Versuch 3: Enzymologie

Enzymologie
3-1
Versuch 3: Enzymologie
Versuche:
1. Bestimmung der Serum-Acetylcholinesterase Aktivität
- Acetylcholinesterase-Bestimmung im Serum
- Hemmung des Enzyms mit Diisopropylfluorophosphat (DIFP)
- Reaktivierung mit Pyridin-2-Aldoxim-Methyljodid (PAM)
2. Enzymkinetik der Laktatdehydrogenase
- Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration
- Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit von der Substrat (Pyruvat-) Konzentration
- Zeichnen des Michaelis Menten Plot und der Lineweaver-Burk-Darstellung
- Ermittelung von KM und vmax, Vergleich der ermittelten Werte aus dem Michaelis-Menten-Plot
und der Lineweaver-Burk-Darstellung
Wissensgebiete
Einteilung der Enzyme in Enzymklassen
Aktivierungsenergie einer Reaktion
Einfluss von Katalysatoren auf die Aktivierungsenergie
Reaktionen 0. und 1. Ordnung
Reaktionsgeschwindigkeit
Enzymatische Reaktionen
Enzymsubstrat-Komplex
Substratspezifität
Substrat- und Enzymkonzentrations-Diagramme
Hemmsubstanzen, Mechanismus der Hemmung
Kompetitive und nicht kompetitive Hemmung, Beispiele
Quantitative Bestimmung der enzymatischen Aktivität
Einheit der Enzymaktivität: Katal (neu), Units (alt)
Lineweaver-Burk-Diagramme
Km-Bestimmung
Wechselzahl
pH- und Temperatur-Einfluss auf enzymatische Reaktionen
Isoenzyme
Multienzym-Komplexe und multifunktionelle Enzyme
Regulation der Enzymaktivität, Allosterie, negative Rückkopplung, Beispiele
Neurotransmitter, Beispiele
Acetylcholinesterase, Inhibitoren und Enthemmer
Optische Eigenschaften sowie Coenzymfunktionen von NAD+, NADP+ und FAD
Optischer Test
Kombinierter optischer Test (Kofaktor-gekoppelte Reaktion)
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Enzymologie
3-2
Einführung
Bei reversiblen chemischen Reaktionen stellt sich ein Gleichgewicht ein. Im Gleichgewichtszustand ist
die Geschwindigkeit von Hin- und Rückreaktion gleich schnell. Katalysatoren erhöhen nur die Geschwindigkeit der Reaktion und beschleunigen damit die Gleichgewichtseinstellung; sie beeinflussen
aber nicht die Lage des Gleichgewichts. Enzyme sind in der Regel Proteine, die als Katalysatoren
fungieren.
Die International Union of Biochemistry and Molecular Biology hat 1961 und 1964 Regeln für die
Nomenklatur der Enzyme aufgestellt. Die Enzyme werden in sechs Hauptklassen eingeteilt, die jeweils
gleiche chemische Reaktionstypen katalysieren.
1. Oxidoreduktasen
übertragen Wasserstoff zwischen zwei Reaktionspartnern. Zu ihnen gehören die Dehydrogenasen, Hydroxylasen und Oxigenasen.
2. Transferasen
katalysieren die Übertragung von Atomgruppen oder ganzen Molekülen zwischen zwei
Reaktionspartnern. Untergruppen dieser Klasse sind die "Kinasen": Carboxyl-Transferasen,
Amino-Transferasen, Glycosyl-Transferasen und Acyl-Transferasen.
3. Hydrolasen
sind Ester-, Peptid- und Glycosylbindungen spaltenden Enzyme. Bekannte Enzyme wie Pepsin, Chymotrypsin, Trypsin, Renin und Papain gehören dazu.
4. Lyasen
katalysieren die nichthydrolytische Spaltung kovalenter Bindungen: Decarboxylasen, Aldolasen, Dehydratasen.
5. Isomerasen
epimerisieren ein optisch aktives C-Atom oder racemisieren optisch aktive Verbindungen.
6. Ligasen
führen zur Verknüpfung zweier Substratmoleküle unter gleichzeitiger Spaltung von ATP in
AMP und Pyrophosphat. Wichtige Vertreter dieser Gruppe sind die Synthetasen, z.B. Aminoacyl-tRNS-Synthetasen, Acyl-CoA-Synthetasen oder auch die Carboxylasen.
Die in Braunschweig angesiedelte Enzymdatenbank Brenda ist das zur Zeit ausführlichste
Informationssystem für alle Aspekte der zur Zeit bekannten Enzyme.
Die Enzymaktivität bestimmt man, indem Enzym und Substrat bei bestimmter Temperatur,
bestimmtem pH-Wert, definierter Substrat- und Enzymkonzentration sowie in Gegenwart erforderlicher
