Tierexperimentelle Untersuchungen der Wirkung

Tierexperimentelle Untersuchungen der Wirkung
immunmodulierender Therapien von Enzephalomyelitiden auf
das Immunsystem
Dissertation zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt in der
Abt. für Medizinische Mikrobiologie/Arbeitsgruppe Prof. Falkenberg
vorgelegt von
Maike Rieks
aus
Bochum
Bochum
2002
Meinem Vater Karl-Heinz Rieks
(* 12.03.1931, † 02.07.1982 an MS),
dessen zu kurzes Leben und zu langes Sterben
mir stets Motivation und Kraftquell war;
und meiner Tochter,
Nadia Rieks
(* 27.08.1987),
die ihren Großvater nie kennenlernen durfte.
INHALTSVERZEICHNIS
Seite
A.
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
B.
Abkürzungsverzeichnis
I. EINLEITUNG
1
1. Allgemein
1
2. Zielsetzung
10
II. MATERIAL UND METHODEN
12
1. Material
12
1.1. Geräte
12
1.2. Häufig verwendete Puffer
12
1.2.1.
Hepes-Puffer Lösung
12
1.2.2.
Phosphate buffered saline (PBS)
12
1.2.3.
NH4 CL-Tris-Lyse-Puffer
13
1.2.4.
Puffer und Substrate für den Anti-Cop-AK-ELISA
13
1.2.5.
Puffer und Lösungen für die histologischen Färbungen
13
1.2.6.
Sonstige Puffer
14
1.3. Lösungen und Chemikalien
14
1.3.1.
Lösungen für die intrazelluläre Zytokin-Färbung
14
1.3.2.
Verschiedene Proteine und Peptide
15
1.3.3.
Lösungen für die TUNEL-Methode
15
1.3.4.
Verschiedene Färbelösungen
15
1.3.5.
Sonstige Lösungen und Chemikalien
15
1.4. Antikörper (-konjugate)
16
1.5. Testsysteme
18
1.6. Verbrauchsmaterialien
18
1.7. Software
18
2. Methoden
19
2.1. Durchflusszytometrie
19
2.2. Apoptotischer Zelltod
20
2.2.1.
Allgemeiner Teil
20
2.2.2.
TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) Methode
20
2.2.3.
Annexin V/Propidiumjodid Methode
21
2.3. Isolierung mononukleärer, peripherer Blutzellen mit Hilfe eines Dichtegradienten
22
2.4. Intrazelluläre Zytokinmessung
23
2.5. Bestimmung von Oberflächenmarkern
24
2.6. Messung der Konzentration löslicher Zytokinmoleküle
26
2.7. Anti-Cop-1-AK-ELISA
26
2.8. Gewinnung von Zellen, Geweben und Organen der Maus für histologische und
zellbiologische Untersuchungen
27
2.8.1.
Blutabnahme bei Mäusen
27
2.8.2.
Herstellung einer Milzzellsuspension
28
2.8.3.
Herstellung einer Suspension von Lymphknotenzellen
28
2.8.4.
Präparation des Gehirns
28
2.8.5.
Präparation des Rückenmarks
28
2.8.6.
Herstellung eines Rückenmarkshomogenats
29
2.9. Färbung von Gefrierschnitten aus Mäusehirnpräparaten
29
2.9.1.
Hämalaun/Eosin-Färbung
29
2.9.2.
Immunhistologische Färbung
30
2.10. Färbung nach Pappenheim
30
2.11. In vitro Stimulation peripherer humaner Blutzellen
31
2.12. Skala zur Bewertung der EAE-Symptome bei Mäusen
31
2.13. 3 H-Thymidin-Proliferationsassay
32
3. Statistik
33
III. PATIENTEN UND VERSUCHSTIERE
34
1. Patienten des in vitro Stimulationsversuchs mit Cop-1 – Vergleich
MS-Patienten und gesunde Probanden
34
2. Patienten der Untersuchungen während der Therapie mit Cop-1
35
3. Versuchstiere
37
IV. ERGEBNISSE
38
1. Untersuchung verschiedener Modelle der murinen experimentellen
autoimmunen Enzephalomyelitis
38
1.1. Klinische Merkmale bei an EAE erkrankten Mäusen
38
1.2. EAE bei Mäusen des Inzuchtstammes BALB/c
40
1.3. EAE bei Mäusen des Inzuchtstammes C57BL/6
42
1.4. EAE bei Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J
43
1.4.1.
EAE-Induktion mit PLP-Peptid
43
1.4.2.
EAE-Induktion mit MBP-Peptid
44
1.4.3.
EAE-Induktion mit Rückenmarkshomogenat
45
1.5. Vergleich der EAE-Modelle
46
2. Vergleich immunologischer Eigenschaften der verschiedenen Mäusestämme
47
3. Untersuchung der Wirkung von Lipo-X auf verschiedene Komponenten des
Immunsystems
3.1. Untersuchungen mit an EAE erkrankten Mäusen
3.1.1.
3.2. In vitro Versuche mit Lipo-X
55
56
Untersuchungen der Zellproliferation sowie des apoptotischen Zelltods
von Leukozyten nach Stimulation mit Lipo-X
3.2.2.
52
Ergebnisse des Therapieversuchs mit Lipo-X bei Mäusen des
Inzuchtstammes SJL/J nach Krankheitsinduktion mit MBP-Peptid
3.2.1.
50
Ergebnisse des Blindversuchs mit Lipo-X bei Mäusen des
Inzuchtstammes SJL/J nach Krankheitsinduktion mit PLP-Peptid
3.1.3.
50
Ergebnisse des Therapieversuchs mit Lipo-X bei Mäusen des
Inzuchtstammes BALB/c nach Krankheitsinduktion mit PLP-Peptid
3.1.2.
50
56
Untersuchung der Zytokinproduktion von Leukozyten nach Stimulation
mit Lipo-X
3.3. Untersuchungen der Wirkung von Lipo-X auf das Immunsystem naiver Mäuse
58
60
4. Untersuchung der Wirkung von Cop-1 auf verschiede ne Komponenten des
Immunsystems
67
4.1. In vitro Versuche mit Cop-1
67
4.1.1.
Untersuchungen des apoptotischen Zelltods nach Stimulation mit Cop-1
67
4.1.2.
Untersuchung der Zytokinproduktion von Leukozyten nach Stimulation mit Cop-1
68
4.2. Untersuchungen der Wirkung von Cop-1 auf das Immunsystem naiver Mäuse
69
4.2.1.
Untersuchungen der Wirkung von Cop-1 auf das Immunsystem von Mäusen des
Inzuchtstammes BALB/c
4.2.2.
Untersuchungen der Wirkung von Cop-1 auf das Immunsystem von Mäusen des
Inzuchtstammes C57BL/6
4.2.3.
4.3. Therapieversuche mit Cop-1 bei an EAE erkrankten Mäusen
4.4. Untersuchungen des Immunsystems von an EAE erkrankten Mäusen
81
84
86
Untersuchungen des Immunsystems bei SJL/J-Mäusen nach
EAE-Induktion mit PLP-Peptid
4.4.2.
78
Therapieversuch mit Cop-1 bei SJL/J-Mäusen nach Induktion
mit MBP 87-99 -Peptid
4.4.1.
76
Therapieversuch mit Cop-1 bei SJL/J-Mäusen nach Induktion
mit PLP 139-151 -Peptid
4.3.4.
76
Therapieversuch mit 1 mg Cop-1 bei BALB/c-Mäusen nach
Induktion mit PLP 139-151 -Peptid
4.3.3.
75
Therapieversuch mit 100 µg Cop-1 bei BALB/c-Mäusen nach Induktion
mit PLP 139-151 -Peptid
4.3.2.
71
Untersuchungen der Wirkung von Cop-1 auf das Immunsystem von Mäusen des
Inzuchtstammes SJL/J
4.3.1.
69
87
Untersuchungen des Immunsystems bei SJL/J-Mäusen nach
EAE-Induktion mit MBP-Peptid
90
4.5. Untersuchung der Wirkung von Cop-1 auf humane periphere Blutzellen
von MS-Patienten
4.5.1.
92
In vitro Stimulation humaner Leukozyten von MS-Patienten und
gesunden Probanden
4.5.1.1. Untersuchung des apoptotischen Zelltods nach in vitro Stimulation mit Cop-1
92
92
4.5.1.2. Untersuchung der Zytokin-Produktion humaner Leukozyten nach
in vitro Stimulation mit Cop-1
4.5.2.
93
Untersuchung an humanen peripheren Leukozyten von MS-Patienten
unter Cop-1-Therapie
94
4.5.2.1. Untersuchung des apoptotischen Zelltods humaner Leukozyten
unter Cop-1-Therapie
94
4.5.2.2. Untersuchung der Zytokin-Produktion humaner Leukozyten unter
Cop-1-Therapie
96
4.5.2.3. Untersuchung verschiedener Lymphozytenpopulationen und
Aktivierungsmarker unter Cop-1-Therapie
98
4.5.2.4. Vergleich der immunologischen Parameter unter Berücksichtigung
des Krankheitsverlaufs
100
V. DISKUSSION
102
1. Untersuchung verschiedener EAE-Modelle
102
2. Versuche mit Lipo-X
104
2.1. Therapieversuche mit Lipo-X
104
2.2. In vitro Versuche mit Lipo-X
105
2.3. Untersuchung der Wirkung von Lipo-X bei naiven Mäusen
106
3. Versuche mit Cop-1
107
3.1. In vitro Versuche mit Cop-1
107
3.2. Untersuchung der Wirkung von Cop-1 bei naiven Mäusen
109
3.3. Therapieversuche mit Cop-1 bei an EAE erkrankten Mäusen
109
3.4. Untersuchung der Wirkung von Cop-1 bei an EAE erkrankten Mäusen
110
3.5. Untersuchung der Wirkung von Cop-1 im Blut von MS-Patienten
112
VI. ZUSAMMENFASSUNG
114
VII. LITERATURVERZEICHNIS
117
SUMMARY
125
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF
A.
ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS
Abb.:
Titel
1
Verschiedene Verlaufsformen der Multiplen Sklerose
2
2
Pathomechanismus bei Multipler Sklerose (aus: Giovannoni 1996)
3
3
Gesunde Maus (im Vordergrund) und an EAE erkrankte SJL-Maus
(im Hintergrund)
4
Seite
38
Charakteristische Beinhaltung einer an EAE erkrankten Maus (A) und
einer gesunden Maus (B)
39
5
HE-Färbung eines Gehirnschnitts einer SJL-Maus im akuten Krankheitsschub
40
6
Darstellung des Krankheitsverlaufs von BALB/c-Mäusen, die nach
Injektion von MOG- oder MBP-Peptid an EAE erkrankten
7
Darstellung des Krankheitsverlaufs von BALB/c-Mäusen, die nach
Injektion von PLP-Peptid an EAE erkrankten
8
43
Darstellung des Krankheitsverlaufs von SJL/J-Mäusen nach Krankheitsinduktion mit PLP 139-151 -Peptid – Tier 7-13
12
43
Darstellung des Krankheitsverlaufs von SJL/J-Mäusen nach Krankheitsinduktion mit PLP 139-151 -Peptid – Tier 1-6
11
42
Darstellung des Krankheitsverlaufs von C57BL/6-Mäusen nach Krankheitsinduktion mit PLP 139-151 -Peptid
10
41
Darstellung des Krankheitsverlaufs von BALB/c-Mäusen, die nach
Injektion von PLP-Peptid (s.c.) und Pertussis Toxin (i.p.) an EAE erkrankten
9
41
44
Darstellung des Krankheitsverlaufs von SJL/J-Mäusen nach Krankheitsinduktion mit MBP-Peptid
45
13
Darstellung des Krankheitsverlaufs von SJL/J-Mäusen nach Krankheitsinduktion mit Rückenmarkshomogenat in Emulsion mit CFA
(SCH= spinal cord homogenate)
14
45
Darstellung der aus der Summe der täglichen Behinderungsgrade errechneten
Gesamtbehinderungsindizes (cumulative disease index – CDI) der einzelnen
Versuchstiere. Dargestellt sind die Einzelwerte und der Median
15
Prozentualer Anteil der T-Lymphozyten im Blut, in der Milz und in den
Lymphknoten von Mäusen verschiedener Inzuchtstämme
16
49
Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/cMäusen ohne Behandlung
19
48
Prozentualer Anteil CD8-positiver Lymphozyten im Blut, in der Milz
und in den Lymphknoten von Mäusen verschiedener Inzuchtstämme
18
48
Prozentualer Anteil der T-Helfer-Zellen im Blut, in der Milz und in den
Lymphknoten von Mäusen verschiedener Inzuchtstämme
17
46
50
Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/cMäusen, die am Tag 0 (= Tag der EAE-Induktion) erstmalig mit Lipo-X
behandelt worden waren
20
51
Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/cMäusen, die am Tag 5 nach EAE-Induktion erstmalig mit Lipo-X
behandelt worden waren
21
51
Darstellung des ‚cumulative disease index’ – CDI der Tiere der drei
Versuchsgruppen des Therapieversuchs mit Lipo-X in BALB/c-Mäusen.
Einzelwerte und Median
22
Darstellung der Krankheitsverläufe bei an EAE erkrankten Tieren, die mit
PBS behandelt worden waren
23
52
53
Darstellung der Krankheitsverläufe bei an EAE erkrankten Tieren, die mit
Lipo-X (ab Tag –9) behandelt worden waren
54
24
Darstellung des aus der Summe der täglichen Behinderungsgrade errechneten
CDI der Tiere der beiden Versuchsgruppen des Blindversuchs
25
CDI der einzelnen Versuchstiere nach Krankheitsinduktion mit MBP-Peptid
und Therapie mit Lipo-X. Einzelwerte und Median.
26
54
55
Messung des 3 H-Thymidin-Einbaus nach Inkubation von LymphknotenZellen (A) und Milz-Zellen (B) mit PLP-Peptid und Lipo-X
(Medium 1 = Kontrolle nur Kulturmedium;
Medium 2 = Kontrolle mit PLP-Peptid)
27
57
Messung des 3 H-Thymidin-Einbaus nach Inkubation von LymphknotenZellen (A) und Milz-Zellen (B) mit Con A und Lipo-X
(Medium 1 = Kontrolle nur Kulturmedium;
Medium 2 = Kontrolle mit Con A)
28
Interferon-γ Konzentration im Zellkulturüberstand von murinen peripheren
Blutzellen nach Stimulation mit Lipo-X
29
59
TNF-α Konzentration im Zellkulturüberstand von murinen peripheren
Blutzellen nach Stimulation mit Lipo-X
30
57
59
Prozentualer Anteil der T-Lymphozyten im Blut, in der Milz und der
Peritoneal (PEC)-Zellsuspension am 1., 3. und 5. Tag nach der ersten i.p.
Injektion von Lipo-X
31
60
Prozentualer Anteil der B-Lymphozyten im Blut, in der Milz und der
Peritoneal-Zellsuspension am 1., 3. und 5. Tag nach der ersten i.p.
Injektion von Lipo-X
32
Wirkung der intraperitonealen Injektion von Lipo-X auf die StreuEigenschaften der durch Peritoneal-Spülung gewonnenen Zellpopulationen
33
61
62
Ausstrich der PEC einer unbehandelten, adulten SJL-Maus, Färbung nach
Pappenheim. Einige Monozyten sind mit roten Pfeilen gekennzeichnet
63
34
Ausstrich der PEC einer adulten SJL-Maus nach intraperitonealer
Injektion von Lipo-X, Färbung nach Pappenheim.
Einige Granulozyten sind mit roten Pfeilen gekennzeichnet.
35
64
Prozentualer Anteil der Monozyten im Blut, in der Milz- und in der
Peritoneal-Zellsuspension am 1., 3. und 5. Tag nach der ersten i.p.
Injektion mit Lipo-X
36
64
Prozentualer Anteil der Granulozyten im Blut, in der Milz- und in der
Peritoneal-Zellsuspension am 1., 3. und 5. Tag nach der ersten i.p.
Injektion mit Lipo-X
37
65
Prozentualer Anteil Interferon-γ produzierender Lymphozyten im Blut, in
der Milz- und in der PEC-Zellsuspension am 1., 3. und 5. Tag nach der
ersten i.p. Injektion mit Lipo-X
38
Darstellung der Annexin V bzw. Propidiumjodid markierten Lymphozyten
nach 24-stündiger Inkubation mit Cop-1
39
67
TNF-α Konzentration im Zellkulturüberstand von murinen Milzzellen nach
Stimulation mit Cop-1
40
65
69
Prozentualer Anteil der B-Lymphozyten in dem nahe der Injektionsstelle
liegenden, inguinalen Lymphknoten von BALB/c-Mäusen nach s.c.
Injektion von 100 µg Cop-1
41
Prozentualer Anteil der B-Lymphozyten in der Milz von BALB/c-Mäusen
nach s.c. Injektion von 100 µg Cop-1
42
70
70
Prozentualer Anteil CD8-positiver Lymphozyten in dem nahe der
Injektionsstelle liegenden, inguinalen Lymphknoten von BALB/c-Mäusen
nach s.c. Injektion von 100 µg Cop-1
43
71
Prozentualer Anteil der B-Lymphozyten im Blut, in der Milz und in dem
nahe der Injektionsstelle liegenden, inguinalen Lymphknoten von
C57BL/6-Mäusen nach s.c. Injektion von 1 mg Cop-1
72
44
Prozentualer Anteil der CD8-positiven Lymphozyten im Blut, in der Milz
und in dem nahe der Injektionsstelle liegenden, inguinalen Lymphknoten
von C57BL/6-Mäusen nach s.c. Injektion von 1 mg Cop-1
45
Prozentualer Anteil IFN-γ- bzw. IL-4-produzierender Lymphozyten in
den Milzen von C57BL/6-Mäusen nach s.c. Injektion von 1 mg Cop-1
46
72
73
Prozentualer Anteil CD8-positiver Lymphozyten in den drainierenden,
inguinalen Lymphknoten von C57BL/6-Mäusen nach s.c. Injektion von
100 µg Cop-1
47
74
Gesamtanzahl der Leukozyten in den nahe der Injektionsstelle liegenden,
inguinalen Lymphknoten von C57BL/6-Mäusen nach s.c. Injektion von
100 µg Cop-1
48
74
Prozentualer Anteil Th-Zellen in den drainierenden, inguinalen
Lymphknoten von SJL/J-Mäusen nach s.c. Injektion von 100 µg Cop-1,
Einzelwerte und Median
49
Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/c-Mäusen
ohne Behandlung (Kontrollgruppe)
50
77
Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/c-Mäusen
nach Therapie mit 100 µg Cop-1 an Alu adsorbiert
52
77
Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/c-Mäusen
nach Therapie mit 100 µg Cop-1 in PBS
51
75
77
Darstellung der aus der Summe der täglichen Behinderungsgrade
errechneten CDI jedes der Tiere der drei Versuchsgruppen des
Vorversuchs mit 100 µg Cop-1.
Dargestellt sind die Einzelwerte sowie der Median.
53
78
Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/c-Mäusen
ohne Behandlung (Kontrollgruppe)
79
54
Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/cMäusen nach Behandlung mit 1 mg Cop-1/CFA am Tag –9
55
Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/cMäusen nach Behandlung mit 1 mg Cop-1/Alu am Tag –9
56
79
80
Darstellung des aus der Summe der täglichen Behinderungsgrade errechneten
CDI jedes Tieres der drei Versuchsgruppen des Therapieversuchs mit
1 mg Cop-1.
Dargestellt sind die Einzelwerte sowie der Median.
57
80
Darstellung der Krankheitsverläufe der mit Cop-1/CFA-behandelten
Versuchstiere des Inzuchtstammes SJL/J nach Krankheitsinduktion
mit PLP-Peptid
58
81
Darstellung der Krankheitsverläufe der mit Cop-1/Alu-behandelten
Versuchstiere des Inzuchtstammes SJL/J nach Krankheitsinduktion
mit PLP-Peptid
59
82
Darstellung der Krankheitsverläufe der mit Cop-1/PBS-behandelten
Versuchstiere des Inzuchtstammes SJL/J nach Krankheitsinduktion
mit PLP-Peptid
60
Darstellung der Krankheitsverläufe der unbehandelten Versuchstiere nach
Induktion der EAE mit PLP-Peptid
61
83
Darstellung der Krankheitsverläufe der unbehandelten Versuchstiere des
Inzuchtstammes SJL/J nach Induktion der EAE mit MBP-Peptid
63
83
CDI der Tiere der verschiedenen Therapiegruppen nach Induktion der
EAE in SJL/J-Mäusen mit PLP-Peptid
62
82
84
Darstellung der Krankheitsverläufe der mit Cop-1/CFA-behandelten
Versuchstiere des Inzuchtstammes SJL/J nach Induktion der EAE mit
MBP-Peptid
84
64
Darstellung der Krankheitsverläufe der mit Cop-1/Alu-behandelten
Versuchstiere des Inzuchtstammes SJL/J nach Induktion der EAE
mit MBP-Peptid
65
85
Darstellung der Krankheitsverläufe der mit Cop-1/PBS-behandelten
Versuchstiere des Inzuchtstammes SJL/J nach Induktion der EAE
mit MBP-Peptid
66
85
CDI der Tiere der verschiedenen Therapiegruppen nach Induktion einer
EAE in SJL/J-Mäusen mit MBP-Peptid. Dargestellt sind die Einzelwerte,
der Median sowie die mit dem Mann-Whitney U-Test berechneten p-Werte.
Signifikanzen sind mit * gekennzeichnet.
67
CD4/CD8-Ratio im peripheren Blut der an PLP-induzierter EAEerkrankten Tiere
68
86
87
Korrelation zwischen dem prozentualen Anteil an T-Helfer-Zellen im
peripheren Blut von an EAE erkrankten Mäusen und dem CDI jedes
einzelnen Tieres
69
88
Korrelation zwischen dem prozentualen Anteil CD8-positiver Zellen im
peripheren Blut von an EAE erkrankten Mäusen und dem CDI jedes
einzelnen Tieres. Dargestellt sind die Einzelwerte pro Versuchstier.
70
Prozentualer Anteil der NK-Zellen im peripheren Blut der an MBPinduzierter EAE erkrankten Tiere. Einzelwerte, Median und Signifikanzen.
71
90
Korrelation zwischen dem prozentualen Anteil NK-Zellen im peripheren
Blut von an EAE erkrankten Mäusen und dem CDI jedes einzelnen Tieres
72
89
91
Prozentualer Anteil apoptotischer T-Helfer-Zellen von MS-Patienten und
gesunden Probanden nach in vitro Stimulation mit Cop-1.
Einzelwerte und Median.
92
73
Im linken der beiden Diagramme ist der prozentuale Anteil IL-10
produzierender Lymphozyten nach 48-stündiger Stimulation mit Cop-1
dargestellt, im rechten Diagramm der prozentuale Anteil IL-10
produzierender T-Helfer-Zellen.
Dargestellt sind jeweils die Einzelwerte und der Median.
74
93
Prozentualer Anteil apoptotischer Lymphozyten im peripheren Blut von
MS-Patienten vor Beginn der Therapie und 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 und
48 Wochen nach Beginn der Therapie mit Cop-1.
Dargestellt sind die Einzelwerte sowie der jeweilige Median.
75
95
Prozentualer Anteil apoptotischer T-Helfer-Zellen im peripheren Blut von MSPatienten vor Beginn der Therapie und 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 und
48 Wochen nach Beginn der Therapie mit Cop-1.
Dargestellt sind die Einzelwerte sowie der jeweilige Median.
76
95
Prozentualer Anteil TNF-α-produzierender Lymphozyten aus dem peripheren
Blut von MS-Patienten vor Therapiebeginn und 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42
und 48 Wochen nach Beginn der Therapie mit Copaxone®
77
96
Prozentualer Anteil IL-4 produzierender Lymphozyten aus dem peripheren
Blut von MS-Patienten vor Therapiebeginn und 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42
und 48 Wochen nach Beginn der Therapie mit Cop-1
78
97
Prozentualer Anteil aktivierter T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut
von MS-Patienten vor Beginn der Therapie und 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42
und 48 Wochen nach Beginn der Therapie mit Cop-1
99
Tabelle
Nr.
Titel
1
Verwendete Antikörper/-Konjugate
2
Schema für die Versuchsansätze für die durchflusszytometrische
Seite
16
Charakterisierung peripherer Blutzellen von MS-Patienten und gesunden
Probanden nach intrazellulärer Zytokin-Färbung
24
3
Schema intrazelluläre Zytokinfärbung bei Mäuselymphozyten
4
Schema für die Versuchsansätze für die durchflusszytometrische
24
Charakterisierung peripherer Blutzellen sowie Milz- und Lymphknotenzellen
von Mäusen
5
Schema für die Versuchsansätze für die durchflusszytometrische
Charakterisierung peripherer Blutzellen von MS-Patienten
6
25
Skala zur Bewertung von Krankheitssymptomen bei an EAE erkrankten
Mäusen
7
25
31
Ein- und Ausschlusskriterien der offenen Phase III Therapie -Studie mit
Copaxone®
34
8
Daten der Probanden des in vitro-Stimulationsversuchs mit Cop-1
35
9
Daten der mit Copaxone® behandelten Patienten
36
10
Zusammenfassung der ‚Expanded Disability Status Scale’ (EDSS) zur
Bewertung der klinischen Symptome bei MS-Patienten nach Kurtzke.
11
12
36
Die bei Mäusen des Inzuchtstammes BALB/c eingesetzten Peptide
bzw. Proteine
40
MHC-Haplotyp der verwendeten Mäusestämme
47
B. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AICD
Activation-induced cell death
AK
Antikörper
APL
altered peptide ligand
CD
cluster of differentiation
CDI
cumulative disease index
COP-1
Copolymer-1
EAE
experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis
EDSS
expanded disability status scale
ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay
FACScan®
fluorescence activated cell analyser
FITC
Fluoreszeinisothiozyanat
FSC
forward light scatter
HE
Hämalaun-Eosin
HLA
human leucocyte antigen
Ig
Immunglobulin
IFN
Interferon
IL
Interleukin
i.p.
intraperitoneal
MBP
basisches Myelinprotein
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex
MS
Multiple Sklerose
min
Minute
MOG
Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein
PEC
peritoneal exudate cells
PBL
periphere Blutlymphozyten
PBMC
peripheral blood mononuclear cells
PBS
phosphate buffered saline
PE
Phykoerythrin
PE-Cy5
Phykoerythrin Zyanin-5
PI
Propidiumjodid
PLP
Proteolipidprotein
PT
Pertussis Toxin
RPMI
Rockwell Park Memorial Institute Medium
s.c.
subkutan
SSC
sideward light scatter
TCR
T-Zell-Rezeptor
TGF
Transforming Growth Factor
TNF
Tumor Nekrose Faktor
TUNEL
TdT-mediated dUTP nick end labeling
I. Einleitung
I. Einleitung
1. Allgemein
Der Begriff ‚Enzephalomyelitis’ beschreibt Entzündungen des zentralen Nervensystems unter
besonderer Beteiligung der die Nervenbahnen umhüllenden Myelinscheide. Die wohl bekannteste
Form der humanen Enzephalomyelitis ist die ‚Enzephalomyelitis disseminata’ (E.d.), besser bekannt
unter dem Namen ‚Multiple Sklerose’. Die Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische,
inflammatorische, demyelinisierende Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) mit bis heute
unbekannter Ätiologie. Im Rahmen der chronischen Entzündung im Bereich des ZNS kommt es zu
Autoimmunreaktionen gegen Bestandteile der die Axone umhüllenden Myelinscheide sowie gegen
verschiedene andere Proteine des ZNS. Die Begriffe ‚Enzephalomyelitis disseminata’ und ‚Multiple
Sklerose’ beschreiben bereits zwei wichtige Merkmale der Erkrankung. Zum einen die Entzündungs(= Enzephalomyelitis) und Entmarkungsherde (= Sklerose) im zentralen Nervensystem, zum anderen
das zeitlich und/oder räumlich wiederholte Auftreten dieser Entzündungsplaques (= disseminata bzw.
multiple).
Die Multiple Sklerose ist mit einer Prävalenz von 50 bis 200 Erkrankungen pro 100.000 Einwohnern
die häufigste neurologische Erkrankung junger Erwachsener in Europa und damit von besonderer
sozialer wie ökonomischer Bedeutung. Die Erstmanifestation der Erkrankung liegt meist um das 30.
Lebensjahr herum, es sind aber auch Formen der kindlichen MS bekannt. Frauen erkranken deutlich
häufiger an MS als Männer (~ im Verhältnis 2:1). Epidemiologische und genetische Studien haben
bewiesen, dass eine genetische Prädisposition die Wahrscheinlichkeit, an Multipler Sklerose zu
erkranken, deutlich erhöht (Olerup 1991, Epplen 1997, Kurtzke 2000). Neben der genetischen
Komponente, die vor allem den HLA-Typ und verschiedene immunrelevante sowie Myelin-assoziierte
Gene betrifft, scheinen aber auch Umweltfaktoren, wie virale oder bakterielle Vorerkrankungen,
Ernährungsgewohnheiten und psychosozialer Stress, zumindest bei der Auslösung der Erkrankung,
eine Rolle zu spielen. Vor allem der Zusammenhang zwischen MS und viralen bzw. bakteriellen
Erregern (z.B. über molekulare Mimikry) wurde und wird intensiv untersucht (Gran 1999, Regner
2001). Ein direkter Zusammenhang konnte aber bis heute nicht festgestellt werden.
Die MS ist eine Erkrankung mit äußerst heterogenem Verlauf, der nicht prognostisch differenziert
werden kann. In Abbildung 1 sind die häufigsten Verlaufsformen der Multiplen Sklerose dargestellt.
Es kommen jedoch auch alle Mischformen vor. Ähnlich heterogen und bis heute nicht
prognostizierbar ist die Lebenserwartung der MS-Patienten. Diese reicht von ‚normaler’
Lebenserwartung bei benignen Formen bis zum Tod durch MS nach nur wenigen Jahren (2-10) nach
Erstmanifestation der Erkrankung. Häufige Frühsymptome der Erkrankung sind Sensibilitätsstörungen
in den oberen und unteren Extremitäten, Gleichgewichtsstörungen, Optikusneuritis und Doppelbilder.
Im weiteren Verlauf der Erkrankung findet man bei vielen Patienten fortschreitende Lähmungen der
unteren, später auch der oberen Extremitäten, Blasen- und Darmstörungen, Visus- und
Augenmotalitätsstörungen, Erschöpfungszustände (Fatigue) und Spastiken.
1
schubförmiger,
vollständig remittierender
Verlauf
neurologische Defizite
neurologische Defizite
I. Einleitung
schubförmiger,
unvollständig remittierender
Verlauf
primär
chronisch progredienter
Verlauf
Zeit
neurologische Defizite
neurologische Defizite
Zeit
sekundär
chronisch progredienter
Verlauf
chronisch progredienter
Verlauf
mit Schüben
Zeit
neurologische Defizite
neurologische Defizite
Zeit
chronisch progredienter Verlauf
mit Schüben & Plateau
Zeit
Zeit
Abb. 1: Verschiedene Verlaufsformen der Multiplen Sklerose
In Abbildung 2 sind die derzeit favorisierten Pathomechanismen für die Entstehung der Multiplen
Sklerose dargestellt. Myelin- oder Glia-spezifische T-Zellen werden aufgrund bisher ungeklärter
Vorgänge in der Peripherie aktiviert und migrieren mit Hilfe von Adhäsionsmolekülen durch die BlutHirn-Schranke ins ZNS (Prat 2002). Hier werden die autoreaktiven T-Zellen durch Antigenkontakt
reaktiviert, und es kommt zur Produktion und Ausschüttung zahlreicher Zytokine. Diese ZytokinAusschüttung setzt eine ganze Kaskade von Reaktionen in Gang (Abb.2). Zum einen kommt es durch
die Ausschüttung von sogenannten proinflammatorischen Th1-typischen Zytokinen zur Aktivierung
von Effektorzellen. Diese Zellen, vor allem Makrophagen oder Mikroglia, sind in der Lage direkt die
die Nervenfasern umhüllende Myelinscheide zu zerstören. Ferner kommt es zur lokalen Sezernierung
toxischer Zytokine (TNF-α, -β), die auch direkt toxisch auf Oligodendrozyten wirken, die dann nicht
mehr in der Lage sind, die Myelinhülle neu zu bilden (Woodroofe 1995, Selmaj 1991). Zum anderen
führt die Sezernierung von sogenannten antiinflammatorischen Th2-typischen Zytokinen, wie IL-4
und IL-5, zur Aktivierung von B-Zellen, die wiederum Myelin-spezifische Antikörper produzieren.
Diese Antikörper bewirken über Komplementaktivierungs- und Opsonierungsprozesse die weitere
2
I. Einleitung
Zerstörung der Myelinscheide (Archelos 2000). Die im ZNS aufgrund der beschriebenen
Entzündungsreaktionen produzierten Zytokine bewirken wiederum die Aktivierung der Endothelzellen
der Blut-Hirn-Schranke, was zur vermehrten Expression von Adhäsionsmolekülen auf der Oberfläche
der Endothelzellen führt. Dies wiederum erleichtert die Migration aktivierter T-Zellen aus der
Peripherie ins ZNS. Seabrook konnte 1998 zeigen, dass die in der Zerebrospinal-Flüssigkeit (Liquor
cerebrospinalis; CSF) befindlichen Lymphozyten tatsächlich Teil des normalen, rezirkulierenden
Lymphozyten-Pools sind (Seabrook 1998).
Abb. 2: Pathomechanismus bei Multipler Sklerose (aus: Giovannoni 1996)
3
I. Einleitung
Im weiteren Verlauf der Erkrankung kommt es durch die fortschreitende Zerstörung der
Myelinscheide und die Aufnahme der Myelinfragmente u.a. durch Makrophagen zum sogenannten
‚Epitope spreading’ (McRae 1995, Vanderlugt 2000). ‚Epitope spreading’ bedeutet, dass im Laufe der
Entzündungsreaktion zu den ursprünglich wenigen Ziel-Antigenen immer neue hinzukommen.
Ein häufig verwendetes Tiermodell für die MS ist die experimentelle ‚autoimmune’ oder ‚allergische’
Enzephalomyelitis (EAE), die durch die Injektion von ZNS-Antigenen in Tiere verschiedener Spezies
ausgelöst werden kann. Bereits 1933 hat Thomas Rivers in Affen mit bis zu 85 Injektionen eines
Extraktes aus Kaninchenhirn eine entzündliche Erkrankung im Gehirn der Versuchstiere ausgelöst.
Dies war die Geburtsstunde der experimentell allergischen Enzephalomyelitis (Rivers 1933). 1947
wurde erstmals eine EAE mit nur einer einzigen Injektion von Gehirngewebe in Freund’schem
Adjuvans ausgelöst. In den 80er Jahren setzte sich dann aufgrund des hinzugewonnenen Wissens um
zelluläre Immunologie der Begriff der ‚autoimmunen’ statt der ‚allergischen’ Enzephalomyelitis
durch. In letzter Zeit wird allerdings wieder diskutiert, ob bei einigen EAE-Modellen nicht doch
Antikörper-vermittelte Prozesse eine entscheidende Bedeutung haben (Weiner 2001).
Am häufigsten wird die EAE in Nagern, vor allem in Mäusen und Ratten, aber auch in
Meerschweinchen sowie in nicht-humanen Primaten (Marmoset-Äffchen Callithrix jacchus)
untersucht (Wekerle 1994, Genain 2001, McFarland 2001). Abhängig von der Spezies und dem zur
Krankheitsinduktion eingesetzten Antigen lassen sich unterschiedliche Krankheitsverläufe in den
Versuchstieren erzeugen.
Zu den zur Induktion der EAE eingesetzten Autoantigenen gehören das Myelin basische Protein
(MBP), das Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG), das Proteolipid Protein (PLP), Myelinassoziiertes Glykoprotein (MAG), Myelin-assoziiertes Oligodendrozyten basisches Protein (MOBP)
sowie S-100 (Wekerle 1994, Holz 2000). Die verschiedenen EAE-Modelle unterscheiden sich sowohl
bezüglich ihres symptomatischen Verlaufs als auch immunpathologisch. Die Heterogenität der EAEModelle spiegelt recht gut die ebenfalls sehr heterogenen Krankheitsverläufe bei der Multiplen
Sklerose wieder (siehe Abb.1). Es gibt jedoch kein einzelnes EAE-Modell, das wirklich der MS
entspricht.
In Zell-Transfer-Versuchen konnte durch Transfer von T-Lymphozyten, die gegen die oben genannten
Autoantigene gerichtet waren, EAE in gesunden Versuchstieren ausgelöst werden (Friedman 1992).
Weitergehende Untersuchungen haben gezeigt, dass die Injektion von Zellen autoreaktiver T-HelferZell-Klone, die spezifisch für die oben genannten Antigene sind und die T-Helfer 1 (Th1) typische
Zytokine sezernieren, im Versuchstier eine EAE auslöste, wohingegen die Injektion von Zellen eines
autoreaktiven Th-Zell-Klons derselben Spezifität, die Th2 typische Zytokine sezernieren, nicht zur
Auslösung der EAE führte (Ando 1989, Martin 1995). Durch vorausgehende Immunisierung mit
Zellen eines dieser Th2-Zell-Klone konnte die anschließende Auslösung einer EAE durch Injektion
von Zellen eines T-Zell-Klons derselben Spezifität, aber des Th1-Typs, verhindert werden (Martin
1995).
4
I. Einleitung
Dies deutet darauf hin, dass proinflammatorische Zytokine vom Th1-Typ, dazu gehören Interferon γ
(IFNγ), Interleukin-2 (IL-2) und Tumor Nekrose Faktor α (TNFα), sowie antiinflammatorische
Zytokine vom Th2-Typ (IL-4, IL-5, IL-10, Transforming Growth Factor β) eine wichtige Rolle in der
Pathogenese und im Verlauf einer EAE und damit wahrscheinlich auch bei der MS spielen.
In diesem Zusammenhang wird die vermehrte Produktion von Zytokinen des Th1-Typs eher als
ungünstig für den Krankheitsverlauf angesehen, die von Zytokinen des Th2-Typs eher als günstig.
Eine eindeutige Einteilung in ‚gute’ (Th2-) und ‚schlechte’ (Th1-typische Zytokine) ist aber sicherlich
nicht möglich (Martin 1998).
Zytokine wirken sowohl autokrin als auch parakrin, d.h. Th1-typische Zytokine stimulieren einerseits
die Produktion von weiteren Th1-Zytokinen und hemmen andererseits die Produktion von Th2typischen Zytokinen. Diese reziproken Regulationsmechanismen gibt es ebenfalls bei Th2-typischen
Zytokinen (Maggi 1992). Auf diese Art und Weise verändern Zytokine über die direkte Wirkung auf
einzelne Zellen hinaus das Mikromilieu der Zellen und beeinflussen so auch indirekt die
Immunantwort (O’Garra 1998).
