primers
Reverse Transkription
Inaktivierung der Reversen Transkriptase
10 min.
50 min.
5 min.
25 °C
50 °C
85°C
48
Im nächsten Schritt wurden die Proben auf Eis gestellt und in jedes 1μl RNase H hinzu
pipettiert und weitere 20 Minuten bei 37°C inkubiert.
3.4.6 Validierung GHUF'1$PLWWHOVȕ-Aktin PCR
Zur Qualitätskontrolle der Nukleinsäuren wurde ȕ–Aktin als Referenzgen mittel PCR
bestimmt.
Bei den speziell gewählten, von Dipl.-Ing. Dr. Sabine Brandt entworfenen Primern handelte
es sich um sogenannte „wobbel primer“ R =A/G, die das ȕ-Aktin-Gen mehrerer Spezies
erkennen können.
Verwendete Primer, PCR–Ansatz und –Bedingungen siehe Tabellen 16 & 17.
Tabelle 16: Primer – Sequenzen
Bezeichnung
Sequenz (5´ Æ 3´)
ȕ–Aktin
TACA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG (24)
¶ȕ–Aktin
CGT CRT ACT CCT GCT TGC TGA TCC (24)
49
Tabelle 17: ß-Aktin PCR Ansatz und Reaktionsbedingungen
ȕ–Aktin – PCR
Reaktionsansatz
9ROXPHQ>ȝO@SUR5HDNWLRQ
Substrat
ȝO
A.D.
ȝO
5x Puffer HF
(ThermoScientific)
ȝO
DMSO
(Sigma-Aldrich)
ȝO
dNTP
(Roche)
ȝO
¶ȕ–Aktin
9ROIUSPROȝO
(VBC Biotech)
ȝO
¶ȕ–Aktin
9ROIUSPROȝO
(VBC Biotech)
ȝO
Phusion DNA Polymerase
(ThermoScientific)
ȈȝO
ȝO
Reaktionsbedingungen
98 °C 2min.
98 °C 15 sec.
70 °C 30 sec
45x
72 °C 30 sec.
72 °C 5 min.
ƒ&’
98 °C 2min.
cDNA
ȈȝO
Die PCR-Produkte wurden mittels Gelelektrophorese auf einem 1,5% Agarosegel in TAEPuffer mit dem DNA-Farbstoff Ethidiumbromid unter UV–Licht sichtbar gemacht und mittels
FluorChem 3 Imaging System (Biozym, Österreich) fotografiert.
Für die Herstellung des 1,5% Agarosegels wurden 2,25g Agarose in einen Erlenmeyerkolben
eingewogen, mit 150ml TAE-Puffer aufgefüllt und für 4 Minuten in der Mikrowelle erhitzt.
Anschließend wurde das flüssige Gel unter fließendem Wasser abgekühlt und 8μl
Ethidiumbromid [10mg/ml] hinzupipettiert und in eine Gelkammer zur Aushärtung gegossen.
Der TAE Puffer, wurde nach Standardmethode hergestellt. Die Reagenzien waren alle von
Sigma-Aldrich, Österreich, hierfür wurden 4,84g Trisma Base (pH 8), 1,142ml CH3COOH,
0,744g Na-EDTAx 2H2O mit A.D. auf 1000ml aufgefüllt.
Die gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in einer Gelkammer
(ComPhor L Midi, Bioplastics, Biozym) in TAE Puffer für 40 Minuten bei 110 Volt
Gleichspannung.
50
3.4.7 Primer Effizienz
Um die Primer Effizienz des MMP-1–Assays sowie des RPS–13–Assays in der qPCR
(StepOne, Applied Biosystems by Life Technology, Österreich) im Vorfeld zu evaluieren,
wurde eine 5–stufige geometrische Verdünnungsreihe mit ȝl cDNA aus einer equinen
Melanomzellinie in Doppelbestimmung durchgeführt.
Die nachfolgenden Konzentrationen wurden getestet:
x 100ng/5μl
x 50ng/5μl
x 25ng/5μl
x 12,5ng/5μl
x 6,25ng/5μl
Verwendete Primer, Probes (3´MGB/NFQ), siehe Tabelle 18 & 19, sowie alle verwendeten
Reagenzien stammen von Applied Biosystems (Life Technology).