Kofaktoren inkubiert und die Reaktion in Abhängigkeit von der Zeit verfolgt. Der Umsatz muss
photometrisch zu verfolgen sein.
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3-3
1) Reaktionen 1. Ordnung
Bei einer Reaktion 1. Ordnung hängt die Reaktionsgeschwindigkeit nur von der Konzentration des
Substrats ab. Das gängige Beispiel ist der radioaktive Zerfall. Welche Enzymreaktion ist eine Reaktion
erster Ordnung?
Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten k einer Reaktion 1. Ordnung
[1]
v = Reaktionsgeschwindigkeit
k = Geschwindigkeitskonstante
[S] = Substratkonzentration
t = Zeit
[2]
Wenn x die Substratmenge ist, die in der Zeit t umgesetzt wurde, und a die SubstratAnfangskonzentration bei t = 0 ist, so gilt:
[3]
[4]
[5]
[6]
Bei der Halbwertszeit t½ ist x = a/2. Daraus ergibt sich:
[7]
2) Reaktionen 2. Ordnung
Die enzymatischen Reaktionen sind Reaktionen 2. Ordnung: Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt von
Konzentrationen zweier Komponenten ab, der Substrat- und der Enzymkonszentration.
[E] = Enzymkonzentration (mg Protein)
[8]
[S] = Substratkonzentration (µMol/l)
Die Berechnung der Substratkonzentration in der Zeit t wird jedoch kompliziert.
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3-4
[9]
Man kann die Behandlung dieses Systems vereinfachen, indem man:
1. Substrat im Überschuss einsetzt oder
2. die Enzymkonzentration konstant hält.
1. Substratüberschuss: Die Reaktionsgeschwindigkeit ist proportional der Enzymkonzentration
[10]
[E] = Enzymkonz. (mg Protein)
[S] = Substratkonz.n (µMol/l)
Die Geschwindigkeit bleibt konstant. Man nutzt dieses Experiment, um die Wechselzahl eines Enzyms
zu bestimmen. Bei einem Enzym mit nur einer Wirkgruppe entspricht die Wechselzahl der Anzahl
Substratmolekülen, die pro Molekül Enzym in einer Minute umgesetzt werden (z.B.: Fumarase 105,
Acetylcholinesterase 2 x 107 mol Substrat/mol Enzym x Min).
2. Enzymkonz. konstant: Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt von der Substratkonz. ab
Hält man die Enzymkonzentration [E] konstant und steigert die Substratkonzentration [S], so erhält
man folgendes Bild:
Abbildung 3-1: Reaktionsgeschwindigkeit bei konstanter Enzym- und variabler Substratkonzentration.
Zu Beginn steigt die Geschwindigkeit linear mit steigender Substratskonzentration (I). Mit steigender
Substratkonzentration wird ein Plateau erreicht (II), d.h. das Enzym ist mit Substrat gesättigt. Die
maximale Reaktionsgeschwindigkeit ist erreicht, und eine weitere Zugabe von Substrat bei konstanter
Enzymkonzentration steigert die Umsatzgeschwindigkeit nicht mehr. Eine solche zweiphasige Kurve
kann man erklären, wenn man eine Komplexbildung zwischen Enzym und Substrat (Enzym-SubstratKomplex, ES) annimmt, bevor das Reaktionsprodukt gebildet wird. Die abnehmende Reaktionsgeschwindigkeit (III) erklärt man durch Substrathemmung: Zu viele Substratmoleküle vermindern die
Effizienz der Enzym-Substrat-Wechselwirkung.
In der Praxis sind die genannten Extremfälle jedoch selten anzutreffen.
Die Nettogeschwindigkeit der Bildung von [ES] = die Nettogeschwindigkeit des Zerfalls von [ES], P ist
das Reaktionsprodukt:
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Enzymologie
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[11]
[12]
Die Einführung der Konstanten Km (der Michaelis-Konstanten), der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit vmax und die Umformulierung nach vo ergibt:
[13]
y = a.x + b
Abbildung 3-2: Der Lineweaver-Burk-Plot.
Trägt man 1/vo als Ordinate gegen 1/[S] als Abszisse auf, resultiert eine Gerade (Lineweaver-BurkPlot). Die Gerade schneidet die Ordinate bei 1/vmax, die Abszisse bei -1/km. Ihre Steigung ist km/vmax.
Die reziproken Anfangsgeschwindigkeiten werden gegen die reziproken Substratkonzentrationen