In verschiedenen Studien wurden Zytokine bezüglich ihrer Eignung als Marker von
Krankheitsaktivität und zur Prognose von Krankheitsschüben bei der MS untersucht (Maimone 1991,
Rieckmann 1995). Zytokine des Th1-Typs fördern vor allem die T-zelluläre Immunantwort,
wohingegen Zytokine des Th2-Typs verstärkt die B-zelluläre und damit humorale Immunantwort
stimulieren. Es konnte gezeigt werden, dass die Konzentration von proinflammatorischen Zytokinen
im Blut vor Beginn bzw. während eines Krankheitsschubes und die Konzentration von
antiinflammatorischen Zytokinen im Blut im bzw. nach einem Schub erhöht ist (Chofflon 1992,
Correale 1995). Ähnliche Befunde ergaben sich jedoch auch im Rahmen von Infekten, so dass die
Untersuchung von Zytokinen zwar möglicherweise zur Therapiekontrolle geeignet ist, aber für
prognostische Aussagen zu unspezifisch zu sein scheint.
Die während eines akuten Schubes bei der MS bzw. der EAE ablaufende Entzündungsreaktion wird
durch verschiedene Mechanismen reguliert. Einer der in diesem Zusammenhang diskutierten Prozesse
ist der apoptotische Zelltod von an der Entzündungsreaktion beteiligten Leukozyten (Tan 1994).
Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass autoreaktive T-Lymphozyten im ZNS nach
Abflauen des Entzündungsprozesses eines apoptotischen Zelltodes sterben. 30-50 Prozent der TZellen in einer Läsion von an EAE erkrankten Tieren sind in der Phase der Remission apoptotisch
(Bauer 1999). Michael Pender postulierte 1998, dass die MS die Folge des genetisch bedingten
Fehlens des ‚activation-induced cell death’ (AICD) bei autoreaktiven T-Zellen ist (Pender 1998).
Viele Jahre lang galt die immunsuppressive Therapie der MS mit Substanzen wie Azathioprin,
Cyclosporin-A oder Cyclophosphamid als wichtigste Behandlungsstrategie. Auch die LangzeitTherapie mit Kortikosteroiden war üblich. Heute werden Kortikosteroide in erster Linie zur
Behandlung des akuten Krankheitsschubes kurzfristig in hohen Dosierungen eingesetzt. In den letzten
Jahren hat sich immer mehr die Erkenntnis durchgesetzt, dass eine Therapie mit immunmodulierenden
5
I. Einleitung
Substanzen, wie Interferon-β, Cop-1 oder intravenösen Immunglobulinen vielversprechendere
Resultate zeigt. Die genauen Wirkungen dieser Substanzen scheinen jedoch sehr komplex zu sein und
sind bis heute nur unzureichend bekannt.
Mit den derzeit zur Therapie der MS zur Verfügung stehenden Substanzen kann die MS nicht geheilt
werden. Sie bieten dennoch die Möglichkeit, die Krankheitsverläufe bei vielen Patienten
abzuschwächen und sie damit deutlich länger in einer Phase mit hoher Lebensqualität zu halten
(Martin 2001).
Lipo-X
Bei dem in dieser Arbeit verwendeten Lipo-X handelt es sich um ein Liponsäurederivat, dessen
genaue Struktur aus patentrechtlichen Gründen hier nicht genannt werden darf. Liponsäure wurde
1953 von Reed und Gunsalus erstmalig in kristalliner Form aus Leberextrakten gewonnen. Sie besteht
aus acht Kohlenstoff-Atomen und wirkt als eines der Koenzyme bei der oxidativen Dekarboxylierung
von Pyruvat und anderen α-Ketosäuren im Zitronensäurezyklus. α-Liponsäure, ein Lipoamid, ist ein
wesentlicher Bestandteil biologischer Membranen und ein wichtiger Kofaktor der mitochondrialen
Dehydrogenase. In Säugetierzellen wird α-Liponsäure leicht in die reduzierte Form, die
Dihydroliponsäure, konvertiert. Beide, α- und Dihydroliponsäure, haben in vitro und in vivo
antioxidative Wirkung (Sen 1996). Ein wichtiger Effekt der Liponsäurederivate ist der Anstieg der
intrazellulären Konzentration von Glutathion (Busse 1992). Ferner werden freie Sauerstoffradikale,
die an der Pathogenese zahlreicher Erkrankungen beteiligt sind, von Liponsäurederivaten neutralisiert.
Seid einigen Jahren wird die Wirkung von Liponsäurederivaten auf verschiedene Komponenten des
Immunsystems genauer untersucht. Über die Redox-Regulation des Transkriptionsfaktors Nuclear
Factor-kappa B (NF-κB) wirkt α-Liponsäure auf die Signaltransduktion und Expression
immunrelevanter Gene (Suzuki 1995). Die orale Gabe von Liponsäure führt in immunsuppremierten
Mäusen zur Wiederherstellung sowohl der Antikörper-vermittelten Immunantwort als auch der THelfer Zell-Aktivität (Ohmori 1986).
α-Liponsäure wird seid einigen Jahren erfolgreich in der Therapie von Patienten eingesetzt, die an
diabetischer peripherer Neuropathie erkrankt sind (Ziegler 1997, Biewenga 1997). Weiterhin scheint
die Therapie mit α-Liponsäure bzw. Liponsäurederivaten bei verschiedenen Erkrankungen, bei denen
oxidative Schädigungen eine entscheidende Rolle spielen, recht effektiv zu wirken. Hierzu gehören
neben Diabetes auch neurodegenerative Erkrankungen und HIV-Infektionen (Packer 1997, Baur
1991).
Auch bei der Multiplen Sklerose und der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis spielen
Sauerstoffradikale eine wichtige Rolle (siehe Abbildung 2). Sie sind sowohl direkt an der Zerstörung
der Myelinscheide beteiligt als auch indirekt an der Aktivierung von Makrophagen, die dann
wiederum an der Zerstörung der Myelinscheide mitwirken können (Van der Goes 1998). Auch die
Wirkung der Blut-Hirn-Schranke wird durch Sauerstoffradikale beeinträchtigt und damit durchlässiger
6
I. Einleitung
für die Passage von aktivierten T-Lymphozyten (Rubanyi 1988). Erste in vitro-Untersuchungen haben
gezeigt, dass diese Wirkung von Sauerstoffradikalen auf Myelinbestandteile und die Aktivität von
Makrophagen durch die Gabe von Liponsäurederivaten inhibiert werden kann (Van der Goes 1998).
Außerdem wird die Konzentration von intrazellulärem Glutathion, einem der wichtigsten
Antioxidantien im menschlichen Gehirn, von Liponsäurederivaten beeinflusst und deren Wirkung
verstärkt (Busse 1992). Die supprimierende Wirkung von Liponsäure auf NF-κB und damit indirekt
auf die durch NF-κB kontrollierten Gene lässt ebenfalls eine Therapie mit Liponsäurederivaten bei an
EAE erkrankten Tieren sinnvoll erscheinen. Nach Krankheitsinduktion mit MOG wurde in NF-κBdefizienten Mäusen ein signifikant leichterer Verlauf der EAE und eine geringere
Entzündungsaktivität im ZNS beobachtet als bei den entsprechenden Wildtyp-Mäusen (Hilliard 1999).
Copolymer-1
Die Geschichte von Copolymer-1 (Cop-1) begann im Jahre 1968 am Weizmann-Institut of Science
(Rehovot, Israel) (Teitelbaum 1971). Ruth Arnon, Dvora Teitelbaum und Michael Sela versuchten mit
Hilfe verschiedener synthetischer Copolymere, die in ihrer Aminosäuresequenz dem MBP ähnelten,
eine EAE in Versuchstieren auszulösen. Allerdings war keines der eingesetzten Copolymere dazu in
der Lage, aber einige und dazu gehörte auch das Copolymer Nr.1, vermochten überraschenderweise
die Induktion einer EAE in den Versuchstieren nach Injektion von MBP zu inhibieren. 27 Jahre später
(1995) wurde Cop-1 unter dem Namen Copaxone® in den USA als Therapeutikum der schubförmig
verlaufenden MS zugelassen. Seit dem Jahr 2001 ist Copaxone® endlich auch in Deutschland zur
Behandlung der MS freigegeben. Copolymer-1 (Cop-1), auch unterm dem Namen Glatiramerazetat
bekannt, ist ein Gemisch aus Polypeptiden, die aus 4 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren in
zufälliger Abfolge synthetisiert werden. Zur Synthese werden folgende Aminosäuren in dem
prozentualen Verhältnis eingesetzt, in dem sie im MBP vorliegen: L-Glutamin 14,1 %, L-Tyrosin 9,5
%, L-Alanin 42,7 % und L-Lysin 33,8 %. Cop-1 besteht also aus einem Gemisch hochpolarer,
hydrophiler Moleküle mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen 4.700 und 13.000 Dalton.
Zur Injektion wird Cop-1 als steriles, lyophilisiertes Pulver angeboten, das pro 20 mg Ampulle
zusätzlich 40 mg Mannitol enthält. Zum Gebrauch wird es in 1 ml Aqua ad injectabile aufgelöst und
täglich einmal subkutan injiziert.
Verschiedene klinische Studien mit Cop-1 als Therapeutikum bei schubförmiger MS haben eine
positive Wirkung von Cop-1 auf die Schubhäufigkeit und Krankheitsprogredienz gezeigt (Johnson
1995 und 1998). Diese Verbesserungen sind bei Patienten mit geringer Behinderung besonders
deutlich. MS-Patienten mit chronisch-progredientem Krankheitsverlauf profitieren nicht in diesem
Maße von einer Cop-1 Therapie (Pöhlau 1996).
Generell wird Copaxone® eine sehr gute Verträglichkeit bescheinigt (Korczyn 1996). Die häufigsten
unerwünschten Arzneimittelreaktionen sind vorübergehende Hautreaktionen an der Injektionsstelle
wie Rötung, Schwellung, Juckreiz, Verhärtung und leichte Schmerzen. Gelegentlich kommt es,
7
I. Einleitung
vermutlich durch versehentliche intravenöse Injektion in kleine Hautvenen, zu systemischen
Postinjektionsreaktionen wie Flush, Dyspnoe und Engegefühl in der Brust.
Die Mechanismen, über die Cop-1 wirkt, sind nur zum Teil bekannt. Im Tierversuch zeigte sich, dass
Cop-1 als MBP-Analogon keine enzephalitogene Wirkung besitzt, mit Cop-1 also keine EAE im
Versuchstier ausgelöst werden kann (Teitelbaum 1997). Bei mit Cop-1 vorbehandelten Tieren (Mäuse,
Ratten, bis zu Primaten) führte die Injektion von MBP oder anderen enzephalitogenen Substanzen
nicht mehr zur Auslösung einer EAE (Teitelbaum 1997). Diese Resistenz konnte durch den Transfer
von T-Zellen aus den Lymphknoten der mit Cop-1 behandelten Mäuse auf naive Mäuse übertragen
werden, was auf die Übertragung suppressorisch wirkender T-Zellen schließen lässt (Teitelbaum
1997).
Auch die orale Gabe von Cop-1 führt bei Versuchstieren zu erhöhter Resistenz gegen die Induktion
einer EAE (Weiner 1999, Teitelbaum 1999). Diese Ergebnisse werden derzeit in Studien mit MSPatienten überprüft.
Studien haben gezeigt, dass Cop-1-Moleküle mit MBP (einem der möglichen Autoantigene bei der
MS) um die Bindung an das MHC II-Molekül konkurrieren, wobei Cop-1 offenbar MBP viel leichter
aus der MHC-Bindung verdrängt als umgekehrt (Teitelbaum 1992, Racke 1992). Eine der
Antigenpräsentation vorausgehende Phagozytose und Prozessierung durch Antigen präsentierende
Zellen ist, wie eine Untersuchung gezeigt hat, weder bei Cop-1 noch bei MBP notwendig (FridkisHareli 1994). Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass monoklonale Antikörper gegen MBP
auch mit Cop-1 kreuzreagieren (Teitelbaum 1991) und dass Cop-1 spezifische T-Zellen des Th2-Typs
mit MBP kreuzreagieren und eine EAE supprimieren können (Aharoni 1997). Man nimmt an, dass
Cop-1 im Komplex mit MHC von MBP-spezifischen autoreaktiven T-Zellen erkannt wird (FridkisHareli 1994). Aufgrund der vergleichsweise geringen Größe der Cop-1-Moleküle scheint diese
Bindung jedoch keine Aktivierung, sondern möglicherweise einen Zellzyklus-Arrest oder die
Apoptose dieser autoreaktiven T-Zellen zu bewirken.
Weitere tierexperimentelle Untersuchungen haben gezeigt, dass die Immunisierung mit Cop-1 durch
die verstärkte Produktion von Zytokinen des Th2-Typs immunmodulierend wirkt. Diese sind in der
Lage Entzündungsreaktionen abzuschwächen bzw. zu beenden. Im Tiermodell bewirkt Cop-1 damit
ähnliche Veränderungen wie sogenannte ‚altered peptid ligands’ (APL). Dies sind Peptide von
Autoantigenen (z.B. PLP-Peptid), die aufgrund des Austausches einer einzigen Aminosäure keine
enzephalitogene Wirkung mehr haben und die nicht mehr die Produktion von Th1-typischen
Zytokinen stimulieren, sondern die Produktion Th2-typischer Zytokine anregen und im Tiermodell die
Auslösung eine EAE verhindern können.
Der sogenannte Th2-Shift bewirkt gleichzeitig eine Stimulation der Antikörperproduktion im
Versuchstier. Die Tatsache, dass 100 % aller mit Cop-1 behandelten Patienten im Laufe der
Behandlung Antikörper gegen Cop-1 produzieren, scheint sich nicht negativ, möglicherweise sogar
positiv auf den Krankheitsverlauf auszuwirken. Eine im Verlauf der Behandlung verstärkte Produktion
von anti-Cop-1-Antikörpern kann Folge des ‘Th2-Shifts’ sein, der u. a. zu einer Steigerung der
8
I. Einleitung
humoralen Immunantwort führt. Die erhöhte Konzentration von spezifischen gegen Cop-1 gerichteten
Antikörpern kann somit Zeichen einer Immunmodulation infolge der Cop-1 Therapie sein (Brenner
2001). Auf diese Weise ist die verstärkte Produktion von gegen Cop-1 gerichteten Antikörpern als
möglicher Indikator für ein Ansprechen der Therapie mit Cop-1 zu sehen. Es ist allerdings auch
vorstellbar, dass gegen Cop-1 gerichtete Antikörper einen direkten Einfluss auf die Wirksamkeit von
Cop-1 haben. So könnte durch die Bindung von Cop-1 an spezifische Antikörper zu AntigenAntikörper-Komplexen der natürliche Abbau von Cop-1 vermindert werden. Die Cop-1-AntikörperKomplexe würden somit eine Art Depot darstellen.
9
I. Einleitung
2. Zielsetzung
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die bis heute nur unzureichende Therapie von Patienten mit
Multipler Sklerose zu verbessern. Hierzu sollten in tierexperimentellen Versuchen die Wirkung von
zwei verschiedene Therapieformen auf das Immunsystem untersucht werden. Als Grundlage für
weitere Untersuchungen sollte in der vorliegenden Arbeit daher zunächst versucht werden, mit Hilfe
verschiedener Agenzien experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in Mäusen zu induzieren. Da
aus der Literatur bekannt ist, dass der Krankheitsverlauf bei den verschiedenen EAE-Modellen,
abhängig vom eingesetzten Mäusestamm und der zur Krankheitsinduktion verwandten Substanz, sehr
unterschiedlich sein kann, erschien es sinnvoll, mehrere Modelle zu etablieren. Mit Hilfe solcher EAEModelle sollte es dann möglich sein, die Wirkmechanismen verschie dener, bei Patienten angewandter
Therapieformen zu untersuchen.
Bei Lipo-X handelt es sich um ein Liponsäurederivat, dessen Wirkung auf die EAE bzw. MS bisher
noch nicht untersucht wurde. Die Ergebnisse einiger Untersuchungen deuten daraufhin, dass
Liponsäurederivate möglicherweise zur Behandlung der Multiplen Sklerose und der experimentellen
autoimmunen Enzephalomyelitis geeignet sein könnten. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es
daher, zunächst die Wirksamkeit von Lipo-X bei der Behandlung von an EAE erkrankten Mäusen zu
untersuchen. Nach Möglichkeit sollten diese Versuche mit unterschiedlichen EAE-Modellen
durchgeführt werden. Falls die Therapieversuche mit Lipo-X eine Verbesserung des
Krankheitsverlaufs oder eine schlechtere Induzierbarkeit der Erkrankung in Mäusen ergeben, sollte in
weiteren Versuchen die Wirkungsweise von Lipo-X genauer untersucht werden. Sowohl mit Hilfe von
in vitro- als auch in vivo-Untersuchungen sollte die Wirkung von Lipo-X auf zelluläre wie auf
humorale Komponenten des Immunsystems analysiert werden. Hierbei sollte das Hauptaugenmerk auf
mögliche Veränderungen der an der Immunantwort beteiligten Zellpopulationen sowie auf eine
mögliche Beeinflussung des Zytokin-Netzwerks gelegt werden.
Die klinische Wirksamkeit von Cop-1 bei der Behandlung der MS ist bewiesen. Jedoch führt die
Therapie mit Copaxone® nicht bei jedem individuellen Patienten zu einer Besserung der
Krankheitssymptomatik. Um eine Subtypisierung der Patienten, bezogen auf das Ansprechen auf die
Therapie mit Copaxone®, zu ermöglichen, müssten die während der Behandlung mit Cop-1
ablaufenden Vorgänge besser bekannt sein. Im Rahmen der im folgenden näher beschriebenen
Versuche sollten die bis heute nur unzulänglich verstandenen Wirkmechanismen von Cop-1
untersucht werden und mit Hilfe einer neuen Applikationstechnik versucht werden, Ansätze zur
Therapieverbesserung zu schaffen. Neben in vitro-Untersuchungen sollte zur Aufklärung der Wirkung
von Cop-1 auf das Immunsystem auch begleitende Untersuchungen von peripheren Blutzellen
während der Therapie mit Cop-1 bei an EAE erkrankten Mäusen sowie MS-Patienten durchgeführt
werden. Von speziellem Interesse ist die Wirkung von Cop-1 auf das Zytokin-Netzwerk. In diesem
10
I. Einleitung
Zusammenhang sollte die Wirkung der Behandlung mit Cop-1 auf die Produktion der verschiedenen
proinflammatorisch (z.B. INF-γ, IL-2, TNF-α) bzw. antiinflammatorisch wirkenden Zytokine (z.B.
IL-4, IL-10) untersucht werden.
Die Produktion von Antikörpern wird in starkem Maße von Zytokinen beeinflusst; vor allem die
Zytokine des Th2-Typs stimulieren Plasmazellen zur verstärkten Antikörper-Sezernierung. Da die
Entstehung von Cop-1-spezifischen Antikörpern nach heutigem Wissensstand keine negativen,
möglicherweise sogar positive Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf hat, könnte die Produktion
von gegen Cop-1 gerichteten Antikörpern evtl. in Abhängigkeit von der Klassen- bzw. SubklassenZugehörigkeit eine wichtige Funktion im Rahmen der immunologischen Wirkung von Cop-1 haben.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, die Entstehung von gegen Cop-1 gerichteten
Antikörpern während der Behandlung mit Cop-1 zu verfolgen und, wenn möglich, mit der
Wirksamkeit der Therapie zu korrelieren. Für die Bestimmung der gegen Cop-1 gerichteten
Antikörper muss ein ELISA-Testsystem entwickelt werden.
Nach den derzeit gültigen Vorstellungen zur Wirksamkeit von Cop-1 wird in autoreaktiven T-Zellen,
die spezifisch mit enzephalitogenen Substanzen wie MBP reagieren, durch die Bindung von Cop-1 im
Komplex mit MHC möglicherweise der Prozess eines ‚activation-induced cell death’ (AICD)
ausgelöst, und der apoptotische Zelltod eingeleitet. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit ist daher die
Aufklärung der Frage, ob es infolge der Therapie bzw. der Stimulation mit Cop-1 zu verstärktem
apoptotischen Zelltod bei Lymphozyten kommt. Von der Annahme ausgehend, dass in diesem
Zusammenhang die Apoptose in Lymphozyten über den Prozess des AICD ausgelöst wird, erscheint
es interessant, die Aktivierung von Lymphozyten vor und während der Cop-1-Therapie zu
untersuchen.
Zusammengefasst sind die wesentlichen Ziele der vorliegenden Arbeit zum einen die Etablierung von
für weitere Untersuchungen geeigneten Tiermodellen für entzündliche ZNS-Erkrankungen
(Enzephalomyelitiden), zum anderen die Untersuchung der Wirkungsweise eines bereits bekannten
Therapeutikums sowie der Versuch ein neue Substanz zur Behandlung von Enzephalomyelitiden auf
seine Wirksamkeit zu überprüfen.
11
II. Material und Methoden
II. Material und Methoden
1. Material
1.1. Geräte
Minifuge RF
Heraeus
Sterilbank Laminair Typ HB 2460
Heraeus
Zeiss Mikroskop Standard
Carl Zeiss, Oberkochen
Neubauer Zählkammer
Brand
CO2 -Begasungsbrutschrank B 5060 EK CO2
Heraeus
FACScan
Becton Dickinson
ELISA-Reader Millenia Kinetic Analyzer
Molecular Devices
ELISA-Photometer EAR 400 AT
SLT
Zentrifuge 5402, F45-18-11
Eppendorf
Kryostat HM 560
Microm
Fluoreszenzmikroskop Eclipse E600
Nikon
Digitalkamera DXM 1200
Nikon
Wallac Microbeta beta-counter
Wallac
1.2. Häufig verwendete Puffer
1.2.1. Hepes-Puffer Lösung:
- HEPES (10 mM)
Sigma-Aldrich
- NaCl (150 mM)
Merck
- CaCl2 (2,4 mM)
Merck
- KCl (5 mM)
Merck
- MgCl2 (1mM)
Merck
1.2.2. Phosphate buffered saline (PBS):
Eine 20fach konzentrierte Stammlösung wird wie folgt hergestellt:
3 M NaCl
0,04 M KH2 PO4
0,2 M Na2 HPO4 x 2 H2 O
werden mit A. bidest auf 1000 ml aufgefüllt.
Der pH-Wert der Gebrauchslösung (Stammlösung 1:20 verdünnt) liegt bei 7,4.
12
II. Material und Methoden
1.2.3. NH4 Cl-Tris-Lyse-Puffer:
Lösung I : 20,594 g Tris in 1l A. bidest lösen,
mit 1N HCl auf pH 7,65 einstellen,
Lösung II: 8,3 g NH4 Cl in 1l A. bidest lösen,
9 Teile der Lösung II und 1 Teil der Lösung I mischen, falls notwendig den pH auf 7,2
nachstellen.
1.2.4. Puffer und Substrate für den Anti-Cop-AK-ELISA:
a) Beschichtungspuffer (0,05 M Bicarbonatpuffer):
Lösung A: 5,3 g/l NaHCO3 (0,05 M)
Lösung B: 4,2 g/l Na2 CO3 (0,05 M)
Lösung A wird vorgelegt, durch Titration mit Lösung B wird ein pH von 9,5 eingestellt.
b) Waschpuffer:
PBS mit 0,05% (W/V) Tween 20
c) Nachbeschichtungspuffer:
Waschpuffer mit 1 % (W/V) Magermilchpulver
d) Substratpuffer (0,05 M Citratpuffer, pH 5,0):
0,5 g / 50 ml C6 H8 O7 x 1 H2 O (0,05 M)
0,9 g / 100 ml NaH2 PO4 x 2 H2 O (0,05 M)
Der pH-Wert wird mit 1 N NaOH auf 5,0 einstellt.
e) Substratlösung:
Zur Herstellung der Substratlösung für POD – konjugierte Antikörper werden
0,8 mg/ml Urea Hydrogen Peroxid
0,8 mg/ml ortho-Phenylendiamin Dihydrochlorid (OPD)
unmittelbar vor dem Auftragen in Substratpuffer gelöst.
1.2.5. Puffer und Lösungen für die histologischen Färbungen
a. Färbelösung zur Markierung toter Zellen:
5 % Trypanblau – Gebrauchslösung in PBS
13
II. Material und Methoden
b. Hämalaun/Eosin-Färbung:
Mayers Hämalaun
Merck
Eosin-Lösung:
0,5 % (w/v) Eosin
Merck
0,1 % Essigsäure
1.2.6. Sonstige Puffer
Hanks balanced salt solution (HBSS) - Pufferlösung:
HBSS (Nr. H-4891)
Sigma-Aldrich
NaHCO3 (350 mg/l)
Sigma-Aldrich
1.3. Lösungen und Chemikalien
1.3.1. Lösungen für die intrazelluläre Zytokin-Färbung
- Fixativ-Lösung für die intrazelluläre Zytokin-Färbung:
1 % Paraformaldehyd in HBSS-Pufferlösung
Hölzel Diagnostics
- Permeabilisierungs-Lösung für die intrazelluläre Zytokin-Färbung:
1 % Saponin-Lösung in HBSS-Puffer
Hölzel Diagnostics
- Cytofix/Cytoperm®
BD/PharMingen
- Perm/Wash®
BD/PharMingen
- Dimethylformamid (DMF)
Sigma-Aldrich
- Phorbol-12-Myristat-13-Azetat (PMA) (in DMF gelöst; Endkonzentration: 10 ng/ml)
Sigma-Aldrich
- Ionomyzin (in DMF gelöst; Endkonzentration:1 µM)
Sigma-Aldrich
- Monensin (in DMF gelöst; Endkonzentration: 3 µM)
Sigma-Aldrich
- Brefeldin A (in DMSO gelöst; Endkonz.: 10 µg/ml)
Sigma-Aldrich
Tiefgefrorene Aliquots von PMA, Ionomyzin, Monensin (in DMF) oder Brefeldin A (in DMSO)
werden unmittelbar vor dem Gebrauch mit Kulturmedium (ohne PBS) 1:10 verdünnt, so dass die o.g.
Endkonzentrationen erreicht wird.
14
II. Material und Methoden
1.3.2. Verschiedene Proteine und Peptide
- Rinderserumalbumin (BSA; Nr. A-9306)
Sigma-Aldrich
- Basisches Myelinprotein (MBP), bovine (M-1891)
Sigma-Aldrich
- MBP 87-99 Peptid, bovine (H-1964)
Sigma-Aldrich
- Copaxone (Copolymer-1, Glatiramerazetat)
Gry Pharma/Teva
- Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG)
35-55 Peptid, rat/mouse
Sigma-Aldrich
- Proteolipidprotein (PLP) 139-151 Peptid ‚serine‘
HSLGKWLGHPDKF
Biosource Int.
- Humanes rekombinantes IL-2
Chiron
- Concanavalin A
Sigma-Aldrich
1.3.3. Lösungen für die TUNEL-Methode
- Permeabilisierungs-Lösung für die TUNEL-Methode:
0,1% Triton X-100 in 0,1 % Natriumcitrat
Sigma-Aldrich
- Fixierungs-Lösung für die TUNEL-Methode:
4% Paraformaldehyd in PBS, pH 7,4
Sigma-Aldrich
1.3.4. Verschiedene Färbelösungen
- Trypanblau (Nr. 15250-012)
Gibco BRL/Life Technologies
- May-Grünwald-Lösung
Merck
(eosinsaures Methylenblau in Methanol/Glycerin 2:1)
- Giemsa-Lösung (Stammlösung)
Merck
(Azur II sowie eosinsaures Azur II in Methanol/Glycerin 1:1)
- Giemsa-Gebrauchslösung (1/2 h verwendbar)
1:40 mit A.bidest verdünnt
1.3.5. Sonstige Lösungen und Chemikalien
- Zellkulturmedium:
- RPMI 1640 (Nr. 21875-035)
Gibco BRL/Life Technologies
- 5-10 % foetales Rinderserum (FBS bzw. FCS )
Gibco BRL/Life Technologies
15
II. Material und Methoden
- Ficoll Separating Solution; Dichte 1,077 g/ml
Biochrom
- Magermilchpulver
Humana
- Aluminiumhydroxid (Rehydra-Gel HPA)
Reheis Inc.
- Heparin (Liquemin® N7500)
Hoffmann-La Roche
- Komplettes Freund’sches Adjuvans (CFA)
mit 0,05% Mycobacterium butyricum
Difco
- Pertussis Toxin (PT) from Bordetella pertussis
Sigma-Aldrich
- Lysing Solution
Becton Dickinson
- CellWash
Becton Dickinson
- FACS Flow
Becton Dickinson
- Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat)
Serva
- Ortho-phenylendiamin Dihydrochlorid (OPD)
Sigma-Aldrich
- Urea Hydrogen Peroxid
Sigma-Aldrich
- Ketamin 10 %
Medistar
- Xylazin 2 %
Medistar
Alle hier nicht aufgeführten Chemikalien wurden, wenn nötig im höchsten Reinheitsgrad, von den
Firmen Merck, Sigma-Aldrich oder Riedel de Ha¸n bezogen.
1.4. Antikörper (-konjugate)
Tabelle Nr. 1
Verwendete Antikörper/-Konjugate
Antikörperspezifität
Herkunft/Klon
Markierung
Firma
Antikörper für die intrazelluläre Zytokinfärbung bei humanen Leukozyten:
Anti-Human-IL-2
Maus
PE
Becton Dickinson (BD)
Anti-Human-IL-4
Maus
PE
BD
Anti-Human-INFγ
Maus
FITC
BD
Anti-Human-IL-10
Maus
Biotin
Hölzel Diagnostics
Anti-Human-TNFα
Maus
FITC
Hölzel Diagnostics
Anti-Human-TGFβ1,2,3
Maus
Ohne
Genzyme
Anti-Maus IgG
Ratte
PE
BD
Anti-Human-CD4
Maus
PE-Cy5
Coulter-Immunotech
Isotypen-Kontrolle IgG2a
Maus
FITC
BD
Isotypen-Kontrolle IgG1
Maus
PE
BD
Isotypen-Kontrolle IgG1
Maus
PE-Cy5
Coulter-Immunotech
16
II. Material und Methoden
Antikörper für die Markierung von Oberflächenantigenen auf humanen Leukozyten:
Anti-Human-CD3
Maus
PerCP
BD
Anti-Human-CD4
Maus
FITC
BD
Anti-Human-CD8
Maus
FITC
BD
Anti-Human-CD69
Maus
PE
BD
Isotypen-Kontrolle IgG1
Maus
FITC
BD
Isotypen-Kontrolle IgG1
Maus
PE
BD
Isotypen-Kontrolle IgG1
Maus
PerCP
BD
Antikörper für die intrazelluläre Zytokinfärbung bei murinen Leukozyten:
Anti-Murine-IL-4
Fluoreszein
AgFa
Anti-Murine-INFγ
PE
BD PharMingen
Antikörper für die Markierung von Oberflächenantigenen auf murinen Leukozyten:
Anti-T-Zellen
59AD2.2
Fluoreszein
AgFa
Anti-B-Zellen
RA3-6B2
Fluoreszein
AgFa
Anti-CD4-Zellen
H129-19
Fluoreszein
AgFa
Anti-CD8-Zellen
53-6.72
Fluoreszein
AgFa
Anti-NK-Zellen
14B11
Fluoreszein
AgFa
Anti-Granulozyten
RB68C5
Fluoreszein
AgFa
Meerrettich-
Sigma
Antikörper für den Anti-Cop-AK-ELISA
Polyklonaler anti-Maus
Ziege
IgG, IgA, IgM
peroxidase
(POD)
Polyklonaler anti-Maus
Ziege
POD
Nordic
Ziege
POD
Nordic
Ziege
POD
Nordic
Ziege
POD
Nordic
Ziege
POD
Nordic
IgM
Polyklonaler anti-Maus
IgG1
Polyklonaler anti-Maus
IgG2a
Polyklonaler anti-Maus
IgG2b
Polyklonaler anti-Maus
IgG3
17
II. Material und Methoden
Zur indirekten Markierung für den biotinylierten anti-IL-10-AK wurde zusätzlich Streptavidin-PE
konjugiert (Hölzel Diagnostics) eingesetzt.
1.5. Testsysteme
- Annexin V/Propidiumjodid-Testkit
Bender MedSystems
- In Situ Cell Death Detection Kit, Fluoreszein
Boehringer Mannheim/Roche
- Vector M.O.M. Immunodetection Kit/Peroxidase
Vector Laboratories
- Cytometric Bead Array (CBA) Kit,
Mouse Th1/Th2 Cytokine CBA
Pharmingen/BD Biosciences
1.6. Verbrauchsmaterialien
Kabavette Probenröhrchen zur Blutentnahme:
- Volumen 10 ml, Gerinnungshemmer Lithium-Heparinat
Kabe
- Volumen 3 ml, Gerinnungshemmer EDTA
Kabe
- Volumen 10 ml, Serumröhrchen
Kabe
Blue Max Conical Tubes, 50 ml
Falcon/Becton Dickinson
FACS Probenröhrchen (Falcon 2052)
Falcon/Becton Dickinson
24-Flat-Bottom-Well-Platten für die Gewebekultur
Greiner
96-Flat-Bottom-Well-Platten für die Gewebekultur
Falcon/Becton Dickinson
96er-Rundboden-Platten für die Gewebekultur
Greiner
96-Flat-Bottom-Well-Platten für den ELISA (35/3912)
Falcon/Becton Dickinson
Drahtgewebe 1.4301 (Leinenbindung)
W 0,080 mm, d 0,050 mm, 200 mesh
Körner/Drahtgewebe
1.7. Software
Software Durchflusszytometrie:
CellQuest®
BD Bioscience
BD Cytometric Bead Array Software
BD Bioscience
Software Fluoreszenzmikroskopie:
ACT1
Nikon
18
II. Material und Methoden
Statistische Berechnungen:
SPSS 10.0 für Windows
SPSS Inc.
Prism
GraphPad Software
2. Methoden
2.1. Durchflusszytometrie
Mit Hilfe der Durchflusszytometrie ist die Charakterisierung von verschiedenen Zellen einer
Einzelzellsuspension möglich. Die im Durchflusszytometer angewandte sog. hydrodynamische
Fokussierung der Zellen bewirkt die Passage einzelner Zellen durch den Strahl eines Argon-IonenLasers (λ = 488 nm). Über ein komplexes, optisches System werden bei dem in der vorliegenden
Arbeit eingesetzten FACScan® fünf verschiedene Parameter abgeleitet. Zum einen werden die
Streulicht (scatter) Eigenschaften jeder Zelle bestimmt. So erlaubt die Messung des vorwärts
gestreuten Lichts (forward scatter - FSC) eine Aussage über die jeweilige Größe der Zelle, die
Messung des seitwärts gestreuten Lichts (sideward scatter - SSC) eine Aussage über die Struktur
(Oberflächenfaltung, Granularität) der einzelnen Zelle . Allein durch die Analyse der
Streulichteigenschaften bei Messungen der Leukozyten des peripheren Bluts können in den meisten
Fällen Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten unterschieden werden.
Die zusätzliche Markierung der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht die Messung weiterer
bis zu drei verschiedener Parameter.
Hierzu sind entsprechende geeignete Farbstoffe nötig. Die Fluorochrome müssen ein
Excitationssspektrum haben, das die Anregung bei 488 nm, der Wellenlänge des Lasers, ermöglicht.
Die Differenz zwischen Absorptions- und Emissionsmaximum, der Stoke’sche Shift, ist für jeden
Fluoreszenzfarbstoff charakteristisch. Die im FACScan eingebauten Photodetektoren ermöglichen die
Messung folgender Emissionsspektren:
⇒ Fluoreszenz 1 (FL1): λ = 515-545 nm (geeigneter Fluoreszenzfarbstoff: Fluoreszein)
⇒ FL2: λ = 564-606 nm (geeigneter Fluoreszenzfarbstoff: Phykoerythrin (PE))
⇒ FL3: λ > 650 nm (geeignete Fluoreszenzfarbstoffe: PE Zyanin 5 (PE-Cy5) und Peridinin
Chlorophyll Protein (PerCP).
Um die Autofluoreszenz der Zellen sowie die durch unspezifische Bindung Fluorochrom-konjugierter
Antikörper entstehende Hintergrundfluoreszenz von der durch die spezifische Bindung dieser
Antikörper entstehenden und dadurch eigentlich interessanten Fluoreszenz der Zellen zu
unterscheiden, ist es notwendig, eine jeweils passende Isotypen-Kontrolle durchzuführen. Für eine
passende Isotypen-Kontrolle setzt man idealerweise einen Antikörper ein, der bezogen auf den
eigentlichen Fluorochrom-markierten AK der gleichen AK-Klasse bzw. Subklasse angehört, die
gleiche Fluorochrommarkierung trägt und vom gleichen Hersteller kommt.
19
II. Material und Methoden
Mit Hilfe dieser Negativkontrolle kann nun am Durchflusszytometer die Hintergrundfluoreszenz als
negativ definiert werden.
2.2. Apoptotische r Zelltod
2.2.1. Allgemeiner Teil
Die Apoptose, auch der programmierte Zelltod genannt, stellt den physiologischen Tod aller Zellen
dar. Seitdem immer deutlicher wird, dass für gesundes Leben auch der physiologische und damit
geordnete Tod bestimmter Zellen notwendig ist und bei Ausbleiben oder einer Fehlregulation dieses
festgelegten Prozesses Krankheiten entstehen, rückt die Apoptose immer mehr in das Interesse der
Wissenschaft.
Die Apoptose spielt nicht nur bei der Gestalt- und Formentwicklung eines Embryos eine wichtige
Rolle, sondern auch bei der Regenerationsfähigkeit verschiedener Organe, wie Leber, Niere,
Gebärmutter.
In der vorliegenden Arbeit gilt das besondere Augenmerk dem physiologischen Zelltod von
Lymphozyten. Die Apoptose aktivierter Zellen des Immunsystems – activation induced death (AID) –
ist einer der wichtigsten Wege zur Regulation und Beendigung eines Entzündungsprozesses. Die
Kenntnisse über die verschiedenen morphologischen und biochemischen Veränderungen einer Zelle
während der Apoptose ermöglichen ein mittlerweile breites Spektrum an Methoden der Analyse des
apoptotischen Zelltodes. Wichtig ist hierbei die Unterscheidung der Apoptose von pathologischen
Prozessen wie der Nekrose.