Tabelle 18: Primer Sequenzen von MMP-1
MMP-1 – Primer
Assay ID
03468020_m1
5´ – Reporter FAM (6-Carboxy-Fluorescein)
Tabelle 19: Primer Sequenz von RPS-13
RPS-13 – Primer
Vorwärtsprimer Sequenz (5´ Æ 3´)
GTGCCCACTTGGCTGAAGTT
Rückwärtsprimer Sequenz (3´ Æ 5´) TCTTGGCCAGCTTGTAGATCTG
5´ – Reporter
VIC-CGTCTGACGACGACGTGAG
51
Die nachfolgende Tabelle 20 zeigt den Ansatz und die Reaktionsbedingungen für die qPCR.
Tabelle 20: qPCR Ansatz und Reaktionsbedingungen
Reaktionsansatz
9ROXPHQ>ȝO@SUR5HDNWLRQ
Substanz
ȝO
Universal Master Mix
MMP 1 Assay Mix FAM
ȝO
RPS 13 Assay Mix VIC
ȝO
A.D.
Ȉ5 ȝO
Master-Mix
ȝO
cDNA
Reaktionsbedingungen
95 °C 10min.
95 °C 15min. 45 Zyklen
60 °C 1min.
Für die Berechnung der Effizienz wurde folgende Formel herangezogen (PFAFFL, 2001):
Formel 2: Berechnung der Effizienz
Effizienz (%) = 10[-1/Steigung]
Die Steigung basiert auf der linearen Funktion einer Geraden
(http://rfdz.ph-noe.ac.at/fileadmin/lernpfade/lernpfad_schnittstelle89_funktionen/sites/06_lineare_fkt.html).
Formel 3: lineare Funktion einer Geraden
y = kx + d
k = Steigung der Geraden
d = Achsenabschnitt
Die Gültigkeit der Aussage hängt von der tatsächlichen Übereinstimmung der
52
PCR-Effizienzen beider Gene ab. Generell ist eine Effizienz zwischen 90 und 110% zulässig
(APPLIED BIOSYSTEMS BY LIFE TECHNOLOGIES, 2011). Je größer die Unterschiede
sind, umso größer ist der Fehler der ǻǻCT-Methode (LIVAK u. SCHMITTGEN, 2001).
Ein weiterer kritischer Parameter zur Evaluierung der PCR Effizenz ist R². Hierbei handelt es
sich um einen statistischen Wert, welcher die Genauigkeit der einzelnen Parameter
widerspiegelt. R² > 0,99 spricht für eine gute Korrelation zweier Messwerte (APPLIED
BIOSYSTEMS BY LIFE TECHNOLOGIE, 2011).
3.4.8 qPCR
Für die quantitative Bestimmung von MMP–1 wurden die in Tabelle 1 aufgelisteten Proben,
mit einer cDNA Konzentration von 100ng/5ȝOPLWGHPVFKRQHUZlKQWHQ3URWRNRll in
Tabelle 20 herangezogen.
Für die Auswertung der Ergebnisse wurden folgende Kriterien festgelegt:
1. Sowohl MMP-1 als auch RPS–13 mussten in den Doppelbestimmungen nachweisbar
sein
2. Maximaler Zyklus–Unterschied betrug 0,5 Zyklen
Die Auswertung erfolgte mittels kompaUDWLYHUǻǻ&T–Methode:
1. durch Vergleich des Arithmetischen Mittelwertes
2. sowie im direkten Vergleich
53
Die Berechnung und Auswertung der Ergebnisse erfolgte auf Basis folgender Formeln
(LIVAK u. SCHMITTGEN, 2001) entsprechend den Empfehlungen von Applied Biosystems
by Life Technologies, Österreich:
Formel 4%HUHFKQXQJǻ&T Mean
Formel 5: kompaUDWLYHUǻǻ&T Meathode
Wenn die Effizienz annähernd gleich ist, gilt für die ermittelten ǻCT Werte die nachfolgende
Formel 6, um die n-fache Expression zu berechnen(APPLIED BIOSYSTEMS BY LIFE
TECHNOLOGIES, 2001):
Formel 6: n – fache – Expression
n – fache - Expression = 2 - ǻǻ&7
54
4 Ergebnisse
4.1 Konzentration & Qualität der RNA
Aufbauend auf den photometrisch gemessenen $EVRUEWLRQVTXRWLHQWHQȜ = 260nm und
Ȝ = 280nm der Doppelbestimmung wurden die in Tabelle 21 stehenden Werte ermittelt.