aufgetragen.
Eine andere Darstellungsart der Gleichung erhält man, wenn man beide Seiten der Gleichung mit [S]
multipliziert. Zeichnet man vo gegen [S] auf, so erhält man eine Hyperbel. Bei dieser Darstellungsart
wird die Bedeutung von Km deutlich, die bei der Ableitung der Gleichung eingeführt wurde.
Km ist demnach die Substratkonzentration, bei der vo = vmax / 2 ist.
Abbildung 3-3: Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration.
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I. Acetylcholinesterase im Serum
Einführung:
Synapsen sind spezialisierte Kontaktstellen für eine Kommunikation zwischen Neuronen oder
zwischen Neuronen und z. B. einer Muskelzelle oder einer Drüsenzelle. Sie stellen auch die
Verbindungen zwischen einem Umweltreiz und der Wahrnehmung im Hirn. Sie ermöglichen das
Denken und die Kontrolle von Systemen des Körpers.
Abbildung 3-5:
Schema einer Synapse [Quelle: Wikipedia, modifiziert]
Breitet sich die Erregung in Form eines Aktionspotenzials über ein Axon - kontinuierlich bei Myelinfreien und saltatorisch über myelinisierte Neuriten - bis hin zu den terminalen Synapsen aus, so wird
dort eine chemische Transmitter-Substanz, z. B. Acetylcholin, aus synaptischen Vesikeln in den Synapsenspalt freigesetzt.
Abbildung 3-6:
Depolarisation der postsynaptischen Membran durch Acetylcholin
Einführung:
Der am längsten bekannte und am besten untersuchte Transmitter ist das Acetylcholin, andere sind
die -Aminobuttersäure und die Glutaminsäure. Der berühmte Versuch von Otto Loewi in 1921 bewies
am perfundierten Froschherzen, dass bei Vagusreizung Acetylcholin an den Endigungen postganglionärer präsynaptischer Nervenfasern entsteht. Dale und Feldberg (1930) zeigten, dass Acetylcholin an vielen Synapsen des peripheren Nervensystems der Säuger entsteht. Auch an den motorischen Endplatten des Skelettmuskels wird Acetylcholin freigesetzt. Acetylcholin wird präsynaptisch in
cholinergen Neuronen durch Cholin-Acetat-Transferase nach folgender Gleichung synthetisiert:
CH3-CO~SCoA + HO-CH2-CH2-N+(CH3)3  CH3-COO-CH2-CH2-N+(CH3)3 + CoASH
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Das Acetylcholin wird dann in Vesikeln gespeichert und bei Depolarisation der präsynaptischen Membran in "Quanten" in den Synapsenspalt ausgeschüttet. Nach Bindung an den Acetylcholinrezeptor
der postsynaptischen Membran mit Öffnung der Natriumkanäle (Depolarisation) wird es durch die
Cholinesterase hydrolysiert. Das Ruhepotenzial wird wieder aufgebaut.
CH3-COO-CH2-CH2-N+(CH3)3 + H2O  CH3-COOH + HO-CH2-CH2-N+(CH3)3
Das Enzym hat im aktiven Zentrum zwei charakteristische Wirkungszentren:
1. die anionische Bindungsstelle, an die der quaternäre Stickstoff des Cholins bindet,
2. die Esterase-Gruppe, die Elektronen auf den Acetatrest übertragen kann, wodurch ein
acetyliertes Enzym entsteht, das anschließend hydrolysiert wird.
Abbildung 3-7:
Die enzymatische Spaltung von Acetylcholin zum Acetat und Cholin
Acetylcholinesterase gehört, wie die Phosphatasen, zur Klasse der Hydrolasen. Man unterscheidet
zwei Typen von Cholinesterasen. Wie aus der Tabelle hervorgeht, enthält vor allem Nervengewebe
einen hohen Gehalt an echter Acetylcholinesterase. Die Rolle der Pseudocholinesterase dürfte im
intermediären Stoffwechsel des Cholins und verwandter Verbindungen sowie in Entgiftungsvorgängen
(Procain-Esterase, Aspirin-Esterase) zu suchen sein.
Tabelle 3-4: Eigenschaften der Cholinesterase-Typen
Kriterium
Acetylcholinesterase
(E C 3.1.1.7.)
Synonym
Vorkommen
pH-Optimum
Spezifität
(E C 3.1.1.8)
echte Cholinesterase
Gehirn, Nerven, Erythrozyten, Schlangengifte
7,8
spaltet nur Ester der Essigsäure
Enzym +
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DFP