2.2.2. TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) Methode
Bei der TUNEL-Methode (= terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated desoxy
Uridintriphosphat (dUTP) nick end labeling) wird die im Verlauf der Apoptose einsetzende,
charakteristische DNA-Fragmentierung erfasst (Sgonc 1994). Als Folge der Spaltung genomischer
DNA entstehen während der Apoptose Doppelstrang-Fragmente (Mono- und Oligonukleosomen)
sowie Einzelstrangbrüche. Solche DNA Strangbrüche können identifiziert werden, indem mit Hilfe
einer enzymatischen Reaktion (hier: TdT) modifizierte Nukleotide (hier: dUTP) an das freie 3‘OHEnde des DNA-Fragments gebunden werden. Die Fluorochrom-Markierung (hier: Fluoreszein) der
verwendeten Nukleotide ermöglicht eine anschließende fluoreszenz-mikroskopische oder
durchflusszytometrische Messung der gebundenen Nukleotide und damit der DNA-Strangbrüche.
20
II. Material und Methoden
Durchführung:
Die wie unter II.2.3. beschrieben isolierten PBMC werden auf eine Zellkonzentration von 2x106
Zellen/ml eingestellt. 100 µl dieser Zellsuspension werden in ein steriles FACS-Röhrchen gegeben
und 100 µl der Fixierungslösung dazugegeben, gut durchmischt und bei Raumtemperatur 1 h lang
inkubiert. Zur Entfernung der Fixierungslösung werden die Zellen anschließend zweimal mit PBS
gewaschen, d.h. bei 110 g 10 min lang zentrifugiert, dekantiert und mit PBS aufgefüllt. Nach dem
zweiten Zentrifugationsschritt werden die Zellen in 100 µl der Permeabilisierungslösung resuspendiert
und zwei Minuten lang auf Eis inkubiert. Anschließend werden die Zellen erneut, wie oben
beschrieben, zweimal mit PBS gewaschen und im Anschluß daran das Zellpellet mit 50 µl der
TUNEL-Reaktions-Lösung (enthalten im In Situ Cell Death Detection Kit) resuspendiert und 60 min
lang im Brutschrank bei 37°C und 7 % CO2 inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS werden
die Zellen in 500 µl PBS resuspendiert und im Durchflusszytometer gemessen.
Zur Kontrolle wird eine Negativprobe (nur Bindungspuffer ohne TUNEL-Reaktions-Lösung) sowie
eine Positivprobe (vorherige Inkubation mit DNAse) mitgeführt.
2.2.3. Annexin V/Propidiumjodid Methode
Die Annexin V/Propidiumjodid-Methode beruht auf der Beobachtung, dass rasch nach der ApoptoseInduktion Phosphatidylserin von der inneren Seite der Plasmamembran auf die Zelloberfläche
transloziert wird (Martin 1995). Exponiert an der Oberfläche der apoptotischen Zelle kann
Phosphatidylserin mit Annexin V markiert werden, einem kalziumabhängigen, phospholipidbindenden Protein mit hoher Affinität zu Phosphatidylserin (Zhang 1997). Da im Rahmen einer
Nekrose die Zellmembran durchlässig wird und Annexin V an Phosphatidylserine auf der
zytoplasmatischen Seite der Membran binden kann, ist es notwendig, zeitgleich mit der AnnexinMarkierung die Integrität der Zellmembran zu überprüfen. Dies geschieht mit der Markierung von
DNA durch Propidiumjodid (PI) (Vermes 1995). Somit haben apoptotische Zellen im
Durchflusszytometer ein positives Signal für Annexin V und zugleich ein negatives Signal für
Propidiumjodid, während nekrotische Zellen für beide Marker positiv sind (Van den Eijnde 1997). Die
Markierung von Annexin V mit einem Fluorochrom (hier: FITC), sowie die Tatsache, dass PI selbst
stark fluoreszierend ist, ermöglicht die Fluoreszenz-mikroskopische oder durchflusszytometrische
Messung der mit dieser Methode bearbeiteten Zellen.
Durchführung:
Da Erythrozyten Annexin V in starkem Maße binden, kann diese Methodik nur mit einer
Erythrozytenfreien Zellsuspension durchgeführt werden. Daher ist es notwendig, zunächst eine
Zellisolation, z.B. mittels Dichtegradienten bzw. eine Erythrozyten-Lyse durchzuführen. 100 µl der
Erythrozytenfreien Zellsuspension, die ca. 2x106 Zellen/ml enthält, werden einmalig mit HEPES-
21
II. Material und Methoden
Puffer gewaschen (Waschschritt wie oben beschrieben). Anschließend werden die Zellen in 200 µl
HEPES-Puffer resuspendiert. 10 µl Annexin V Fluoreszein-konjugiert und 20 µl Propidiumjodid
werden hinzugegeben und 20 Minuten lang im Dunkeln inkubiert. Im selben Schritt kann ferner ein
weiterer AK, der gegen Moleküle auf der Oberfläche der Zellen gerichtet ist (hier: z.B. anti-CD4-AK)
und einen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff trägt (hier z.B. PE-Cy5), dazugegeben werden. Nach
einmaligem Waschen mit HEPES-Puffer, zur Entfernung nicht gebundener AK- bzw. Annexin V- und
PI-Moleküle, werden die Zellen in 500 µl HEPES-Lösung resuspendiert und durchflusszytometrisch
gemessen.
2.3. Isolierung mononukleärer, peripherer Blutzellen mit Hilfe eines Dichtegradienten (nach
Jacobs 1996)
Für die Isolierung mononukleärer Zellen aus dem peripheren Blut von Probanden wird diesen Vollblut
entnommen (Menge je nach Versuchsansatz) und Lithium-Heparinat zur Gerinnungshemmung
dazugegeben. Unter sterilen Bedingungen wird zunächst Ficoll-Lösung (hier: 20 ml) in ein 50 ml
Kunststoff-Röhrchen gegeben und das frisch entnommene Blut (hier: 20 ml) vorsichtig darüber
geschichtet. Die zwei Flüssigkeiten dürfen sich hierbei nicht mischen. Das 50 ml Röhrchen wird
anschließend in der Zentrifuge ungebremst 20 Minuten lang bei 2000 U/min (≈ 700 g) zentrifugiert.
Aufgrund der unterschiedlichen Dichte der verschiedenen Zellpopulationen bilden sich während der
Zentrifugation folgende Schichten aus: im Sediment, finden sich Erythrozyten und Granulozyten,
direkt darüber befindet sich die wässrige, durchsichtige Schicht mit der Ficoll-Lösung und auf ihr der
dünne, weißlich schimmernde Interphase-Ring mit den peripheren mononukleären Blutzellen
(PBMC). In der anschließenden obersten Schicht des Plasmas befinden sich kleinste Partikel wie
Thrombozyten. Zur Isolierung der PBMC wird der Interphase-Ring vorsichtig unter sterilen
Bedingungen abgesaugt und in ein mit Kulturmedium gefülltes 50 ml Röhrchen gegeben. Der
nachfolgende Waschschritt dient der Entfernung von in der Zellsuspension verbliebenen FicollResten. Hierzu wird das Röhrchen bei 1200 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand
verworfen, das Sediment in Zellkulturmedium resuspendiert und ein weiteres Mal bei 1200 U/min 10
Minuten lang zentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstandes werden die Zellen in einer definierten
Menge (z.B. 1 ml) Kulturmedium resuspendiert und die Zelldichte mittels Neubauerzählkammer
bestimmt.
Bestimmung der Zelldichte
Zur Bestimmung der Zelldichte wird eine repräsentative Probe (10 µl) der Zellsuspension entnommen
und mit 190 µl Trypanblau-Lösung vermischt. Trypanblau dringt in tote Zellen ein, so dass mittels
dieser Färbung eine Aussage über die Vitalität der Zellen und damit über die Qualität der Präparation
22
II. Material und Methoden
getroffen werden kann. Die Zellen werden mittels einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Die Anzahl
der Zellen pro ml ergibt sich aus folgender Formel:
Anzahl gezählter Zellen x Verdünnungsfaktor (hier: 20) x 104 = Zellen/ml Zellsuspension.
2.4. Intrazelluläre Zytokinmessung
Durch die durchflusszytometrische Messung intrazellulärer Zytokine in peripheren Blutzellen ist die
Analyse individueller Zytokin-produzierender Zellen auf Einzelzellniveau (Jung 1993) bei
gleichzeitiger Charakterisierung der Zelle möglich. Um ein im Durchflusszytometer messbares
Fluoreszenzsignal zu erzeugen, ist es notwendig, die Zytokin-Produktion der Zellen zunächst
unspezifisch zu stimulieren (hier: mit PMA und Ionomyzin) und gleichzeitig die Sekretion der
Zytokine zu inhibieren (hier: mit Monensin bzw. Brefeldin A). Die anschließende Fixierung und
Permeabilisierung (hier: mit Saponin) der Zellen ermöglicht die intrazelluläre Markierung der von der
Zelle synthetisierten und im Golgi-Apparat akkumulierten Zytokine mit Fluorochrom-konjugierten
spezifischen Antikörpern.
Ein großer Vorteil dieser Methode ist die gleichzeitige Charakterisierung der Zelle über geeignete,
spezifisch gegen bestimmte Oberflächenstrukturen gerichtete, Fluorochrom-markierte AK (hier: antiCD4-AK zur Markierung von T-Helfer Zellen) bei Einsatz eines Mehrfarben-Durchflusszytometers.
Mit Hilfe dieser Methode können Angaben über den Prozentsatz oder die Anzahl Zytokinproduzierender Zellen eines bestimmten Zelltyps gemacht werden, jedoch nicht Angaben über die
Menge des von der Zelle produzierten Zytokins.
Durchführung:
In dieser Arbeit wurden intrazelluläre Zytokinfärbungen mit Vollblut, isolierten PBMC, Milz- und
Lymphknotenzellsuspensionen sowie mit Peritoneal-Zellen durchgeführt. Je 200 µl einer 1-2 x 106
Zellen/ml enthaltenden Zellsuspension werden pro Ansatz in jeweils ein steriles FACS-Röhrchen
gegeben, je 2 µl der Stimulatoren PMA und Ionomyzin (siehe II.1.3.1.), sowie 2 µl Monensin bei
humanen Zellen bzw. 2 µl Brefeldin A bei murinen Zellen hinzugegeben (siehe II.1.3.1.), gut
durchmischt und fünf Stunden lang im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert.
Die Zellen werden dann zweimal, wie oben beschrieben, mit HBSS gewaschen, das Zellpellet
anschließend in 1 ml eiskaltem Fixativ (1% Paraformaldehyd-Lösung) resuspendiert und fünf Minuten
lang bei 4°C inkubiert. Es folgen zwei weitere Waschschritte mit HBSS. Die Zellen werden
anschließend in 100 µl Permeabilisierungs-Lösung (siehe II.1.3.1.) resuspendiert und mindestens 30
Minuten lang inkubiert.
Die jeweiligen spezifischen AK werden zu den Proben gegeben. Der Ansatz wird gut durchmischt und
30 Minuten lang im Dunkeln bei 4°C inkubiert. Es folgt ein weiterer Waschschritt mit HBSS zur
23
II. Material und Methoden
Entfernung nicht gebundener AK. Die Zellen werden anschließend in 500 µl HBSS resuspendiert und
durchflusszytometrisch gemessen.
Tabelle Nr. 2
Schema für die Versuchsansätze für die durchflusszytometrische Charakterisierung peripherer
Blutzellen von MS-Patienten und gesunden Probanden nach intrazellulärer Zytokin-Färbung
Versuchs - Verwendeter
AK-Menge Fluorochrom-
ansatz
Antikörper
1.
Isotypen-Kontrolle IgG2a
10 µl
FITC
Isotypen-Kontrolle IgG1
10 µl
PE
Isotypen-Kontrolle IgG1
5 µl
PE-Cy5
Anti-INF-γγ -mAK
10 µl
FITC
Anti-IL-4-mAK
10 µl
PE
Anti-CD4-mAK
5 µl
PE-Cy5
Anti-TNF-α
α -mAK
2 µl
FITC
Anti-IL-10-mAK
2 µl
Biotin
Streptavidin
2 µl
PE
Anti-CD4-mAK
5 µl
PE-Cy5
Anti-IL-2-mAK
10µl
FITC
Anti-TGF-β
β -mAK
1 µl
-----
Ratte-anti-Maus IgG mAK
10 µl
PE
Anti-CD4-mAK
5 µl
PE-Cy5
2.
3.
4.
Markierung
Tabelle Nr. 3
Schema intrazelluläre Zytokinfärbung bei Mäuselymphozyten
AK-Spezifität
Negativkontrolle
Probe
AK-Menge
Fluorochrom-Markierung
-
-
-
1. IL-4
1 µl
Fluoreszein
2. INF-γγ
5 µl
Phycoerythrin
2.5. Bestimmung von Oberflächenmarkern
Mit Hilfe Fluorochrom-konjugierter spezifischer AK ist es möglich periphere Blutzellen aufgrund
ihrer auf der Zelloberfläche befindlichen Moleküle genauer zu charakterisieren. Da die starke
Eigenfluoreszenz von Erythrozyten die durchflusszytometrische Messung stört, müssen die
24
II. Material und Methoden
Erythrozyten zunächst durch Lyse oder Zellisolierung vor der Messung am FACScan® entfernt
werden.
Durchführung:
In dieser Arbeit wurde die Markierung von Zelloberflächenmolekülen mit Blutzellen, Milz- und
Lymphnotenzellsuspensionen und Peritoneal-Zellen durchgeführt. Die Zellen der jeweiligen
Zellsuspension werden mit den jeweiligen AK (siehe Tabelle Nr.1) gemischt und 20 Minuten lang im
Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Anschließend wird 1 ml der zuvor 1:10 mit A. bidest
verdünnten Lysing Solution dazugegeben, gemischt und 10 Minuten lang im Dunkeln bei RT
inkubiert. Die Zellen werden zweimal mit CellWash, wie oben beschrieben, gewaschen, in 500 µl
CellWash resuspendiert und innerhalb der nächsten 24 h durchflusszytometrisch gemessen.
Tabelle Nr. 4
Schema für die Versuchsansätze für die durchflusszytometrische Charakterisierung peripherer
Blutzellen sowie Milz- und Lymphknotenzellen von Mäusen
Versuchs - AK-Spezifität
AK-Menge Farbstoffe
Ansatz
1.
-
-
-
2.
T-Zellen
0,5 µl
Fluoreszein
3.
B-Zellen
0,5 µl
Fluoreszein
4.
CD4-Zellen
1,0 µl
Fluoreszein
5.
CD8-Zellen
1,0 µl
Fluoreszein
6. nur
NK-Zellen
1,0 µl
Fluoreszein
teilweise
Tabelle Nr. 5
Schema für die Versuchsansätze für die durchflusszytometrische Charakterisierung peripherer
Blutzellen von MS-Patienten
Versuchs - AK-Spezifität
AK-Menge Farbstoffe
Ansatz
1.
Isotypen-
10 µl
FITC/PE/PE-Cy5
kontrolle
2.
CD3/CD4/CD69
10 µl
FITC/PE/PE-Cy5
3.
CD3/CD8/CD69
10 µl
FITC/PE/PE-Cy5
25
II. Material und Methoden
2.6. Messung der Konzentration löslicher Zytokinmoleküle
Die Bestimmung der Konzentration löslicher Zytokinmoleküle (hier: IL-2, IL-4, IL-5, TNF-α, IFN-γ)
erfolgt im Zellkulturüberstand sowie im murinen Plasma mit Hilfe eines Cytometric Bead Arrays
(CBA).
In diesem Test werden fünf Sorten unterschiedlich stark fluoreszierender Kunststoffkügelchen (Beads)
verwendet die jeweils mit spezifischen Antikörpern gegen IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ und TNF-α markiert
sind. Die fünf verschiedenen Bead-Populationen werden vermischt und können im
Durchflusszytometer im Messbereich von Fluoreszenz 3 voneinander unterschieden werden.
Die Beads werden zusammen mit der zu analysierenden Probe sowie einem PE-konjugierten
Zweitantikörper inkubiert. Die anschließend im Durchflusszytometer im PE-Messbereich (Fluoreszenz
2) bestimmte Fluoreszenzintensität der jeweiligen Beads ist proportional zur Menge des gebundenen
Zytokins. Auf diese Weise lassen sich in Proben mit geringem Volumen (50 µl) gleichzeitig bis zu
fünf verschiedene Zytokine bestimmen. Mit Hilfe entsprechender Standards bekannter Konzentration
lassen sich die Zytokinkonzentrationen der jeweiligen Proben quantifizieren (Detektionslimit ca. 20
pg/ml).
Der Test wird wie vom Hersteller empfohlen durchgeführt. Die Auswertung der Daten erfolgt mit
Hilfe der speziellen BD Cytometric Bead Array Software.
2.7. Anti-Cop-1-AK-ELISA (Enzyme – Linked – Immunosorbent – Assay)
Der ELISA bietet die Möglichkeit, Antigen-Antikörper-Bindungen über eine nachgeschaltete
enzymatische Reaktion, die mit einem Farbumschlag gekoppelt ist, photometrisch messbar zu machen.
Beim hier verwendeten Indirekten ELISA wird das Antigen (hier: Cop-1) direkt adsorbtiv an die feste
Phase von 96-Depot-Flachbodenplatten gebunden.
Die zu testenden Plasmen werden in drei Verdünnungsstufen (1:10; 1:30; 1:100) aufgetragen. Es
wurden jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt.
Als Positivkontrolle bzw. Standard dient ein Maus-anti-Cop-1-Mischplasma, als Negativkontrolle
Mausnormal-Mischplasma (MNP).
Der Nachweis spezifisch gebundener Antikörper erfolgt durch Peroxidase-konjugierte, polyklonale
Ziegen-Antikörper gegen Maus-Immunglobuline (IgG, IgM, IgA), bzw. polyklonalen Ziegen-AK
gegen Maus-Ig der Subklasse IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3.
Durchführung:
- Beschichtung
mit 100 µl des in Beschichtungspuffer gelösten Antigens
(1 µg Cop-1) pro Depot, Inkubation 1h lang bei 37°C
26
II. Material und Methoden
- 3 x Waschen
mit 200 µl Waschpuffer pro Depot
- Nachbeschichtung
mit 200 µl Nachbeschichtungspuffer pro Depot,
Inkubation 30 min lang bei 37°C
- 3 x Waschen
mit 200 µl Waschpuffer pro Depot
- Auftragen der Plasmen
je 100 µl der in Nachbeschichtungspuffer verdünnten Proben
pro Depot, Inkubation 1 h lang bei 37°C
- 3 x Waschen
mit 200 µl Waschpuffer pro Depot
- Auftragen des
100 µl pro Depot, in Nachbeschichtungspuffer verdünnt (1:3.000
Zweitantikörpers
polyvalenter AK, 1:10.000 verdünnt; die anti IgG1, IgG2a, IgG2b,
IgG3, IgM-Antikörper werden jeweils 1:3.000 verdünnt),
Inkubation 1 h lang bei 37°C
- 3 x Waschen
mit 200 µl Waschpuffer pro Depot
- Substratauftrag
100 µl OPD-Substrat in Substratpuffer pro Depot,
Inkubation 1 h lang bei RT
- Photometrische
Messung
des Substratumsatzes bei 450 nm in einem
8-Kanal-ELISA-Platten-Photometer.
2.8. Gewinnung von Zellen, Geweben und Organen der Maus für histologische und
zellbiologische Untersuchungen
2.8.1 Blutabnahme bei Mäusen
Die Blutentnahme bei lebenden Mäusen erfolgt durch Punktion des Plexus retroorbitalis mittels einer
Pasteurpipette. Das Blut wird in ein Reagenzglas mit 3 Tropfen 20 %iger Heparinlösung gegeben.
Anschließend wird 20 Minuten lang bei 2.000g zentrifugiert, der Überstand (= Plasma) abgenommen
und bei –20°C gelagert.
Aus dem Sediment können noch Blutzellen z.B. zur durchflusszytometrischen Analyse entnommen
werden.
27
II. Material und Methoden
2.8.2. Herstellung einer Milzzellsuspension
Die Maus wird schmerzfrei durch Ether getötet und die Milz entnommen. Die Milz wird in ein Gefäß
mit ca. 5 ml PBS überführt und die Zellen aus dem Bindegewebssack herausgedrückt. Die
Zellsuspension wird anschließend durch ein feinmaschiges Stahlnetz in ein Zentrifugenröhrchen
filtriert um das Bindegewebe von den Einzelzellen zu trennen. Die Anzahl der in der Zellsuspension
enthaltenen Leukozyten kann nun mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt werden. Unter
Berücksichtigung des Gesamtvolumens der Zellsuspension kann die Anzahl der in der Milz
enthaltenen Zellen bestimmt werden.
2.8.3. Herstellung einer Suspension von Lymphknotenzellen
Nach dem Töten der Maus werden die zu untersuchenden Lymphknoten entnommen und in ein Gefäß
mit PBS gegeben. Analog zur Herstellung einer Milzzellsuspension (siehe II.2.8.2.) wird mit dem
Lymphknoten verfahren. Die Anzahl der im Lymphknoten enthaltenen Leukozyten wird mit Hilfe
einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.
2.8.4. Präparation des Gehirns
Um das Gehirn und das Rückenmark frei von Leukozyten zu erhalten, ist es notwendig, das betäubte
Tier mit einer Waschlösung zu perfundieren. Hierzu wird die Maus zunächst betäubt, wobei darauf zu
achten ist, dass der Kreislauf stabil bleibt.
Zur Betäubung wird dem Tier pro 40 g Körpergewicht 0,15 ml folgender Lösung intraperitoneal
injiziert: 0,4 ml Ketamin (10 %ig) + 0,1 ml Xylazin (2 %ig) + 1 ml PBS.
Der Brustkorb wird geöffnet und das Herz freigelegt. Um den Abfluss des Blutes und der
Perfusionslösung zu ermöglichen, wird ein kleiner Schnitt in den rechten Vorhof des Mäuseherzens
gemacht. In den linken Ventrikel wird von der Herzspitze aus eine feine Kanüle hineingeschoben. Mit
einem leichten, gleichbleibenden Druck wird nun die Perfusionslösung (hier: PBS) injiziert. Es
wurden 50-100 ml PBS pro Tier perfundiert. Während der Perfusion stirbt das Versuchstier
schmerzfrei. Anschließend wird das Gehirn präpariert, sofort in Tissue Tek® eingebettet und
schockgefroren. Die Lagerung erfolgt bei -80°C.
Von den Gehirnpräparaten werden 10 µm dicke Gefrierschnitte bei -20°C bis -25°C hergestellt.
2.8.5. Präparation des Rückenmarks
Nach Perfusion des Versuchstiers, wie unter II.2.8.4. beschrieben, wird die Wirbelsäule freipräpariert
und auf der einen Seite im Lendenbereich, auf der anderen Seite im Schulterbereich durchtrennt. Mit
28
II. Material und Methoden
Hilfe einer 10 ml Spritze und einer Kanüle wird nun das Rückenmark aus dem Rückenmarkskanal
herausgepresst. Für spätere Gefrierschnitte wird das Rückenmark in Tissue Tek® eingebettet, sofort
schockgefroren und bei -80°C gelagert.
Von den Rückenmarkspräparaten werden 10-12 µm dicke Gefrierschnitte bei -20°C bis -25°C
hergestellt.
2.8.6. Herstellung eines Rückenmarkshomogenats
Das, wie unter II.2.8.5. beschrieben, präparierte Rückenmark wird in eine mit ca. 3 ml PBS gefüllte
Petrischale gegeben und mechanisch zerkleinert. Die Zellsuspension wird mit Hilfe einer Pipette
gleichmäßig suspendiert.
2.9. Färbung von Gefrierschnitten aus Mäusehirnpräparaten
2.9.1. Hämalaun/Eosin – Färbung
Bei dieser Färbemethode werden der Kernfarbstoff Hämatoxilin und der Plasmafarbstoff Eosin
kombiniert. Folgende Anfärbungen sind zu beobachten:
- Zellkerne: blau bis schwarz,
- eosinophile Granula: orange bis rot,
- Kollagenfasern: orange bis rot,
- Erythrozyten: orange,
- Zytoplasma: schwach orange.
Durchführung:
Die auf Objektträgern befindlichen Gefrierschnitte werden wie folgt gefärbt:
-
100-200 µl Hämalaun auf das Präparat pipettieren, 3 min lang inkubieren,
-
mit A. bidest spülen,
-
2 min lang in Leitungswasser inkubieren,
-
200-300 µl Eosin-Lösung auf das Präparat geben, 1 min lang inkubieren,
-
1-2 mal mit A. bidest spülen,
-
anschließend trocknen lassen.
Das fertige Präparat wird mit einem Tropfen Vitro-Clud und einem Deckgläschen versehen und
lichtmikroskopisch untersucht.
29
II. Material und Methoden
2.9.2. Immunhistologische Färbung
a. Direkte Immunfluoreszenz
Bei der direkten Immunfluoreszenz wird zur Anfärbung bestimmter Zellstrukturen ein spezifischer
Antikörper verwendet, der direkt mit einem Fluorochrom markiert ist .
Durchführung:
-
10 min lang mit Aceton fixieren
-
nach Trocknen des Gewebeschnitts 50-100 µl des direkt markierten Antikörpers (hier: anti-CD4
bzw. anti-CD8 Fluoreszein-konjugiert, Verdünnung 1:100 in PBS) auftragen
-
20 min lang bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer im Dunkeln inkubieren
-
dreimal mit PBS waschen
-
Objektträger um den Schnitt herum trocknen, mit 50 %iger Glyzerin-Lösung bedecken und unter
einem Deckglas einschließen.
b. Indirekte Immunfluoreszenz
Bei der indirekten Immunfluoreszenz erfolgt die Anfärbung der zu untersuchenden Zellstrukturen mit
Hilfe von spezifischen Antikörpern, die nicht direkt mit Fluorochromen markiert sind, deren Bindung
an die Antigenstrukturen in einem zweiten Schritt mit Hilfe z.B. eines Fluorochrom-markierten
Zweitantikörpers nachgewiesen wird.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein biotin-markierter Erstantikörper (hier: anti-CD8) eingesetzt,
dessen Bindung anschließend mit PE-konjugiertem Streptavidin nachgewiesen wurde.
Die Präparation erfolgt analog zur Durchführung der direkten Immunfluoreszenz, jedoch erfolgt ein
weiterer Färbeschritt nach dem dreimaligen Waschen mit PBS. Hierbei wird 50-100 µl des PEkonjugierten Streptavidins (Verdünnung 1:100 in PBS) auf den Gewebeschnitt aufgetragen, 20 min
lang bei RT im Dunkeln in einer feuchten Kammer inkubiert und anschließend dreimal mit PBS
gewaschen.
2.10. Färbung nach Pappenheim
Die Zellen werden durch den Alkohol, der sich in der May-Grünwald-Lösung befindet, fixiert. Durch
die Zugabe von A. bidest fällt der Farbstoff aus. Die unterschiedliche Anfärbung verschiedener Zellen
und Zellstrukturen beruht u.a. auf der unterschiedlichen Affinität der Farbstoffe zu den in der Zelle
vorhandenen makromolekularen Substanzen.
30
II. Material und Methoden
So färben sich die DNA des Kerns, RNA der Nukleoli und die RNA des zytoplasmatischen Raumes
mit basischen Farbstoffen (Methylenblau, Azur II) an, während die Proteine des Zytoplasmas und das
Hämoglobin mit sauren Farbstoffen (Eosin) reagieren.
Durchführung:
-
5 min lang May-Grünwald-Lösung (konzentriert) einwirken lassen
-
5 min lang die gleiche Menge A. bidest einwirken lassen
-
Zwischenspülen mit A. bidest
-
5 min lang Giemsa-Gebrauchslösung (1:40 mit A. bidest)
-
Spülen mit A. bidest
Das Präparat schräg stellen und lufttrocknen lassen.
2.11. In vitro-Stimulation peripherer humaner Blutzellen
Für die in vitro-Stimulationsversuche werden die wie oben beschrieben isolierten PBMC auf eine
Konzentration von 2 x 105 Zellen/ml mit Zellkulturmedium eingestellt. Je 2 ml der Zellsuspension
werden anschließend in 24-Depot-Gewebekulturplatten pipettiert und entweder ohne Zusatz von
Protein (Negativkontrolle), mit Copaxone (1µg/ml), MBP (2 µg/ml) oder BSA (2 µg/ml) 48 Stunden
lang im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Die Proteine werden einmalig zu Beginn der
Inkubationszeit zugegeben.
Im Anschluß an diese spezifische Stimulation der Zellen wird die Bestimmung der Apoptoserate
(mittels Annexin V/Propidiumjodid Methode; siehe II.2.2.3.) bzw. die Bestimmung intrazellulärer
Zytokine (siehe II.2.4.) durchgeführt.
2.12. Skala zur Bewertung der EAE-Symptome bei Mäusen
Die klinischen Symptome der an EAE erkrankten Tiere werden mit Hilfe der unten stehenden Skala
bewertet. Die Tiere werden bis ca. 30-40 Tage nach Induktion der Erkrankung täglich untersucht. Die
Summe der täglich erhobenen Werte ergibt den sogenannten ‚cumulative disease index’ (CDI).
Tabelle Nr. 6
Skala zur Bewertung von Krankheitssymptomen bei an EAE erkrankten Mäusen
0,5
Muskulatur allgemein schwächer, oder Schwanzmuskulatur schwächer/schlaff
oder Gangart unbeholfen
1,0
Völlig geschwächte Schwanzmuskulatur oder ataktische Gangart
1,5
Völlig geschwächte Schwanzmuskulatur und unbeholfener Gang oder schlechteres
31
II. Material und Methoden
Umdrehen aus der Rückenlage
2,0
Eingeschränkter Gang – Probleme beim Umdrehen aus der Rückenlage –
eingeschränkte Mobilität der Hinterbeine
2,5
Wie 2,0 und mindestens ein Fuß schleift, aber noch keine vollständige Lähmung –
Gewicht liegt schon auf den Vorderbeinen
3,0
Völlige Lähmung eines oder beider Hinterbeinen
3,5
Wie 3,0 und leichte Schwäche der Vorderbeine
4,0
Wie 3,0 und Schwächung der Vorderbeine (Bewegung noch möglich) –
Allgemeinzustand schlechter
4,5
Völliger Mobilitätsverlust (alle Beine gelähmt) – allgemeiner Zustand schlecht
5,0
Sterben (evtl. einschläfern)
2.13. 3 H-Thymidin-Proliferationsassay
Mit Hilfe des 3 H-Thymidin-Proliferationsassays ist es möglich die Proliferation von Zellen unter
bestimmten Zellkulturbedingungen zu analysieren. Hierzu wird 3 H-Thymidin dem Kulturmedium
zugesetzt und während der Proliferationsphase der Zellen als Nukleotid eingebaut. Die anschließend
gemessene Stärke der Radioaktivität ist proportional zur Menge des eingebauten 3 H-Thymidins und
damit proportional zur Proliferationsrate.
Sechs Wochen alten, weiblichen SJL-Mäusen wird subkutan 200 µg PLP 139-151 -Peptid in den
Oberschenkel injiziert. 10 Tage später werden die Tiere schmerzfrei getötet, die drainierenden
Lymphknoten sowie die Milz entnommen und wie oben beschrieben (siehe II.2.8.2-3.) eine
Zellsuspension aus Lymphknoten- bzw. Milzzellen hergestellt. Aus der Milzzellsuspension werden
mittels Dichtegradienten (siehe II.2.3.) PBMC isoliert. Anschließend werden pro Depot jeweils 2 x 105
Lymphknotenzellen sowie aus der Milz isolierte PBMC in einer 96-Depot-Gewebekulturplatte mit
Rundboden 72 Stunden lang in Zellkulturmedium (RPMI + 10 % FCS + Glutamin) bei 37ºC und 5 %
CO2 inkubiert. Dem Medium wird zuvor entweder 10 µg PLP 139-151 -Peptid/ml oder 2 µg Concanavalin
A/ml sowie Lipo-X in verschiedenen Konzentrationen wie folgt hinzugegeben:
-
Ansatz 1: Kontrolle Kulturmedium ohne Zusatz,
-
Ansatz 2: 10 µg PLP-Peptid,
-
Ansatz 3: 10 µg PLP-Peptid + 1 mg Lipo-X pro ml,
-
Ansatz 4: 10 µg PLP-Peptid + 0,2 mg Lipo-X pro ml,
-
Ansatz 5: 10 µg PLP-Peptid + 0,0004 mg Lipo-X pro ml,
-
Ansatz 6: 2 µg Con A pro ml,
-
Ansatz 7: 2 µg Con A pro ml + 1 mg Lipo-X pro ml,
-
Ansatz 8: 2 µg Con A pro ml + 0,2 mg Lipo-X pro ml,
32
II. Material und Methoden
-
Ansatz 9: 2 µg Con A pro ml + 0,0004 mg Lipo-X pro ml.
Nach der 72-stündigen Inkubation wird pro Depot 0,5 µCi 3 H-Thymidin hinzugegeben, 16 Stunden
lang bei 37ºC und 5 % CO2 inkubiert und die Zellen anschließend geerntet. Mit einem Wallac
Microbeta beta-counter wird anschließend die Anzahl der radioaktiven Zerfälle (‚counts’) pro Depot
bestimmt.
3. Statistik
Für die statistische Berechnung wurde SPSS®-Software genutzt.
Eingesetzt wurden folgende nicht parametrischen Tests:
-
der Wilcoxon-Rank-Test,
-
Mann-Whitney U Test
-
Student T-Test
-
Pearson Korrelationstest.
33
III. Patienten und Versuchstiere
III. Patienten und Versuchstiere
1. Patienten des in vitro-Stimulationsversuchs mit Cop-1 – Vergleich MS-Patienten und
gesunde Probanden
Zur Durchführung der unter II.2.11. beschriebenen in vitro-Stimulationsversuche wurde 15 Patienten
mit schubförmig verlaufender Multipler Sklerose einmalig Blut abgenommen. Alle 15 Patienten
nahmen an der in der Neurologischen Uniklinik am St. Josef-Hospital Bochum durchgeführten
offenen Phase III Therapie -Studie mit Copaxone teil (siehe Tab. 7).
Tabelle Nr. 7
Ein- und Ausschlusskriterien der offenen Phase III Therapie -Studie mit Copaxone®
Einschlusskriterien
Ausschlusskriterien
Alter der Patienten: 18-60 Jahre
Schwangerschaft oder Stillzeit
Geschlecht: männlich und weiblich möglich,
Innere oder psychiatrische Erkrankungen, die die
Frauen nur mit zuverlässiger Methode zur
Fähigkeiten des Patienten zur
Konzeptionsverhütung
Einverständniserklärung beeinträchtigen
Klinisch oder laborunterstützt gesicherte,
Unfähigkeit, sich die Medikation selbst subkutan
schubförmige remittierende Multiple Sklerose
zu injizieren
Bei Studienbeginn darf der Wert auf der
Therapie mit Kortikosteroiden oder
‚Expanded Disability Status Scale’ (EDSS-Wert; adrenokortikotropem Hormon (ACTH) innerhalb
siehe Tabelle) nicht größer als 6,0 sein
der letzten 30 Tage vor Beginn der Therapie mit
Copaxone®
Krankheitssymptome können nicht durch andere
Therapie mit Interferonen, anderen
Erkrankungen begründet sein
Prüfmedikamenten und/oder immunsuppressive
Behandlung mit einer Chemotherapie oder einer
Bestrahlung von lymphoidem Gewebe innerhalb
Schriftliche Einverständniserklärung des Patienten der letzten 90 Tage vor Beginn der Therapie mit
Copaxone®
Den Patienten wurde das für die in vitro-Stimulationsversuche benötigte Blut nach Einschluss in die
Therapiestudie, jedoch vor der ersten Injektion von Copaxone, abgenommen. Um Alters- und
Geschlechtsbedingte immunologische Unterschiede auszuschließen, wurden 15 gesunde Probanden
gleichen Alters und Geschlechts ausgewählt (siehe Tab. 8).
34
III. Patienten und Versuchstiere
Folgende Ausschlusskriterien galten für die gesunden Probanden:
- Anamnestisch überlieferte Krankheiten mit vermuteter bzw. nachgewiesener immunologischer
Implikation, typischerweise aus dem allergischen, rheumatischen und dermatologischen Formenkreis
wie auch chronisch entzündliche Darmerkrankungen,
- Anamnestisch überlieferte Krankheiten unbekannter Ätiologie,
- Einnahme von möglicherweise immunmodulierend wirkenden Medikamenten.
Sowohl für Patienten als auch für gesunde Probanden galt weiterhin folgendes Ausschlusskriterium:
- Klinisch manifeste, akute Infektionen zum Zeitpunkt der Blutabnahme, wie auch im Zeitraum von
sechs Wochen vor bis zwei Wochen nach der Blutabnahme.
Tabelle Nr. 8
Daten der Probanden des in vitro-Stimulationsversuchs mit Cop-1
MS Patienten
Gesunde Probanden
Alter
21-43 Jahre; ∅ 33,3 Jahre
21-43 Jahre; ∅ 33 Jahre
Geschlecht
10 Frauen; 5 Männer
10 Frauen; 5 Männer
Im Rahmen des in vitro-Stimulationsversuchs wurden die peripheren Blutzellen der MS-Patienten und
gesunden Probanden mit Copaxone stimuliert und anschließend die Zytokin-Produktion (IL-2, IL-4,
IL-10, INF-γ, TNF-α, TGF-β) sowie die Apoptoserate der Lymphozyten mittels Annexin V/PITechnik bestimmt.
2. Patienten der Untersuchung während der Therapie mit Cop-1
Im Rahmen der hier beschriebenen Verlaufsuntersuchung wurde das periphere Blut von 19 Patienten
(siehe Tab. 9) mit schubförmig verlaufender MS untersucht. Alle 19 Patienten nahmen an der offenen
Phase III Therapie Studie mit Copaxone in der neurologischen Uniklinik am St. Josef-Hospital
Bochum teil. Zusätzlich zu den für die Therapiestudie geltenden Ein- und Ausschlusskriterien (siehe
Tab. 7) durften die Patienten innerhalb eines Monats vor Therapiebeginn keine Infektionen oder
andere Erkrankungen durchgemacht haben.
Den Patienten wurde vor Therapiebeginn sowie im Abstand von 6 Wochen während des ersten Jahres
der Therapie mit Copaxone für die Untersuchungen Blut abgenommen.
35
III. Patienten und Versuchstiere
Tabelle Nr. 9
Daten der mit Copaxone® behandelten Patienten
19 Patienten
Alter
Geschlecht
(in Jahren)
(w = weiblich;
EDSS
EDSS
(Studienbeginn)
m = männlich)
Verteilung
Durchschnitt
22 - 44
12 w; 7 m
(nach 1.Jahr Therapie
mit Copaxone)
1,0 – 5,5
1,5 - 5,0
2,4
2,3
34,9
Tabelle Nr. 10
Zusammenfassung der ‚Expanded Disability Status Scale’ (EDSS) zur Bewertung der klinischen
Symptome bei MS-Patienten nach Kurtzke (1983).