Tabelle 21: Arithmetische Mittelwerte der RNA Konzentration & -Qualität
Proben – ID
ARI
BT
CAL
CT
CH
DIN
DT
DH
DOL T
DOL H
DOL ZK 1
GT
GH
LT
LH
HAC
MIR
SCH
Konzentration >QJȝO@
507
480
340
520
420
760
660
333.33
2786
3162
1224
460
420
520
560
1080
1300
514
Qualität
1,81
3,43
1,42
4,33
5,25
1,81
2,36
3,13
1,32
1,65
1,88
4,60
10,50
1,13
4,00
2,02
1,68
1,76
55
4.2 ȕ-Aktin PCR
Um die Reverse Transkription zu überprüfen, sowie sicherzustellen, dass die Proben aus
LQWDNWHU 51$ JHZRQQHQ ZXUGHQ ZXUGH HLQH ȕ-Aktin PCR von allen Proben durchgeführt.
Von allen 22 Proben konnte bei 17 Proben ȕ-Aktin nachgewiesen werden.
Für die NTC wurde A.D. und als positive Kontrolle eine bereits bekannte DNA herangezogen.
Abbildung 8: ß-Aktin-PCR
56
4.3 Primer Effizienz
Wie im Methodenteil bereits beschrieben, wurde die Effizienz der Primer erfasst.
Tabelle 22: ǻ&T – Berechung zur relativen Quantifizierung
log [ng]
2,00
1,70
1,40
1,10
0,80
[ng]
100ng
50ng
25ng
12,5ng
6,25ng
&ɬ0HDQ MMP-1 Assay
27,8922081
28,8907375
29,813055
30,8150406
31,7876091
&ɬ0HDQ536-13 Assay
24,1156731
25,7363091
26,2764988
27,3851833
28,4285393
ǻ&ɬ
3,77653503
3,15442848
3,53655624
3,42985725
3,35906982
Dabei wurde eine deutliche invers proportionale Zunahme des CT-Werts bei abnehmender
Konzentration beobachtet (Tabelle 22) und in den nachfolgenden Abbildungen grafisch
dargestellt (Abbildung 9 und 10).
57
Abbildung 9: MMP-1 Primer Effizienz
ǻ&ɬ0HDQ
MMP-1 Primer Effizienz
y = 0,9715x + 26,925
R2 = 0,9999
33
32
31
30
29
28
27
26
25
2,00
1,70
1,40
1,10
0,80
log[ng]
Abbildung 9: Ermittlung der MMP-1 Primer-Effizienz. Auf der X-Achse sind die logarithmierten
Startkonzentrationen (umgerechnet aus der Menge cDNA) aufgetragen und auf der Y-Achse die
gemessenen CT-Werte.
Abbildung 10: RPS-13 Primer – Effizienz
RPS-13 Primer Effizienz
y = 1,0275x + 23,306
ǻ&ɬ0HDQ
R2 = 0,9812
29
28
27
26
25
24
23
22
21
2,00
1,70
1,40
1,10
0,80
log [ng]
Abbildung 10: Ermittlung der RPS-13 Primer-Effizienz. Auf der X-Achse sind die logarithmierten
Startkonzentrationen (umgerechnet aus der Menge cDNA) aufgetragen und auf der Y-Achse die
gemessenen CT-Werte.
58
Die nachfolgende Abbildung 11 vereint die ǻ&T beider Verdünnungsreihen. Die Annäherung
der Steigung der Geraden an Null (-0,056) deutet, wie im Kapitel 3.4.7 beschrieben, auf eine
annähernd gleiche Effizienz der beiden Analysen hin (LIVAK u. SCHMITTGEN, 2001).
Abbildung 11: Vergleich der relativen Effizienz von MMP-1 und RPS-13
Vergleich der relativen Effizienz
MMP-1 & RPS-13
y = -0,056x + 3,6191
3,9
3,8
3,7
ǻ&ɬ
3,6
3,5
3,4
3,3
3,2
3,1
3
2,00
1,70
1,40
lg [ng] Gesamt RNA
1,10
0,80
59
Die nachfolgenden Abbildungen (Abbildung 12 und Abbildung 13) zeigen auf der X-Achse
die CT–Werte (Cycle), auf der Y-$FKVH GLH JHPHVVHQHQ )OXRUHV]HQ]HQ ǻ5Q und die
Korrelation der Grafen der einzelnen Konzentrationen, welche in Doppelbestimmung
durchgeführt wurden.