Pseudo-Cholinesterase
Leber, Pankreas, Blutserum
8,5
weiter Spezifitätsbereich
gehemmtes Enzym
Enzymologie
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Die Aktivität beider Cholinesterase-Typen kann durch spezifische Inhibitoren teilweise oder völlig gehemmt werden. Das Enzym mit Aktivitäten um 2000 U/l im Serum wird in der Leber synthetisiert. Daher sind bei schweren Lebererkrankungen die Werte im Serum erniedrigt. Pharmakologische und
physiologische Studien haben zur Entwicklung vieler Enzym-Inhibitoren geführt, von denen einige
sehr toxisch sind. Cholinesterasen werden von zahlreichen Insektiziden (z.B. E 605, p-Nitrophenyl-diethylester der Thiophosphorsäure) und von Physostigmin stark gehemmt. Praktische Bedeutung
haben vor allem folgende Gruppen von Cholinesterase-Hemmern:
a. Medikamente, die auf Grund einer gewissen Strukturanalogie die Acetylcholinspaltung kompetitiv hemmen. Dazu gehören die als Parasympathikomimetika verwendeten Pharmaka wie
Prostigmin, Biotin, Eserin.
b. Organische Phosphorsäure- oder Thiophosphorsäure-Ester, welche als Insektizide in der
Landwirtschaft verbreitet Anwendung finden, z. B. Parathion. Ähnlich in Bau und Wirkung sind
die in der experimentellen Forschung verwendeten Cholinesterase-Blocker DFP oder DIFP (=
Diisopropylfluorophosphat). Es handelt sich dabei um äußerst gefährliche Nervengifte.
c.
Nervengifte vom Typ der Trilone, deren Verwendung als chemische Kampfstoffe (Sarin, Soman, Tabun) nach der Genfer-Konvention verboten sind.
Enzym-DFP-Komplex +
PAM