Skalen-Wert
Befund
0
ohne Befund
1
Keine Behinderung, abnorme Untersuchungsbefunde
2
Minimale Behinderung
3
Mäßiggradige Behinderung
4
Gehfähig ohne Hilfe mindestens 500 m
5
Gehfähig ohne Hilfe mindestens 200 m
6
Gehhilfe nötig um 100 m zu gehen
7
Rollstuhlpflicht (weniger als 5 m gehfähig)
8
Bett oder Rollstuhl, Hilfe bei der Körperpflege
9
Hilflos bettlägeriger Patient; erhaltene Kommunikations- und Essfähigkeit
10
Tod infolge Multiple Sklerose
Folgende immunologische Parameter wurden bei diesen Patienten analysiert:
-
Der prozentuale Anteil IL-2, IL-4, IL-10, INF-γ, TNF-α, TGF-β produzierender Zellen,
-
die Apoptoserate der Lymphozyten,
-
der Anteil CD4-positiver T-Zellen, CD8-positiver T-Zellen und der jeweilige Aktivierungsgrad
dieser Zelltypen.
36
III. Patienten und Versuchstiere
3. Versuchstiere
Als Versuchstiere dienten Mäuse der Inzuchtstämme C3H/HeN, BALB/cJ Bom und SJL/N Bom der
Firma M&B A/S (Dänemark) sowie SJL/J der Fa. Janvier (Frankreich).
Die in den EAE-Versuchen eingesetzten Mäuse waren bei Krankheitsinduktion mindestens 6 und
maximal 9 Wochen alt und weiblichen Geschlechts.
37
IV. Ergebnisse
IV.
Ergebnisse
1.
Untersuchung verschiedener Modelle der murinen experimentellen autoimmunen
Enzephalomyelitis
Zur Untersuchung der immunologischen Wirkmechanismen von Cop-1 und Lipo-X war es zunächst
notwendig ein bzw. mehrere geeignete Tiermodelle zu etablie ren. Hierzu wurden verschiedene EAEinduzierende Substanzen in Mäusen verschiedener Inzuchtstämme auf ihre Enzephalitogenität getestet.
1.1. Klinische Merkmale bei an EAE erkrankten Mäusen
Die ersten Symptome einer Erkrankung mit einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis
sind häufig Schwanzlähmungen und unsicherer Gang (Behinderungsgrad 0,5-1,5). Im weiteren
Verlauf der Erkrankung kommt es zur leichten bis vollständigen Lähmung der hinteren Extremitäten
(2-3,5). Aufsteigend sind bei einer weiteren Krankheitsverschlechterung auch die vorderen
Extremitäten der Tiere betroffen (4-4,5). Dies kann zum Tod des Tieres führen (5). Kurz vor und zu
Beginn eines akuten Krankheitsschubes beobachtet man häufig einen starken Gewichtsverlust. Das
Fell der Tiere wird struppig und der Allgemeinzustand mit zunehmendem Behinderungsgrad
schlechter. Häufig ist während der Lähmung der hinteren Extremitäten auch eine ausgeprägte
Inkontinenz zu beobachten.
Abb. 3: Gesunde Maus (im Vordergrund) und an EAE erkrankte SJL-Maus (im Hintergrund)
38
IV. Ergebnisse
In Abb. 3 ist eine gesunde SJL-Maus mit normaler Schwanzhaltung und gutem Allgemeinzustand
gezeigt sowie eine an EAE erkrankte Maus. Die EAE-Maus ist gut durch das struppige Fell, die
gekrümmte Körperhaltung sowie die Schwanzlähmung zu erkennen.
A
B
Abb. 4: Charakteristische Beinhaltung einer an EAE erkrankten Maus (A) und einer gesunden
Maus (B)
Ein weiteres, frühes Kennzeichen einer EAE-Erkrankung ist die in Abb. 4 dargestellte Beinhaltung der
Mäuse. Hält man die Tiere am Schwanz, so streckt eine gesunde Maus reflexhaft ihre Hinterläufe nach
außen (B). Eine EAE-Maus hingegen fasst häufig mit ihren Vorderbeinen an die zusammengelegten
Hinterläufe (A).
Zur besseren Darstellung der Krankheitssymptome sind im Anhang dieser Arbeit auf CD folgende
Digitalfilme zu finden:
-
EAE 1,0
=> ataktische Gangart
-
EAE 2,0-2,5
=> eingeschränkte Mobilität der Hinterbeine
-
EAE 3
=> starke Lähmung der Hinterbeine
-
EAE 4-4,5.
=> völliger Mobilitätsverlust.
In Abb. 5 ist beispielhaft ein HE-gefärbter Gehirnschnitt einer an EAE erkrankten SJL-Maus im
akuten Krankheitsschub dargestellt. Deutlich zu erkennen ist ein Entzündungsplaque (weißer Pfeil),
der typischerweise in der Nähe eines Gefäßes liegt (schwarzer Pfeil). Mittels Fluoreszenzfärbung
konnte festgestellt werden, dass es sich bei den meisten der im Entzündungsplaque befindlichen
Lymphozyten vor allem um T-Helfer-Zellen handelte.
39
IV. Ergebnisse
Abb. 5: HE-Färbung eines Gehirnschnitts einer SJL-Maus im akuten Krankheitsschub
(mit einem schwarzen Pfeil gekennzeichnet ist ein Gefäß, mit einem weißen Pfeil gekennzeichnet
ein Entzündungsplaque)
1.2. EAE bei Mäusen des Inzuchtstammes BALB/c
Sechs bis acht Wochen alten, weiblichen Mäusen des Inzuchtstammes BALB/c wurde subkutan in die
Flanke eines der in Tabelle Nr. 11 aufgeführten Peptide jeweils in Emulsion mit komplettem
Freund’schem Adjuvans (CFA) gespritzt.
Tabelle Nr. 11
Die bei Mäusen des Inzuchtstammes BALB/c eingesetzten Peptide bzw. Proteine
Abkürzung
Peptid/Protein
Konzentration
N
MOG
Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein 35-55 Peptid
100 µg in 100 µl CFA
4
MBP
Basisches Myelin Protein 87-99 Peptid
50 µg in 100 µl CFA
2
PLP
Proteolipid Protein 139-151 Peptid ,Serin’
100 µg in 100 µl CFA
4
40
IV. Ergebnisse
PLP+PT
s.o.
100 µg in 100 µl CFA +
4
je 200 ng Pertussis Toxin
(i.p. Tag 0 und 2)
Die Tiere aller Versuchsgruppen wurden jeden Tag untersucht und unter zu Hilfenahme der unter
II.2.12. beschriebenen Skala zur Bewertung der EAE-Symptome bei Mäusen der Behinderungsgrad
beurteilt. In den nachfolgenden Diagrammen ist der Krankheitsverlauf der einzelnen Versuchstiere bis
zum Tag 30-35 nach Krankheitsinduktion dargestellt.
MOG-T.4
MOG-T.3
MOG-T.2
Auslösung der EAE
Behinderungsgrad
3
2
1
MOG-T.1
MBP-T.1
MBP-T.2
0
0
5
10
15
20
25
30
Tage
Abb. 6: Darstellung des Krankheitsverlaufs von BALB/c-Mäusen, die nach Injektion von MOGoder MBP-Peptid an EAE erkrankten
Wie in Abb. 6 dargestellt, zeigten die an MOG-induzierter EAE erkrankten Tiere einen leichteren
Krankheitsverlauf als die an MBP-induzierter EAE erkrankten Versuchstiere. Keines der an MOGinduzierter EAE erkrankten Tiere zeigte hierbei eine Krankheitsaktivität die über einen
Behinderungsgrad von 1,0 hinausging, ein Tier zeigte überhaupt keine Krankheitssymptome. Bei den
an MBP-induzierter EAE erkrankten Tieren lag der höchste Behinderungsgrad bei 1,5. Das Tier zeigte
damit deutliche motorische Einschränkungen im Bereich der hinteren Extremitäten.
PLP-T.4
PLP-T.3
PLP-T.2
Auslösung der EAE
Behinderungsgrad
3
2
1
PLP-T.1
0
0
5
10
15
20
25
30
Tage
Abb. 7: Darstellung des Krankheitsverlaufs von BALB/c-Mäusen, die nach Injektion von PLPPeptid an EAE erkrankten
41
IV. Ergebnisse
Abbildung 7 zeigt den Krankheitsverlauf der BALB/c-Mäuse nach EAE-Induktion mit PLP 139-151 Peptid. Die Krankheitsinduktion mit PLP-Peptid bewirkte einen schubförmigen Krankheitsverlauf.
D.h. nach ca. 9-12 Tagen zeigten sich erste Krankheitssymptome, die zunächst stärker wurden und
nach ca. 25-35 Tagen wieder zurückgingen. Der bei dieser Krankheitsinduktion bei BALB/c-Mäusen
erreichte maximale Behinderungsgrad lag bei 2,0, was deutliche Lähmungserscheinungen der hinteren
Extremitäten bedeutet. Die PLP-induzierte EAE zeigte damit die schwersten Krankheitssymptome der
bei BALB/c-Mäusen getesteten Substanzen.
Um den Krankheitsverlauf nach Induktion mit subkutan applizierten Substanzen unspezifisch zu
verstärken, wird häufig eine zusätzliche, intraperitoneale Injektion mit Pertussis Toxin am Tag 0 und
Tag 2 nach Krankheitsinduktion vorgenommen. In der vorliegenden Arbeit wurde diese zusätzliche
Injektion von Pertussis Toxin (PT) bei PLP-induzierter EAE eingesetzt.
PLP+PT-T.4
PLP+PT-T.3
PLP+PT-T.2
Auslösung der EAE
Behinderungsgrad
3
2
1
PLP+PT-T.1
0
0
5
10
15
20
25
30
Tage
Abb. 8: Darstellung des Krankheitsverlaufs von BALB/c-Mäusen, die nach Injektion von PLPPeptid (s.c.) und Pertussis Toxin (i.p.) an EAE erkrankten
Wie in Abbildung 8 dargestellt unterschieden sich die Krankheitsverläufe der Mäuse mit zusätzlicher
Pertussis Toxin Injektion nicht deutlich von denen der Tiere, denen nur PLP injiziert wurde.
1.3. EAE bei Mäusen des Inzuchtstammes C57BL/6
Sieben weiblichen, 6-8 Wochen alten Mäusen des Inzuchtstammes C57BL/6 wurde am Tag 0 100 µg
des PLP 139-151 -Peptids in 100 µl CFA subkutan injiziert. Die Mäuse wurden täglich untersucht. Wie in
Abb. 9 dargestellt, zeigte sich bei den Mäusen dieses Inzuchtstammes in den 35 Tagen nach
Krankheitsinduktion nahezu keine Krankheitsaktivität. Die Tiere wurden noch sieben Monate lang
weiter beobachtet, zeigten aber auch später keine deutlichen Krankheitssymptome.
42
Behinderungsgrad
IV. Ergebnisse
1.Tier
2.Tier
3.Tier
4.Tier
5.Tier
6.Tier
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
7.Tier
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
20
25
30
35
Tage nach Injektion
Abb. 9: Darstellung des Krankheitsverlaufs von C57BL/6-Mäusen nach Krankheitsinduktion
mit PLP139-151 -Peptid
1.4. EAE bei Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J
1.4.1. EAE-Induktion mit PLP-Peptid
13 weiblichen, sieben Wochen alten Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J wurden jeweils 100 µg des
PLP 139-151 -Peptids in 100 µl CFA subkutan in die Flanke injiziert. Die Tiere wurden bis zum 35. Tag
nach Krankheitsinduktion täglich untersucht.
Wie in den Abb. 10 und 11 dargestellt, erkrankte ein großer Teil der Tiere 10 bis 18 Tage nach
Krankheitsinduktion schwer. Das am schwersten erkrankte Tier (Nr. 6) musste am 19. Tag bei einem
Behinderungsgrad von 4,5 aus ethischen Gründen getötet werden. Das Tier litt unter einer Tetraplegie
und war nicht mehr zur Nahrungsaufnahme fähig.
Tier getötet
1.Tier
2.Tier
3.Tier
4.Tier
5.Tier
6.Tier
Behinderungsgrad
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
20
25
30
35
Tage nach Injektion
Abb. 10: Darstellung des Krankheitsverlaufs von SJL/J-Mäusen nach Krankheitsinduktion mit
PLP139-151 -Peptid – Tier 1-6
43
IV. Ergebnisse
7.Tier
8.Tier
9.Tier
10.Tier
11.Tier
12.Tier
13.Tier
Behinderungsgrad
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
20
25
30
35
Tage nach Injektion
Abb. 11: Darstellung des Krankheitsverlaufs von SJL/J-Mäusen nach Krankheitsinduktion mit
PLP139-151 -Peptid – Tier 7-13
Die Krankheit nahm bei den SJL/J -Mäusen nach EAE-Induktion mit PLP-Peptid einen meist primär
schubförmigen Verlauf. Der erste Krankheitsschub begann mit sichtbaren Krankheitssymptomen um
den Tag 10-18. Je nach individuellem Krankheitsverlauf verbesserten sich die Symptome nach einem
unterschiedlich langen Zeitraum. Die Tiere zeigten zum Teil noch einen weiteren, meist milder
verlaufenden zweiten Schub mit häufig nicht vollständiger Remission. Danach blieben die Tiere für
einen längeren Zeitraum ohne neue, sichtbare Krankheitssymptome. Nach fünf bis sieben Monaten
verschlechterte sich der Gesundheitszustand der Tiere schleichend und chronisch progredient und
führte bei einigen Tieren sogar zum Tod (nicht dargestellt).
1.4.2. EAE-Induktion mit MBP-Peptid
6 weiblichen, sieben Wochen alten Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J wurden jeweils 50 µg des
MBP-Peptids in 100 µl CFA subkutan in die Flanke injiziert. Die Tiere wurden bis zum 38. Tag nach
Krankheitsinduktion täglich untersucht. In Abb. 12 ist der Krankheitsverlauf der einzelnen Tiere
dargestellt.
44
Behinderungsgrad
IV. Ergebnisse
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Tier 1
Tier 2
Tier 3
Tier 4
Tier 5
Tier 6
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Abb. 12: Darstellung des Krankheitsverlaufs von SJL/J-Mäusen nach Krankheitsinduktion mit
MBP-Peptid
Die an MBP-induzierter EAE erkrankten SJL/J-Mäuse zeigten die ersten Krankheitssymptome bereits
wenige Tage nach Krankheitsinduktion. Der Krankheitsverlauf war jedoch deutlich milder als bei den
SJL-Mäusen, die an PLP-induzierter EAE erkrankt waren. Die Krankheitssymptome bildeten sich
meist völlig zurück, und es konnte auch nach einigen Monaten kein chronisch progredienter
Krankheitsverlauf beobachtet werden.
1.4.3. EAE-Induktion mit Rückenmarkshomogenat
5 weiblichen, sieben Wochen alten Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J wurden jeweils 200 µl einer
Emulsion aus CFA und Rückenmarkshomogenat (siehe II.2.8.6.) subkutan auf zwei verschiedene
Stellen verteilt in die Flanke injiziert. Die Tiere wurden täglich bis zum 36. Tag nach
Krankheitsinduktion untersucht. In Abb. 13 ist der Krankheitsverlauf der einzelnen Tiere dargestellt.
Behinderungsgrad
5.0
4.5
5.Tier
4.Tier
3.Tier
2.Tier
1.Tier
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
20
25
30
35
Tage nach Injektion
Abb. 13: Darstellung des Krankheitsverlaufs von SJL/J-Mäusen nach Krankheitsinduktion mit
Rückenmarkshomogenat in Emulsion mit CFA (SCH = spinal cord homogenate)
45
IV. Ergebnisse
Die Tiere zeigten ca. 10-15 Tage nach Krankheitsinduktion erste Symptome. Die Krankheit verlief
schubförmig mit remittierendem Verlauf und der maximale Behinderungsgrad lag bei 2,5.
1.5. Vergleich der EAE-Modelle
Um eine bessere Aussage über die jeweilige Krankheitsaktivität der verschieden induzierten EAEModelle in den drei Inzuchtstämmen treffen zu können, wurde der sogenannte ‚cumulative disease
index’ (CDI) berechnet und in Abb. 14 für alle untersuchten Modelle dargestellt. Der CDI stellt die
Summe der täglichen Behinderungsgrade (siehe II.2.12.) der ersten 34 Tage nach Krankheitsinduktion
dar.
100
CDI
75
50
25
0
SJL/PLP
SJL/SCH
SJL/MBP
C57BL6/PLP
BALB/c-PLP BALB/c-PLP+PT BALB/c-MBP
BALB/c- MOG
Abb. 14: Darstellung der aus der Summe der täglichen Behinderungsgrade errechneten
Gesamtbehinderungsindizes (cumulative disease index – CDI) der einzelnen Versuchstiere.
Dargestellt sind die Einzelwerte und der Median.
Die Darstellung der CDI in Abb. 14 zeigt, dass die in Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J induzierten
Formen der EAE zur stärksten Krankheitsaktivität führen. In C57BL/6-Mäusen konnte mit PLP nur
eine sehr gering ausgeprägte EAE induziert werden, und auch in BALB/c-Mäusen war der
Krankheitsverlauf in allen vier Fällen deutlich milder als bei SJL-Mäusen.
Aufgrund dieser Ergebnisse wurden alle weiteren EAE-Versuche mit weiblichen SJL/J-Mäusen
durchgeführt. Da sich die drei hier untersuchten, verschieden induzierten Modelle in ihren
Krankheitsverläufen zum Teil erheblich unterscheiden:
-
PLP-Peptid-Induktion: primär schubförmig remittierend, sekundär chronisch progredient,
-
SCH-Induktion: schubförmig,
-
MBP-Peptid-Induktion: monophasisch schubförmig remittierend,
wurden in den folgenden Versuchen mehrere dieser Modelle verwendet.
46
IV. Ergebnisse
2.
Vergleich immunologischer Eigenschaften der verschiedenen Mäusestämme
Die unter IV.1. beschriebenen Ergebnisse der Versuche zur Induktion einer EAE in Tieren
verschiedener Mäusestämme zeigten, dass die Stärke der Erkrankung nicht nur von der auslösenden
Substanz abhängt, sondern ebenso vom eingesetzten Mäusestamm.
Die Mäuse der verschiedenen Inzuchtstämme unterscheiden sich genetisch bezüglich ihres MHCHaplotyps (siehe Tabelle Nr. 12), aber auch bezüglich einer nicht genau definierten Anzahl anderer
genetisch-bedingter Eigenschaften.
Tabelle Nr. 12
MHC-Haplotypen der verwendeten Mäusestämme
Mäusestamm
MHCHaplotyp
SJL/J
H-2s
C57BL/6
H-2b
BALB/c
H-2d
C3H/He
H-2k
Die Vermutung, dass der MHC-Haplotyp der Mäuse bei der Stärke der Krankheitsaktivität eine
wichtige Rolle spielt, liegt nahe, da es auch bei Untersuchungen mit MS-Patienten ähnliche
Ergebnisse gibt, die auf einen Zusammenhang zwischen Erkrankung und MHC-Typ hindeuten
(Epplen 1997).
Neben diesen genetischen Faktoren, die für die Schwere der Erkrankung von Bedeutung sein könnten,
spielt sowohl bei der EAE als auch bei der Multiplen Sklerose das Immunsystem in jeder Phase der
Erkrankung eine entscheidende Rolle. Daher wurden im folgenden zunächst vergleichende
Untersuchungen des Immunsystems der Mäuse der verschiedenen Inzuchtstämme durchgeführt.
Hierzu wurde jeweils 4-5 unbehandelten, gleichaltrigen, weiblichen Tieren der Inzuchtstämme SJL/J,
BALB/c, C57BL/6 und C3H/HeN Blut abgenommen, die Milz sowie ein inguinaler Lymphknoten
entnommen, die darin enthaltenen Lymphozyten gewonnen und mit spezifischen, monoklonalen
Antikörpern (gegen T-, B-, CD4- und CD8-Zellen) angefärbt (siehe II.2.5.). Die prozentuale Anteil der
einzelnen Lymphozytensubpopulationen wurde im Durchflusszytometer bestimmt.
47
IV. Ergebnisse
periphere Blutzellen
Lymphknotenzellen
Milzzellen
% Lymphozyten
100
75
50
25
0
SJL/J-PB
Balb/c-PB
C57Bl/6-PB C3H/NeH-PB
SJL/J-Milz
Balb/c-Milz
C57Bl/6-Milz C3H/NeH-Milz
SJL/LK
Balb/LK
C57Bl/6-LK C3H/NeH-LK
Abb. 15: Prozentualer Anteil der T-Lymphozyten im Blut, in der Milz und in den Lymphknoten
von Mäusen verschiedener Inzuchtstämme
In Abb. 15 sind die prozentualen Anteile der T-Lymphozyten im Blut, in der Milz und im
Lymphknoten einzelner Mäuse der verschiedenen Inzuchtstämme als Einzelwerte mit Median
dargestellt. Es ist deutlich zu sehen, dass SJL/J-Mäuse vor allem im Blut, aber auch in der Milz, einen
höheren Anteil von T-Lymphozyten hatten als die Tiere der drei anderen Inzuchtstämme. C57BL/6Mäuse, in denen es wie unter IV.1. beschrieben kaum möglich war eine EAE-Erkrankung zu
induzieren, hatten dagegen im Vergleich zu den Mäusen der anderen Stämme einen besonders
geringen Anteil von T-Lymphozyten in allen drei Kompartimenten. Im Vergleich zu den C57BL/6Tieren war der prozentuale Anteil der T-Lymphozyten im Blut von SJL-Mäusen im Mittel um 172 % ,
in der Milz um 119 % und im Lymphknoten um 22,5 % höher.
Lymphknotenzellen
Milzzellen
periphere Blutzellen
% Lymphozyten
75
50
25
0
SJL/J-PB
Balb/c-PB
C57Bl/6-PB C3H/NeH-PB
SJL/J-Milz
Balb/c-Milz C57Bl/6-Milz C3H/NeH-Milz
SJL/J-LK
Balb/c-LK
C57Bl/6-LK C3H/NeH-LK
Abb. 16: Prozentualer Anteil der T-Helfer-Zellen im Blut, in der Milz und in den Lymphknoten
von Mäusen verschiedener Inzuchtstämme
In Abb. 16 ist der prozentuale Anteil CD4-positiver Lymphozyten (= T-Helfer-Zellen, Th -Zellen) im
Blut, in der Milz und in den Lymphknoten der Mäuse der vier verschiedenen Inzuchtstämme
dargestellt. C57BL/6-Mäuse hatten in allen drei Kompartimenten den geringsten Anteil an T-HelferZellen. Im Vergleich dazu hatten SJL-Mäuse im Blut einen um 248 % und in der Milz einen um 135
% höheren Anteil T-Helfer-Zellen. Der prozentuale Anteil von Th -Zellen im Blut und in der Milz der
48
IV. Ergebnisse
Tiere der Inzuchtstämme BALB/c und C3H/HeN lag zwischen dem der SJL- und C57BL/6-Mäuse. Im
Lymphknoten war der Anteil der T-Helfer-Zellen bei SJL-, BALB/c- und C3H/HeN-Mäusen ähnlich
hoch. Nur C57BL/6-Mäuse hatten auch hier einen wesentlich geringeren Anteil an Th -Zellen.
% Lymphozyten
Lymphknotenzellen
Milzzellen
periphere Blutzellen
40
30
20
10
0
SJL/J-PB
Balb/c-PB
C57Bl/6-PB
C3H/NeH-PB
SJL/J-Milz
Balb/c-Milz
C57Bl/6-Milz
C3H/NeH-Milz
SJL/J-LK
Balb/c-LK
C57Bl/6-LK
C3H/NeH-LK
Abb. 17: Prozentualer Anteil CD8-positiver Lymphozyten im Blut, in der Milz und in den
Lymphknoten von Mäusen verschiedener Inzuchtstämme
Wie in Abb. 17 dargestellt, war der prozentuale Anteil CD8-positiver Lymphozyten im Blut von SJLMäusen um mehr als 100% höher als der Anteil CD8-positiver Lymphozyten im Blut der Tiere der
drei anderen Inzuchtstämme. In den Milzen war der Anteil an CD8-Zellen bei allen vier
Mäusestämmen vergleichbar hoch. In den Lymphknoten war der Anteil CD8-positiver Lymphozyten
bei Tieren der Stämme SJL und C57BL/6 sowie der, der Stämme BALB/c und C3H/HeN, jeweils
vergleichbar hoch, aber bei SJL und C57BL/6 deutlich höher als bei den anderen beiden Stämmen.
Ferner wurde der prozentuale Anteil an B-Lymphozyten im Blut, in der Milz und in den Lymphknoten
von Tieren der vier Mäusestämme untersucht (Daten nicht dargestellt). Im Vergleich zu dem
prozentualen Anteil an B-Lymphozyten von SJL-Mäusen lag der Anteil der B-Lymphozyten im Blut
von C57BL/6-Mäusen um 53,5 %, in der Milz um 47 % und im Lymphknoten um 102 % höher.
BALB/c-Mäuse hatten ebenfalls einen relativ hohen Anteil an B-Lymphozyten in allen drei
Kompartimenten, wohingegen C3H/HeN eher einen geringeren Anteil an B-Lymphozyten aufwiesen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die Mäuse der verschiedenen Inzuchtstämme in der
Zusammensetzung der Lymphozytenpopulationen der Immunorgane Blut, Milz und Lymphknoten
stark voneinander unterscheiden. Die besonders schwer an EAE erkrankenden Tiere des SJL-Stammes
hatten deutlich mehr T-Lymphozyten, insbesondere mehr CD4-positive, aber auch CD8-positive
Lymphozyten, und deutlich weniger B-Lymphozyten als die Tiere des C57BL/6-Stammes, in denen
gar nicht oder nur schwer eine EAE induziert werden konnte. BALB/c-Mäuse lagen sowohl in der
Schwere der EAE-Symptome als auch in der prozentualen Verteilung von T-, B-, CD4- und CD8Zellen zwischen SJL- und C57BL/6-Mäusen.
49
IV. Ergebnisse
3. Untersuchung der Wirkung von Lipo-X auf verschiedene Komponenten des
Immunsystems
Zunächst wurde untersucht, ob Lipo-X eine Wirkung auf die Auslösung oder die Schwere des
Krankheitsverlaufs der EAE in Mäusen hat.
3.1. Untersuchungen mit an EAE erkrankten Mäusen
3.1.1. Ergebnisse des Therapieversuchs mit Lipo-X bei Mäusen des Inzuchtstammes BALB/c nach
Krankheitsinduktion mit PLP-Peptid
Pro Versuchsgruppe wurden jeweils vier weiblichen, sechs bis acht Wochen alten Mäusen des
Inzuchtstammes BALB/c am Tag 0 zur Krankheitsinduktion 100 µg PLP 139-151 -Peptid in Emulsion mit
CFA subkutan in die Flanke injiziert.
Folgende Versuchsgruppen wurden gebildet:
1. keine Therapie = Kontrollgruppe,
2. ab Tag 0 jeden 2. Tag, 2 mg Lipo-X in 200 µl PBS gelöst i.p. injiziert,
3. ab Tag 5 jeden 2. Tag, 2 mg Lipo-X in 200 µl PBS gelöst i.p. injiziert.
Die Tiere aller Versuchsgruppen wurden jeden Tag bis zum 37. Tag nach Krankheitsinduktion
untersucht und mit Hilfe der unter II.2.12. beschriebenen Skala zur Quantifizierung der EAESymptome bei Mäusen der Behinderungsgrad beurteilt.
In den folgenden Diagrammen sind die täglich gemessenen Behinderungsgrade dargestellt.
2.0
Tier 1
Behinderungsgrad
Tier 2
Tier 4
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Tage nach Krankheitsinduktion
Abb. 18: Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/c-Mäusen ohne
Behandlung
50
IV. Ergebnisse
Tier 3 dieser Versuchsgruppe starb am zweiten Tag nach Auslösung der EAE, ohne irgendwelche
Krankheitssymptome gezeigt zu haben. Die übrigen drei Tiere zeigten deutliche Krankheitsmerkmale
bis zu einem maximalen Behinderungsgrad von 1,5.
Behinderungsgrad
2.0
Tier 1
Tier 2
Tier 3
1.5
Tier 4
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Tage nach Krankheitsinduktion
Abb. 19: Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/c-Mäusen, die am
Tag 0 (= Tag der EAE-Induktion) erstmalig mit Lipo-X behandelt worden waren
Behinderungsgrad
2.0
Tier 1
Tier 2
Tier 3
Tier 4
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Tage nach Krankheitsinduktion
Abb. 20: Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/c-Mäusen, die am
Tag 5 nach EAE-Induktion erstmalig mit Lipo-X behandelt worden waren
Die in Abb. 19 und 20 dargestellten Krankheitsverläufe nach Therapie mit Lipo-X zeigen, dass
ebenfalls alle Versuchstiere an einer EAE erkrankten.
Um einen besseren Vergleich zwischen den drei Versuchsgruppen ziehen zu können, wurde der
sogenannte ‚cumulative disease index’-CDI berechnet und in Abb. 21 dargestellt.
51
IV. Ergebnisse
30
20
C
DI
10
0
Kontrollgruppe
Lipo-X Tag 0
Lipo-X Tag 5
Abb. 21: Darstellung des ‚cumulative disease index’-CDI der Tiere der drei Versuchsgruppen des
Therapieversuchs mit Lipo-X in BALB/c-Mäusen. Einzelwerte und Median
Wie Abb. 21 zeigt, ist der CDI der Tiere der Kontrollgruppe deutlich höher, als derjenige der Tiere,
die mit Lipo-X ab dem Tag 0 behandelt worden waren. Diese Differenz ist nach Berechnung mit dem
Mann-Whitney U-Test nur knapp nicht signifikant (p=0,057). Der Median der CDI der mit Lipo-X ab
Tag 5 behandelten Tiere ist zwar auch niedriger als der Median der Kontrollgruppe, die Einzelwerte
sind aber stärker gestreut (p=0,229). Dieses deutet daraufhin, dass ein möglichst frühzeitiger
Therapiebeginn sich positiv auf die Therapie mit Lipo-X auswirkt, und das diese Therapie einen
durchaus positiven Effekt auf den Krankheitsverlauf und die Schwere der Erkrankung bei an EAE
erkrankten BALB/c-Mäusen hat.
3.1.2. Ergebnisse des Blindversuchs mit Lipo-X bei Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J nach
Krankheitsinduktion mit PLP-Peptid
Aufgrund der unter IV.3.1.1. beschriebenen Ergebnisse des Therapieversuchs mit BALB/c-Mäusen
wurde ein weiterer Therapieversuch mit PLP-induzierter EAE bei SJL/J-Mäusen durchgeführt. Das
Modell der PLP-induzierten EAE in SJL-Mäusen wurde ausgewählt, da dieses Modell, wie in IV.1.4.
dargestellt, die schwersten Krankheitsverläufe aller in dieser Arbeit untersuchten EAE-Modelle zeigte.
Um eine subjektive Beeinflussung der Beurteilung der Krankheitsaktivität durch den Operator
auszuschließen, wurde ein sogenannter Blindversuch durchgeführt. D.h. den Tieren einer
Versuchsgruppe wurde eine unbekannte Substanz A, den Tieren einer anderen Versuchsgruppe eine
unbekannte Substanz B intraperitoneal appliziert. Die Person, welche die Versuchstiere untersuchte,
wusste auf diese Art und Weise nicht, welches Tier welche Substanz bekommen hatte. In diesem
Versuch wurde ein prophylaktischer Ansatz gewählt, d.h. die Versuchstiere bekamen je 200 µl der
Substanz A oder B bereits erstmalig neun Tage (Tag –9) vor Induktion der EAE intraperitoneal
appliziert. Bis zum Ende des Untersuchungszeitraums am Tag 34 nach EAE-Induktion wurde den
52
IV. Ergebnisse
Tieren jeden zweiten Tag Substanz A oder B appliziert. Am Tag 0 wurde die EAE durch subkutane
Injektion von 100 µg PLP 139-151 -Peptid in Emulsion mit CFA induziert.
In den nachfolgenden Diagrammen (Abb. 22 und 23) sind die Krankheitsverläufe der einzelnen Tiere
der Versuchsgruppen bis zur Entblindung am Tag 34 nach Auslösung der EAE dargestellt.
Behinderungsgrad
5
4
3
Tier 1
Tier 2
Tier 3
Tier 4
Tier 5
2
PLP/CFA
Injektion
s.c.
1
0
-10
-5
0
5
Behinderungsgrad
5
4
3
Tier 9
Tier 8
Tier 7
Tier 6
2
10
15
20
25
30
35
20
25
30
35
Versuchstage
PLP/CFA
Injektion
s.c.
1
0
-10
-5
0
5
10
15
Versuchstage
Abb. 22: Darstellung der Krankheitsverläufe bei an EAE erkrankten Tieren, die mit PBS
behandelt worden waren
Am 34. Tag nach Krankheitsinduktion wurde der Versuch entblindet: Substanz A = PBS, Substanz B
= Lipo-X in PBS gelöst.
Wie in Abb. 22 und 23 dargestellt ist der Krankheitsverlauf bei den mit Lipo-X behandelten
Versuchstieren deutlich schwächer, als bei denen der Kontrolltiere.
53
IV. Ergebnisse
Behinderungsgrad
5
Tier 5
Tier 4
Tier 3
Tier 2
Tier 1
4
3
2
1
0
-10
-5
Tier 6
Tier 7
Tier 8
Tier 9
Tier 10
5
Behinderungsgrad
PLP/CFA
Injektion
s.c.
4
3
2
0
5
10
15
20
25
30
35
Versuchstage
PLP/CFA
Injektion
s.c.
1
0
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
Versuchstage
Abb. 23: Darstellung der Krankheitsverläufe bei an EAE erkrankten Tieren, die mit Lipo-X
(ab Tag –9) behandelt worden waren
Im folgenden Diagramm (Abb. 24) ist der CDI jedes einzelnen Versuchstiers dargestellt.
Es zeigt sich ein deutlicher Unterschied bezüglich des CDI zwischen den mit PBS und den mit Lipo-X
behandelten Tieren. Acht von zehn Versuchstiere, die mit Lipo-X behandelt worden waren, zeigten
keinerlei Symptome einer EAE.
CDI
25
20
15
verstorben
am Tag 3
10
5
0
-5
PBS
Lipo-X
Abb. 24: Darstellung des aus der Summe der täglichen Behinderungsgrade errechneten CDI der
Tiere der beiden Versuchsgruppen des Blindversuchs
54
IV. Ergebnisse
Der CDI der mit Lipo-X behandelten Versuchstiere war statistisch signifikant niedriger als der CDI
der mit PBS behandelten Tiere (p = 0,003, im Mann-Whitney U-Test).
Ein Tier der Gruppe A (PBS; Tier Nr. 10) verstarb am Tag 3 nach Auslösung der EAE während der
Ethernarkose. Da es sich in diesem Fall nicht um eine Wirkung der Substanz Lipo-X handeln kann,
wurde das Tier bei der statistischen Berechnung nicht mit berücksichtigt.
3.1.3. Ergebnisse des Therapieversuchs mit Lipo-X in Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J nach
Krankheitsinduktion mit MBP-Peptid
Im Folgenden wurde die therapeutische Wirksamkeit von Lipo-X in SJL-Mäusen nach
Krankheitsinduktion mit MBP 87-99 -Peptid untersucht. Hierzu wurden 12 weiblichen, sieben Wochen
alten Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J jeweils 50 µg MBP-Peptid in 100 µl Emulsion mit CFA
subkutan in die Flanke injiziert. Vier Tage später wurden sechs dieser Tiere das erstemal 2 mg Lipo-X
in 200 µl PBS intraperitoneal injiziert. Die Lipo-X-Injektion wurde jeden 2. Tag wiederholt und die
Tiere 35 Tage lang täglich untersucht.
40
CDI
30
20
10
0
Kontrolle
Lipo -X
Abb. 25: CDI der einzelnen Versuchstiere nach Krankheitsinduktion mit MBP-Peptid und
Therapie mit Lipo-X; Einzelwerte und Median
Wie in Abb. 25 dargestellt war der mittlere CDI der mit Lipo-X behandelten Tiere deutlich, aber nicht
signifikant niedriger (p=0,065; Mann-Whitney U-Test) als der mittlere CDI der nicht therapierten
Kontrolltiere.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass es in drei unterschiedlichen EAE-Modellen (1. PLP-Induktion in
BALB/c-Mäusen, 2. PLP-Induktion in SJL-Mäusen, 3. MBP-Induktion in SJL-Mäusen) als Folge der
Therapie mit Lipo-X zu einer Verbesserung der Krankheitssymptome bzw. zur Verhinderung der
Entstehung von Krankheitssymptomen kam.
55
IV. Ergebnisse
3.2. In vitro Versuche mit Lipo-X
Die unter IV.3.1. dargestellten Ergebnisse der Therapieversuche belegen die Wirksamkeit von Lipo-X
bei der Behandlung der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis. Im Folgenden wurde nun
untersucht, ob und in wie weit die therapeutische Wirkung von Lipo-X auf immunologische
Mechanismen zurückzuführen ist.
3.2.1. Untersuchungen der Zellproliferation sowie des apoptotischen Zelltods von Leukozyten nach
Stimulation mit Lipo-X
Sowohl die EAE als auch die MS gelten als T-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankungen.
Immunologische Parameter spielen sowohl bei der Auslösung als auch bei der Manifestation sowie
Remission der Erkrankungen eine wichtige Rolle. Nach heutiger Lehrmeinung wird davon
ausgegangen, dass in der Peripherie aktivierte Leukozyten ins zentrale Nervensystem gelangen und
hier eine Entzündungsreaktion gegen ZNS-Komponenten einleiten. Im Rahmen der Gegenregulation
eines Entzündungsprozesses spielt die Apoptose von Leukozyten eine wichtige Rolle.
Im Folgenden wurde daher untersucht, ob und in wie weit Lipo-X eine Wirkung auf die Proliferation
und Apoptose von Leukozyten hat.
a. Proliferationsassay mit 3 H-Thymidin
Mit Hilfe des 3 H-Thymidin-Proliferationsassays (siehe II.2.13.) wurde die Proliferation von
Lymphknoten- und Milzzellen nach spezifischer Stimulation mit PLP-Peptid bzw. nach unspezifischer
Stimulation mit Con A sowie die Wirkung von Lipo-X in verschiedenen Konzentrationen auf die
Proliferation der Zellen analysiert.