Abbildung 12: Darstellung der PCR-Amplifikation des MMP-1-Assays
Abbildung 13: Amplifikation Plot RPS-13
60
4.4 qPCR
Die Ergebnisse der qPCR wurden, wie im Methodenteil bereits beschrieben, ermittelt und
ausgewertet.
4.4.1 Messergebnisse der Melanom-, Zellkultur- und Hautproben
Die nachfolgende Tabelle 23 liefert die CT – Werte (CT) der Doppelbestimmung des MMP-1
und RPS-13 Assays, sowie die berechnete CT Differenz (CTDiff.), den CT Mittelwert
(CT Mean) und die daraus errechnete Normalisierung des jeweiligen Gens (ǻCT).
Die Ergebnisse der Melanomproben ARI, CAL, DIN und DOL T, sowie der Hautproben CH,
GH, HAC und SCH wurden im Rahmen dieser Arbeit aufgrund fehlender Ergebnisse in der
Doppelbestimmung bzw. zu hoher Zyklus-Unterschiede ausgeschlossen. Aus diesem Grund
HUIROJWHGLH$XVZHUWXQJQXUIUGHUȕ-Aktin positiven Proben.
61
Tabelle 23: CT – Werte
Proben – ID
BT
CT
DT
DH
DOL H
DOL ZK 1
GT
LT
LH
MIR
Target – Name
RPS13
RPS13
MMP1
MMP1
RPS13
RPS13
MMP1
MMP1
RPS13
RPS13
MMP1
MMP1
RPS13
RPS13
MMP1
MMP1
RPS13
RPS13
MMP1
MMP1
RPS13
RPS13
MMP1
MMP1
RPS13
RPS13
MMP1
MMP1
RPS13
RPS13
MMP1
MMP1
MMP1
MMP1
RPS13
RPS13
RPS13
RPS13
MMP1
MMP1
CT
32,350
32,755
32,783
32,927
32,656
33,114
34,087
34,414
29,977
30,070
30,535
30,557
30,400
30,720
36,879
36,888
36,526
36,931
35,324
36,245
25,510
25,883
25,793
25,844
35,366
36,015
30,360
30,493
30,640
31,024
30,798
30,947
36,386
37,192
30,850
31,090
26,560
26,676
31,725
31,822
CT Diff.
0,405
CT Mean
ǻ CT
32,552
0,303
0,144
32,855
0,458
32,885
1,365
0,327
34,250
0,093
30,024
0,522
0,022
30,546
0,320
30,560
0,009
36,883
6,323
0,405
36,729
-0,944
0,921
35,784
0,373
25,697
0,050
25,819
0,648
35,691
0,122
-5,264
0,133
30,427
0,384
30,832
0,041
0,150
30,873
0,807
36,789
0,240
30,970
0,116
26,618
5,819
5,155
0,098
31,773
62
4.4.2 Auswertung im Arithmetischen Mittelwertvergleich
Die nachfolgende Tabelle 24 vergleicht alle Haut und Melanomproben im arithmetischen
Mittelwert Vergleich.
Tabelle 24: Arithmetischer Mittelwertvergleich
Haut - Proben
Proben – ID ǻCT - Wert
DH
6,32312775
DOL H
-0,94437408
LH
5,81921387
Mittelwert
ǻǻCT
2-ǻǻ&7
ǻCT Haut
Melanom - Proben
Proben – ID
ǻCT – Wert
BT
0,303
CT
1,365
DT
0,522
GT
-5,264
LT
0,041
MIR
5,155
3,73265585
ǻCT Melanom
0,35366667
-3,37898918
10,40344315
Die Berechnung des Arithmetischen Mittelwertes der Haut- und Tumorproben zeigt eine 10fache Hochregulierung der MMP-1 Expression im Melanom im Vergleich zur Haut.
63
4.4.3 Relative Quantifizierung mittels kompaUDWLYHUǻǻCT Methode
Die nachfolgende Tabelle 25 vergleicht die Expression von MMP-1 im Melanom zur Haut
beim selben Pferd, sowie die Expression von einer etablierten primären Melanomzelllinie zur
Haut des Pferdes.