Reaktivierung des Enzyms
Während die Wirkung von Stoffen der Gruppe a) auf einer reversiblen Veränderung beruht, kommt es
bei denen der Gruppe b) zu einer festen Bindung des Blockers an das Serin des Enzymproteins. Die
völlige Hemmung der Acetylcholinesterase im zentralen und peripheren Nervensystem durch solche
"Blocker" führt zu einem stetigen Ansteigen der Acetylcholinkonzentration im Bereich der cholinergischen Synapsen und Nervenendigungen. Die Folge ist eine starke Parasympathikusreizung und
eine Störung der neuromuskulären Reizübertragung. Der Tod infolge Atemlähmung kann innerhalb
einer Stunde eintreten.
Da Vergiftungsfälle durch Inhibitoren relativ häufig sind (Verwechslungen, Unachtsamkeit, Suizidversuche), sei kurz auf den biochemischen Aspekt von Diagnose und Therapie dieser Vergiftung
eingegangen. Die Formel einiger Cholinesterase-Substrate und Inhibitoren sowie des Deblockers
PAM werden hier aufgeführt.
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Enzymologie
DFP
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PAM
Physostigmin-Eserin
Die Diagnose hat in erster Linie auf Grund des allgemeinen klinischen Bildes und des Augenbefundes
(kleine, stecknadelkopfgroße, reaktionslose Pupillen!) zu erfolgen. Als Ergänzung vermag auch die
Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität des Serums im Schnelltest (Testpapierstreifen) wertvolle
Hinweise zu geben. Bei der Behandlung derartiger Vergiftungsfälle sollen neben Atropin (in hoher
Dosierung!) spezifisch auf den Cholinesterase-Inhibitor-Komplex einwirkende Substanzen wie Picolinhydroxansäure oder PAM (Pyridin-2-Aldoxim-Methojodid) verwendet werden. Der therapeutische Effekt von PAM beruht auf einer Befreiung des Enzyms vom anhaftenden Inhibitor.
Auch zur Erkennung der nicht allzu seltenen Fälle von Dyscholinesterasämie leistet die Bestimmung
der Cholinesterase-Aktivität im Serum wertvolle Dienste. Bei dieser genetisch determinierten Anomalie
wird eine atypische Variante von Cholinesterase mit einem unterschiedlichen Spezifitätsbereich syn-
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Enzymologie
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thetisiert. Die strukturanaloge Verbindung Succinyldicholin wird beispielsweise infolge einer etwa 100fach geringeren Affinität von dem atypischen Enzym kaum umgesetzt. Die Träger dieser Anomalie
sind nicht in der Lage, Succinyldicholin zu spalten bzw. zu inaktivieren. Wird diese Substanz als Muskelrelaxans bei der Operationsvorbereitung injiziert, kommt es zu einem lebensbedrohenden Zustand
(Apnoe). Die Untersuchung der Serum-Cholinesterase auf atypisches Verhalten gehört daher zu einer
gewissenhaften Operationsvorbereitung, sofern die Verabreichung von Succinyldicholin beabsichtigt
ist.
Prinzip:
Als Substrat dient Acetylthiocholinjodid und als Indikator für freigesetztes Thiocholin wird 5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure verwendet, die zur gelb gefärbten 5-Mercapto-2-nitrobenzoesäure reduziert
wird. Zur Bestimmung der Pseudocholinesteraseaktivität wird der Thiocholinester der Buttersäure
verwendet.
In alkalischem Medium vertieft sich die gelbe Farbe des 5-Mercapto-2-nitro-benzoesäure unter
Bildung der chinoiden Verbindung:
Abbildung 3-8:
Bestimmung der AcetylcholinesteraseAktivität
1) Zeit-Umsatzkurve der SerumCholinesterase
2) Hemmung mit DIFP
3) Reaktivierung mit PAM
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3-11
II. Laktatdehydrogenase
Einführung:
Die Laktatdehydrogenase (LDH) gehört zur Enzymklasse der Oxidoreduktasen und kommt praktisch
in allen Geweben vor. Hohe Aktivitäten lassen sich im Herzmuskel, in der Leber, im Skelettmuskel, in
Erythrozyten und Thrombozyten nachweisen.
Für LDH sind fünf Isoenzyme bekannt. Isoenzyme unterscheiden sich in ihren physikalischen
Eigenschaften (Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt, Denaturierungstemperatur) wie auch in ihren
katalytischen Eigenschaften (KM, pH-Optimum, Wechselzahl). Das LDH-Holoenzym ist aus vier
Untereinheiten aufgebaut, die entweder dem Typ M (Muskeltyp) oder dem Typ H (Herztyp)
entsprechen. Diese Untereinheiten werden durch nicht-kovalente Bindungen zusammengehalten. Die
Kombination dieser beiden Untereinheiten zu einem Tetramer in unterschiedlicher Relation ergibt die
fünf Isoenzyme: H4, H3M, H2M2, HM3 und M4, die auch als LDH 1, 2, 3, 4 und 5 bezeichnet werden.
Die Anteile der fünf LDH-Isoenzyme im Cytosol sind von Gewebe zu Gewebe unterschiedlich,
innerhalb eines Organs jedoch relativ konstant.

