Untersuchung der Wirkung von Zytokin-Depot
Werbung
Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1.1 Einführung in die Problematik 1 1.2 Zielsetzung 9 2. Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Chemikalien 11 2.1.2 Materialien für die Säulenchromatographie 12 2.1.3 Proteine, Antikörper und Testsysteme 12 2.1.4 Verbrauchsmaterial 14 2.1.5 Geräte 14 2.1.6 Zellkulturmedien 15 2.1.7 Kultivierte Zellen 16 2.1.8 Versuchstiere 16 2.1.9 Lösungen und Puffer 17 2.1.9.1 häufig verwendete Puffer 17 2.1.9.2 Puffer für die Säulenchromatographie 17 2.1.9.3 Färbelösungen 18 2.1.9.4 Lösungen für den CTLL-2-Proliferationstest 18 2.1.9.5 Lösungen für den IL2-Sandwich-ELISA 18 2.1.9.6 Puffer und Lösungen für die immunhistologischen Färbungen 19 2.2 Methoden 2.2.1 Zellkultur 20 2.2.1.1 Kultivierung von Zellen 20 2.2.1.2 Bestimmung der Zelldichte 20 2.2.1.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen 20 2.2.2 Isolierung von Antikörpern mittels Fast Protein Liquid Chromatographie (FPLC) TM 21 2.2.2.1 Konzentrierung von miniPERM -Überständen 21 2.2.2.2 Gelfiltrations-Säulenchromatographie 21 2.2.2.3 Anionenaustausch-Chromatographie 22 2.2.3 Bestimmung der Konzentration von gereinigten Antikörpern 22 2.2.4 Konjugation von Proteinen mit Fluorochromen oder Biotin 22 PDF created with FinePrint pdfFactory trial version http://www.fineprint.com 2.2.4.1Markierung von Antikörpern mit Fluoreszein 23 2.2.4.2 Biotinylierung von Antikörpern 24 2.2.4.3 Markierung von Proteinen mit Texas Red 25 2.2.5 Markierung von Zellen und Liposomen mit Fluorochromen 26 2.2.5.1 Markierung von Zellen mit CFSE 26 2.2.5.2 Markierung von Zellen mit PKH-2 27 2.2.5.3 Markierung von Liposomen mit dem lipophilen Fluorochrom CM -DiI 29 2.2.6 Herstellung von Leukozytensuspensionen 29 2.2.6.1 Isolierung von Leukozyten aus Lymphorganen 29 2.2.6.2 Isolierung von Zellen aus subkutanen Inokula 30 2.2.7 Verfahren zur Anreicherung von Leukozyten -Subpopulationen 30 2.2.7.1 Erythrozyten-Lyse 30 2.2.7.2 Anreicherung von mononukleären Zellen durch Zentrifugation mit Lympholyt M 30 2.2.7.3 Anreicherung von B-Lymphozyten durch Elimination von T-Lymphozyten durch Antikörper und Komplement 31 2.2.7.4 Anreicherung von T-Zellen durch Passage durch Nylonwoll-Säulen 31 2.2.7.5 Depletion von B-Lymphozyten aus Zellsuspensionen durch „Pannin g“ 32 2.2.8 Histologische Techniken 32 2.2.8.1 Einfrieren von Geweben zur Erstellung von Kryostatschnitten 32 2.2.8.2 H&E-Färbung 33 2.2.8.3 Histochemischer Nachweis von Aluminiumhydroxid im Gewebe 34 2.2.9 Immunhistologische Färbeme thoden 34 2.2.9.1 Indirekte Immunfluoreszenz 34 2.2.9.2 Nachweis biotinylierter Antikörper durch Streptavidin konjugierte alkalische Phosphatase 35 2.2.9.3 Nachweis biotinylierter Antikörper durch die ABC -Methode 35 2.2.9.4 Direkte Immunfluoreszenz auf Gewebeschnitten 36 2.2.10 Immunfluoreszenz von Zellsuspensionen 37 2.2.11 Nachweis von apoptotischen Tumorzellen durch Annexin V und Propidiumiodid 2.2.12 Nachweis von „apoptotic bodies“ 38 38 2.2.13 Methoden zur Ermittlung von Zytokin-Konzentrationen in biologischen Flüssigkeiten 39 2.2.13.1 Sandwich-ELISA zur Bestimmung der Konzentration von rhuIL-2 39 2.2.13.2 CTLL-2-Proliferationstest zur Bestimmung der Konzentration von IL-2 40 PDF created with FinePrint pdfFactory trial version http://www.fineprint.com 2.2.13.3 „Cytometric Bead Array (CBA)“ zur Bestimmung der Konzentration von Zytokinen 41 2.2.14 Durchflußzytometrie 42 2.2.15 Mikrofotografie 43 2.2.16 Herstellung von Depot-Zytokinen und Tumorvakzinen 44 2.2.16.1 Herstellung von Liposomen unter V erwendung von Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) 45 2.2.16.2 Adsorption von IL-2 an Latex-Beads 45 2.2.16.3 Adsorption von Proteinen an Aluminiumhydroxid 45 2.2.16.4 Herstellung von Tumorvakzine 45 2.2.17 Adoptiver Transfer von Lymphozyten-Suspensionen 46 2.2.18 Statistische Analyse von Überlebenskurven 46 3. Ergebnisse 3.1 Untersuchung der Reaktionen des Immunsystems auf Zytokine in Depot-Form 48 3.1.1 Phagozytose von Depot-Materialien 48 3.1.2 Nachweis von rhuIL-2 in Phagozyten der Bauchhöhle 50 3.1.3 Untersuchung der Freisetzung von IL-2 aus phagozytierten Zytokin enthaltenden Depot-Materialien 3.1.4 Nachweis von IL-2 in der