Tabelle 25: RelatiYH4XDQWLIL]LHUXQJPLWWHOVNRPSDUDWLYHUǻǻCT – Methode
Nummer
#1
#2
#3
Proben - ID
DT
DH
LT
LH
DOL ZK 1
DOL H
ǻCT Melanom
ǻCT Haut
0,52229881
6,32312775
0,0407753
5,81921387
0,12181854
0,94437408
ǻǻCT
= ǻCT Melanom – ǻCT Haut
2-ǻǻCT
-5,8008
55,746
-5,7784
54,887
1,0662
0,4775
Die Melanom-Proben DT und LT zeigen eine deutliche Hochregulation von MMP-1 im
Vergleich zur Haut desselben Pferds. Auffällig ist, dass Melanomzelllinie eine deutlich
niedrigere Expression aufweist.
64
4.5 Zusammenfassung der Ergebnisse
Im Vorfeld wurde die Konzentrationsbestimmung über Messung der optischen Dichte sowie
der Reinheit bestimmt. Daran angeschlossen wurde eine qualitative ȕ-Aktin-PCR
durchgeführt, um den erfolgreichen DNase-Verdau und die reverse Transkription zu
überprüfen. Die PCR Produkte wurden hierfür mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und
mittels Ethidiumbromidfärbung visualisiert.
Nach diesen beiden Arbeitsschritten wiesen 5 von 22 Proben auf mangelnde Qualität hin.
Die Pimer-Effizienz errechnete sich für MMP-1 mit 100% und für RPS-13 mit 98%. Dies
spricht, wie in Abbildung 11 grafisch dargestellt, für eine gute Übereinstimmung der PrimerEffizienzen beider Gene. Es zeigte sich eine deutliche invers proportionale Zunahme der CT
Werte bei abnehmender Konzentration.
Mittels qPCR konnte die quantitative Expression von MMP-1 in den Melanomproben, der
Zelllinie und der Haut erfasst werden. Die Ergebnisse zeigten beim Vergleich der
arithmetischen Mittelwerte eine deutlich vermehrte Expression der MMP-1 Konzentration in
Melanomproben, welche sich als 10-fache Hochregulation der Expression darstellte.
Auch die Ergebnisse der relativen Quantifizierung zeigen eine deutlich vermehrte Expression
der MMP-1 Konzentration, währenddessen die Expression in der Zelllinie geringer war als bei
der kompaUDWLYHQǻǻCT – Methode (siehe Tabelle 25).
65
5 Diskussion
Diese
Diplomarbeit
basiert
auf
ersten
präliminären
Ergebnissen
einer
RNA–
Sequenzierungsanalyse der Forschungsgruppe Onkologie der Veterinärmedizinischen
Universität Wien, welche eine Hochregulierung von MMP-1 in 3 Melanomen beim Schimmel
im Vergleich zu 3 Hautproben zeigen konnte. Die Kenntnis aus der Humanmedizin, dass
MMP-1 in verschiedenen Tumoren hochreguliert ist (FOLEY et al., 2012), sowie der
Nachweis, dass MMP-1 auch im equinen Sarkoid vermehrt exprimiert ist (YUAN et al., 2011)
ermutigte ebenfalls zu dieser Studie.
In dieser Arbeit wurde die MMP-1 Expression in einer größeren Anzahl von
Schimmelmelanomen im Vergleich zur gesunden Schimmelhaut untersucht. Dabei sollte
geklärt werden, ob eine Hochregulation auf mRNA-Ebene wie von den RNASequenzierungsergebnissen suggeriert, tatsächlich vorliegt.
Für die Aufarbeitung dieser Fragestellung erfolgte eine RNA-Isolierung mit anschließendem
DNAse-Verdau und Clean-up von insgesamt 9 Tumor-, 8 Hautproben und einer primären
Melanomzelllinie. Der Ziel des Clean-up war es, das Melanin weitestgehend aus der Probe zu
entfernen, da ECKHART et al. (2000) beschrieben haben, dass Melanin ein potenter Inhibitor
der thermostabilen DNA Polymerase in vitro ist und dass der inhibitorische Effekt sich
einerseits aus der irreversiblen und andererseits aus der reversiblen Polymerase-Melanin
Interaktion zusammensetzt. Dies begründet, warum trotz Clean-up stark-melaninhaltige
Proben wie DOL T in der PCR kein Ergebnis lieferten.