LDH 1 und 2: Herzmuskel, rote Blutkörperchen

LDH3: Lunge, Milz, Lymphknoten, Thrombozyten, Schilddrüse, Nebennierenrinde

LDH 4 und 5: Leber und Skelettmuskulatur
Die Verteilung der LDH-Isoenzyme in den verschiedenen Organen weist eine Korrelation zu deren O2Versorgung auf. Das H4-Isoenzyme arbeitet relativ langsam und wird durch einen Überschuss an
Pyruvat gehemmt. Das M4-Enzym hat dagegen eine wesentlich höhere Wechselzahl und wird kaum
durch Pyruvat gehemmt.
PDH
10
10
Abbildung 3-8: Die metabolische Funktion der LDH.
Die Zelle gewinnt viel mehr ATP durch die Verstoffwechselung des Pyruvats im Citronensäurezyklus
als durch die Umsetzung zu Laktat. Dazu ist allerdings Sauerstoff nötig, um das produzierte NADH
reoxidieren zu können und damit in der Atmungskettenphosphorylierung ATP zu synthetisieren. In
einem aeroben Gewebe, wie im Herzen, steht Sauerstoff immer in genügenden Mengen zur
Verfügung, so dass jede Umwandlung von Pyruvat zu Laktat, das heißt Abzug dieses Metaboliten vom
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Enzymologie
3-12
Citronensäurezyklus, einen Energieverlust darstellen würde. Deshalb dominieren in diesem Gewebe
die Isoenzyme H4 und H3M, deren Aktivität unter physiologischen Bedingungen durch Pyruvat
gehemmt
wird.
Als
Konsequenz
wird
Pyruvat
nicht
zu
Laktat
umgesetzt,
sondern
im
Citronensäurezyklus verstoffwechselt.
In anaeroben Geweben mit limitiertem Sauerstoffangebot, wie z.B. in kontrahierenden Skelettmuskeln,
wird ATP unabhängig von der Verfügbarkeit von Sauerstoff während der Umwandlung von Glucose in
Pyruvat produziert. Wenn die ATP-Konzentration sinkt, steigt der Fluss der Glykolyse um ein
vielfaches an, um die notwendige Menge ATP zu synthetisieren. Unter diesen Bedingungen muss
NADH schnell in NAD+ überführt werden, weil es sonst zum Stopp der Glykolyse kommen würde.
NAD+ kann aber durch die LDH-Reaktion schnell regeneriert werden. Deshalb herrscht in solchen
anaeroben Geweben das Isoenzym M4 mit hoher Wechselzahl vor, dessen Aktivität Pyruvat nicht
hemmt. Als Produkt der Reaktion akkumuliert Laktat, was schließlich im Cori-Zyklus der
Gluconeogenese benutzt werden kann.
Klinische Anwendung:
Die im Serum messbare LDH-Aktivität stellt eine Summe der aus verschiedenen Organen
stammenden Isoenzyme dar. Deswegen kann aus einer einfachen Aktivitätsmessung nicht unbedingt
auf die Organherkunft des Enyzms geschlossen werden. Da aber im Falle der LDH das Verhältnis der
einzelnen Isoenzyme von Organ zu Organ unterschiedlich ist, spiegelt sich die Schädigung eines
bestimmten Gewebes auch als typisches Isoenzymmuster im Serum wider. Eine solche
Differenzierung der LDH-Isoenzyme nach Organen ist mit Elektrophorese möglich. Auf diese Weise
lässt sich z.B. unterscheiden, ob eine Erhöhung der LDH-Aktivität im Serum auf eine Schädigung des
Herzmuskels oder der Leberzelle zurückzuführen ist.
Abbildung 3-9: Eiweiß-Elektrophorese der
LDH-Isoenzyme aus menschlichen Seren
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Enzymologie
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Die LDH-Aktivität im Blut wird aus verschiedenen Gründen bestimmt:

Als Teil einer Routinelaboruntersuchung

Bei Gelbsucht (Ikterus)

Bei Lebererkrankungen

Verdacht auf Infektiöse Mononukleose (Pfeiffersches Drüsenfieber)