Milz nach Injektion von Zytokinen in Depot-Form 3.1.5 51 53 Histologische Untersuchung der Milz nach Injektion von IL-2 gefüllten Liposomen 54 3.2 Untersuchung der Apoptose von bestrahlten Tumorzellen 56 3.3 Untersuchung der immunologischen Vorgänge nach intraperitonealer Vakzinierung 61 3.3.1 Untersuchung der Infiltration in die Bauchhöhle nach der Injektion von Aluminiumhydroxid-adsorbiertem IL-2 und B16-Zellen 3.3.2 Untersuchung des Omentum majus nach der Injektion von Aluminiumhydroxid-adsorbiertem IL-2 3.4 68 Untersuchung der subkutanen Inokulationsstelle von Zytokin-Depot-Tumorvakzinen 3.4.2 65 Untersuchung der immunologischen Vorgänge nach subkutaner Immunisierung 3.4.1 61 68 Untersuchung der Zusammensetzung des zellulären Infiltrats, dass durch aus dem Depot freigesetztes IL-2 induziert wird PDF created with FinePrint pdfFactory trial version http://www.fineprint.com 77 3.4.3 Untersuchung der Phagozytose von Tumorzellfragmenten 80 3.4.4 Untersuchung der regionalen Lymphknoten nach Injektion von Tumorvakzinen, die PKH-2-markierte Tumorzellen enthalten 3.4.4.1 Verteilung von Graphit-Partikeln nach subkutaner Injektion 82 82 3.4.4.2 Durchflußzytometrischer und Fluoreszenzmikroskopischer Nachweis von Tumorzellfragmenten in Lymphozyten des Lymphknotens 83 3.4.4.3 Untersuchung der Antigen-Dichte im Lymphknoten von Mäusen nach Injektion von Zytokin-Depot-Tumorvakzinen 3.4.5 Untersuchung der Lymphozyten-Populationen im Lymphknoten nach Vakzinierung mit bestrahlten B16-Zellen und IL-2-Alu 3.4.6 3.4.7 Untersuchung der lokalen Wirkung von GM -CSF und IL-4 in Depot-Form 92 95 Untersuchung der Reaktionen im Lymphknoten nach Vakzinierung mit Tumorzellen und GM-CSF in Depot-Form 3.4.9 88 Untersuchung der Lymphozyten-Populationen im Lymphknoten nach Vakzinierung mit bestrahlten RenCa-Zellen und IL-2-Alu 3.4.8 87 106 Vergleich der lokalen Reaktion des Immunsystems auf die Injektion von Aluminiumhydroxid-adsorbiertem GM-CSF oder 108 Aluminiumhydroxid-adsorbiertem IL-2 3.4.10 Untersuchung der Aktivierung von Antigenpräsentierenden Zellen durch Zytokin-Depot-Tumorvakzinen 109 3.4.10.1 Untersuchung der Expression von MHCII- und B7-2-Molekülen in vitro 109 3.4.10.2 Untersuchung der Expression von MHCII-Molekülen in vivo 111 3.4.11 Untersuchung der Induktion von sekundären Zytokinen nach Injektion von Aluminiumhydroxid-adsorbiertem IL-2 3.5 112 Untersuchung der Effektormechanismen, die an de r Abstoßung von Tumorzellen beteiligt sind 116 3.5.1 Untersuchung der T-Lymphozyten-vermittelten Immunantwort 116 3.5.1.1 Reinigung von T-Lymphozyten 116 3.5.1.2 Adoptiver Transfer von T-Lymphozyten zur Erzeugung prophylaktischer Immunität gegen RenCa Tumore 118 3.5.1.3 In vivo Depletion von T-Lymphozyten-Subpopulation zur Charakterisierung der Immunantwort gegen RenCa -Zellen 3.5.2 Untersuchung der B-Lymphozyten-vermittelten Immunantwort 119 121 3.5.2.1 Eliminierung von T-Lymphozyten durch monoklonale Antikörper und Komplement 121 3.5.2.2 Adoptiver Transfer von B-Lymphozyten zur Erzeugung von prophylaktischer Immunität gegen RenCa Tumore PDF created with FinePrint pdfFactory trial version http://www.fineprint.com 122 3.5.2.3 Adoptiver Transfer von Immunserum zur Erzeugung von prophylaktischer Immunität gegen RenCa Tumore 4. Diskussion 4.1 Zytokine in Depot-Form als Transportmittel für Zytokine 124 zu den Lymphorganen 129 4.2 Untersuchungen zur Apoptose von bestrahlten Tumorzellen 133 4.3 Untersuchungen zur intraperitonealen Vakzinierung mit Tumorzellen und Aluminiumhydroxid-adsorbiertem IL-2 4.4 Untersuchung der Reaktionen des Immunsystems nach subkutaner Vakzinierung 4.5 141 Vergleich der Wirkung von GM-CSF-Alu mit IL-2-Alu auf das Immunsystem von Mäusen 4.8 140 Untersuchung der Wirkung von Aluminiumhydroxid -adsorbiertem GM-CSF und IL-4 auf das Immunsystem von Mäusen 4.7 136 Untersuchung der Lymphknoten nach Vakzinierung mit bestrahlten Tumorzellen und Aluminiumhydroxid-adsorbiertem IL-2 4.6 135 143 Untersuchung der IL-2-induzierten Synthese von Zytokinen durch inflammatorische Zellen 145 4.9 Untersuchung der Effektormechanismen der anti-Tumor-Immunantwort 147 5. Zusammenfassung 151 6. Literaturverzeichnis 153 PDF created with FinePrint pdfFactory trial version http://www.fineprint.com