Zur Bestimmung der Qualität und Reinheit der RNA wurde die Methode der
Absorptionsspektrometrie gewählt. Die Berechnung der Reinheit (260/280 Ratio) lieferte bei
den Proben, BT, CT, CH, DT, DH, GT, GH, LH, HAC über das erwartete Maß hinaus hohe
Werte. Dieses Ergebnis macht die RNA – Konzentration fraglich. Über die im Methodenteil
erklärte Messung und Berechnung der Reinheit besteht Einigkeit in der Literatur, jedoch gibt
es Publikationen, welche darauf hinweisen, dass die Messungen sowohl vom pH als auch vom
66
Salzgehalt des verwendeten Wassers abhängig sind, und infolgedessen Unterschiede in der
errechneten Konzentration entstehen können (MÜLHARDT, 2009).
Von allen getesteten cDNAs konnten nach Anwendung aller Ausschlusskriterien zur Wahl der
Qualität leider nur 2 Proben mittels kompaUDWLYHU ǻǻCT Methode ausgewertet werden. Die
Ergebnisse zeigten, sowie auch schon aus der Humanmedizin bekannt (HOFMANN et al.,
2000), eine vermehrte Expression von MMP-1.
Ein weiterer interessanter Aspekt dieser Arbeit ist, dass die MMP-1 Expression von in
Zellkultur kultivierter, primärer Melanomzellen deutlich niedriger war, als in den
Melanomproben. Auch YUAN et al. (2010) hat schon beobachtet, dass die MMPs in
Zelllinien nicht im selben Ausmaß wie in Tumorproben exprimiert werden. Er führt dies auf
die unterschiedliche Variabilität zwischen natürlich vorkommenden Tumoren und im Rahmen
der Kultivierung und Subkultivierung entstandenen Veränderungen zurück (YUAN et al.,
2010). Möglicherweise steht diese Veränderung der MMP-1-Expression in vitro mit der
fehlenden Wechselwirkung mit umliegendem Gewebe im Zusammenhang.
Zusammenfassend bestätigen die hier angeführten Resultate die Ergebnisse der RNASequenzierungsanalyse sowie die Arbeitshypothese dieser Forschungsarbeit.
In der Humanmedizin ist die Überexpression von MMP-1 sowohl in vitro als auch in vivo
nachgewiesen und wird sowohl mit chronischen Hautwunden als auch mit verschiedenen
Neoplasien assoziiert (NIKKOLA et al., 2002). HOFMAN et al., (2000) beschreiben den
Nachweis der vermehrte Expression von MMP-1, neben anderen MMPs, auch im Melanom.
NIKKOLA et al., (2002) haben nachweisen können, dass Patienten mit MMP-1 positiven
Metastasen eine kürzere symptomfreie Zeit aufweisen konnten, im Vergleich zu Patienten mit
MMP-1 negativen Metastasen (NIKKOLA et al., 2002).
Darüber hinaus ist ihnen aufgefallen, dass die Anwesenheit von Melanin mit einem hohen
Expressionslevel von MMP-1 korreliert (NIKKOLA et al., 2002).
Die Ergebnisse dieser Forschungsarbeit liefern für das Schimmelmelanom in der
Veterinärmedizin den entsprechenden ersten Nachweis. Jedoch kann auf Grund fehlender
67
Studien in diesem Bereich noch nicht auf einen Zusammenhang zwischen vermehrter
Expression und kürzerer Überlebenszeit der Patienten geschlossen werden.
Die vermehrte Expression von MMP-1 korreliert in der Humanmedizin mit Tumorinvasion
und somit mit einer schlechteren Prognose und einer kürzeren Überlebenszeit der Patienten
(NIKKOLA et al., 2002). Hierzu gibt es in der Tiermedizin auf Grund fehlender Studien keine
Daten. Bisher ist in der Veterinärmedizin nur bekannt, dass eine Papillomavirusinfektion mit
einer vermehrten Synthese der MMPs in Sarkoidzellen in Zusammenhang steht, wobei im
Speziellen virale Onkogene dafür mitverantwortlich gemacht werden (YUAN et al., 2011).