Verdacht auf Hämolyse (Zerfall von Erythrozyten)

Verdacht auf Blutarmut

Verlaufsbeurteilung maligner Erkrankungen (Krebs, Lymphdrüsen, Leukämien)
(Referenzbereiche:
Männer: 135-225 U/l
Frauen: 135-215 U/l)
Die Bestimmung der LDH zur Erkennung und Beobachtung von Herzerkrankungen und
Muskelerkrankungen ist durch den Ersatz besserer Marker (z.B. Troponin, CK-MB) abgelöst worden.
Stark erhöhte Werte der LDH-Aktivität finden sich bei Hämolyse, Vitamin B12/Folsäuremangel,
Herzinfarkt, Lebererkrankungen und malignen Erkrankungen. Ebenso können körperliche Arbeit und
Leistungssport zur Erhöhung führen.
Prinzip:
Die Pyridinnukleotide NAD+ und NADP+ können reversibel Wasserstoff aufnehmen. Ihre Funktion als
Coenzym vieler Dehydrogenasen (Oxidoreduktasen) beruht auf dieser Fähigkeit. Bei der Hydrierung
wird der aromatische Charakter des Nikotinsäureamid-Ringsystems aufgehoben. Das entstandene Dihydropyridin-Ringsystem besitzt eine spezifische Lichtabsorption mit einem Maximum von 340 nm, die
bei NAD+ fehlt. Man kann daher die Umwandlung von NAD+ in NADH und umgekehrt mit dem
Photometer messen.
NAD+
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NADH
Enzymologie
3-14
Abbildung 3-10: Absorptionsspektren von NADH und NAD+. Die Konzentration des gebildeten bzw.
verbrauchten NADH oder die Konzentration der entsprechenden Reaktionspartner
der Enzyme werden mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes berechnet.
Pyruvat wird von Laktatdehydrogenase (LDH) in Gegenwart von NADH nach folgender Gleichung zu
L+-Laktat reduziert.
CH3-CO-COO- + NADH + H+
 CH3-CH(OH)-COO- + NAD+
Die Gleichgewichtskonstante dieser Reaktion ist bei 25 °C:
K = [Laktat]/[Pyr] = 3,6 . 1011 l/mol
Pyruvat wird daher praktisch vollständig zu Laktat reduziert.
Abbildung 3-11: NADH Verbrauch als indirekter Nachweis der Pyruvat-Umsetzung nach Zugabe der
LDH
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Enzymologie
3-15
Durchführung der Versuche
I. Bestimmung der Serum-Acetylcholinesterase-Aktivität
1. Bestimmung der Acetylcholinesterase-Aktivität
2. Hemmung der Acetylcholinesterase mit Diisopropylfluorophosphat (DIFP)
3. Reaktivierung mit Pyridin-2-aldoximmethyljodid (PAM)
II. Enzymkinetik der Lactatdehydrogenase
1. Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration
2. Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit von der Substrat (Pyruvat-) Konzentration
3. Zeichnen des Michaelis-Menten-Plot und der Lineweaver-Burk-Darstellung
4. Ermittelung von KM und vmax, Vergleich der beiden Werte aus dem Michaelis-Menten-Plot und
der Lineweaver-Burk-Darstellung
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I. Bestimmung der Serum-Acetylcholinesterase-Aktivität
1. Bestimmung der Acetylcholinesterase-Aktivität
2. Hemmung der Acetylcholinesterase mit Diisopropylfluorophosphat (DIFP)
3. Reaktivierung mit Pyridin-2-aldoximmethyljodid (PAM)

die Acetylcholinesterase katalysiert die Umsetzung von Acetylthiocholinjodid zu Thiocholin