In Abb. 26 sind die Ergebnisse des Versuchs nach Inkubation mit dem PLP 139-151 -Peptid dargestellt. Es
fällt auf, dass die Wirkung von Lipo-X auf die Proliferation der Zellen nach Stimulation mit PLPPeptid konzentrationsabhängig ist. Nach Inkubation der Lymphknoten- bzw. der Milzzellen mit 1 mg
Lipo-X pro ml Kulturmedium wird die Proliferation der PLP-spezifischen Zellen gehemmt,
wohingegen nach Inkubation mit den niedrigeren Konzentrationen Lipo-X die Proliferationsrate der
PLP-spezifischen Zellen sehr deutlich ansteigt.
56
7000
3000
6000
2500
5000
2000
4000
H-Thymidine
3500
1500
2000
3
1000
3000
3
H-Thymidin
IV. Ergebnisse
1000
500
0
0
Medium1
Medium2
1 mg/ml
0,2 mg/ml
Medium1
0,004 mg/ml
Medium2
1 mg/ml
0,2 mg/ml
0,004 mg/ml
Lipo -X
Lipo-X
PLP (10 µg/ml)
PLP (10 µg/ml)
B
A
Abb. 26: Messung des 3 H-Thymidin-Einbaus nach Inkubation von Lymphknoten-Zellen (A) und
Milz-Zellen (B) mit PLP-Peptid und Lipo-X (Medium 1 = Kontrolle nur Kulturmedium;
25000
40000
20000
H-Thymidine (counts)
50000
30000
10000
3
20000
15000
3
H-Thymidine uptake (counts)
Medium 2 = Kontrolle mit PLP-Peptid)
10000
5000
0
0
Medium1
Medium2
1 mg/ml
0,2 mg/ml
0,004 mg/ml
Medium1
Lipo -X
Medium2
1 mg/ml
0,2 mg/ml 0,004 mg/ml
Lipo-X
ConA (2 µg/ml)
ConA (2 µg/ml)
A
B
Abb. 27: Messung des 3 H-Thymidin-Einbaus nach Inkubation von Lymphknoten-Zellen (A) und
Milz-Zellen (B) mit Con A und Lipo-X (Medium 1 = Kontrolle nur Kulturmedium; Medium 2 =
Kontrolle mit Con A)
Wie in Abb. 27 dargestellt, ist auch die Wirkung von Lipo-X auf die Proliferation von unspezifisch
mit Con A aktivierten Zellen konzentrationsabhängig. Nach Inkubation der Lymphknoten- und
Milzzellen mit Lipo-X in der höchsten hier eingesetzten Konzentration (1 mg/ml) wurde eine sehr
deutliche Hemmung der Proliferation der mit Con A stimulierten Zellen beobachtet. Nach Inkubation
mit den niedrigeren Konzentrationen von Lipo-X (0,2 bzw. 0,0004 mg/ml) gab es einen leichten
57
IV. Ergebnisse
Anstieg der Proliferationsrate der mit Con A-stimulierten Lymphknotenzellen und eine leichte
Hemmung der Proliferation der Milzzellen nach Stimulation mit Con A.
b. Messung des apoptotischen Zelltods mittels Annexin V/Propidiumjodid-Technik und TUNELMethode
Je 2 x 105 Zellen einer, wie unter II.2.8.2. beschrieben, hergestellten Milzzellsuspension (Milz einer
adulten, weiblichen SJL/J-Maus) wurden in 1 ml RPMI-Medium mit 5 % FCS 24 bzw. 48 h lang im
Brutschrank bei 37°C und 5 % CO2 in sterilen FACS-Röhrchen inkubiert. Die im folgenden
aufgeführten Mengen von Lipo-X wurden den Ansätzen zugesetzt:
-
Medium-Kontrolle: ohne Lipo-X,
-
0,1 µg, 0,5 µg, 2 µg, 10 µg, 50 µg sowie 200 µg Lipo-X pro Ansatz.
Nach 24 und 48 Stunden wurde mit Hilfe der Annexin V/Propidiumjodid-Methode (siehe II.2.2.3.)
sowie mittels TUNEL-Methode (siehe II.2.2.2.) der Anteil derjenigen Milzzellen bestimmt, die
apoptotisch wurden.
In beiden Fällen konnte weder nach 24 noch nach 48 Stunden Inkubation mit Lipo-X eine Zunahme
oder Abnahme des prozentualen Anteils apoptotischer Lymphozyten in der Zellsuspension im
Vergleich zur Mediumkontrolle (Daten nicht dargestellt) beobachtet werden.
3.2.2. Untersuchung der Zytokinproduktion von Leukozyten nach Stimulation mit Lipo-X
Zytokine vermitteln zahlreiche Interaktionen zwischen den Zellen des Immunsystems. Bei der
Vermittlung des Entzündungsprozesses bei einer Enzephalomyelitis scheinen sie von entscheidender
Bedeutung zu sein. Aus diesem Grund wurde die Wirkung von Lipo-X auf die Zytokin-Produktion
von Leukozyten in vitro untersucht.
Je 50 µl Vollblut einer weiblichen adulten SJL-Maus wurden 24 bzw. 48 h lang in 1 ml Kulturmedium
(RPMI+5 % FCS) zusammen mit Lipo-X in folgenden Konzentrationen im Brutschrank (37 C, 7 %
CO2 ) inkubiert: ohne Lipo-X (Mediumkontrolle), 0,1 µg, 0,5 µg, 2 µg, 10 µg, 50 µg bzw. 200 µg.
Anschließend wurde mit Hilfe eines CBA-Testsystems (siehe II.2.6.) die Konzentration von
Interleukin-2 (IL-2), IL-4, IL-5, TNF-α und IFN-γ im Zellkulturüberstand bestimmt.
Die Konzentration der Th2-typischen Zytokine IL-4 und IL-5 blieb in allen Ansätzen, sowohl nach 24
als auch nach 48 Stunden Inkubation unverändert, unterhalb des Detektionslimits des Testsystems (10
pg/ml)(Daten nicht dargestellt).
Ferner wurde nach Inkubation mit Lipo-X in keinem der Versuchsansätze eine erhöhte Konzentration
des auch als T-Zell-Wachstumsfaktor bekannten IL-2 gemessen.
58
IV. Ergebnisse
20
pg/ml
15
10
5
0
o. Dex 0,1 µg 0,5 µg
2 µg
10 µg
50 µg
200 µg o. Dex 0,1 µg 0,5 µg
2 µg
10 µg
50 µg
200 µg
48 h
24 h
Abb. 28: Interferon-γγ Konzentration im Zellkulturüberstand von murinen peripheren Blutzellen
nach Stimulation mit Lipo-X
In Abb. 28 sind die nach 24- bzw. 48-stündiger Inkubation mit Lipo-X im Zellkulturüberstand
gemessenen IFN-γ Konzentrationen dargestellt. Nach 24-stündiger Inkubation mit 0,1 µg, 0,5 µg und
2 µg Lipo-X war zwar ein leichter Anstieg der IFN-γ Konzentration zu beobachten, diese Werte lagen
jedoch alle in der Nähe des Detektionslimits des Testsystems.
100
pg/ml
75
50
25
0
o. Dex
0,1 µg 0,5 µg
2 µg
10 µg
24 h
50 µg
200 µg o. Dex
0,1 µg 0,5 µg
2 µg
10 µg
50 µg
200 µg
48 h
Abb. 29: TNF-α
α Konzentration im Zellkulturüberstand von murinen peripheren Blutzellen nach
Stimulation mit Lipo-X
Wie in Abb. 29 dargestellt, stieg die TNF-α Konzentration im Kulturüberstand peripherer Blutzellen
nach 24-stündiger Inkubation mit 0,1 µg, 0,5 µg, 2 und 10 µg Lipo-X im Vergleich zur TNF-α
Konzentration der Mediumkontrolle deutlich an. Bei höheren Konzentrationen (50 und 200 µg) von
59
IV. Ergebnisse
Lipo-X kam es allerdings zu einer Abnahme der TNF-α Konzentration. Nach 48 h stieg die TNF-α
Konzentration im Versuchsansatz ohne Zugabe von Lipo-X, nur mit Kulturmedium (RPMI+5 % FCS)
auf 75 pg/ml an. Der Zellkulturüberstand des Versuchsansatzes mit 10 µg Lipo-X enthielt nach 48 h
noch mehr TNF-α als die Mediumkontrolle, alle anderen Ansätze lagen jedoch deutlich darunter. Vor
allem die mit 200 µg Lipo-X inkubierten Zellen produzierten deutlich weniger TNF-α als die nur mit
Kulturmedium inkubierten Zellen.
3.3. Untersuchungen der Wirkung von Lipo-X auf das Immunsystem naiver Mäuse
Um die Wirkungsweise von Lipo-X auf Komponenten des Immunsystems besser zu verstehen sind
neben den in vitro-Untersuchungen auch in vivo-Untersuchungen von Interesse.
Im Folgenden sind die Ergebnisse der immunologischen Untersuchungen an gesunden adulten Mäusen
dargestellt, denen Lipo-X injiziert worden war. Insgesamt 15 weiblichen SJL-Mäusen wurden jeweils
2 mg Lipo-X in 200 µl PBS gelöst intraperitoneal an den Tagen 0, 2 und 4 injiziert. Jeweils einen Tag
nach der Lipo-X-Injektion (1. Tag, 3. Tag und 5. Tag nach der 1. Lipo-X-Injektion) wurden 5 Tiere
getötet, Blut und Milz entnommen und eine Peritoneal-Spülung durchgeführt. Zur Kontrolle dienten
drei gleichaltrige SJL-Mäuse, denen keinerlei Substanz injiziert wurde.
Wie unter II.2.5. beschrieben, wurden in den gewonnenen Zellsuspensionen (Blut, Milzzellsuspension,
Peritoneal Exudate Cells) der prozentuale Anteil T-, B-, CD4- und CD8-Zellen, sowie Granulozyten
und Monozyten durchflusszytometrisch bestimmt.
% Lymphozyten
80
60
40
20
0
Blut/Kontr. Blut/1.Tag Blut/3.Tag Blut/5.Tag Milz/Kontr. Milz/1.Tag Milz/3.Tag Milz/5.Tag PEC/Kontr.
PEC/1.Tag PEC/3.Tag PEC/5.Tag
Abb. 30: Prozentualer Anteil der T-Lymphozyten im Blut, in der Milz- und der Peritoneal
(PEC)-Zellsuspension am 1., 3. und 5. Tag nach der ersten i.p. Injektion von Lipo-X. Dargestellt
sind die Einzelwerte, sowie der jeweilige Median
In Abb. 30 ist der prozentuale Anteil der T-Lymphozyten nach intraperitonealer Injektion von Lipo-X
dargestellt. Bereits einen Tag nach der ersten Lipo-X-Injektion war ein Anstieg des prozentualen
Anteils der T-Lymphozyten in der durch Peritoneal Spülung gewonnenen Zellsuspension zu
beobachten. Im Vergleich zum Anteil der T-Lymphozyten der Kontrolltiere stieg der Anteil der T-
60
IV. Ergebnisse
Lymphozyten der am ersten Tag nach der ersten Lipo-X Injektion gewonnenen Peritoneal Exudate
Cells (PEC) im Mittel um 86,8 % an, nach drei Tagen um 66,7 % und nach fünf Tagen um 121,4 %.
% Lymphozyten
100
75
50
25
0
Blut/Kontr. Blut/1.Tag
Blut/3.Tag
Blut/5.Tag Milz/Kontr. Milz/1.Tag Milz/3.Tag Milz/5.Tag PEC/Kontr.
PEC/1.Tag PEC /3.Tag PEC/5.Tag
Abb. 31: Prozentualer Anteil der B-Lymphozyten im Blut, in der Milz- und PeritonealZellsuspension am 1., 3. und 5. Tag nach der ersten i.p. Injektion von Lipo-X
Wie in Abb. 31 dargestellt, war der prozentuale Anteil der B-Lymphozyten in der durch Peritoneal
Spülung gewonnenen Zellsuspension erheblich höher als im Blut und in der Milz von SJL-Mäusen.
Initial, d.h. einen Tag nach der ersten Lipo-X-Injektion, sank der Anteil der B-Lymphozyten bei den
PEC, stieg aber nach drei bzw. fünf Tagen wieder an.
Der prozentuale Anteil CD4-positiver Lymphozyten blieb im Blut und in der Milz der mit Lipo-X
behandelten Tiere im Vergleich zu dem der Kontrolltiere unverändert (Daten nicht dargestellt).
Allerdings stieg der Anteil der Th -Zellen bei den PEC von 6,4 % (angegeben ist jeweils der
Mittelwert) bei den Kontrolltieren auf 12,2 % am ersten Tag nach der ersten Lipo-X-Injektion, 10,6 %
am dritten Tag und 14,5 % am fünften Tag.
Auch bei dem prozentualen Anteil an CD8-Zellen fanden sich in den drei Kompartimenten keinerlei
Unterschiede, jedoch fiel auf, dass bei allen Versuchstieren, einschließlich der Kontrolltiere, der Anteil
CD8-positiver Lymphozyten bei den Peritonealzellen mit ca. 2 % äußerst niedrig war (Daten nicht
dargestellt).
Während der durchflusszytometrischen Messung der mittels Peritoneal Spülung gewonnenen
Leukozyten fiel bei der Auftragung der gemessenen Vorwärts- und Seitwärtsstreuung des Lichts durch
die Zellen, bei denen Größe und Granularität der gemessenen Leukozyten erfasst werden, eine
deutliche Veränderung der Zellpopulationen auf. In Abb. 32 sind die Streulichteigenschaften der PEC
der Kontrolltiere (A) sowie der Versuchstiere nach einem (B) und nach fünf Tagen (C) nach der ersten
Lipo-X-Injektion dargestellt (SSC/FSC, die jeweils links aufgetragenen Diagramme).
61
IV. Ergebnisse
rot gefaerbte Zellen
R1
A. Kontrolle
B. 1. Tag nach i.p. Injektion
R2
gruen gefaerbte Zellen
C. 5. Tag nach i.p. Injektion
Abb. 32: Wirkung der intraperitonealen Injektion von Lipo-X auf die Streu-Eigenschaften der
durch Peritoneal-Spülung gewonnenen Zellpopulationen
In der rechten Spalte wurde die jeweilige Fluoreszenzintensität der Zellen nach Markierung mit dem
Fluoreszein-markierten anti-Granulozyten Antikörpern dargestellt. Bei den unbehandelten
Kontrolltieren (A) fand sich im Peritoneum eine Zellpopulation (rot gefärbt) bestehend aus großen,
kompakten bzw. granulären Zellen, die durch den verwendeten Antikörper schwach markiert wurden.
Fünf Tage (C) nach der ersten Injektion war der Anteil dieser Zellen erheblich zurückgegangen
62
IV. Ergebnisse
zugunsten einer Population deutlich kleinerer granulärer Zellen (grün gefärbt). Diese Zellen wurden
von dem Anti-Granulozyten-Antikörper stark markiert. Am ersten Tag nach der ersten Injektion mit
Lipo-X (B) konnten beide Zellpopulationen, sowohl in der Darstellung der Streulichteigenschaften als
auch nach Fluoreszenzmarkierung, nachgewiesen werden. Der verwendete Antikörper markiert das
Molekül Ly6G, das sich u.a. in geringen Mengen auf der Oberfläche von Eosinophilen und Monozyten
findet und in großen Mengen auf der Zelloberfläche von basophilen und neutrophilen Granulozyten.
Zur weiteren Charakterisierung der PEC wurde eine Färbung nach Pappenheim durchgeführt (siehe
II.2.10).
Abb. 33: Ausstrich der PEC einer unbehandelten adulten SJL-Maus, Färbung nach
Pappenheim. Einige Monozyten sind mit roten Pfeilen gekennzeichnet
In Abb. 33 ist ein Ausstrich der durch Peritoneal Spülung gewonnenen Zellen einer unbehandelten
Maus nach Pappenheim-Färbung dargestellt. Man sieht zahlreiche kleine, schwarz gefärbte,
mononukleäre Zellen, bei denen es sich um Lymphozyten handelt, sowie wenige große, schwarz
gefärbte, mononukleäre Zellen (=Monozyten). Vereinzelt fanden sich ferner violett gefärbte, kleine
Zellen, bei denen es sich um Granulozyten handelt.
63
IV. Ergebnisse
Abb. 34: Ausstrich der PEC einer adulten SJL-Maus nach intraperitonealer Injektion von
Lipo-X, Färbung nach Pappenheim. Einige Granulozyten sind mit roten Pfeilen gekennzeichnet
In Abb. 34 ist ein nach Pappenheim gefärbter Ausstrich von PEC einer Maus nach Injektion von LipoX dargestellt. Deutlich erkennbar ist der große Anteil violett gefärbter Granulozyten.
Die quantitative Auswertung des Anteils der Monozyten und Granulozyten erfolgte durch Analyse der
durchflusszytometrischen Daten (siehe Abb. 35 und 36).
40
%
30
20
10
0
Blut/Kontr. Blut/1.Tag Blut/3.Tag
Blut/5.Tag Milz/Kontr. Milz/1.Tag
Milz/3.Tag
Milz/5.Tag PEC/Kontr.
PEC/1.Tag PEC/3.Tag PEC/5.Tag
Abb. 35: Prozentualer Anteil der Monozyten im Blut, in der Milz- und in der PeritonealZellsuspension am 1. ,3. und 5. Tag nach der ersten i.p. Injektion mit Lipo-X
64
IV. Ergebnisse
30
%
20
10
0
Blut/Kontr.
Blut/1.Tag Blut/3.Tag Blut/5.Tag Milz/Kontr. Milz/1.Tag Milz/3.Tag Milz/5.Tag PEC/Kontr.
PEC/1.Tag PEC/3.Tag PEC/5.Tag
Abb. 36: Prozentualer Anteil der Granulozyten im Blut, in de r Milz- und in der Peritoneal Zellsuspension am 1. ,3. und 5. Tag nach der ersten i.p. Injektion mit Lipo-X
Der prozentuale Anteil der Monozyten im Peritoneum von Versuchstieren nahm, wie in Abb. 35
dargestellt, nach peritonealer Injektion von Lipo-X deutlich ab. Diese Wirkung des Lipo-X war bereits
am ersten Tag nach der ersten Injektion sichtbar, wurde aber im Laufe der Zeit immer deutlicher. Die
Abnahme des Anteils der Monozyten nach Injektion von Lipo-X war nach fünf Tagen signifikant
(p=0,036).
Noch beeindruckender war die in Abb. 36 dargestellte Zunahme des prozentualen Anteils der
Granulozyten im Peritoneum von Versuchstieren nach Injektion von Lipo-X. Der Anteil der
Granulozyten erhöhte sich von im Mittel 0,33 % bei den Kontrolltieren auf 3,15 % am ersten Tag
(p=0,036), 14,33 % am dritten Tag (p=0,057) und 16,41 % (p=0,036) am fünften Tag nach der ersten
Lipo-X-Injektion.
Neben der durchflusszytometrischen Untersuchung der verschiedenen Zellpopulationen wurde eine
intrazelluläre Zytokin-Färbung der aus dem Blut, der Milz und dem Peritoneum der Kontrolltiere bzw.
der Versuchstiere nach Lipo-X-Injektion gewonnenen Zellen durchgeführt (siehe II.2.4.).
% Lymphozyten
15
10
5
0
Blut/Kontr. Blut/1.Tag Blut/3.Tag Blut/5.Tag Milz/Kontr. Milz/1.Tag Milz/3.Tag Milz/5.Tag PEC/Kontr.
PEC/1.Tag PEC/3.Tag PEC/5.Tag
Abb. 37: Prozentualer Anteil Interferon-γγ produzierender Lymphozyten im Blut, in der Milzund in der PEC-Zellsuspension am 1. ,3. und 5. Tag nach der ersten i.p. Injektion mit Lipo-X.
Einzelwerte und Median
65
IV. Ergebnisse
Es wurde jeweils der Anteil der Interferon-γ- (Abb. 37) sowie der Interleukin-4- (Daten nicht
dargestellt) produzierenden Lymphozyten ermittelt. Der prozentuale Anteil IL-4-produzierender
Zellen nach Lipo-X-Injektion unterschied sich in allen drei Immunorganen nicht von dem der
Kontrolltiere.
Wie in Abb. 37 dargestellt, stieg der Anteil der IFN-γ produzierenden Lymphozyten sowohl in der
Milz als auch bei den PEC nach Injektion von Lipo-X an.
66
IV. Ergebnisse
4. Untersuchung der Wirkung von Cop-1 auf verschiedene Komponenten des
Immunsystems
Die therapeutische Wirkung von Cop-1 (Copolymer-1, Glatiramerazetat, Copaxone®) bei der
Behandlung der Multiplen Sklerose ist bekannt und in Patienten-Studien bewiesen. Cop-1 ist in
mehreren Ländern bereits als Medikament zur Therapie der schubförmig verlaufenden Multiplen
Sklerose zugelassen. Aus diesem Grunde wurden zunächst keine Therapie -Versuche mit Cop-1 bei an
EAE erkrankten Tieren durchgeführt, sondern das Hauptaugenmerk auf die bisher nur in Ansätzen
verstandene immunologische Wirkungsweise von Cop-1 gesetzt.
4.1. In vitro Versuche mit Cop-1
In in vitro-Untersuchungen wurde die Wirkung einer Stimulation mit Cop-1 auf die Apoptoserate
sowie auf die Zytokinproduktion von Leukozyten analysiert.
4.1.1. Untersuchungen des apoptotischen Zelltodes nach Stimulation mit Cop-1
Einer adulten weiblichen Maus des Inzuchtstammes SJL/J wurde die Milz steril entnommen und eine
Milzzellsuspension hergestellt (siehe II.2.8.2). Je 1 x 106 Leukozyten wurden in 1 ml RPMI-Medium
mit 5 % FCS 24 h lang im Brutschrank bei 37 ºC, 5 % CO2 und 98 % Luftfeuchtigkeit inkubiert.
Folgende Konzentrationen an Cop-1 wurden hinzugegeben:
1. Medium-Kontrolle ohne Cop-1 Zugabe,
2. 0,5 µg Cop-1,
3. 2 µg Cop-1,
4. 10 µg Cop-1.
Mit Hilfe der Annexin V/Propidiumjodid-Methode (siehe II.2.2.3.) wurde nach 24 h der apoptotische
Zelltod der Lymphozyten analysiert.
Prozentualer Anteil Annexin V markierter
Zellen nach 24h Inkubation
Prozentualer Anteil Propidiumjodid
markierter Zellen nach 24h Inkubation
30
% Lymphozyten
% Lymphozyten
100
75
50
25
0
ohne Zusatz
0,5 µg Cop
2 µg Cop
10µg Cop
20
10
0
ohne Zusatz
0,5 µg Cop
2 µg Cop
10µg Cop
Abb. 38: Darstellung der Annexin V bzw. Propidiumjodid markierten Lymphozyten nach 24stündiger Inkubation mit Cop-1
67
IV. Ergebnisse
Wie in Abb. 38 dargestellt, war der Anteil Annexin V-positiver Zellen bereits nach 24 Stunden bei der
Mediumkontrolle sehr hoch und nach Inkubation mit Cop-1 in den verschiedenen Konzentrationen
nicht signifikant verändert. Der prozentuale Anteil Propidiumjodid-markierter Zellen hingegen stieg
nach Inkubation mit Cop-1 in Abhängigkeit von der Cop-1-Konzentration deutlich an. Propidiumjodid
ist ein DNA-Farbstoff, der nekrotische Zellen, deren Zellmembran beschädigt ist, markiert. Da die
apoptotischen Zellen (Annexin V-positiv, Propidiumjodid-negativ) in dieser Zellkultur nicht oder
kaum phagozytiert werden können, geht die Apoptose der Zellen in eine Nekrose mit Integritätsverlust
der Zellmembran über. Der Anstieg des Anteils Propidiumjodid markierter Zellen lässt daher keinen
eindeutigen Schluss darauf zu, ob es sich hierbei um Zellen handelt, die eines nekrotischen oder
apoptotischen Zelltodes gestorben sind. Interessant ist je doch das der Anteil toter Lymphozyten nach
Inkubation mit Cop-1 deutlich zunimmt.
4.1.2. Untersuchungen der Zytokinproduktion von Leukozyten nach Stimulation mit Cop-1
Die Ergebnisse verschiedener Studien (Miller 1998, Neuhaus 2000) deuten daraufhin, dass Cop-1 eine
Wirkung auf die Produktion von Zytokinen hat. Aus diesem Grund wurde zunächst in einem in vitroExperiment der Einfluss von Cop-1 auf die Produktion verschiedener Zytokine durch Leukozyten
untersucht.
Je 50 µl Vollblut einer weiblichen adulten SJL-Maus wurden 24 bzw. 48 h lang in 1 ml Kulturmedium
(RPMI + 5 % FCS) zusammen mit folgenden Konzentrationen an Cop-1 im Brutschrank (37°C, 98 %
Luftfeuchtigkeit, 5 % CO2 ) inkubiert: ohne Cop-1 (Mediumkontrolle), mit 0,5 µg, 2 µg bzw. 10 µg
Cop-1.
Anschließend wurde mit Hilfe eines CBA-Testsystems (siehe II.2.6.) die Konzentration von
Interleukin-2 (IL-2), IL-4, IL-5, TNF-α und IFN-γ im Zellkulturüberstand bestimmt.
In Abb. 39 sind die Ergebnisse der Messung der TNF-α-Konzentration nach Stimulation von Vollblut
mit Cop-1 dargestellt. Bereits nach 24 h stieg die Konzentration von TNF-α in Abhängigkeit von der
eingesetzten Menge Cop-1 im Vergleich zu derjenigen der Mediumkontrolle deutlich an. Auch nach
48 Stunden war dieser Effekt noch zu beobachten, nur dass hier die Mediumkontrolle eine deutlich
höhere Konzentration von TNF-α aufwies.
68
IV. Ergebnisse
300
pg/ml
200
100
0
o. Cop - 24h
0,5 µg - 24 h
2 µg - 24h
10 µg - 24 h
o. Cop - 48h
0,5 µg - 48h
2 µg - 48h
10 µg - 48h
Abb. 39: TNF-α
α Konzentration im Zellkulturüberstand von murinen Milzzellen nach
Stimulation mit Cop-1
Die Konzentration der Th2-typischen Zytokine IL-4 und IL-5 sowie der Th1-typischen Zytokine IL-2
und IFN-γ blieb sowohl in der Mediumkontrolle als auch bei allen eingesetzten Cop-1Konzentrationen nach 24 und 48 Stunden Inkubation unverändert unterhalb des Detektionslimits des
Testsystems (5-10 pg/ml)(Daten nicht dargestellt).
4.2. Untersuchungen der Wirkung von Cop-1 auf das Immunsystem naiver Mäuse
Um die Wirkung der subkutanen Injektion von Cop-1 auf zelluläre Komponenten des Immunsystems
zu untersuchen, wurde Mäusen verschiedener Inzuchtstämme (BALB/c, C57BL/6, SJL/J), die sich,
wie unter IV.2. beschrieben, zum Teil erheblich in der Verteilung der Lymphozytenpopulationen in
den Immunorganen unterscheiden, Cop-1 injiziert und im Abstand von einigen Tagen Blut,
drainierende Lymphknoten und Milz entnommen. Die anschließend hergestellten Zellsuspensionen
(siehe II.2.8.1.bis 3.) wurden durchflusszytometrisch untersucht. Es wurde jeweils der Anteil von T-,
B- und NK-Zellen sowie von CD4- und CD8-positiven Lymphozyten bestimmt (siehe II.2.5.). Im
Folgenden sind die wichtigsten Ergebnisse dieser Untersuchungen zusammengefasst.
4.2.1. Untersuchungen der Wirkung von Cop-1 auf das Immunsystem von Mäusen des
Inzuchtstammes BALB/c
Insgesamt 12 weiblichen adulten Mäusen des Inzuchtstammes BALB/c wurden je 100 µg Cop-1
subkutan in den Oberschenkel injiziert. Wie Vorversuche gezeigt haben (hier nicht dargestellt) ist bei
subkutaner Injektion in den Oberschenkel der inguinale Lymphknoten der diesen Bereich
drainierende. Aus diesem Grunde wurde bei den im Folgenden dargestellten Experimenten der
jeweilige inguinale und damit der den Inokulationsbereich drainierende Lymphknoten entnommen.
69
IV. Ergebnisse
Jeweils drei Tiere wurden einen, drei, sechs bzw. acht Tage nach Injektion von Cop-1 getötet, Blut,
Milz und der drainierende Lymphknoten entnommen und die jeweiligen Lymphozytenpopulationen
durchflusszytometrisch bestimmt. Außerdem wurden drei unbehandelte Kontrolltiere (Tag 0)
untersucht.
% Lymphozyten
40
30
20
10
0
Tag 0
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tag 8
Abb. 40: Prozentualer Anteil der B-Lymphozyten in dem nahe der Injektionsstelle liegenden,
inguinalen Lymphknoten von BALB/c-Mäusen nach s.c. Injektion von 100 µg Cop-1
Wie in Abb. 40 dargestellt, stieg der prozentuale Anteil der B-Lymphozyten in den drainierenden
Lymphknoten am ersten und dritten Tag nach Injektion von Cop-1 deutlich an, fiel aber am achten
Tag nach der Injektion wieder ab.
% Lymphozyten
75
50
25
0
Tag 0
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tag 8
Abb. 41: Prozentualer Anteil der B-Lymphozyten in der Milz von BALB/c-Mäusen nach s.c.
Injektion von 100 µg Cop-1
70
IV. Ergebnisse
Auch in der Milz der BALB/c-Mäuse stieg der Anteil der B-Lymphozyten am ersten, dritten und
sechsten Tag nach der Injektion von Cop-1 an (siehe Abb. 41). Nach acht Tagen ging der Anteil der BLymphozyten wieder auf das Ausgangsniveau zurück.
% Lymphozyten
30
20
10
0
Tag 0
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tag 8
Abb. 42: Prozentualer Anteil CD8-positiver Lymphozyten in dem nahe der Injektionsstelle
liegenden, inguinalen Lymphknoten von BALB/c-Mäusen nach s.c. Injektion von 100 µg Cop-1
Im Blut der BALB/c-Mäuse nahm dagegen initial, am ersten und dritten Tag nach der Injektion, der
Anteil der B-Lymphozyten ab (Daten nicht dargestellt). Dies legt die Vermutung nahe, dass der
Anstieg des Anteils der B-Lymphozyten in Milz und Lymphknoten zumindest teilweise auf
eingewanderte Zellen zurückzuführen ist.
Der prozentuale Anteil der CD8-Zellen in den Lymphknoten nahm am ersten und dritten Tag nach der
Injektion von Cop-1 deutlich ab, stieg jedoch am Tag 8 nach der Injektion wieder an (siehe Abb. 42 ).
Im Blut und in der Milz der Mäuse war keine dementsprechende Veränderung zu beobachten.
Der prozentuale Anteil der T-Lymphozyten nahm in Milz und Lymphknoten etwas ab, was auf die
Abnahme des Anteils der CD8-positiven Lymphozyten zurückzuführen ist. Der Anteil CD4-positiver
Lymphozyten blieb unverändert (Daten nicht dargestellt).
4.2.2. Untersuchungen der Wirkung von Cop-1 auf das Immunsystem von Mäusen des
Inzuchtstammes C57BL/6
Um zu untersuchen, ob der unter IV.4.2.1. beschriebene Effekt einer Injektion mit Cop-1 auch bei
Tieren anderer Inzuchtstämme mit anderen immunologischen Eigenschaften zu finden ist, wurde ein
ähnlicher Versuch nochmals mit C57BL/6-Mäusen durchgeführt. In Mäusen dieses Inzuchtstammes
konnte nahezu keine EAE induziert werden (siehe IV.1.2.). In diesem Versuch wurden verschiedene
Konzentrationen von Cop-1 injiziert.
71
IV. Ergebnisse
a. Nach subkutaner Injektion von 1 mg Cop-1
Sieben weiblichen, adulten Mäusen des Inzuchtstammes C57BL/6 wurden je 1 mg Cop-1 subkutan in
den Oberschenkel injiziert. Nach drei bzw. sechs Tagen wurden die Tiere getötet, Blut, Milz und
Lymphknoten entnommen und, wie unter II.2.8. beschrieben, präpariert. Der Anteil der T-, B- und
NK-Zellen sowie der CD4- und CD8-positiven Lymphozyten wurde durchflusszytometrisch ermittelt.
Mit fünf unbehandelten Kontrolltiere wurde ebenso verfahren (hier: Tag 0).
75
PB
Milz
% Lymphozyten
LK
50
25
0
Tag 0
Tag 3
Tag 6
Tag 0
Tag 3
Tag 6
Tag 0
Tag 3
Tag 6
Abb. 43: Prozentualer Anteil der B-Lymphozyten im Blut, in der Milz und in dem nahe der
Injektionsstelle liegenden, inguinalen Lymphknoten von C57BL/6-Mäusen nach s.c. Injektion
von 1 mg Cop-1
Ähnlich wie in dem vorher beschriebenen Versuch mit BALB/c-Mäusen stieg der Anteil der BLymphozyten in den Lymphknoten von C57BL/6-Mäusen initial nach drei Tagen an, nahm aber nach
sechs Tagen wieder ab. Anders als bei BALB/c-Mäusen nahm jedoch der Anteil der B-Lymphozyten
in der Milz von C57BL/6-Mäusen ab, und im Blut zu (Abb. 43).
40
PB
Milz
% Lymphozyten
LK
30
20
10
0
Tag 0
Tag 3
Tag 6
Tag 0
Tag 3
Tag 6
Tag 0
Tag 3
Tag 6
Abb. 44: Prozentualer Anteil der CD8-positiven Lymphozyten im Blut, in der Milz und in dem
nahe der Injektionsstelle liegenden, inguinalen Lymphknoten von C57BL/6-Mäusen nach s.c.
Injektion von 1 mg Cop-1
72
IV. Ergebnisse
Wie in Abb. 44 dargestellt, ging der prozentuale Anteil CD8-positiver Lymphozyten in den
Lymphknoten der C57BL/6-Mäuse drei Tage nach subkutaner Injektion von 1 mg Cop-1 sehr deutlich
zurück. Nach sechs Tagen war jedoch wieder ein leichter Anstieg zu beobachten. Dies entspricht in
etwa dem auch in den Lymphknoten von BALB/c-Mäusen beobachteten Effekt.
Der Anteil der T- und Th-Zellen in den drainierenden Lymphknoten der C57BL/6-Mäuse fiel am
dritten Tag nach der Injektion von Cop-1 zunächst ab und lag am sechsten Tag wieder auf dem Niveau
der T- und Th-Zellen in den LK der unbehandelten Kontrolltiere. Alle weiteren erhobenen Werte
blieben nahezu unverändert.
Neben der Analyse der Lymphozytensubpopulationen wurde bei den in diesem Versuch gewonnenen
Zellen eine intrazelluläre Zytokinfärbung durchgeführt (siehe II.2.4.). Es wurde der prozentuale Anteil
Interferon-γ- und Interleukin-4-produzierender Lymphozyten durchflusszytometrisch bestimmt.
Im peripheren Blut und in den drainierenden Lymphknoten fanden sich keine Veränderungen
bezüglich des Anteils IFN-γ- und IL-4-produzierender Zellen (Daten nicht dargestellt). In der Milz von
C57BL/6 bewirkte die Injektion von 1 mg Cop-1 jedoch einen Rückgang der Produktion des Th1typischen Zytokins IFN-γ und einen gleichzeitigen Anstieg der Produktion des Th2-typischen
Zytokins IL-4 (siehe Abb. 45).
INF-γ
IL-4
0.75
5
0.50
4
0.25
3
Tag 0
Tag 3
Tag 6
Tag 0
Tag 3
Tag 6
% IL-4 produzierender
Lymphozyten
% INFγ
produzierender
Lymphozyten
6
0.00
Abb. 45: Prozentualer Anteil IFN-γγ - bzw. IL-4-produzierender Lymphozyten in den Milzen von
C57BL/6-Mäusen nach s.c. Injektion von 1 mg Cop-1
b. Nach subkutaner Injektion von 100 µg Cop-1
Insgesamt 16 weiblichen adulten C57BL/6-Mäusen wurden 100 µg Cop-1 subkutan in den
Oberschenkel injiziert und nach 1, 3, 6, 8 oder 14 Tagen (Kontrolltiere = Tag 0) jeweils die Milz, der
drainierende Lymphknoten sowie Blut entnommen. Wie oben beschrieben wurde aus den daraus
73
IV. Ergebnisse
gewonnenen Zellsuspensionen durchflusszytometrisch der Anteil der verschiedenen
Lymphozytensubpopulationen bestimmt.
Der prozentuale Anteil der B-Lymphozyten in den Lymphknoten der C57BL/6-Mäuse nach Injektion
von 100 µg Cop-1 nahm initial leicht ab und stieg anschließend wieder auf das Niveau des Anteils der
B-Lymphozyten der Kontrolltiere (Daten nicht dargestellt).
% Lymphozyten
40
30
20
10
0
Tag 0
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tag 8
Tag 14
Abb. 46: Prozentualer Anteil CD8-positiver Lymphozyten in dem drainierenden, inguinalen
Lymphknoten von C57BL/6-Mäusen nach s.c. Injektion von 100 µg Cop-1
Ähnlich wie bei den vorherigen Versuchen mit BALB/c- und C57BL/6-Mäusen nahm auch nach der
subkutanen Injektion von 100 µg Cop-1 bei C57BL/6-Mäusen der Anteil der CD8-positiven
Lymphozyten in den drainierenden Lymphknoten bis zum dritten Tag stark ab und anschließend
langsam wieder zu (siehe Abb. 46).
Zu Beachten ist allerdings, dass es sich bei den oben beschriebenen Effekten um den prozentualen
Anteil der jeweiligen Zellen handelt und damit eine Aussage über die Verteilung der jeweiligen
Zellpopulationen im jeweiligen Organ gibt. Wie in der folgenden Abbildung 47 gezeigt, nahm die
Anzahl der Leukozyten in den Lymphknoten drei Tage nach der Injektion von Cop-1 auf 13 x 106
Leukozyten (Mittelwert) zu. Die mittlere Anzahl der Leukozyten in den Lymphknoten der
Kontrolltiere (Tag 0) lag dagegen nur bei 1,93 x 106 Leukozyten.
x 10 Zellen
15
6
10
5
0
Tag 0
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tag 8
Tag 14
Abb. 47: Gesamtanzahl der Leukozyten in den nahe der Injektionsstelle liegenden, inguinalem
Lymphknoten von C57BL/6-Mäusen nach s.c. Injektion von 100 µg Cop-1
74
IV. Ergebnisse
Die Anzahl der Leukozyten in der Milz der Versuchstiere blieb von der Cop-Injektion nahezu
unbeeinflusst (o. Abb.).