Neben seiner Rolle als Diagnose- und Prognosewerkzeug kann auch darüber diskutiert
werden, ob MMP-1 als sinnvoller Marker zur Verlaufs- und Therapiekontrolle herangezogen
werden kann. So zeigte sich in der Humanmedizin, dass die Vermehrte Expression von MMP2 und MMP-9 mit der Invasivität und Progression des Melanoms korrelieren. Während MMP1 und MMP-13 mit der Invasion der Primärtumore in Verbindung gebracht werden
(NIKKOLA et al., 2002).
Als neue Therapiestrategie wird die Hemmung von MMPs mit niedermolekularen Substanzen
in der Humanmedizin gerade erforscht. Es zeigte sich, dass ein chemisch modifiziertes nicht
antibiotisches Tetrazyklin-Derivat nur die MMP-2 und MMP-9 Expression erfolgreich
inhibierte (HOFMANN et al., 2005). In der Veterinärmedizin liegen zu diesem Thema noch
keine Forschungsergebnisse vor.
Die weitere Forschung am Melanom des Schimmels soll dem Pferdepatienten zu Gute
kommen, ein besseres Verständnis zu die Ätiologie, Krankheitsverlauf und Metastasierung
liefern. Dies wiederum kann zu verbesserten therapeutischen Strategien führen, von denen
sowohl die Veterinärmedizin als auch die Humanmedizin profitieren können.
68
6 Zusammenfassung
Melanome gehören zu den melanozytären Tumoren und treten bei Pferden aller Rassen,
unterschiedlichen Alters, verschiedener Fellfarbe und unabhängig von ihrem Geschlecht auf.
Sie zählen zu den häufigsten Neoplasien der Haut. Ihre Bedeutung in der Veterinärmedizin ist
nicht zu unterschätzen, vor allem Schimmel weisen eine ausgeprägt hohe Prävalenz auf. Die
klinisch-pathologische Natur der Melanome beim Schimmel wird auf Grund des besonderen
Verhaltens seit mehr als 200 Jahren diskutiert. Zu den häufigsten Prädilektionsstellen zählen
Schweifrübenunterseite und anogenital Region, aber auch Augen sowie deren Lider, Lippen,
Nacken und Parotisregion. Nicht zuletzt die bis jetzt weitgehend ungeklärte Ätiologie, die
Unterschiede zur Humanmedizin und fehlende Therapieerfolge im fortgeschrittenen Stadium
machen das equine Melanom forschungsrelevant.
Gegenstand der hier präsentierten Arbeit war es, die MMP-1 Expression in Melanomen und
intakter Haut von Schimmeln auf mRNA-Ebene vergleichend zu analysieren.
Melanomproben von 9 Pferden wurden einer RNA-Extraktion und cDNA Synthese zugeführt.
Erfolg des DNase-Verdaus und PCR kompatible Qualität wurden mittels einer ȕ-Aktin-PCR
ermittelt und die mRNA-Levels von MMP-1 mittels qPCR untersucht.
Die Ergebnisse zeigten in beiden Auswertungsmethoden, Summen- und Einzelvergleich, eine
vermehrte Expression von MMP-1 im Vergleich zu intakter Haut und eine geringere
Überexpression in einer Melanomzellkultur.
Zusammengefasst bestätigen die hier präsentierten Daten die Arbeitshypothese, dass die
Expression von MMP-1 im Melanom im Vergleich zur gesunden Haut hochreguliert ist.
Schlüsselwörter:
Pferd, Schimmel,
Hautneoplasie, Melanom, Haut,
MMP-1, RPS-13,
qPCR, komparative ǻǻ CT Methode
69
7 Extended Summary
Melanomas are melanocytic tumours seen in horses of any breed, coat colour or age, without
any gender predilection. They are very common skin-tumours. The particular importance of
melanomas should not be underestimated in veterinary medicine, especially because grey
horses show a high prevalence. The clinical and pathological nature of equine melanoma has
been discussed for over 200 years because of their special clinical behavior. Typical sites of
melanoma development are underneath the tail and in the perianal region, eyes, eyelids, lips,
neck and parotid salivary gland. The largely unknown aetiology, the differences to human
melanomas and the lack of effective strategies for treatment of advanced stages of melanoma
are the main reasons for performing melanoma research.