4.2.3. Untersuchungen der Wirkung von Cop-1 auf das Immunsystem von Mäusen des
Inzuchtstammes SJL/J
In Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J war nach subkutaner Injektion von 100 µg Cop-1 in den
Oberschenkel in den drainierenden Lymphknoten keine wesentliche Veränderung des prozentualen
Anteils der B-Lymphozyten zu beobachten. Der Anteil CD8-positiver Lymphozyten nahm am ersten
Tag nach der Injektion von Cop-1 ab, stieg anschließend aber wieder auf das Niveau der CD8positiven Lymphozyten im Lymphknoten der Kontrolltiere an (Daten nicht dargestellt).
% Lymphozyten
60
50
40
Tag 0
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tag 8
Abb. 48: Prozentualer Anteil der Th-Zellen in den drainierenden inguinalen Lymphknoten von
SJL/J-Mäusen nach s.c. Injektion von 100 µg Cop-1, Einzelwerte und Median
Wie in Abb. 48 dargestellt, war in den Lymphknoten von SJL/J-Mäusen eine Abnahme der CD4positiven Lymphozyten (Th-Zellen) ab dem dritten Tag nach der Injektion von Cop-1 zu beobachten.
Allerdings lagen die Einzelwerte zum Teil weit auseinander.
Zusammenfassend kann man sagen, dass Cop-1 bei den Tieren aller verwendeten Inzuchtstämme eine
Wirkung auf den Anteil CD8-positiver Lymphozyten hat. Ein Effekt auf den Anteil der BLymphozyten war vor allem in den Mäusen der Inzuchtstämme zu beobachten, die ohnehin einen
hohen Anteil an B-Lymphozyten haben.
75
IV. Ergebnisse
4.3. Therapieversuche mit Cop-1 bei an EAE erkrankten Mäusen
Um zu untersuchen, inwieweit sich die unter IV.4.2. beschriebenen Veränderungen im Immunsystem
auf die Krankheitsverläufe von an EAE erkrankten Tieren auswirken, wurden Therapieversuche mit
Cop-1 bei an EAE erkrankten Mäusen sowie begleitende immunologische Untersuchungen
durchgeführt.
Cop-1 (Copaxone®, Glatiramerazetat) wird Patienten zur Therapie der Multiplen Sklerose täglich in
wässriger Lösung subkutan injiziert. Die tägliche subkutane Injektion über mehrere Jahre ist für die
Patienten häufig äußerst unangenehm und führt bei einigen Patienten trotz guten Ansprechens auf die
Behandlung mit Cop-1 sogar zum Abbruch der Therapie. Um dieses für die Patienten unangenehme
Applikationsverfahren zu verbessern, ist es vorstellbar, dass die Applikation von Cop-1 in Depotform
größere Abstände zwischen den Injektionen bei gleicher Wirksamkeit ermöglicht.
Aluminiumhydroxid-Gel (hier: Alu) wird in Vakzinen zur Adsorption der Vakzine-Antigene
verwendet. Der Adjuvans-Effekt von Alu in Vakzinen ist vor allem auf die Depot-Wirkung
zurückzuführen. Proteine werden von Alu adsorbiert und anschließend aus dem Depot wieder
freigesetzt. Um zu untersuchen, ob die Depotwirkung durch Adsorption an Alu auch ein geeignetes
Mittel darstellt, um die Therapie mit Cop-1 zu optimieren, wurde in den folgenden Versuchen nicht
nur Cop-1 in wässriger Lösung, sondern auch an Alu adsorbiert eingesetzt.
4.3.1. Therapieversuch mit 100 µg Cop-1 bei BALB/c-Mäusen nach Induktion mit PLP139-151-Peptid
Im folgenden Versuch wurde weiblichen, 7 Wochen alten Mäusen des Inzuchtstammes BALB/c 100
µg PLP-Peptid in Emulsion mit CFA subkutan in die Flanke injiziert. Drei Tage später wurden jeweils
vier Tiere folgendermaßen behandelt:
1. ohne Therapie,
2. 100 µg Cop-1 in PBS s.c.,
3. 100 µg Cop-1 an Aluminiumhydroxid (Alu) adsorbiert (1:1) s.c.
Die Tiere aller Versuchsgruppen wurden jeden Tag insgesamt 38 Tage lang untersucht und mit Hilfe
der unter II.2.12. beschriebenen Skala zur Bewertung der EAE Symptome bei Mäusen wurde der
Behinderungsgrad beurteilt.
In den folgenden Diagrammen sind die täglich gemessenen Behinderungsgrade dargestellt.
Tier Nr. 3 der in Abb. dargestellten Kontrollgruppe starb am fünften Tag nach Krankheitsinduktion,
ohne irgendwelche Krankheitsmerkmale entwickelt zu haben.
76
IV. Ergebnisse
Tier 1
Tier 2
2
Tier 4
100 µg PLP
in CFA s.c.
Behinderungsgrad
3
1
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Tage
Abb. 49: Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/c-Mäusen ohne
Behandlung (Kontrollgruppe)
Tier 1
Tier 2
Tier 3
Tier 4
1
100 µg COP-1
in PBS s.c.
2
100 µg PLP
in CFA s.c.
Behinderungsgrad
3
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Tage
Abb. 50: Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/c-Mäusen nach
Therapie mit 100 µg Cop-1 in PBS
Tier 1
Tier 2
Tier 3
1
Tier 4
100 µg COP-1/
Alu s.c.
2
100 µg PLP
in CFA s.c.
Behinderungsgrad
3
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Tage
Abb. 51: Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/c-Mäusen nach
Therapie mit 100 µg Cop-1 an Alu adsorbiert
77
IV. Ergebnisse
Die in den Abb. 49 bis 51 dargestellten Krankheitsverläufe der Tiere der verschiedenen
Versuchsgruppen zeigten keine wesentlichen Unterschiede.
30
CDI
20
10
0
Kontrollgruppe
Cop-1/PBS
Cop-1/Alu
Abb. 52: Darstellung der aus der Summe der täglichen Behinderungsgrade errechneten CDI
jedes der Tiere der drei Versuchsgruppen des Vorversuchs mit 100 µg Cop-1. Dargestellt sind
die Einzelwerte sowie der Median.
Der Vergleich der in Abb. 52 dargestellten CDI-Werte der Tiere der verschiedenen Versuchsgruppen
zeigte keine Verbesserung der Krankheitssymptome durch eine Therapie mit Cop-1.
Aufgrund der oben dargestellten Ergebnisse des Versuchs wurde bei den folgenden Versuchen eine
deutlich höhere Konzentration Cop-1 eingesetzt.
4.3.2. Therapieversuch mit 1 mg Cop-1 bei BALB/c-Mäusen nach Induktion mit PLP139-151 Peptid
In diesem Versuch wurde den Versuchstieren mit jeweils 1 mg Cop-1 eine wesentlich höhere Dosis
Cop-1 injiziert als im vorherigen Versuch (100 µg Cop-1). In dem folgenden Versuch wurde 1 mg
Cop-1 zum einen in Emulsion mit CFA zum anderen an Alu adsorbiert den Mäusen subkutan injiziert.
Es wurde ein prophylaktischer Ansatz gewählt, d.h. den Tieren wurde zunächst Cop-1 (am Tag –9)
injiziert und erst neun Tage später (Tag 0) die EAE durch subkutane Injektion von 200 µg PLP 139-151 Peptid in Emulsion mit CFA in die Flanke der Tiere induziert. Je 7 bzw. 8 weibliche, 6-8 Wochen alte
Mäuse des Inzuchtstammes BALB/c wurden pro Versuchsgruppe eingesetzt.
78
IV. Ergebnisse
Behinderungsgrad
3
Tier 1
Tier 2
2
Tier 3
Tier 4
200 µg PLP
in CFA s.c.
1
Behinderungsgrad
0
-10
3
-5
0
5
10
15
20
25
Blutabnahme
30
Tage
Tier 5
Tier 6
2
Tier 7
200 µg PLP
in CFA s.c.
1
0
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
Tage
Blutabnahme
Abb. 53: Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten BALB/c-Mäusen ohne
Behandlung (Kontrollgruppe)
Behinderungsgrad
3
Tier 1
Tier 2
2
Tier 3
Tier 4
1
1 mg Cop-1
in CFA s.c.
Behinderungsgrad
0
-10
3
200 µg PLP
in CFA s.c.
-5
0
5
10
15
20
25
Blutabnahme
30
Tage
Tier 5
Tier 6
2
Tier 7
Tier 8
1
1 mg Cop-1
in CFA s.c.
0
-10
200 µg PLP
in CFA s.c.
-5
0
5
10
15
20
25
Blutabnahme
30
Tage
Abb. 54: Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten Balb/c-Mäusen nach
Behandlung mit 1 mg Cop-1/CFA am Tag -9
79
IV. Ergebnisse
Überraschenderweise zeigen die Krankheitsverläufe der mit Cop-1 in Emulsion mit CFA behandelten
Tiere in Abb. 54 einen eher schwereren Krankheitsverlauf als die der unbehandelten Tiere (Abb.53).
Behinderungsgrad
3
Tier 1
Tier 2
2
Tier 3
Tier 4
1
1 mg Cop-1
in Alu s.c.
Behinderungsgrad
0
-10
3
200 µg PLP
in CFA s.c.
-5
0
5
10
15
20
25
Blutabnahme
30
Tage
Tier 8
Tier 7
2
Tier 6
Tier 5
1
1 mg Cop-1
in Alu s.c.
0
-10
200 µg PLP
in CFA s.c.
-5
0
5
10
15
20
25
Blutabnahme
30
Tage
Abb. 55: Darstellung des Krankheitsverlaufs bei an EAE erkrankten Balb/c-Mäusen nach
Behandlung mit 1 mg Cop-1/Alu am Tag –9
CDI
20
15
10
5
0
Kontrollgruppe
Cop-1/CFA
Cop-1/Alu
Abb. 56: Darstellung des aus der Summe der täglichen Behinderungsgrade errechneten CDI
jedes Tieres der drei Versuchsgruppen des Therapieversuchs mit 1 mg Cop-1. Dargestellt sind
die Einzelwerte sowie der Median.
Die statistische Berechnung (Mann-Whitney U-Test) ergab einen signifikant schlechteren
Krankheitsverlauf bei den Tieren, die mit Cop-1 in Emulsion mit CFA behandelt worden waren, im
80
IV. Ergebnisse
Vergleich zu demjenigen der unbehandelten Tiere (p=0,021). Der CDI der mit Cop-1/Alu behandelten
Tiere unterschied sich nicht signifikant von dem der Tiere der Kontrollgruppe (p=0,463).
Dieses Ergebnis ist sehr überraschend, da die Wirksamkeit von Cop-1 sowohl bei der Therapie der
Multiplen Sklerose als auch in EAE-Versuchen bewiesen wurde. Möglicherweise hat CFA alleine
bereits eine enzephalitogene Wirkung.
4.3.3. Therapieversuch mit Cop-1 bei SJL/J-Mäusen nach Induktion mit PLP139-151 -Peptid
Im folgenden Versuch wurde die Wirkung von Cop-1 auf die Krankheitssymptome von an EAE
erkrankten Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J nach Krankheitsinduktion mit PLP-Peptid untersucht,
da dieses EAE-Modell im Vorversuch (siehe IV.1.) im Vergleich zu den anderen Modellen die
schwersten Krankheitsverläufe gezeigt hatte.
Weiblichen, 7 Wochen alten Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J wurden am Tag 0 zur Auslösung der
EAE 100 µg PLP 139-151 -Peptid in Emulsion mit CFA subkutan in die Flanke injiziert. Die Tiere wurden
neun Tage zuvor folgendermaßen behandelt:
1. ohne Therapie, Kontrollgruppe, N = 13,
2. 1 mg Cop-1 in Emulsion mit CFA, s.c., N = 6,
3. 1 mg Cop-1 an Alu adsorbiert (1:1), s.c., N = 6,
4. 1 mg Cop-1 in PBS am Tag –9, s.c., + 100 µg Cop-1 in PBS s.c. am Tag 5, N = 6.
Die Tiere wurden anschließend 35 Tage lang täglich untersucht und der Behinderungsgrad ermittelt. In
Abb. 57 bis 60 sind die Krankheitsverläufe der einzelnen Tiere dargestellt.
1.Tier
2.Tier
3.Tier
4.Tier
5.Tier
6.Tier
Behinderungsgrad
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-10
-5
1 mg Cop-1
in CFA s.c.
0
5
10
15
20
100 µg PLP
in CFA s.c.
25
30
35
Tage nach Injektion
Abb. 57: Darstellung der Krankheitsverläufe der mit Cop-1/CFA-behandelten Versuchstiere des
Inzuchtstammes SJL/J nach Krankheitsinduktion mit PLP-Peptid
81
Behinderungsgrad
IV. Ergebnisse
1.Tier
2.Tier
3.Tier
4.Tier
5.Tier
6.Tier
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-10
-5
1 mg Cop -1
an Alu s.c.
0
5
10
15
20
25
30
35
Tage nach Injektion
100 µg PLP
in CFA s.c.
Abb. 58: Darstellung der Krankheitsverläufe der mit Cop-1/Alu-behandelten Versuchstiere des
Inzuchtstammes SJL/J nach Krankheitsinduktion mit PLP-Peptid
1.Tier
2.Tier
3.Tier
4.Tier
5.Tier
6.Tier
Behinderungsgrad
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-10
1 mg Cop-1
in PBS s.c.
-5
0
100 µg PLP
in CFA s.c.
5
10
15
20
100 µg Cop-1
in PBS s.c.
25
30
35
Tage nach Injektion
Abb. 59: Darstellung der Krankhe itsverläufe der mit Cop-1/PBS-behandelten Versuchstiere des
Inzuchtstammes SJL/J nach Krankheitsinduktion mit PLP-Peptid
In den dargestellten Krankheitsverläufen (siehe Abb. 57 bis 60) der Tiere der verschiedenen
Versuchsgruppen konnten keine deutlichen Unterschiede in der Schwere der Erkrankung
nachgewiesen werden. Der Mittelwert der einzelnen CDI-Werte der Tiere der unbehandelten
Kontrollgruppe liegt mit 25,42 deutlich über dem der mit Cop/CFA-behandelten Tiere (MW = 13,25),
dem der mit Cop/Alu behandelten Tiere (15,5) sowie dem der mit Cop/PBS behandelten Tiere (19,92).
Die statistische Berechnung unter Verwendung des nicht-parametrischen Mann-Whitney U-Tests und
des t-Tests ergab aber keinerlei statistisch signifikanten Unterschiede beim Vergleich der CDI-Werte
der jeweiligen Gruppen (siehe Abb. 61).
82
IV. Ergebnisse
Tier getötet
1.Tier
2.Tier
3.Tier
4.Tier
5.Tier
6.Tier
5.0
Behinderungsgrad
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
Tage nach Injektion
7.Tier
8.Tier
9.Tier
10.Tier
11.Tier
12.Tier
13.Tier
5.0
Behinderungsgrad
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
100 µg PLP
in CFA s.c.
1.0
0.5
0.0
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
Tage nach Injektion
100 µg PLP
in CFA s.c.
Abb. 60: Darstellung der Krankheitsverläufe der unbehandelten Versuchstiere nach Induktion
der EAE durch PLP-Peptid
100
CDI
50
50
25
0
o.Therapie
Cop/CFA
Cop/Alu
Cop/PBS
Einzelwerte + Mittelwert (nicht signifikant nach t-Test und Mann-Whitney U-Test)
Abb. 61: CDI der Tiere der verschiedenen Therapiegruppen nach Induktion einer EAE in
SJL/J-Mäusen mit PLP-Peptid
83
IV. Ergebnisse
4.3.4. Therapieversuch mit Cop-1 bei SJL/J-Mäusen nach Induktion mit MBP87-99 -Peptid
Da es in den bisherigen Versuchen nicht gelungen war, den bereits beschriebenen therapeutischen
Effekt von Cop-1 in einem der murinen EAE-Modelle nachzuweisen, wurde in dem folgenden
Versuch ein EAE-Modell gewählt, in dem die therapeutische Wirksamkeit von Cop-1 bereits
mehrfach bewiesen worden war.
Je 6 weiblichen, 7 Wochen alten Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J wurden am Tag 0 zur Auslösung
der EAE 100 µg MBP-Peptid in Emulsion mit CFA subkutan in die Flanke injiziert. Die Tiere wurden
neun Tage zuvor folgendermaßen behandelt:
1. ohne Therapie, Kontrollgruppe,
2. 1 mg Cop-1 in Emulsion mit CFA, s.c.,
3. 1 mg Cop-1 an Alu adsorbiert (1:1), s.c.,
Behinderungsgrad
4. je 100 µg Cop-1 in PBS am Tag –9, am Tag –4 und am Tag 4, s.c., .
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-10
Tier
Tier
Tier
Tier
Tier
Tier
-5
1
2
3
4
5
6
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Abb. 62: Darstellung der Krankheitsverläufe der unbehandelten Versuchstiere des
Behinderungsgrad
Inzuchtstammes SJL/J nach Induktion der EAE mit MBP-Peptid
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
Cop/CFA
1.0
s.c.
0.5
0.0
-10
Tier 6
Tier 5
Tier 4
Tier 3
Tier 2
Tier 1
MBP/CFA
s.c.
0
10
20
30
40
Abb. 63: Darstellung der Krankheitsverläufe der mit Cop/CFA-behandelten Versuchstiere des
Inzuchtstammes SJL/J nach Induktion der EAE mit MBP-Peptid
84
IV. Ergebnisse
Wie in Abb. 62 zu erkennen, war der Krankheitsverlauf der nach Krankheitsinduktion mit MBP-
Behinderungsgrad
Peptid erkrankten Tiere wesentlich milder als der nach Krankheitsinduktion mit PLP-Peptid.
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
Cop/Alu
1.0
s.c.
0.5
0.0
-10
Tier 6
Tier 5
Tier 4
Tier 3
Tier 2
Tier 1
MBP/CFA
s.c.
0
10
20
30
40
Abb. 64: Darstellung der Krankheitsverläufe der mit Cop/Alu-behandelten Versuchstiere des
Behinderungsgrad
Inzuchtstammes SJL/J nach Induktion der EAE mit MBP-Peptid
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
Cop/PBS
1.0 s.c.
0.5
0.0
-10
Tier 6
Tier 5
Tier 4
Tier 3
Tier 2
Tier 1
Cop/PBS MBP/CFA Cop/PBS
s.c.
s.c.
s.c.
0
10
20
30
40
Abb. 65: Darstellung der Krankheitsverläufe der mit Cop/PBS-behandelten Versuchstiere des
Inzuchtstammes SJL/J nach Induktion der EAE mit MBP-Peptid
Die in Abb. 62 bis 65 dargestellten Krankheitsverläufe der an EAE erkrankten Tiere zeigten nach
Behandlung mit Cop-1 unabhängig von der Applikationsform (mit CFA, mit Alu oder in PBS) einen
deutlich milderen Verlauf als die unbehandelten Kontrolltiere.
In Abb. 66 sind die CDI-Werte der Tiere der verschiedenen Therapiegruppen gegeneinander
aufgetragen. Mit Hilfe des nicht-parametrischen Mann-Whitney U-Tests wurde berechnet, ob die CDIWerte der Therapiegruppen sich signifikant von denen der Kontrollgruppe unterscheiden. Sowohl die
mit Cop-1/CFA (p=0,015) als auch die mit Cop/PBS-behandelten Tiere (p=0,026) hatten einen
signifikant milderen Krankheitsverlauf als die unbehandelten an EAE erkrankten Tiere. Bei den mit
Cop/Alu-behandelten Tieren lag der mittlere CDI mit 5,33 ebenfalls deutlich aber nicht signifikant
85
IV. Ergebnisse
unter dem der unbehandelten Kontrolltiere (mittlerer CDI=14,92). Für dieses EAE-Modell konnte
somit die therapeutische Wirksamkeit von Cop-1 bewiesen werden.
CDI
* p = 0,026
p = 0,093
40
* p = 0,015
30
20
10
0
Cop/CFA
Cop/Alu
Cop/PBS
o. Therapie
Abb. 66: CDI der Tiere der verschiedenen Therapiegruppen nach Induktion einer EAE in
SJL/J-Mäusen mit MBP-Peptid. Dargestellt sind die Einzelwerte, die Mittelwerte sowie die mit
dem Mann-Whitney U-Test berechneten p-Werte. Signifikanzen sind mit * gekennzeichnet.
4.4. Untersuchungen des Immunsystems von an EAE erkrankten Mäusen
Im Folgenden wurde die Wirkung der Therapie mit Cop-1 auf das Immunsystem von an einer EAE
erkrankten Versuchstieren untersucht. Hierzu wurde den jeweiligen Versuchstieren durch Punktion des
retroorbitalen Plexus Blut abgenommen. Die Gerinnung wurde durch Zugabe von Heparin
unterbunden. Die Leukozyten der Versuchstiere wurden, wie unter II.2.5. beschrieben, mit Hilfe von
spezifischen, Fluorochrom-markierten Antikörpern durchflusszytometrisch analysiert. Außerdem
wurde durch Zentrifugation (300xg) des Blutes Plasma gewonnen und zur späteren Bestimmung von
anti-Cop-1-AK bei –20°C eingefroren. Die Antikörpertiter (anti-Cop-1-AK) der Plasmen der
Versuchstiere wurden später im ELISA bestimmt (siehe II.2.7.). Mit Hilfe Klassen-spezifischer bzw.
Subklassen-spezifischer Zweitantikörper wurden die AK-Klassen und -Subklassen der Anti-Cop-1Titer analysiert.
86
IV. Ergebnisse
4.4.1. Untersuchungen des Immunsystems bei SJL-Mäusen nach EAE-Induktion mit PLP-Peptid
Den in IV.4.3.3. beschriebenen Versuchstieren wurde 30 Tage nach Induktion der EAE durch
subkutane Injektion des PLP 139-151 -Peptids in CFA Blut abgenommen. Unmittelbar danach wurde je
20 µl des heparinisierten Blutes in FACS-Röhrchen pipettiert und mit Hilfe spezifischer,
Fluorochrom-markierter Antikörper gefärbt und folgende Zellpopulationen im Durchflusszytometer
untersucht (siehe II.2.5.):
-
T-Lymphozyten,
-
B-Lymphozyten,
-
CD4-positive Lymphozyten (= T-Helfer-Zellen),
-
CD8-positive Lymphozyten,
-
Granulozyten.
Ferner wurde der CD4/CD8-Quotient berechnet, im Folgenden CD4/CD8-Ratio genannt.
In Abb. 67 ist der CD4/CD8-Quotient des Blutes der einzelnen Tiere der jeweiligen Versuchsgruppen
sowie dreier gleichaltriger, unbehandelter, gesunder Tiere dargestellt. Im Vergleich zur CD$/CD8Ratio der Kontrollgruppe der unbehandelten, an EAE erkrankten Tiere stieg die CD4/CD8-Ratio im
Blut der mit Cop/CFA- und Cop/Alu-behandelten Tiere statistisch signifikant an (p=0,005; p=0,003).
Die Veränderung der CD4/CD8-Ratio ist auf einen starken Anstieg des prozentualen Anteils an THelfer-Zellen und auf einen leichten Rückgang des Anteils CD8-positiver Lymphozyten
zurückzuführen.
p=0,003*
3.0
p=0,005*
2.5
2.0
1.5
o.Therapie
Cop-CFA
Cop-Alu
Cop-PBS
SJL-Kontrolle
Abb. 67: CD4/CD8-Ratio im peripheren Blut der an PLP-induzierter EAE erkrankten Tiere
Der prozentuale Anteil der T- und B-Lymphozyten sowie der Granulozyten im Blut der Tiere der
einzelnen Versuchsgruppen unterschied sich nicht (Daten nicht dargestellt).
Um zu untersuchen, ob es einen Zusammenhang zwischen dem Vorkommen bestimmter Leukozyten
und der Schwere der Erkrankung gibt, wurden im Folgenden die jeweiligen prozentualen Anteile der
87
IV. Ergebnisse
T-, B-, Th- und CD8-positiven Lymphozyten sowie Granulozyten gegen den CDI des jeweiligen
Tieres aufgetragen und mittels Pearson-Korrelationstest mögliche Korrelationen berechnet.
Cop-CFA
Cop-Alu
Cop-PBS
o. Therapie
70
% Lymphozyten
65
60
55
50
45
0
10
20
30
40
50
CDI
Korrelationskoeffizient r = -0,4989, p=0,0069
⇒ signifikante negative Korrelation
Abb. 68: Korrelation zwischen dem prozentualen Anteil an T-Helfer-Zellen im peripheren Blut
von an EAE erkrankten Mäusen und dem CDI jedes einzelnen Tieres
Für T- und B-Lymphozyten sowie Granulozyten ergaben sich keine Korrelationen mit dem CDI der
Tiere (o. Abb.).
In Abb. 68 sind die prozentualen Anteile der Th-Zellen im peripheren Blut der Versuchstiere gegen
den CDI der Tiere aufgetragen. Es ist eine deutliche Korrelation zwischen diesen Werten zu erkennen,
die sich auch im Korrelationskoeffizienten r = - 0,4989 und im Signifikanzniveau p=0,0069
widerspiegelt.
Es handelt sich hierbei um eine negative Korrelation, d.h. je größer der prozentuale Anteil Th-Zellen
im peripheren Blut der Mäuse ist, desto niedriger der CDI der Tiere und umgekehrt.
Wie in Abb. 69 zu sehen, korreliert auch der prozentuale Anteil der CD8-positiven Lymphozyten
signifikant mit dem CDI der Versuchstiere (r = 0,5147; p = 0,0051). Hierbei handelt es sich jedoch um
eine positive Korrelation, was bedeutet, dass die Tiere mit dem höchsten CDI auch den größten Anteil
CD8-positiver Lymphozyten im peripheren Blut haben.
88
IV. Ergebnisse
Cop/CFA
Cop/Alu
Cop/PBS
o. Therapie
32.5
% Lymphozyten
30.0
27.5
25.0
22.5
20.0
17.5
0
10
20
30
Korrelationskoeffizient r = 0,5147, p=0,0051
⇒ signifikante Korrelation
40
50
CDI
Abb. 69: Korrelation zwischen dem prozentualen Anteil CD8-positiver Zellen im peripheren
Blut von an EAE erkrankten Mäusen und dem CDI jedes einzelnen Tieres. Dargestellt sind die
Einzelwerte pro Versuchstier.
Die Rolle von anti-Cop-1-AK im Blut von an EAE erkrankten Versuchstieren wurde bisher nicht
untersucht. Im folgenden Experiment sollte daher untersucht werden, ob es einen Zusammenhang
zwischen der Schwere der Erkrankung, und damit dem Ansprechen auf die Therapie und dem
Auftreten von Antikörpern gegen Cop-1 im Blut von Versuchstieren gibt. Zu diesem Zweck wurde
zunächst ein anti-Cop-1-AK-ELISA entwickelt (siehe II.2.7.). Als Standard wurde eine Probe
mitgeführt, die aus einem Pool von anti-Cop-1-AK enthaltenden Plasmaproben bestand. Es wurde
jeweils die Verdünnungsstufe jeder Plasmaprobe bestimmt, bei der, der Standard eine optische Dichte
von 1,0 (bei IgG3 und IgM OD von 0,5) hatte und auf diese Weise der AK-Titer definiert. Die
Antikörper der verschiedenen Klassen und Subklassen unterscheiden sich nicht nur morphologisch,
sondern auch funktionell. Um eine zusätzliche Aussage darüber treffen zu können zu welchen AKKlassen und -Subklassen die anti-Cop-1-AK zuzuordnen sind, wurden folgende Zweitantikörper
(Detektionsantikörper) verwendet:
-
polyvalenter Antikörper gegen IgM, IgG, IgA,
-
Antikörper gegen IgM,
-
AK gegen IgG1,
-
AK gegen IgG2a,
-
AK gegen IgG2b und
-
AK gegen IgG3.
89
IV. Ergebnisse
Die gemessenen Antikörpertiter wurden mit dem CDI des jeweiligen Tieres korreliert, um zu
untersuchen ob ein Zusammenhang zwischen Antikörperproduktion und der Schwere der Erkrankung
besteht.
Es fanden sich keinerle i Korrelationen zwischen der Produktion von anti-Cop-1-AK, gleichgültig
welcher AK-Klasse oder Subklasse, und dem CDI der jeweiligen Versuchstiere (Daten nicht
dargestellt). Insgesamt waren die Antikörpertiter der Tiere auch innerhalb der einzelnen
Versuchsgruppen zum Teil sehr unterschiedlich hoch.
4.4.2. Untersuchungen des Immunsystems bei SJL/J-Mäusen nach EAE-Induktion mit MBP-Peptid
Den in IV.4.3.4. beschriebenen Versuchstieren wurde 24 Tage nach Induktion der EAE durch
subkutane Injektion des MBP 87-99 -Peptids in CFA Blut abgenommen. Unmittelbar danach wurde je
20 µl des heparinisierten Blutes in FACS-Röhrchen pipettiert und mit Hilfe spezifischer,
Fluorochrom-markierter Antikörper gefärbt und die unter IV.4.4.1. aufgeführten Zellpopulationen
sowie der prozentuale Anteil der NK-Zellen im Durchflusszytometer untersucht.
Der Vergleich der prozentualen Anteile der T- und B-Lymphozyten, CD4- und CD8-positiver
Lymphozyten sowie Granulozyten zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Tieren der
verschiedenen Versuchsgruppen (o. Abbildung).
Nur der prozentuale Anteil der NK-Zellen war bei den mit Cop-1 behandelten Tieren signifikant
erhöht (Cop/CFA: p=0,004, Cop/Alu: p=0,002, Cop/PBS: p=0,026; Mann-Whitney U-Test) (Abb. 70).
30
p=0,004*
p=0,002*
% Lymphozyten
p=0,026*
20
10
0
Cop/CFA
Cop/Alu
Cop/PBS
o. Therapie
Abb. 70: Prozentualer Anteil der NK-Zellen im peripheren Blut der an MBP-induzierter EAE
erkrankten Tiere. Einzelwerte, Median und Signifikanzen.
90
IV. Ergebnisse
Um auch hier zu untersuchen, ob es einen Zusammenhang zwischen dem Vorkommen bestimmter
Leukozyten und der Schwere der Erkrankung gibt, wurden im Folgenden die jeweiligen prozentualen
Anteile der T-, B-, NK-, Th- und CD8-positiven Lymphozyten sowie der Granulozyten gegen den CDI
des jeweiligen Tieres aufgetragen und mittels Pearson-Korrelationstest mögliche Korrelationen
berechnet.
Wie in Abb. 71 dargestellt, korrelierte der prozentuale Anteil der NK-Zellen mit der Schwere der
Erkrankung des jeweiligen Versuchstieres (Korrelationskoeffizient r = -0,4154, Signifikanz p =
0,0487). Hierbei handelte es sich wiederum um eine negative Korrelation, d.h. je höher der
prozentuale Anteil der NK-Zellen im Blut der Versuchstiere ist, desto niedriger der CDI und
umgekehrt.
30
% Lymphozyten
Cop/CFA
Cop/Alu
Cop/PBS
o. Therapie
20
10
0
0
10
20
30
Korrelationskoeffizient r = -0,4154, p = 0,0487
40
CDI
ð Signifikante negative Korrelation
Abb. 71: Korrelation zwische n dem prozentualen Anteil der NK-Zellen im peripheren Blut von
an EAE erkrankten Mäusen und dem CDI jedes einzelnen Tieres
Alle anderen Zelltypen (T-, B-, Th- und CD8-positive Lymphozyten, Granulozyten) zeigten keine
Korrelation mit dem CDI der Tiere (o. Abbildung).
Die Titer der anti-Cop-Antikörper der verschiedenen Klassen und Subklassen wurden aus dem Plasma
der Tiere dieser Versuchsgruppen bestimmt und mit dem CDI der jeweiligen Tiere korreliert. Es war
keinerlei Korrelation zwischen Antikörpertiter und der Schwere der Erkrankung bei den
Versuchstieren vorhanden (Daten nicht dargestellt).
91
IV. Ergebnisse
4.5. Untersuchung der Wirkung von Cop-1 auf humane periphere Blutzellen von MS-Patienten
4.5.1. In vitro Stimulation humaner Leukozyten von MS-Patienten und gesunden Probanden
Nach der Untersuchung immunologischer Wirkmechanismen von Cop-1 in in vitro-Versuchen mit
murinen Leukozyten (IV.4.1.) wurde in den im Folgenden dargestellten in vitro-Versuchen die
Wirkung der Stimulation mit Cop-1 auf Leukozyten von Multiple Sklerose Patienten und gesunden
Probanden untersucht.
4.5.1.1. Untersuchungen des apoptotischen Zelltods nach in vitro Stimulation mit Cop-1
Von je 15 Patienten und gesunden Probanden wurde Blut abgenommen und Heparin zur
Gerinnungshemmung dazugegeben. Mittels Dichtegradientenzentrifugation (siehe II.2.3.) wurden die
peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) gewonnen und mit Hilfe einer Neubauerzählkammer
die Anzahl der isolierten PBMC bestimmt. Je 2 x 105 Zellen/ml wurden in 24-Depot Mikrotiterplatten
in 2 ml Kulturmedium (RPMI + 5 % FBS) 48 Stunden lang im Brutschrank bei 37°C, 5 % CO2 und 98
% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Den Zellsuspensionen wurde zuvor jeweils 2 µg Cop-1 zugegeben.
Nach 48 Stunden wurden die Zellen in FACS-Röhrchen überführt, einmal mit HEPES-Puffer (siehe
II.1.2.1.) gewaschen und anschließend mit Hilfe der Annexin V/Propidiumjodid-Methode die Zellen
angefärbt (siehe II.2.2.3.). Parallel zur Annexin V- und Propidiumjodid-Färbung wurden die Zellen
mit einem PE-Cy5-konjugierten anti-CD4 Antikörper markiert. Auf diese Weise konnte die
Apoptoserate der T-Helfer-Zellen im Durchflusszytometer bestimmt werden.
30
% T-Helfer Zellen
25
20
15
10
5
0
MS-Patienten
Gesunde Probanden
Abb. 72: Prozentualer Anteil apoptotischer T-Helfer-Zellen von MS-Patienten und gesunden
Probanden nach in vitro Stimulation mit Cop-1. Einzelwerte und Median.
92
IV. Ergebnisse
Mit Hilfe des nicht-parametrischen Mann-Whitney U-Tests wurden die in Abb. 72 dargestellten
Apoptoseraten nach Stimulation mit Cop-1 bei T-Helfer-Zellen von MS-Patienten mit denen von ThZellen gesunder Probanden verglichen. Der Anteil an apoptotischen T-Helfer-Zellen nach in vitro
Stimulation mit Cop-1 war bei den aus dem Blut von MS-Patienten isolierten Zellen statistisch
signifikant (p=0,021) höher als bei den Zellen aus dem Blut gesunder Probanden.
4.5.1.2. Untersuchung der Zytokin-Produktion humaner Leukozyten nach in vitro Stimulation
mit Cop-1
Wie unter IV.4.5.1.1. beschrieben wurden die PBMC von gesunden Probanden und MS-Patienten
isoliert und 48 h lang mit Cop-1 in vitro stimuliert. Nach 48-stündiger Inkubation mit Cop-1 wurde
durch intrazellulärer Färbung die Produktion folgender Zytokine analysiert: INF-γ, TNF-α, TGF-β,
IL-2, IL-4 und IL-10 (siehe II.2.4.).
Durch die gleichzeitige Markierung von CD4-Molekülen auf der Oberfläche der Leukozyten konnte
12.5
11
9
7
5
% T-Helfer Zellen
% Lymphozyten
der Anteil der Zytokin-produzierenden T-Helfer-Zellen im Durchflusszytometer bestimmt werden.
2
1
0
MS-Patienten
Gesunde Probanden
10.0
7.5
5.0
2
1
0
MS-Patienten
Gesunde Probanden
Abb. 73: Im linken der beiden Diagramme ist der prozentuale Anteil IL-10 produzierender
Lymphozyten nach 48-stündiger Stimulation mit Cop-1 dargestellt, im rechten Diagramm der
prozentuale Anteil IL-10 produzierender T-Helfer-Zellen. Dargestellt sind jeweils die
Einzelwerte und der Median.
Nur der prozentuale Anteil IL-10 produzierender Lymphozyten war bei den aus dem Blut von MSPatienten isolierten Zellen höher als bei den von gesunden Probanden stammenden Blutzellen. Der
Unterschied war nach Berechnung mit dem nicht-parametrischen Mann-Whitney U-Test signifikant
(p=0,03). Der Anteil IL-10-produzierender T-Helfer-Zellen war zwar bei MS-Patienten nach Cop-1Stimulation im Vergleich zum Anteil der Zellen der gesunden Probanden erhöht (siehe Abb. 73),
dieser Effekt war aber statistisch nicht signifikant.
93
IV. Ergebnisse
Der prozentuale Anteil aller weiteren mittels intrazellulärer Färbung bestimmter Zytokinproduzierender Zellen (IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-2 und IL-4) nach Stimulation mit Cop-1 unterschied
sich nicht bei den aus Patientenblut und von gesunden Probanden stammenden Zellen (Daten nicht
dargestellt).
4.5.2. Untersuchung an humanen peripheren Leukozyten von MS-Patienten unter Cop-1-Therapie
Neben den begleitenden immunologischen Untersuchungen zur Therapie mit Cop-1 bei an EAE
erkrankten Tieren sind auch die begleitenden immunologischen Untersuchungen bei mit Cop-1
(Copaxone®) behandelten Patienten mit Multipler Sklerose für das Verständnis der Wirkmechanismen
von Cop-1 von großer Bedeutung. Daher wurde 19 MS-Patienten (siehe III.) vor Therapiebeginn und
6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 und 48 Wochen nach Therapiebeginn mit Copaxone® peripheres Blut
abgenommen und untersucht.
4.5.2.1. Untersuchung des apoptotischen Zelltods humaner Leukozyten unter Cop-1-Therapie
Das den Patienten abgenommene Blut wurde zur Gerinnungshemmung heparinisiert, mittels
Dichtegradienten die PBMC isoliert (siehe II.2.3.) und anschließend der prozentuale Anteil
apoptotischer Zellen mittels TUNEL-Technik durchflusszytometrisch bestimmt (siehe II.2.2.2.). Im
Folgenden ist der prozentuale Anteil von apoptotischen Lymphozyten und T-Helfer-Zellen im
peripheren Blut von MS-Patienten vor und während der Therapie mit Cop-1 dargestellt.
Mittels TUNEL-Methodik wurde die mit der Apoptose einhergehende DNA-Fragmentierung der
Zellen erfasst. Der mit dieser Methodik gemessene prozentuale Anteil apoptotischer Lymphozyten war
in Woche 30 und 36 leicht und in Woche 42 (p=0,047) und 48 (p=0,05) statistisch signifikant höher
als vor Therapiebeginn (siehe Abb. 74). Die statistischen Berechnungen wurden mit dem WilcoxonRank-Test durchgeführt.
Gleichzeitig mit der Anfärbung der Zellen durch die TUNEL-Methode können die Zellen durch
spezifische Fluorochrom-markierte Antikörper genauer charakterisiert werden. Im vorliegenden
Versuch wurden die Zellen zusätzlich mit einem PE-Cy5-konjugierten anti-CD4-AK sowie mit einem
PE-konjugierten anti-CD8-AK markiert.
94
IV. Ergebnisse
p=0,05
*
% Lymphozyten
7.5
p=0,047
5.0
2.5
0.0
Vorher
6
12
18
24
30
36
42
48
Wochen
Therapie mit Copaxone
Median * signifikant nach Wilcoxon-test (p < 0,05)
Abb. 74: Prozentualer Anteil apoptotischer Lymphozyten im peripheren Blut von MS-Patienten
vor Beginn der Therapie und 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 und 48 Wochen nach Beginn der Therapie
mit Cop-1. Dargestellt sind die Einzelwerte sowie der jeweilige Median.
*
*
10.0
% T-Helfer Zellen
*
*
7.5
p=0,036
p=0,008
p=0,049
p=0,041
5.0
2.5
0.0
Vorher
6
12
18
24
30
36
42
48
Wochen
Therapie mit Copaxone
Median * signifikant nach Wilcoxon-Test (p < 0,05)
Abb. 75: Prozentualer Anteil apoptotischer T-Helfer-Zellen im peripheren Blut von MSPatienten vor Beginn der Therapie und 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 und 48 Wochen nach Beginn der
Therapie mit Cop-1. Dargestellt sind die Einzelwerte sowie der jeweilige Median.
Der prozentuale Anteil apoptotischer Th -Zellen war nach 30, 36, 42 und 48 Wochen Therapie mit Cop1 signifikant höher als vor Beginn der Therapie (siehe Abb.75). Berechnet wurde diese Statistik mit
Hilfe des nicht-parametrischen Wilcoxon-Rank-Tests.
Der prozentuale Anteil der mittels TUNEL-Methodik erfassten apoptotischen CD8-positiven
Lymphozyten zeigte einen signifikanten Abfall des Anteils apoptotischer Zellen nach 12 Wochen
95
IV. Ergebnisse
Therapie. Alle weiteren Werte zeigten keine Veränderungen im Vergleich zum Ausgangswert (Daten
nicht dargestellt).
4.5.2.2. Untersuchung der Zytokin-Produktion humaner Leukozyten unter Cop-1-Therapie
Vor Therapiebeginn und 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 und 48 Wochen nach Therapiebeginn mit
Copaxone® wurde den 19 MS-Patienten peripheres Blut abgenommen, zur Gerinnungshemmung
heparinisiert und mittels Dichtegradienten die PBMC isoliert (siehe II.2.3.). Anschließend wurde der
prozentuale Anteil Zytokin-produzierender Zellen mittels intrazellulärer Zytokinfärbung (siehe II.2.4.)
bestimmt. Parallel zur Färbung mit den die Zytokine markierenden Antikörpern wurden PE-Cy5konjugierte anti-CD4-AK zur Charakterisierung der T-Helfer-Zellen eingesetzt. Im Folgenden sind die
Ergebnisse der intrazellulären Zytokin-Messungen bei Lymphozyten und Th -Zellen aus dem Blut der
mit Copaxone behandelten MS-Patienten dargestellt. Die Produktion folgender Zytokine wurde
durchflusszytometrisch bestimmt: INF-γ, TNF-α, TGF-β, IL-2, IL-4, IL-10. Die statistischen
Berechnungen wurden jeweils mit dem nicht-parametrischen Wilcoxon-Rank-Test durchgeführt.
a) IL-2- produzierende Lymphozyten
24 und 30 Wochen nach Therapiebeginn war der prozentuale Anteil IL-2-produzierender
Lymphozyten signifikant höher als vor Therapiebeginn. Alle anderen Werte zeigten keine statistisch
signifikanten Veränderungen (Daten nicht dargestellt).
b) TNF-α
α -produzierende Lymphozyten
* p=0,041
% Lymphozyten
30
20
10
0
Vorher
6 Wochen
12 Wochen
18 Wochen 24 Wochen
30 Wochen 36 Wochen
42 Wochen
48 Wochen
Therapie mit Cop-1
Abb. 76: Prozentualer Anteil TNF-α
α -produzierender Lymphozyten aus dem peripheren Blut
von MS-Patienten vor Therapiebeginn und 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 und 48 Wochen nach Beginn
der Therapie mit Copaxone®
96
IV. Ergebnisse
Der prozentuale Anteil TNF-α-produzierender Zellen stieg während der Therapie mit Cop-1 leicht an,
war nach 24 Wochen statistisch signifikant erhöht und fiel dann wieder leicht ab (siehe Abb. 76).
c) IL-4-produzierende Lymphozyten
* p = 0,035
* p = 0,047
* p = 0,002
% Lymphozyten
10.0
* p = 0,034
7.5
5.0
* p = 0,020
* p = 0,021
2.5
0.0
Baseline
6
12
18
24
30
36
42
48
Wochen
Therapie mit Copaxone
median
* signifikant nach Wilcoxon-Test (p < 0,05)
Abb. 77: Prozentualer Anteil IL-4 produzierender Lymphozyten aus dem peripheren Blut von
MS-Patienten vor Therapiebeginn und 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 und 48 Wochen nach Beginn der
Therapie mit Cop-1
Die deutlichsten Veränderungen auf der Zytokinebene zeigten sich im Anstieg des Anteils IL-4produzierender Lymphozyten. IL-4 gilt als Th2-typisches Zytokin. Sechs (p=0,021), 12 (p=0,020), 18
(p=0,034), 24 (p=0,002), 36 (p=0,047) und 42 Wochen (p=0,035) nach Beginn der Therapie mit Cop-1
war der prozentuale Anteil IL-4-produzierender Lymphozyten signifikant höher als vor
Therapiebeginn (siehe Abb. 77). Die statistischen Berechnungen wurden mit dem Wilcoxon-RankTest durchgeführt.
d) IL-10-produzierende Lymphozyten
Nach 24 Wochen Therapie mit Cop-1 zeigte sich ein signifikanter Anstieg des prozentualen Anteils
IL-10-produzierender Lymphozyten im Vergleich zum Wert vor Therapiebeginn (o. Abb.). Alle
anderen Werte zeigten keine statistisch signifikanten Veränderungen.
e) TGF-β
β -produzierende Lymphozyten
Es fand sich zu keinem Zeitpunkt während des ersten Jahres Therapie mit Cop-1 eine signifikante
Veränderung des Anteils TGF-β-produzierender Lymphozyten (o. Abb.).
97
IV. Ergebnisse
f) INF-γγ -produzierende T-Helfer-Zellen
Verglichen mit dem Wert vor Beginn der Therapie war zu keinem Zeitpunkt während des ersten Jahres
Therapie mit Cop-1 ein signifikant veränderter Prozentsatz INF-γ-produzierender Th -Zellen zu
erkennen (o. Abb.).
g) IL-2- produzierende T-Helfer-Zellen
Der prozentuale Anteil der IL-2-produzierender Th -Zellen stieg in Woche 24 und 30 nach
Therapiebeginn im Vergleich zum Wert vor der Therapie signifikant an (o. Abb.). Alle anderen Werte
zeigten keine statistisch signifikanten Veränderungen.
h) TNF-α
α -produzierende T-Helfer-Zellen
Nur nach 42 Wochen Therapie mit Cop-1 zeigte sich ein statistisch signifikanter Abfall TNF-αproduzierender T-Helfer-Zellen (o. Abb.). Zu allen anderen Zeitpunkten fanden sich keine
Veränderungen im Vergleich zum Ausgangswert.
i) IL-4-produzierende T-Helfer-Zellen
Der prozentuale Anteil IL-4-produzierender Th -Zellen stieg in Woche 24 und 42 nach Therapiebeginn
im Vergleich zum Wert vor der Therapie signifikant an (o. Abb.). Alle anderen Werte zeigten keine
statistisch signifikanten Veränderungen.
j) IL-10-produzierende T-Helfer-Zellen
Verglichen mit dem Wert vor Beginn der Therapie war zu keinem Zeitpunkt während des ersten Jahres
Therapie mit Cop-1 ein signifikant veränderter Prozentsatz IL-10-produzierender Th -Zellen zu
beobachten (o. Abb.).
k) TGF-β
β -produzierende T-Helfer-Zellen
Zu keinem Zeitpunkt während der Therapie mit Cop-1 fand sich ein signifikant veränderter
Prozentsatz TGF-β-produzierender Th -Zellen im Vergleich zu den Werten vor Therapiebeginn
(o. Abb.).
4.5.2.3. Untersuchung verschiedener Lymphozytenpopulationen und Aktivierungsmarker unter
Cop-1-Therapie
Vor Therapiebeginn und 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 und 48 Wochen nach Therapiebeginn mit
Copaxone® wurde den 19 MS-Patienten peripheres Blut abgenommen, zur Gerinnungshemmung
EDTA zugesetzt und anschließend mittels spezifischer, Fluorochrom-konjugierter AK verschiedene
98
IV. Ergebnisse
Zellpopulationen charakterisiert (siehe II.2.5.). Mit Hilfe der Dreifarben-Durchflusszytometrie wurden
folgende Zelltypen markiert:
-
CD3-Markierung = T-Lymphozyten,
-
CD3 + CD4-Markierung = T-Helfer-Zellen,
-
CD3 + CD8-Markierung = CD8-positive T-Lymphozyten (Zytotoxische T-Lymphozyten),
-
CD3 + CD69-Markierung = aktivierte T-Lymphozyten,
-
CD3 + CD4 + CD69-Markierung = aktivierte Th-Zellen,
-
CD3 + CD8 + CD69-Markierung = aktivierte, zytotoxische T-Lymphozyten.
Bei dem Molekül CD69 handelt es sich um ein in einer sehr frühen Phase der Aktivierung einer Zelle
auf der Oberfläche exprimiertes Molekül, das auch unter dem Namen ‚activation-induced molecule’
(AIM) bekannt ist (Ziegler 1994).
42 Wochen nach Beginn der Therapie mit Cop-1 stieg der Anteil der T-Helfer-Zellen im Blut von MSPatienten signifikant im Vergleich zum Ausgangswert an (p=0,011). Der Anteil der CD8-positiven TLymphozyten im peripheren Blut von MS-Patienten ging nach 6 (p=0,002), 30 (p=0,008), 42
(p=0,049) und 48 Wochen (p=0,011) Therapie mit Cop-1 statistisch signifikant zurück (Daten nicht
dargestellt). Die statistischen Berechnungen wurden unter Verwendung des Wilcoxon-Rank-Tests
durchgeführt.
* p=0,036
* p=0,020
* p=0,039
* p=0,013
p=0,05
* p=0,004
% T-Lymphozyten
20
15
10
5
0
Vorher
6
12
18
24
30
36
42
48
Wochen
Therapie mit Copaxone
median
*
signifikant nach Wilcoxon-Test (p < 0,05)
Abb. 78: Prozentualer Anteil aktivierter T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut von MSPatienten vor Beginn der Therapie und 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 und 48 Wochen nach Beginn der
Therapie mit Cop-1
99
IV. Ergebnisse
Wie in Abb. 78 dargestellt, war 6 , 12, 18, 24 und 48 Wochen nach Beginn der Therapie mit Cop-1
verglichen mit dem Wert vor Therapiebeginn ein Anstieg des prozentualen Anteils aktivierter TLymphozyten zu beobachten. In Woche 36 war der Wert fast signifikant (p=0,05; Signifikanzniveau
p<0,05).
Verglichen mit dem Wert vor Beginn der Therapie stieg der prozentuale Anteil aktivierter Th -Zellen in
Woche 48 signifikant an. Zu allen anderen Messzeitpunkten waren die gemessenen Werte nicht
signifikant verändert (Daten nicht dargestellt).
Der prozentuale Anteil aktivierter CD8-positiver T-Lymphozyten im Blut von MS-Patienten änderte
sich während der Therapie mit Cop-1 nicht (o. Abb.).
4.5.2.4. Vergleich der immunologischen Parameter unter Berücksichtigung des
Krankheitsverlaufs
Die oben dargestellten Ergebnisse beziehen sich immer auf die bei allen 19 Patienten erhobenen
Messwerte. Um zu untersuchen, ob es einen Zusammenhang zwischen den immunologischen
Veränderungen und dem Ansprechen auf die Therapie mit Cop-1 gibt, wurden die Patienten in zwei
Gruppen aufgeteilt. Zum einen in die Gruppe von Patienten, die während der einjährigen Therapie mit
Cop-1 keinen Krankheitsschub hatten und sich klinisch nicht verschlechterten, und zum anderen in die
Gruppe der Patienten, die entweder mindestens einen Krankheitsschub hatten, oder eine deutlich
klinische Verschlechterung zeigten. Die klinische Verschlechterung oder Verbesserung wurde mit
Hilfe des ‚expanded disability status scale’ (EDSS) unmittelbar vor Therapiebeginn und nach 6 bzw.
12 Monaten Therapie mit Copaxone® gemessen (Kurtzke 1983). Von den insgesamt 19 MS-Patienten
hatten während des Beobachtungszeitraumes 4 Patienten mindestens einen Krankheitsschub, 7
Patienten verschlechterten sich klinisch um mindestens einen Punkt auf der EDS-Skala und 9
Patienten hatten weder einen Krankheitsschub, noch eine Verschlechterung der Krankheitssymptome
und galten daher als stabil oder gebessert unter Cop-1-Therapie.
Die statistische Signifikanz möglicher immunologischer Veränderungen wurde daher für alle in
IV.4.5.2.1. bis 3. analysierten Parameter noch einmal für die zwei Patientengruppen:
- 10 Patienten mit sichtbaren klinischen Verschlechterungen,
- 9 Patienten mit stabilem oder verbessertem Krankheitsverlauf,
getrennt berechnet.
Wegen der kleinen Gruppen (10 bzw. 9 Patienten) war ein statistisch signifikanter Unterschied
eigentlich kaum zu erwarten
Bei den 9 Patienten, deren Krankheitssymptome unter Therapie mit Cop-1 stabil blieben oder sich
besserten wurde ein signifikanter Anstieg apoptotischer Th-Zellen nach 30 (p=0,038) bzw. 42
(p=0,021) Wochen Therapie mit Copaxone® beobachtet. Nach 36 und 48 Wochen Therapie war zwar
auch ein Anstieg der mittleren Apoptoserate zu beobachten, dieser Anstieg war jedoch statistisch nicht
100
IV. Ergebnisse
signifikant. Bei der Messung der Proben aller 19 Patienten (siehe Abb.) war der Anstieg der
Apoptoserate der T-Helfer-Zellen sowohl nach 30, 36, 42 und 48 Wochen signifikant gewesen. Auch
bei den 10 Patienten, die unter Cop-1 Therapie einen Krankheitsschub hatten oder/und deren
Krankheitssymptome sich verschlechterten war ein Anstieg der Apoptoserate von T-Helfer-Zellen im
peripheren Blut der MS-Patienten nach 30, 36, 42 und 48 Wochen zu beobachten. Dieser Anstieg war
aber zu keinem Zeitpunkt signifikant (Daten nicht dargestellt).
Außerdem stieg bei den 9 Patienten, deren Krankheitssymptome sich unter Cop-Therapie besserten
oder stabil blieben, der Anteil der IL-4-produzierenden Lymphozyten nach 6 (p=0,026), 24 (p=0,008),
36 (p=0,021) und 42 Wochen (p=0,028) signifikant an. Ein signifikanter Anstieg des Anteils der IL-4produzierenden Lymphozyten war bei den Patienten, die Krankheitsschübe hatten oder deren
Krankheitssymptome sich verschlechterten, nicht zu beobachten (Daten nicht dargestellt).
Bei den 9 Patienten, die gut auf die Cop-1 Therapie ansprachen, war außerdem ein Anstieg des
prozentualen Anteils aktivierter T-Lymphozyten zu beobachten. Dieser Anstieg war nach 24
(p=0,028), 36 (p=0,013) und 48 (p=0,012) Wochen Therapie mit Cop-1 statistisch signifikant (o.Abb).
Bei den Patienten, deren Krankheitssymptome sich unter der Therapie verschlechterten, stieg der
Anteil aktivierter T-Lymphozyten im peripheren Blut ebenfalls an, war aber nur nach 6 Wochen
Therapie (p=0,028) signifikant gestiegen (Daten nicht dargestellt).
101
V. Diskussion
V. Diskussion
1. Untersuchung verschiedener EAE-Modelle
Eines der Ziele der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung von murinen EAE-Modellen, die
anschließend für weitere Untersuchungen eingesetzt werden können. Ein für immunologische,
pathologische oder therapeutische Untersuchungen geeignetes EAE-Modell muss bestimmte Kriterien
erfüllen. Zum einen ist es notwendig, dass eine möglichst große Anzahl der Versuchstiere nach
Krankheitsinduktion wirklich an einer EAE erkrankt (Prävalenz > 80 %) zum anderen muss der
individuelle Krankheitsverlauf so schwer sein, dass Unterschiede im Krankheitsverlauf auch
tatsächlich deutlich werden (maximaler Behinderungsgrad > 2,0). Leichte Krankheitssymptome bis zu
einem Behinderungsgrad von 1,0 sind häufig schwierig zu differenzieren (siehe Tab. 6).
Bei den unter IV.1. beschriebenen Versuchen zur Etablierung verschiedener EAE-Modelle zeigte sich,
dass die Tiere, abhängig von dem verwendeten Mäusestamm und der zur Krankheitsinduktion
eingesetzten Substanz, unterschiedlich schwere Krankheitssymptome entwickelten. Auch der Anteil
der Tiere einer Gruppe, bei denen nach Krankheitsinduktion Krankheitssymptome auftraten, variierte
in den verschiedenen EAE-Modellen stark. Wie unter IV.1.5. beschrieben, entwickeln die Tiere der
verschiedenen Inzuchtstämme unterschiedlich starke Krankheitssymptome. So zeigen C57BL/6Mäuse nach Krankheitsinduktion mit PLP 139-151 -Peptid so gut wie keine Behinderungen, BALB/cMäuse erkranken leicht, jedoch SJL/J-Mäuse zeigten deutlich stärkere Krankheitssymptome.
Allerdings ist zu berücksichtigen, dass in C57BL/6-Mäusen nur mit einem Peptid versucht wurde eine
EAE auszulösen. Möglicherweise, und Ergebnisse anderer Studien deuten darauf hin (Sun 2001,
Okuda 2002), ist es mit anderen Substanzen auch in C57BL/6 möglich eine EAE mit deutlichen
Krankheitssymptomen auszulösen.
Für diese sehr unterschiedlichen Schweregrade der Erkrankung können verschiedene Mechanismen
verantwortlich sein. Die Mäuse der einzelnen Inzuchtstämme unterscheiden sich bezüglich ihrer Major
Histokompatibilitätskomplex-Gene (MHC) und besitzen unterschiedliche H-2 Haplotypen (H-2 =
MHC der Maus)(siehe Tab. 12). Verschiedene Studien haben gezeigt, dass beim Menschen ein
direkter Zusammenhang zwischen der Expression bestimmter Typen des ,human leukocyte antigen’
(HLA)-Typ (HLA = MHC des Menschen) und der Wahrscheinlichkeit, an Multipler Sklerose zu
erkranken, besteht (Olerup 1991, Epplen 1997). Dies legt die Vermutung nahe, dass auch bei den an
EAE erkrankten Mäusen der H-2-Haplotyp bei der Krankheitsinduktion und der Schwere der
Krankheitssymptome eine Rolle spielt. Über die Bindung von MHC-Peptid-Komplexen an T-ZellRezeptoren während der Antigenpräsentation sind die MHC-Moleküle entscheidend an der Auslösung
und Manifestation einer Immunantwort beteiligt. Möglicherweise sind einige MHC-Haplotypen
stärker an der Aktivierung autoreaktiver T-Zellen beteiligt als andere (Das 2000). Auch die Bindung
102
V. Diskussion
von Myelin-spezifischen Peptiden in die MHC-Spalte ist möglicherweise bei einigen MHCHaplotypen häufiger und/oder stärker als bei anderen Haplotypen.
Darüber hinaus können aber neben dem H-2-Haplotyp der Mäuse auch noch andere Faktoren für die
unterschiedliche Schwere der Erkrankungen bei den verschiedenen Mäusestämmen verantwortlich
bzw. beteiligt sein. Da sowohl bei der EAE als auch bei der MS Lymphozyten und hier speziell TLymphozyten eine wichtige Rolle spielen, wurde in der vorliegenden Arbeit die T-/B-Zell-Ratio bei
Mäusen der verschiedenen Mäusestämme im Blut, in der Milz und in den Lymphknoten bestimmt.
Wie unter IV.2. dargestellt, unterscheidet sich überraschenderweise der Anteil der verschiedenen
Lymphozytensubpopulationen von einem Mäusestamm zum anderen stark. Die stark auf die Induktion
einer EAE reagierenden SJL/J-Mäuse haben einen deutlich höheren Anteil an T- als an B-Zellen,
wohingegen die auf eine EAE-Induktion schwächer reagierenden C57BL/6- und BALB/c-Mäuse einen
deutlich höheren Anteil an B- als an T-Lymphozyten haben. Da die EAE als T-Zell-vermittelte
Erkrankung gilt, d.h. da die Erkrankung durch den Transfer von T-Zellen von erkrankten auf gesunde
Mäuse übertragbar ist, nicht jedoch durch den Transfer von Antikörpern, spricht einiges dafür, dass
neben dem MHC auch die unterschiedliche Zusammensetzung der Zellpopulationen in den
Immunorganen der Versuchstiere eine Rolle bei der Pathogenese und Manifestation der Erkrankung
spielt. Interessanterweise lassen sich EAE-Modelle, bei denen eine stärkere Beteiligung von
Antikörpern beschrieben ist, z.B. MOG-induzierte EAE, eher bzw. auch in C57BL/6-Mäusen, also
Tieren mit einer niedrigen T-/B-Zell-Ratio, induzieren (Okuda 2002). Diese EAE-Typen werden in
einigen Arbeiten als experimentelle allergische Enzephalomyelitiden bezeichnet und von den
experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitiden auf Grund der stärkeren Beteiligung von
Antikörpern, vor allem bei der Antikörper-vermittelten Demyelinisierung, unterschieden (Wekerle
1994, Weiner 2001).
Es zeigte sich im Verlauf der Arbeit, dass von den getesteten EAE-Modellen, die folgenden aufgrund
ihrer Prävalenz und der Schwere der Erkrankung für die weiteren Versuche geeignet sind:
1. Die Krankheitsinduktion mit PLP 139-151 -Peptid bei weiblichen SJL/J-Mäusen ergibt einen primär
schubförmig remittierenden und sekundär chronisch progredienten Verlauf.
2. Die Krankheitsinduktion mit MBP 87-99 -Peptid bei weiblichen SJL/J-Mäusen ergibt einen
monophasischen, remittierenden Verlauf.
3. Die Krankheitsinduktion mit Rückenmarkshomogenat bei weiblichen SJL/J-Mäusen ergibt einen
eher chronischen Krankheitsverlauf mit Schüben.
4. Die Krankheitsinduktion mit PLP 139-151 -Peptid und mit MBP 87-99 -Peptid bei weiblichen BALB/cMäusen ergibt jeweils einen leichten, schubförmig remittierenden Krankheitsverlauf.
Bezogen auf ihre Krankheitssymptome konnten schwere Verläufe einer EAE in dieser Form nur in
SJL/J-Mäusen beobachtet werden. Für weitere Untersuchungen erscheint es aber sinnvoll, auch Tiere
eines Inzuchtstammes mit einem anderen H-2-Haplotyp und einer anderen T-/B-Zell-Ratio
einzusetzen. Zudem spiegeln diese sehr unterschiedlichen Krankheitsverläufe in etwa die Breite der
103
V. Diskussion
Krankheitsverläufe bei der Multiplen Sklerose wieder, so dass es in jedem Fall sinnvoll ist neue
Therapiekonzepte auf ihre Wirksamkeit in verschiedenen EAE-Modellen zu testen.
2. Versuche mit Lipo-X
2.1. Therapieversuche mit Lipo-X
Bei dem in der vorliegenden Arbeit verwendeten Lipo-X handelt es sich um ein Liponsäurederivat.
Einige der in verschiedenen Arbeiten beschriebenen Effekte von Liponsäurederivaten in in vitro bzw.
in vivo Untersuchungen suggerieren, dass diese auch für die Therapie der EAE geeignet sein könnten
(Ohmori 1986, Biewenga 1997, Packer 1997). Unter IV.3.1. sind die Ergebnisse der im Verlauf dieser
Arbeit durchgeführten Therapieversuche mit Lipo-X bei verschiedenen EAE-Modellen beschrieben.
Die Ergebnisse des unter IV.3.1.1. beschriebenen Therapieversuchs mit BALB/c-Mäusen nach
Krankheitsinduktion mit PLP 139-151 -Peptid zeigen einen leichteren Krankheitsverlauf bei den mit LipoX behandelten Tieren als bei den unbehandelten Tie ren. Dieser Effekt ist allerdings nicht signifikant.
Diese Versuchstiere wurden am Tag 0 bzw. am Tag 5 nach Krankheitsinduktion erstmalig mit Lipo-X
behandelt. Da die ersten Krankheitssymptome bereits 3-8 Tage nach Krankheitsinduktion auftreten,
könnte die Zeitspanne zwischen Therapiebeginn und Krankheitsmanifestation einfach zu kurz gewählt
worden sein, um einen signifikanten Effekt zu erzielen. Daher wurde im nächste Versuch ein
prophylaktisches Therapiekonzept gewählt und die Therapie mit Lipo-X bereits neun Tage vor
Krankheitsinduktion begonnen (siehe IV.3.1.2.). Für diesen Versuch, der als Blindversuch
durchgeführt wurde, wurde das EAE-Modell gewählt, das sich in den Vorversuchen als das mit dem
schwersten Krankheitsverlauf erwiesen hatte (PLP 139-151 -Peptid induzierte EAE in SJL/J). Nur zwei
von zehn Tiere zeigen nach der prophylaktischen Behandlung mit Lipo-X überhaupt noch
Krankheitssymptome und diese waren auch nur sehr leicht (siehe Abb. 24). Die Krankheitsaktivität
der mit Lipo-X behandelten Tiere ist in diesem Versuch statistisch signifikant niedriger als bei der
unbehandelter Kontrolltiere. Auch in dem dritten EAE-Modell, mit MBP 87-99 -Peptid in SJL/J-Mäusen,
zeigte sich ein milderer Krankheitsverlauf bei den mit Lipo-X behandelten Tieren. Dieser Effekt war
jedoch statistisch nicht signifikant. Auch diese Tiere wurden erst vier Tage nach Krankheitsinduktion
erstmalig behandelt.
Eine „prophylaktische“ Behandlung kommt beim Menschen zwar nicht infrage, da unbekannt ist, wer
wann an MS erkranken wird. Trotzdem geben die sehr guten (und signifikanten) Ergebnisse dieses
Versuchs einen Hinweis darauf, dass Lipo-X eine therapeutische Wirkung hat. In diesem Sinn sind
auch die – zwar nicht signifikante, aber doch deutlichen – Verbesserungen im therapeutischen Ansatz
durchaus als positiv zu werten. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde untersucht auf welche Art und
104
V. Diskussion
Weise Lipo-X auf Komponenten des Immunsystems, die bei der Pathogenese der Erkrankung eine
entscheidende Rolle spielen, wirkt.
2.2. In vitro Versuche mit Lipo-X
In verschiedenen in vitro Versuchen wurden die Auswirkungen einer Stimulation mit Lipo-X auf die
Zellen des Immunsystems untersucht (siehe IV.3.2.). Die wichtigsten Ergebnisse der in vitroUntersuchungen sind erstens die Hemmung der Proliferation von spezifisch und unspezifisch
stimulierten Lymphknoten- und Milzzellen durch hohe Konzentrationen von Lipo-X, sowie der
Anstieg der Proliferationsrate von PLP-spezifisch stimulierten Zellen nach Inkubation mit geringeren
Dosierungen von Lipo-X. Zum zweiten die Tatsache, dass nach in vitro Stimulation mit Lipo-X der
prozentuale Anteil apoptotischer Lymphozyten unverändert bleibt und drittens der Befund, dass die
Stimulation mit Lipo-X nicht zur Produktion der folgenden Zytokine führt: IL-2, IL-4, IL-5 und IFN-γ.
Allerdings ist bei geringen Konzentrationen von Lipo-X nach 24 Stunden ein leichter Anstieg der
TNF-α-Produktion sowie bei höheren Konzentrationen von Lipo-X ein leichter Abfall der TNF-αProduktion peripherer Blutzellen nach 24 und 48 Stunden Inkubation zu finden (siehe Abb. 29). Die
Tatsache, dass Lipo-X in niedrigeren Konzentrationen im in vitro Versuch andere Ergebnisse zeigt als
nach Gabe von hochdosiertem Lipo-X, lässt sich damit erklären, das die Hauptwirkungen von
Liponsäurederivaten nach Aufnahme in die Zelle intrazellulär ablaufen (Packer 1995, Sen 1996). In
niedrigen Konzentrationen zeigt Lipo-X möglicherweise über extrazelluläre Mechanismen bzw.
Bindung an die Zelle nur stimulierende Effekte.
Die oben genannten Ergebnisse deuten daraufhin, dass die Hemmung der Proliferation von
Lymphozyten durch die Gabe von Lipo-X in hohen Dosierungen nicht über den Mechanismus der
Auslösung des apoptotischen Zelltods der Zellen läuft, sondern über andere zellregulierende
Vorgänge. Die Wirkung von Liponsäurederivaten auf den Transkriptionsfaktor NF-κB wurde
verschiedentlich beschrieben (Suzuki 1995, Packer 1995). Die DNA-Bindungsaktivität von NF-κB
wird von alpha-Liponsäure inhibiert, was wiederum hemmend auf die von NF-κB aktivierten Gene
wirkt. So gehört u.a. das TNF-α-Gen zu den Genen, die durch Bindung von NF-κB in der PromotorRegion aktiviert werden (Suzuki 1995).
Dies erklärt die hemmende Wirkung von hochdosiertem Lipo-X auf die TNF-α-Produktion von
peripheren Blutzellen. TNF-α wiederum wirkt aktivierend auf NF-κB, so dass durch die Inhibierung
der TNF-α-Produktion wiederum ein aktivierendes Signal für NF-κB wegfällt. Neben der Wirkung
auf das TNF-α-Gen beeinflusst NF-κB auch zahlreiche andere Gene der Zellregulation, u.a.
verschiedene an der Aktivierung von Zellen beteiligte Gene (Hilliard 1999).
Demzufolge lässt sich auch die proliferationshemmende Wirkung von Lipo-X auf Lymphozyten über
die Wirkung auf den Transkriptionsfaktor NF-κB erklären. Diese Hemmung der Proliferation setzt
105
V. Diskussion
nicht zwingend die Apoptose der Zelle voraus, es ist eher vorstellbar, dass die Zellen anergisch
werden. In in vitro Versuchen mit Ratten Thymozyten wurde gezeigt, dass Liponsäurederivate in der
Lage sind, die Induktion von Apoptose u.a. durch Freisetzung von Kortikosteroiden zu unterbinden
(Packer 1995).
Da NF-κB über die Regulation der Gene verschiedener im Immunsystem wirkender Komponenten
(z.B.: TNF-α als Oligodendrozyten-toxischer Faktor, Adhäsionsmoleküle bei der Migration durch die
Blut-Hirn-Schranke) bei der Pathogenese und Manifestation von Enzephalomyelitiden eine wichtige
Rolle spielt, lässt sich der beobachtete positive therapeutische Effekt von Lipo-X auf die EAE über
diesen Wirkmechanismus gut erklären.
2.3. Untersuchung der Wirkung von Lipo-X bei naiven Mäusen
Um die Wirkmechanismen von Lipo-X nicht nur in vitro sondern auch in vivo zu untersuchen, wurden
die unter IV.3.3. beschriebenen Versuche durchgeführt. Nach intraperitonealer Injektion von 2 mg
Lipo-X (jeden 2. Tag) wurden periphere Blutzellen, Milzzellen sowie durch Peritoneal Lavage
gewonnene Zellen von ansonsten unbehandelten Mäusen durchflusszytometrisch untersucht. Die
wichtigsten Ergebnisse dieser Untersuchungen sind zum einen, dass sich in der Milz und im
peripheren Blut der Mäuse nach Injektion von Lipo-X keine nennenswerten Verschiebungen in den
Anteilen der einzelnen Leukozytensubpopulationen finden, und zum anderen, dass wesentliche
Verschiebungen der prozentualen Anteile der verschiedenen Leukozytenpopulationen bei den
‚Peritoneal Exudate Cells’ (PEC) beobachtete werden konnten. Zum einen ist ein verhältnismäßig
geringer Anstieg des Anteils an T-Lymphozyten bei den PEC nach i.p. Injektion von Lipo-X zu
erkennen. Wesentlich deutlicher ist allerdings die starke Abnahme des Anteils an Monozyten und die
enorme Zunahme des Anteils an Granulozyten in der durch Peritoneal Lavage gewonnenen
Zellsuspension nach Injektion von Lipo-X (siehe Abb. 32). Dieser Effekt wird im zeitlichen Verlauf
immer stärker. Die Monozyten und Granulozyten wurden zum einen mit Hilfe einer PappenheimFärbung im Ausstrich von PEC (siehe Abb. 33 und 34) und zum anderen durchflusszytometrisch mit
Hilfe eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch gegen das Molekül Ly6G auf der Oberfläche
dieser Zellen gerichtet ist, differenziert (siehe Abb. 35 und 36). Monozyten tragen nur relativ wenige
dieser Moleküle auf der Zelloberfläche, wohingegen Granulozyten die Ly6G-Moleküle in einer um ein
Vielfaches höheren Dichte auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Bei der durchflusszytometrischen
Messung findet man entsprechend der Menge der an die Ly6G-Moleküle auf der Zelloberfläche
gebundenen Fluorochrom-konjugierten, monoklonalen Antikörper ein schwächeres (= Monozyten)
oder stärkeres Fluoreszenzsignal (= Granulozyten) der einzelnen Zellen. Die Färbung der PEC nach
Pappenheim bietet die Möglichkeit die Zellen aufgrund ihrer Morphologie zu differenzieren. Da
Monozyten nur noch in der Lage sind, sich in Makrophagen oder dendritische Zellen, aber nicht in
106
V. Diskussion
Granulozyten weiter zu entwickeln, liegt die Vermutung nahe, dass es sich bei den ursprünglich als
Monozyten identifizierten Zellen in Wirklichkeit um sog. ‚Granulocyte Macrophage Colony Forming
Cells’ (GMCFC) handelt. Diese Vorläuferzellen sind in der Lage sich entweder in Monozyten oder in
Granulozyten weiter zu entwickeln. Sie expremieren ebenfalls in geringem Umfang das Molekül
Ly6G auf ihrer Zelloberfläche und zeichnen sich morphologisch durch einen großen Zellkern aus.
Unter dem Einfluss von Lipo-X kommt es demzufolge in vivo zur Entwicklung von Granulozyten aus
Vorläuferzellen. Die Rolle von Granulozyten während einer Enzephalomyelitis ist derzeit nicht
verstanden. Es gibt erste Berichte darüber, dass zumindest bei einigen Enzephalomyelitiden auch
Granulozyten an der Entzündungsreaktion innerhalb des ZNS beteiligt sind und vor allem über die von
ihnen produzierten Chemokine den Krankheitsverlauf negativ beeinflussen (McColl 1998, Nygardas
2000). Ob die in den Versuchen dieser Arbeit beobachtete Anreicherung von Granulozyten im
Peritoneum ein spezifisch für die Wirkung von Lipo-X in der Peritonealhöhle auftretendes Phänomen
ist, oder ob es auch bei anderen Applikationsversuchen zur Verstärkung des Granulozyten-Anteils in
verschiedenen Organen/Geweben kommt, ist noch unklar.
3. Versuche mit Cop-1
Copolymer-1 (Cop-1), auch als Glatiramerazetat oder Copaxone® bekannt, ist ein randomisiert
synthetisiertes Gemisch aus Polypeptiden, das seid einigen Jahren zur Therapie der schubförmig
verlaufenden Multiplen Sklerose zugelassen ist, dessen genaue Wirkmechanismen aber nur
unzureichend bekannt sind. Da nur ein Teil der damit behandelten Patienten von der Therapie mit
Cop-1 profitiert, ist es notwendig, mehr über die genaue Wirkungsweise von Cop-1 zu erfahren, um
zukünftig möglicherweise über eine Subtypisierung der Patienten diese gezielter behandeln zu können.
Unter IV.4. sind die Ergebnisse der in vitro- und in vivo-Untersuchungen der Wirkung von Cop-1 auf
verschiedene Komponenten des Immunsystems dargestellt.
3.1. In vitro Versuche mit Cop-1
Die interessantesten Ergebnisse nach in vitro Stimulation mit Cop-1 sind die Wirkung von Cop-1 zum
einen auf den Zelltod von Lymphozyten (siehe IV.4.1.1.) und zum anderen auf die Produktion
verschiedener Zytokine durch periphere Blutzellen (siehe IV.4.1.2.). Mit Hilfe der Annexin V/
Propidiumjodid-Technik wurde nach 24-stündiger Stimulation mit Cop-1 der prozentuale Anteil toter
Zellen bestimmt. Diese Technik erlaubt prinzipiell die Unterscheidung derjenigen toten Zellen, die
eines apoptotischen Zelltodes sterben und aufgrund der Umstrukturierung im Bereich der
Zellmembran Annexin V binden, von denjenigen toten Zellen, die „nekrotisch“ sterben und keine
107
V. Diskussion
intakte Zellmembran mehr haben und daher sowohl Annexin V als auch Propidiumjodid binden (Van
den Eijnde 1997). Über die Phosphatidylserine, die an der Oberfläche apoptotischer Zellen zu finden
sind und an die Annexin V bindet, binden in vivo phagozytierende Zellen an die apoptotischen Zellen
und entfernen diese, ohne dass es zur Freisetzung intrazellulärer Zellbestandteile kommt. In
Zellkulturversuchen, in denen keine oder kaum professionelle phagozytierende Zellen vorhanden sind,
gehen auch apoptotische Zellen einen ‚nekrotischen Weg’, d.h. die Zellmembranen werden
durchlässig und Zellbestandteile gelangen in das umgebende Medium. Daher ist die Unterscheidung
von Zellen, die eines apoptotischen Zelltodes sterben von denen, die eines „nekrotischen“ Zelltodes
sterben in Zellkulturversuchen häufig nicht eindeutig vorzunehmen. Die in Abb. 38 dargestellten
Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analyse des Anteils der nach in vitro Stimulation mit Cop-1
sterbenden Lymphozyten, zeigen keine Veränderungen bezüglich des Prozentsatzes der Annexin-Vpositiven Zellen, aber einen deutlichen Anstieg der Propidiumjodid-positiven Zellen. Der Anteil
Propidiumjodid-positiver Zellen steigt sehr deutlich mit der Konzentration des eingesetzten Cop-1 an.