The aim of the current project was to confirm primliminary data on the up-regulation of
MMP-1 mRNA in melanoma of grey horses. To this aim, 9 tumour samples, 8 skin samples
and one melanoma cell line were subjected to RNA extraction and subsequent reverse
transcription of the latter to cDNA. Successful DNase digestion and amplification-compatible
quality of cDNA was confirmed by ȕ-actin PCR. Subsequently MMP-1 mRNA levels in
tumour tissue and cells versus intact skin were assessed by qPCR.
As it was not possible to use comparative ǻǻCT analysis in all cases the arithmetic mean of
tumour, skin and cell culture have been compared. Both analytical methods yielded comp…
results, i.e. an up regulation of MMP-1 mRNA in equine melanoma and to a lesser extend, in
an equine primary melanoma cell line in comparison to intact horse skin.
Accordingly the results of this work support the working hypothesis.
Keywords:
horse; grey-horse;
skin neoplasia; grey-horse-melanoma; skin;
MMP-1; RPS-13;
qPCR; comparative ǻǻCT method;
70
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9 Abbildungs-, Formel- und Tabellenverzeichnis
9.1 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Struktureller Aufbau von MMPs........................................................................25
Abbildung 2: Pferd # 2 .............................................................................................................37
Abbildung 3: Pferd # 4 .............................................................................................................38
Abbildung 4: Pferd # 6 .............................................................................................................39
Abbildung 5: Pferd # 7 .............................................................................................................40
Abbildung 6: Pferd # 8 .............................................................................................................41
Abbildung 7: Pferd # 9 .............................................................................................................42
Abbildung 8: ß-Aktin-PCR.......................................................................................................55
Abbildung 9: MMP-1 Primer Effizienz....................................................................................57
Abbildung 10: RPS-13 Primer – Effizienz ...............................................................................57
Abbildung 11: Vergleich der relativen Effizienz von MMP-1 und RPS-13 ............................58
Abbildung 12: Darstellung der PCR-Amplifikation des MMP-1-Assays ................................59
Abbildung 13: Amplifikation Plot RPS-13 ..............................................................................59
77
9.2 Formelverzeichnis
Formel 1: Berechnung der RNA – Konzentration....................................................................46
Formel 2: Berechnung der Effizienz ........................................................................................51
Formel 3: lineare Funktion einer Geraden................................................................................51
Formel 4%HUHFKQXQJǻ&T Mean ...........................................................................................53
)RUPHONRPSDUDWLYHUǻǻ&T Meathode.................................................................................53
Formel 6: n – fache – Expression .............................................................................................53
78
9.3 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Proben – Umfang.....................................................................................................34
Tabelle 2: Pferd # 1 ..................................................................................................................36
Tabelle 3: Pferd # 2 ..................................................................................................................37
Tabelle 4: Pferd # 3 ..................................................................................................................37
Tabelle 5: Pferd # 4 ..................................................................................................................38
Tabelle 6: Pferd # 5 ..................................................................................................................38
Tabelle 7: Pferd # 6 ..................................................................................................................39
Tabelle 8: Pferd # 7 ..................................................................................................................40
Tabelle 9: Pferd # 8 ..................................................................................................................41
Tabelle 10: Pferd # 9 ................................................................................................................42
Tabelle 11: Pferd # 10 ..............................................................................................................42
Tabelle 12: Pferd # 11 ..............................................................................................................43
Tabelle 13: Pferd # 12 ..............................................................................................................43
Tabelle 14: cDNA - Synthese - Reaktionsgemisch ..................................................................47
Tabelle 15: Reaktionsbedingungen für Reverse Transkription ................................................47
Tabelle 16: Primer – Sequenzen...............................................................................................48
Tabelle 17: ß-Aktin PCR Ansatz und Reaktionsbedingungen .................................................49
Tabelle 18: Primer Sequenzen von MMP-1 .............................................................................50
Tabelle 19: Primer Sequenz von RPS-13 .................................................................................50
Tabelle 20: qPCR Ansatz und Reaktionsbedingungen.............................................................51
Tabelle 21: Arithmetische Mittelwerte der RNA Konzentration & -Qualität ..........................54
7DEHOOHǻ&T – Berechung zur relativen Quantifizierung ...................................................56
Tabelle 23: CT – Werte .............................................................................................................61
Tabelle 24: Arithmetischer Mittelwertvergleich ......................................................................62
Tabelle 255HODWLYH4XDQWLIL]LHUXQJPLWWHOVNRPSDUDWLYHUǻǻ&T – Methode.........................63