Aus diesen Ergebnissen lässt sich die Aussage ableiten, dass Cop-1 in Lymphozyten den Zelltod
induziert. Ob dieser allerdings apoptotischer oder nekrotischer Art ist, ist mit diesem Versuch nicht
eindeutig zu klären. Der in diesem Versuch gemessene Anteil sterbender Lymphozyten kann sich nicht
ausschließlich aus autoreaktiven myelinspezifischen Lymphozyten zusammensetzen, da dieser
Versuch mit Milzzellen naiver Mäuse durchgeführt wurde und hier nicht mit einem entsprechenden
Anteil an autoreaktiven myelinspezifischen Lymphozyten zu rechnen ist. In verschiedenen Studien
wird über einen sog. ‚Th1/Th2-Shift’ unter Stimulation mit Cop-1 berichtet (Neuhaus 2000, Miller
1998). Die Annahme liegt also durchaus nahe, dass es sich bei den als Folge der Stimulation mit Cop1 sterbenden Zellen um Lymphozyten mit Th1-typischem Zytokinmuster handelt und auf diese Weise
eine Verschiebung der Th1/Th2-Ratio in Richtung der T-Helfer-Zellen mit Th2-typischen
Zytokinmuster bewirkt wird. Dagegen sprechen allerdings die unter IV.4.1.2. beschriebenen
Ergebnisse der Analyse der von peripheren Blutzellen produzierten Zytokine. Diese Ergebnisse zeigen
keine Veränderungen der Konzentration der Th1-typischen Zytokine IL-4 und IL-5 sowie der Th2typischen Zytokine IFN-γ und IL-2 (alle unterhalb des Detektionslimits). Die Produktion von TNF-α
aber steigt unter Stimulation mit Cop-1 erheblich an (siehe Abb. 39). Da bei diesen
Stimulationsversuchen peripheres Blut eingesetzt wurde, sind auch Monozyten, die in deutlich
stärkerem Maße TNF-α produzieren als Lymphozyten, in der Zellkultur vorhanden. Dies gibt Grund
zu der Annahme, dass die gesteigerte Produktion von TNF-α in erster Linie auf die Wirkung von Cop1 auf Monozyten zurückzuführen ist. Auf eine Veränderung der Th1/Th2-Ratio kann aus den
Ergebnissen dieses Versuchs nicht geschlossen werden.
108
V. Diskussion
3.2. Untersuchung der Wirkung von Cop-1 bei naiven Mäusen
Neben den in vitro Versuchen wurden auch in vivo Untersuchungen zur Aufklärung der
Wirkmechanismen von Cop-1 durchgeführt. Bei den unter IV.4.2. dargestellten Untersuchungen
wurde gesunden unbehandelten Versuchstieren (SJL/J-, BALB/c-, C57BL/6-Mäuse) Cop-1 subkutan
injiziert und anschließend verschiedene Leukozytenpopulationen im peripheren Blut, in der Milz und
in den drainierenden Lymphknoten durchflusszytometrisch untersucht. Auffällig ist, dass bei den
Tieren aller eingesetzten Mäusestämme am ersten bis dritten Tag nach Injektion von Cop-1 in den
Lymphknoten der jeweiligen Tiere der prozentuale Anteil CD8-positiver Lymphozyten geringer wird.
Der Anteil der B-Zellen steigt bei den Tieren der Mäusestämme, die ohnehin einen relativ hohen
Anteil an B-Zellen haben, nach Injektion von Cop-1 an. Die Ergebnisse sind allerdings nicht
eindeutig, was darauf hinweisen könnte, dass die Wirkmechanismen, über die Cop-1 auf das
Immunsystem der Mäuse wirkt, sich in den verschiedenen Inzuchtstämmen unterscheiden (siehe
IV.2.).
3.3. Therapieversuche mit Cop-1 bei an EAE erkrankten Mäusen
Die unter IV.4.3. dargestellten Ergebnisse der Therapieversuche mit Copaxone® sind, abhängig vom
eingesetzten Mäusestamm und von der zur Krankheitsinduktion eingesetzten Substanz, durchaus
unterschiedlich. Mäuse des Inzuchtstammes BALB/c zeigen nach Krankheitsinduktion mit PLP 139-151 Peptid während der Therapie mit Cop-1 keine Abschwächung der Krankheitssymptome. Hierbei ist
allerdings zu beachten, dass BALB/c-Mäuse generell einen relativ leic hten Krankheitsverlauf zeigen
(siehe IV.1.2.). Bei weiblichen Mäusen des Inzuchtstammes SJL/J konnten die Symptome der EAE,
wie in Abb. 61 und 66 dargestellt, sowohl nach der Krankheitsinduktion mit PLP- als auch mit MBPPeptid, nach dem prophylaktischen Einsatz von Cop-1 deutlich abgeschwächt werden. Dieser Effekt
war nach Krankheitsinduktion mit MBP-Peptid signifikant. Diese Ergebnisse weisen daraufhin, dass
es einen Zusammenhang zwischen eingesetztem Mäusestamm und dem Ansprechen auf eine Therapie
mit Cop-1 gibt. Ein wichtiger, bereits beschriebener Effekt von Cop-1 ist die Bindung an den MHCKomplex und die Verdrängung von MBP-Peptiden aus der Spalte der MHC-kodierten Rezeptoren
(Teitelbaum 1992, Racke 1992). Möglicherweise ist diese Wirkungsweise von Cop-1 dafür
verantwortlich, dass die Tiere verschiedener Mäusestämme, die sich bezüglich ihres MHC-Haplotyps
unterscheiden, unterschiedlich gut auf die Therapie mit Cop-1 ansprechen. Wie Fusco im Jahre 2001
zeigen konnte, scheint es auch beim Menschen einen Zusammenhang zwischen MHC-Typ und dem
Ansprechen auf die Therapie mit Cop-1 zu geben (Fusco 2001). Neben dem MHC-Haplotyp könnte
aber auch die bei den verschiedenen Mäusestämmen sehr unterschiedliche Zusammensetzung der
Lymphozytenpopulation aus den verschiedenen Subpopulationen bei der Wirkung von Cop-1 eine
109
V. Diskussion
Rolle spielen. Wenn Cop-1 in erster Linie auf T-Lymphozyten wirkt, könnte dies erklären, warum in
den eher B-Zell-dominierten Mäusestämmen (BALB/c) (siehe IV.2.) die Immunantwort durch Cop-1
gar nicht oder nicht so stark beeinflusst werden kann. Beide Ansätze, sowohl die Abhängigkeit der
Wirkung einer Therapie mit Cop-1 vom MHC-Haplotyp als auch von der individuellen Verteilung der
Lymphozytenpopulationen, könnten aber genauso gut nebeneinander wirken und in Zukunft die
Möglichkeit zu einer Subtypisierung der Patienten bieten.
Ein weiteres Ergebnis dieser Therapieversuche mit Cop-1 bei an EAE erkrankten Tieren ist, dass die
Wirkung von Cop-1 bei Tieren, deren Erkrankung mit einem MBP-Peptid induziert wurde, größer ist
als bei Tieren, bei denen die Erkrankung durch Injektion eines PLP-Peptids erzeugt wurde. Da Cop-1
ursprünglich als Analogon zum MBP entwickelt wurde (Teitelbaum 1971) überrascht dieses Ergebnis
nicht. Offensichtlich wirkt Cop-1 zwar nicht ausschließlich, aber doch am stärksten auf eine MBPspezifische EAE. In diesem Zusammenhang ist es interessant, dass es bei MS-Patienten im Verlauf der
Erkrankung zum sog. ‚epitope spreading’ kommt. D.h. zu der anfangs eher geringen Anzahl von als
Autoantigene wirkenden Proteinen bzw. Peptiden kommen im Laufe der Erkrankung vor allem als
Folge von Phagozytoseprozessen, weitere Autoantigene hinzu (McRae 1995, Vanderlugt 2000).
Patienten, die vor allem eine anti-MBP spezifische Entzündungsreaktion haben, profitieren
möglicherweise stärker von der Therapie mit Copaxone® als Patienten, die vor allem eine
Autoimmunreaktion gegen andere ZNS-Komponenten haben. Auch das genaue Verständnis für den
Effekt des ‚epitope spreadings’ könnte in Zukunft dazu beitragen, Patienten aufgrund der
Identifizierung der individuellen autoreaktiven, ZNS-spezifischen T-Lymphozyten genauer zu
typisieren.
3.4. Untersuchung der Wirkung von Cop-1 bei an EAE erkrankten Mäusen
Eine wichtige Erkenntnis, die aus den Ergebnissen der unter IV.4.4. beschriebenen Versuche gezogen
werden kann, ist, dass Cop-1-spezifische Antikörper, unabhängig von ihrer Klassen- und
Subklassenzugehörigkeit, offensichtlich keine Rolle bei der Therapie mit Cop-1 spielen. Dieses
Ergebnis unterstützt die bereits unter V.3.3. postulierte Annahme, dass Cop-1 weniger auf BLymphozyten, sondern eher auf T-Lymphozyten wirkt.
Ein weiteres interessantes Ergebnis der unter IV.4.4. beschriebenen Versuche ist die Korrelation
zwischen dem CDI, als Bewertungsgrad der Krankheitsaktivität, und dem prozentualen Anteil der
CD4- bzw. CD8-positiven Lymphozyten im peripheren Blut von SJL/J-Mäusen, die nach
Krankheitsinduktion mit dem PLP 139-151 -Peptid an einer EAE erkrankt sind. Hier zeigen die CD4positiven, also die T-Helfer-Zellen, eine negative Korrelation zum CDI (Abb. 68). D.h. je stärker die
Erkrankung, desto geringer der Anteil der T-Helfer-Zellen im peripheren Blut der Mäuse. Da sich
auch in den Entzündungsplaques im ZNS der Mäuse (siehe IV.1.1.) in erster Linie T-Helfer-Zellen
110
V. Diskussion
finden, liegt die Vermutung nahe, das der geringer werdende Anteil an CD4-Zellen in der Peripherie
auf die Migration dieser Zellen ins ZNS zurückzuführen ist. Wird der Anteil der T-Helfer-Zellen in
der Peripherie niedriger, wirkt sich dies automatisch auf den prozentualen Anteil der CD8-positiven
Zellen aus. Allerdings erscheint es etwas fraglich, ob die Menge der ins ZNS einwandernden T-HelferZellen ausreicht, um im peripheren Blut derartige Verschiebung hervorzurufen. Da es aber während
einer EAE zur verstärkten Expression von Adhäsionsmolekülen kommt, auch aber nicht nur im
Bereich der Blut-Hirn-Schranke, ist es möglich, dass T-Helfer-Zellen aus dem peripheren Blut nicht
nur ins ZNS einwandern, sondern auch in andere Gewebe. Es kann allerdings auch nicht
ausgeschlossen werden, dass die Verschiebung der CD4/CD8-Ratio durch die Proliferation der CD8Zellen verursacht wird. Diese Möglichkeit wird durch die Ergebnisse einer Untersuchung von
Karandikar et al. unterstützt, die davon berichten, dass die Therapie mit Copaxone® zu einer
vermehrten CD8-T-Zell-Immunantwort führt (Karandikar 2002). In einer kürzlich veröffentlichten
Arbeit berichtete Jacobsen darüber, dass es in der ‚cerebrospinal fluid (CSF)’ von MS-Patienten zu
einer oligoklonalen Expansion von CD8-positiven T-Zellen kam (Jacobsen 2002).
Überraschenderweise ist die oben beschriebene Korrelation zwischen CDI und CD4- bzw. CD8positiven Lymphozyten nicht bei SJL/J-Mäusen zu beobachten, die nach Injektion von MBP-Peptid an
EAE erkranken. Erklärend ist hier festzustellen, dass die Krankheitsverläufe der PLP-Peptid bzw.
MBP-Peptid-induzierten EAE sehr unterschiedlich sind (siehe IV.1.4.) und die jeweilige Blutabnahme
daher in verschiedenen Krankheitsphasen lag (PLP-induziert: Remissionsphase; MBP-induziert: akute
Phase). Ferner ist der Krankheitsverlauf nach Induktion der EAE mit PLP 139-151 -Peptid wesentlich
schwerer als nach Induktion mit dem MBP 87-99 -Peptid. Dies alles zeigt, wie stark sich die
verschiedenen EAE-Modelle voneinander unterscheiden und unterstreicht die Notwendigkeit der
Differenzierung bzw. der Typisierung der verschiedenen EAE-Modelle und der individuellen MSVerläufe.
Außerdem findet sich überraschenderweise bei den SJL/J-Mäusen, die nach Injektion von MBP-Peptid
erkrankten, eine statistisch signifikante, negative Korrelation zwischen dem prozentualen Anteil der
NK-Zellen im peripheren Blut und dem jeweiligen CDI. Leider konnte bei den entsprechenden
Versuchen mit PLP-induzierter EAE bei SJL/J-Mäusen der Anteil der NK-Zellen nicht bestimmt
werden, so dass hier kein Vergleich möglich ist. Über die Rolle von NK-Zellen bei
Enzephalomyelitiden war lange Zeit wenig bekannt. Einige neuere Untersuchungen haben aber
gezeigt, das sowohl in vitro als auch in vivo NK-Zellen an den während einer Enzephalomyelitis
ablaufenden Entzündungsprozessen beteiligt sind. In in vitro-Untersuchungen wurde gezeigt, dass
NK-Zellen bei der Lyse von den für die Remyelinisierung verantwortlichen Oligodendrozyten
beteiligt sind (Morse 2001). Andererseits scheint zumindest ein Teil der NK-Zellen in der Lage zu
sein, sog. Th2-typische Zytokine (IL-4, IL-10) zu produzieren und auf diese Weise an der Remission
der Krankheitssymptome bei MS-Patienten mitzuwirken (Takahashi 2001). Möglicherweise führt die
oben beschriebene Expansion peripherer NK-Zellen im weiteren Verlauf der Erkrankung zur
111
V. Diskussion
Migration der NK-Zellen ins ZNS. In den Entzündungsläsionen sind dann möglicherweise die NKZellen bzw. die von ihnen produzierten Zytokine an der Veränderung des herrschenden Mikromilieus
beteiligt, was zum Abklingen der Entzündungsreaktion führen kann.
3.5. Untersuchung der Wirkung von Cop-1 im Blut von MS-Patienten
Die wichtigsten Ergebnisse der unter IV.4.5. dargestellten Untersuchungen an peripheren Blutzellen
von MS-Patienten mit schubförmig remittierendem Krankheitsverlauf beziehen sich auf die Apoptoseauslösende Wirkung von Cop-1, auf den Aktivierungsgrad der T-Lymphozyten sowie auf die
Produktion verschiedener Zytokine während der Therapie mit Copaxone®. Wie in Abb. 72 dargestellt,
ist der Anteil der apoptotischen T-Helfer-Zellen nach in vitro Stimulation von PBMC mit Cop-1 bei
Zellen von MS-Patienten signifikant höher als bei Zellen von gesunden Probanden. Außerdem steigt
der prozentuale Anteil der apoptotischen Lymphozyten sowie der apoptotischen T-Helfer-Zellen im
peripheren Blut von MS-Patienten nach 30 bzw. 42 Wochen Therapie mit Copaxone® signifikant und
fortschreitend an (Abb. 74 und 75). Die Ergebnisse des in vitro Versuchs suggerieren, dass die
Stimulation mit Cop-1 die Apoptose von solchen T-Helfer-Zellen bewirkt, die vor allem bei MSPatienten auftreten und im peripheren Blut von gesunden Probanden nur in deutlich geringerem
Umfang zu finden sind. Dies trifft auf autoreaktive, ZNS-spezifische Th-Zellen zu. Der
Zusammenhang zwischen der Apoptose von T-Lymphozyten, in erster Linie autoreaktiven ZNSspezifischen T-Lymphozyten und der Krankheitsremission ist bereits verschiedentlich für die EAE
und die MS beschrieben bzw. diskutiert worden (Pender 1992, McFarland 1995, Gold 1997). Die
Frage, wie hoch der Anteil an autoreaktiven, ZNS-spezifischen T-Zellen im peripheren Blut von MSPatienten ist, wurde in verschiedenen Studien untersucht und sehr unterschiedlich beantwortet
(Allegretta 1990, Bieganowska 1997). Die Vermutung liegt aber nahe, dass es sich bei den unter in
vitro Stimulation mit Cop-1 apoptotisch werdenden Th-Zellen nicht ausschließlich um autoreaktive,
ZNS-spezifische Th-Zellen handelt, sondern ebenso um solche die nach Aktivierung eher dazu neigen
apoptotisch zu werden als die Zellen der gesunden Probanden. Hier ist möglicherweise der Prozess des
sog. ‚activation induced cell death (AICD)’ beteiligt (Budd 2001, Zimmermann 2001). Neben der in
vitro beobachteten Apoptose-Induktion verursacht die Therapie mit Cop-1 auch in vivo die Apoptose
peripherer Blutlymphozyten und hier speziell der T-Helfer-Zellen. Dieser Effekt wird allerdings erst
nach etlichen Wochen (ab der 30. Woche) täglicher, subkutaner Injektion von Copaxone®
nachweisbar. Klinische Studien haben gezeigt, dass auch die therapeutische Wirkung von Copaxone®
erst nach ca. einem halben Jahr Therapie einsetzt (Johnson 1995 und 1998). Leider ist die
Untersuchung der Wirkung einer Langzeittherapie mit Cop-1 auf die verschiedenen Komponenten des
Immunsystems bei gesunden Probanden aus ethischen Gründen nicht möglich. Neben der Bestimmung
der Apoptoserate von Lymphozyten im peripheren Blut der mit Cop-1 behandelten Patienten wurde
112
V. Diskussion
auch der Aktivierungsgrad der Lymphozyten, speziell die Expression von CD69 (auch ‚activation
induced molecule – AIM’ genannt) auf der Zelloberfläche, durchflusszytometrisch untersucht. Auch
hier findet sich ein z.T. signifikanter Anstieg des prozentualen Anteils aktivierter T-Lymphozyten
während der Therapie mit Copaxone®, der im Gegensatz zum Anstieg der Apoptoserate aber bereits
erstmalig sechs Wochen nach Therapiebeginn zu beobachten ist. Trotzdem passt auch dieses Ergebnis
zu der Annahme, dass Cop-1 in der Lage ist, in Lymphozyten einen ‚activation induced cell deathAICD’ auszulösen.
Ein weiteres interessantes Ergebnis der unter IV.4.5. beschriebenen Untersuchungen zur
Wirkungsweise von Cop-1 auf das Immunsystem von MS-Patienten ist der in Abb. 77 dargestellte
Anstieg des prozentualen Anteils IL-4-produzierender Lymphozyten. Dieser ist vor allem bei
Patienten, die eine Stabilisierung oder Besserung der Krankheitssymptome zeigen, besonders deutlich.
Dieses Ergebnis unterstützt die auch schon von anderen Arbeitsgruppen postulierte Annahme, dass
Cop-1 die verstärkte Produktion von Th-2-typischen, antiinflammatorisch wirkenden Zytokinen
induziert (Neuhaus 2000, Miller 1998). Autoreaktive, ZNS-spezifische Zellen, die nach der
Aktivierung durch Enzephalitogene wie MBP etc. ein eher Th1-typisches Zytokinmuster zeigen,
produzieren nach Stimulation mit Cop-1 Th2-typische Zytokine (Neuhaus 2000). Ähnliche Effekte
wurden bei Versuchen mit sog. ‚altered peptide ligands-APL’ beobachtet. APL sind Moleküle die sich
von einem ursprünglichen Wildtyp-Molekül nur bezüglich einer oder zweier Aminosäuren, die aber an
zentralen, für die Bindung an den T-Zell-Rezeptor (TCR) entscheidenden Stellen liegen,
unterscheiden. Die Bindung der APL an die T-Zell-Rezeptoren löst nun in der Wildtyp-spezifischen TZelle z.T. völlig andere Mechanismen aus, als die Bindung des Wildtyp-Moleküls an denselben TCR.
So kann z.B. die Bindung eines APL statt zu einer Aktivierung der T-Zelle, zur Anergie der Zelle
führen, oder statt zur Produktion von proinflammatorisch wirkenden Zytokinen des Th1-Typs (nach
Bindung des Wildtyp-Moleküls), zur Produktion von antiinflammatorisch wirkenden Zytokinen des
Th2-Typs (Boutin 1997, Pearson 1997, Tao 1997). Derartige APL sind auch schon in der Behandlung
verschiedener Enzephalomyelitiden eingesetzt worden (Kappos 2000). Die Tatsache, dass nach in
vitro Stimulation mit Cop-1 bei Lymphozyten aus dem peripheren Blut von unbehandelten MSPatienten der prozentuale Anteil IL-10- produzierender Lymphozyten signifikant höher ist als bei
Lymphozyten aus dem peripheren Blut von gesunden Probanden (Abb. 73), weist ebenfalls daraufhin,
dass im peripheren Blut von MS-Patienten Zellen vorhanden sind, die nach der Aktivierung mit Cop-1
einen Th1 => Th2-Shift vollziehen. Der Mechanismus, über den Cop-1 auf Lymphozyten wirkt,
scheint daher in vielen Bereic hen der Wirkungsweise von APL ähnlich zu sein.
113
VI. Zusammenfassung
VI. Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den immunologischen Wirkmechanismen verschiedener
zur Therapie von Enzephalomyelitiden eingesetzter Substanzen. Bei Enzephalomyelitiden handelt es
sich um entzündliche Erkrankungen des Zentralen Nervensystems (ZNS) mit Autoimmunreaktionen
gegen verschiedene Bestandteile der die Nerven-umhüllenden Myelinscheide. Die häufigste
Enzephalomyelitis beim Menschen ist unter dem Namen Multiple Sklerose (MS) bekannt.
In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst mehrere Modelle der experimentellen autoimmunen
Enzephalomyelitis (EAE), einem häufig verwendeten Tiermodell der MS, bei Mäusen untersucht, die
sich sowohl bezüglich des verwendeten Mäusestamms (BALB/c, SJL/J, C57BL/6) als auch bezüglich
des Krankheits-induzierenden Agens (MOG-, MBP-, PLP-Peptid, Rückenmarkshomogenat)
voneinander unterschieden. Es zeigte sich, dass Krankheitsverlauf und Schwere der Erkrankung,
abhängig von den verwendeten Inzuchtstämmen, stark variierte. Daraufhin durchgeführte
durchflusszytometrische Analysen ergaben deutliche Unterschiede in den verschiedenen
Lymphozytensubpopulationen in den lymphatischen Organen der Tiere der verschiedenen
Inzuchtstämme. So zeigten Versuchstiere, in deren Lymphorganen ein höherer Anteil an BLymphozyten gefunden wurde, deutlich weniger ausgeprägte Krankheitssymptome und einen
insgesamt milderen Krankheitsverlauf als Tiere mit einem höheren Anteil an T-Lymphozyten. Die
Tiere der verschiedenen Inzuchtstämme unterscheiden sich in vielen Eigenschaften voneinander.
Hervorzuheben ist jedoch der Unterschied bezüglich ihres MHC-Haplotyps (H-2), der nach den
vorliegenden Informationen mit Sicherheit an der Ausprägung einer EAE beteiligt ist und
möglicherweise auch bei Verlauf und Schwere der Erkrankung eine Rolle spielt.
Bei der ersten der in dieser Arbeit auf ihre Wirkung im EAE-Modell untersuchten Substanzen handelt
es sich um ein Liponsäurederivat (Lipo-X), das erstmalig in tierexperimentellen Versuchen zur
Behandlung einer Enzephalomyelitis eingesetzt wurde. Die Versuche mit Mäusen verschiedener
Inzuchtstämme ergaben gute bis sehr gute Therapieerfolge, so dass im weiteren Verlauf der Arbeit die
Wirkung von Lipo-X auf die verschiedenen Komponenten des Immunsystems untersucht wurde.
Dabei zeigte sich im in vitro Versuch, dass Lipo-X in hohen Dosierungen hemmend auf die
Produktion des Tumor Nekrose Faktors-α (TNF-α) und auf die mit Hilfe eines 3 H-Thymidin-Assays
bestimmte Proliferation spezifisch bzw. unspezifisch stimulierter Lymphknoten- und Milzzellen wirkt.
Beide Effekte können den Krankheitsverlauf von Enzephalomyelitiden positiv beeinflussen. Dieses
lässt sich mit der Wirkung von Liponsäurederivaten u.a. auf den Transkriptionsfaktor NF-κB erklären,
der wiederum regulatorisch auf die TNF-α-Produktion sowie die Aktivierung und Proliferation
verschiedener Zellen wirkt. Nach intraperitonealer Injektion von Lipo-X findet sich im Peritonealraum
eine große Anzahl von Granulozyten, die sich höchstwahrscheinlich aus ‚Granulocyte Macrophage
Colony Forming Cells’ (GMCFC) nach Stimulation mit Lipo-X entwickelt haben. Welche Rolle diese
Granulozyten bei der therapeutischen Wirkung von Lipo-X auf an EAE erkrankte Tiere haben, ist
114
VI. Zusammenfassung
noch unklar. Klar ist jedoch, dass die therapeutischen Versuche an Mäusen sowie die in vitroUntersuchungen so interessante Ergebnisse gebracht haben, dass dieses Therapiekonzept unbedingt
auch in klinischen Studien bei MS-Patienten weiterverfolgt werden sollte.
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde die Wirkung von Copolymer-1 (Cop-1, Glatiramerazetat,
Copaxone®) auf die verschiedenen Komponenten des Immunsystems untersucht. Bei Cop-1 handelt
es sich um ein randomisiert aus vier verschiedenen Aminosäuren (L-Glutamin 14,1 %, L-Tyrosin 9,5
%, L-Alanin 42,7 % und L-Lysin 33,8 %) synthetisiertes Gemisch von Polypeptiden. Cop-1 ist bereits
als Medikament zur Behandlung der schubförmig, remittierend verlaufenden MS in verschiedenen
Ländern zugelassen. Die Wirkmechanismen sind aber bis heute nur unzureichend bekannt. An
Multipler Sklerose erkrankte Patienten zeigen nicht nur in Schwere und Symptomen sehr
unterschiedliche Krankheitsverläufe, sie sprechen auch unterschiedlich gut auf die verschiedenen
Therapiemöglichkeiten an. So kann eine Therapie, die dem einen Patienten nützt, dem anderen
zumindest dadurch schaden, dass mit einer unwirksamen Therapie viel wertvolle Zeit vergeudet wird.
Daher ist es dringend notwendig, sinnvolle Subtypisierung der MS-Patienten, z.B. auf genetischer oder
immunologischer Ebene, von Nöten um gezielt Patienten mit individuellen Therapienkonzepten zu
maximal zu helfen. Die Versuche mit verschiedenen Tiermodellen sollen dazu dienen
Typisierungsmethoden, die auch auf Patienten übertragbar sind, zu entwickeln. Die Aufklärung der
Wirkmechanismen von Cop-1 könnte eine frühzeitige Subtypisierung der Patienten in ‚NonResponder’ (= kein Ansprechen auf die Therapie) und in ‚Responder’ (= gutes Ansprechen auf die
Therapie) ermöglichen und helfen neue wie alte Therapien sinnvoller und optimaler einzusetzen.
In den in vitro- und in vivo-Untersuchungen bei Maus und Mensch zeigte sich, dass die deutlichste
und vielleicht auch wichtigste Wirkung von Cop-1 die Auslösung des apoptotischen Zelltods von
Lymphozyten und speziell von T-Helfer-Zellen ist. Die Apoptose der Zellen wurde mit verschie denen
Techniken (TUNEL- und Annexin V/Propidiumjodid-Methode) mit Hilfe eines Durchflusszytometers
sowohl in vivo als auch nach in vitro Stimulation muriner und humaner Leukozyten bestimmt. Da
während der Therapie mit Cop-1 im peripheren Blut von MS-Patienten auch ein Anstieg des Anteils
aktivierter T-Lymphozyten zu finden war, liegt die Vermutung nahe, dass es sich bei der durch Cop-1
ausgelösten Apoptose zumindest teilweise um einen Aktivierungs-induzierten Zelltod (AICD) handelt.
Ein weiteres Ergebnisse der in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen ist die
Wirkung von Cop-1 auf die Produktion verschiedener Zytokine. Die Untersuchung der intrazellulären
Zytokinproduktion von Lymphozyten aus dem peripheren Blut von MS-Patienten während einer
einjährigen Therapie mit Cop-1 ergab einen signifikanten Anstieg des Anteils IL-4-produzierender
Lymphozyten vor allem bei den Patienten, die am stärksten von der Therapie mit Cop-1 profitierten.
Die Induktion der Apoptose u.a. von autoreaktiven, ZNS-spezifischen Lymphozyten sowie die
verstärkte Produktion antiinflammatorisch wirkender Zytokine scheinen daher wichtige Mechanismen
zu sein, über die Cop-1 das Immunsystem moduliert und die Entzündungsreaktion im ZNS hemmt.
115
VI. Zusammenfassung
Die tierexperimentellen Untersuchungen der therapeutischen Wirkung von Cop-1 bei an EAE
erkrankten Mäusen ergab, dass der Einfluss der Therapie mit Cop-1 auf den Krankheitsverlauf bzw.
die Schwere der Erkrankung sowohl vom eingesetzten Inzuchtstamm abhängt als auch von dem zur
Krankheitsinduktion verwendeten Peptid. Die in diesen Versuchen gewonnenen Erkenntnisse, nämlich
dass Cop-1 in erster Linie bei den Mäuse der Inzuchtstämmen wirkt, die eine höhere T-/B-Zell-Ratio
haben, sowie bestimmte H-2-Haplotypen besitzen, bietet möglicherweise erste Ansätze für eine
Subtypisierung von MS-Patienten.
Mit Hilfe der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die Mechanismen, über die Lipo-X sowie
Copolymer-1 auf verschiedene Komponenten des Immunsystems wirken, genauer zu beleuchten und,
mit Lipo-X, eine für den späteren therapeutischen Einsatz interessante, neue Therapie zu finden.
116
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Summary
In the present study the effects of immunomodulating therapy of encephalomyelitides on the immune
system was investigated. Encephalomyelitides are inflammatoric diseases of the central nervous
system (CNS). A most probably autoreactive immune reaction leads to the destruction of the myelin
sheet, which covers the nervous fibres. Multiple sclerosis (MS), also named ‘Encephalomyelitis
disseminata’, is the well known designation of the human encephalomyelitis disease.
As a first step, animal models of multiple sclerosis known as experimental autoimmune
encephalomyelitis (EAE) were established in different strains of mice. During the study of these
models it was shown that the susceptibility of mice to develop symptoms of EAE was depending on
the H-2 haplotype and on the composition of the lymphocyte populations in the immune organs of the
animals. The individual course and severity of the disease were depending on the strain of mice as
well as on the type of disease-inducing agent used. It is hoped that these observations will results in a
better understanding and interpretation of the heterogeneity of the disease in multiple sclerosis patients
and lead to the development of individual therapeutic strategies.
Using these well-characterized EAE models, it was clearly shown that application of Lipo-X, a lipoic
acid derivate, caused inhibition of EAE symptoms. In vitro experiments with high-dose Lipo-X
resulted in down regulation of TNF-α production and proliferation of leucocytes after specific and
unspecific stimulation. Furthermore, intraperitoneal injection of Lipo-X in mice induced a massive
recruitment (and/or proliferation) of the peritoneum with granulocytes from ‘Granulocyte Macrophage
Colony Forming Cells’. The significance of granulocytes in EAE and MS is not yet understood
adequately. The effect of Lipo-X on TNF-α production and activation or proliferation of leucocytes
related to the effect of Lipo-X on the nuclear factor κB (NF-κB). NF-κB promotes the activation of an
other immune-relevant genes, e.g. the TNF-α gene and many cell activation genes. It appears that the
application of Lipo-X offers an interesting new therapeutic strategy for treatment of patients suffering
from multiple sclerosis.
Copolymer-1 (Cop-1), also named Glatirameracetate or Copaxone®, is a well known therapeutic agent
for the treatment of relapsing remitting multiple sclerosis. The exact mechanism by which Cop-1
exerts its immune-modulating effects on the immune system of MS patients is not sufficiently clear so
far. Results of in vitro and in vivo experiments indicate that the induction of apoptotic cell death of
lymphocytes, especially T-helper cells, after confrontation with Cop-1, is clearly part of this reaction.
The simultaneous up-regulation of activated (CD69-positive) lymphocytes suggested that the
inflammatory process is stopped by the induction of apoptosis as a consequence of activation-induced
cell death (AICD). Most probably, by this apoptosis-inducing effect of Cop-1 both, CNS-specific
autoreactive cells and also uninvolved bystander immune cells are suppressed. Changes in the
cytokine network which were also observed after treatment with Cop-1. Under therapy with COP-1,
the Th2-typical cytokine Interleukin-4 (IL-4) was up-regulated in the lymphocytes of MS-patients,
125
especially in patients with stable or remitting disease. This effect was seen during Copaxone® therapy
for one year. Th2-typical cytokines like IL-4 induce anti-inflammatoric effects, and inhibit the
inflammation process in the CNS. In experiments with Cop-1 in different EAE models a therapeutic
effect of Cop-1 was seen in mice of the strain SJL/J, but not in BALB/c mice. This observation
suggests that the H-2 haplotype interferes with the beneficial effect of therapy with Cop-1. It also is
possible that Cop-1 dominantly affects T-lymphocytes and therefore is more efficient in mice with a
high ratio of T:B-lymphocytes (for example SJL/J). It is hoped that the results of these experiments
will contribute to a better understanding of the mechanism of action of Cop-1 and help to develop
methods for subtyping of MS patients in responders and non-responders for each of the currently
applied therapy regimens.
126
Mein Dank gilt
- Prof. Dr. Falkenberg, für die Betreuung und das Interesse am Fortschreiten der Arbeit, die jahrelange
gute Zusammenarbeit und die konstruktive Kritik,
- Prof. Dr. Lübbert, für die trotz hoher Arbeitsbelastung bereitwillige Übernahme der Aufgabe des
Zweit-Gutachters,
- Prof. Dr. Gatermann, für die überhaupt nicht selbstverständliche Überlassung der für die
Fertigstellung der Arbeit in der Endphase benötigten Stelle, sowie das freundliche Interesse an der
Arbeit,
- vor allem Dr. Dieter Pöhlau, der mir die Chance gab, an der Aufklärung der Ursachen der Multiplen
Sklerose zu arbeiten und mir damit einen lange gehegten Wunsch erfüllte. Er hat mir während unserer
langen Zusammenarbeit diese Arbeit inhaltlich und finanziell ermöglicht und mir dabei immer
freundschaftlich zur Seite gestanden,
- allen MitarbeiterInnen der AG Falkenberg insbesondere Marcus Peters, Christine Hahnel und
Melanie Teller für hilfreiche und interessante Diskussionen und eine überaus angenehme
Arbeitsatmosphäre,
- der neuroimmunologischen Arbeitsgruppe des St. Josef-Hospitals, insbesondere Nils Brune, mit dem
ich pragmatisches Denken geübt habe, Volker Hoffmann, für den anspornenden Wettkampf um den
Titel, sowie Miriam Juschka, Iris Spitzer und Nurtac Ari,
- Orhan Aktas, von der neuroimmunologischen Arbeitsgruppe der Charité Berlin und ehemaliges
Mitglied der neuroimmunologischen Arbeitsgruppe des St. Josef-Hospitals, für die immer kooperative,
inhaltlich hoch interessante und wissenschaftlich wie persönlich bereichernde Zusammenarbeit,
- dem Institut für Neuroanatomie der RUB, insbesondere Frau Dr. Dorothee Krause-Finkeldey und Dr.
Pedro Faustmann, für die interessanten und interessierten Diskussionen in Vergangenheit und Zukunft,
- dem Team der Zentralen Versuchstierhaltung der Medizinischen Fakultät der RUB für die Betreuung
und Pflege der Versuchstiere,
- Claudia Enders und Doris Evertz, die stets wussten, wann sie mich mit Fußball oder Rotwein
ablenken oder in Ruhe lassen mussten,
- Maike und Oliver Krup, für die ermutigende Art mit der sie ihr neues Leben angehen und mich und
andere daran teilhaben lassen,
- meiner Mutter, Edith Rieks, die in Ihrer Stärke und Klugheit mir immer wieder Vorbild war und ist,
- allen, die in den vergangenen Wochen und Monaten klaglos auf mich verzichtet haben,
- und besonders Stefan Collm für seine Liebe, sein Vertrauen und alles das was mein Leben so
bereichert hat. Ich habe es ihm nicht immer leicht gemacht.
LEBENSLAUF
Name:
Rieks
Vorname:
Maike
geboren am:
23.09.1966 in Bochum
Familienstand:
ledig
Kinder:
Nadia Rieks, geboren am 27.08.1987
Schulbesuch:
1972 bis 1976 Kreyenfeld-Grundschule in Bochum-Werne
1976 bis 1985 Lessing-Gymnasium in Bochum-Langendreer
Schulabschluss:
Abitur
Berufl. Ausbildung: 1985-1988 Ausbildung zur Gärtnerin bei der Stadt Bochum
1988 Gärtner-Gehilfen-Prüfung
1988 bis 1994 Studium der Biologie (Diplom)
1991 Diplomvorprüfung
1993 Diplomhauptprüfung
Okt. 1993 bis Juli 1994 Diplomarbeit am Institut für Mikrobiologie
und Immunologie zum Thema „Untersuchungen zur
Antigenpräsentation”
Juli 1994 Diplom im Fach Biologie
Berufstätigkeit:
Seit 01.08.1994 wissenschaftliche Mitarbeiterin der Ruhr-Universität
Bochum:
- 01.08.1994 bis 30.06.1998 tätig im Neuroimmunologischen Labor
der Neurologischen Universitätsklinik am St. Josef-Hospital
Bochum,
- seit 01.07.1998 tätig am Institut für Med. Mikrobiologie der RuhrUniversität Bochum, AG Falkenberg,
- ab April 2002 am neugegründeten Zentrum für klinische Forschung
(ZKF) der Ruhr-Universität Bochum,
AG Neuroimmunologie/Neurogenetik.