indirekter kolorimetrischer Nachweis von Thiocholin mit 5,5‘-Dithio-bis-(2-nitro-benzoesäure)
als Indikator, welches zur gelb gefärbten 5-Mercapto-2-nitrobenzoesäure reduziert wird
 Photometer auf λ= 405 nm einstellen
 in vier beschriftete Küvetten werden folgende Lösungen pipettiert:
Küvetten-Nr.
1
2
3
4
Leerwert
Aktivität
Hemmung
Reaktivierung
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
20 l
20 l
20 l
20 l
50 l
-
50 l
50 l
5,5‘-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure)
Serum (enthält
Acetylcholinesterase)
DIFP (Hemmstoff)
Jede Lösung mit dem Plastikspatel gut mischen und 5 min warten, dann PAM in die
angegebenen Küvetten geben !!
50 l
PAM (Enthemmer)
-
50 l
-
Jede Lösung mit dem Plastikspatel gut mischen und 10 min warten, dann Substrat in
die angegebenen Küvetten geben!!
Acetylthiocholinjodid (Substrat)
-
100 l
100 l
100 l
Jede Lösung mit dem Plastikspatel gut mischen!
Achtung Reaktion startet jetzt, da Substratzugabe!!!! Zeit nehmen!!
 Photometer vor jeder Zeitmessreihe mit Küvette 1 (Leerwert) nullen!
 nach 1, 3, 5, 10, 15, 20 min Extinktionen der Küvetten 2-4 im Photometer messen, indem die
Küvette ins Photometer gestellt und der Wert abgelesen wird
 Werte in die Tabelle 1.1 eintragen
Achtung: DIFP ist hoch toxisch!!!!
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Tabelle: 1.1
Zeit nach
Werte für
Werte für
Werte für
Substratzugabe
Aktivität
Hemmung
Reaktivierung
1 min
3 min
5 min
10 min
15 min
20 min
a) Stellen Sie die Ergebnisse graphisch dar. (Extinktion gegen Zeit)
b) Berechnen Sie die Acetylcholinesterase-Aktivität in der Einheit U/l im normalen,
gehemmten und reaktivierten Zustand.
c) Diskutieren Sie die Graphen für Aktivität, Hemmung und Reaktivierung. Was sind die
Unterschiede? Welche Aussage kann man anhand der Ergebnisse machen ?
Die Aktivität wird mit Hilfe von Steigungsdreiecken aus dem linearen Bereich der Kurven bestimmt, die
Extinktionsveränderung der Kurve pro Minute (E/t) angegeben und mit Hilfe des LambertBeerschen Gesetz berechnet. Wichtig: Wählen Sie für alle drei Fälle (Normalzustand, gehemmter
und reaktivierter Zustand) den gleichen Zeitraum (z.B. immer zwischen der 1. und 5. Minute).
E=*c*d
E
t
d

c/min
VF
Unit
:
:
:
:
:
:
:
∆E
c/min [U/l] =
x
VF
d *  * t
aus Kurve ablesen [Steigung] oder aus Werten errechnen [E(405nm)5 min - E(405nm)1min]
aus Kurve ablesen [Steigung] oder aus Werten errechnen [5 min - 1min]
1 cm
13,3 * 103 [l/mol * cm]
umgesetztes Substrat/min [mol/l * min]
Verdünnungsfaktor (Enzym)  s. Plastikküvette I (3120 l : 20 l = 156)
1 mol Substratumsatzerhöhung / min [Vorsicht: mol in mol umrechnen (x 106)]
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3-18
II. Enzymkinetik der Lactatdehydrogenase
1.
Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration

die Laktatdehydrogenase katalysiert die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat mit Hilfe von
NADH, das dabei zu NAD+ oxidiert wird

NADH besitzt im Gegensatz zu NAD+ ein zusätzliches Extinktions-Maximum bei λ= 340nm;
dadurch kann der Verbrauch von NADH photometrisch bestimmt werden
 Photometer auf =340nm einstellen
 Photometer mit H2O nullen
 Lösungen in die bereitgestellten Reagenzgläser pipettieren und mit einem Plastikspatel gut
mischen! (Spatel zwischendurch abwischen)
Pipettierschema:
Reagenzglas-Nr.
1
2
3
4
5
Citrat-Puffer pH 6,0 [ml]
1,65
1,6
1,5
1,3
1,1
0,5mM Natrium-Pyruvat-Lösung [ml]
0,05
0,1
0,2
0,4
0,6
1mM NADH [ml]
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
 Lösung Nr.1 in die Küvette pipettieren oder schütten und die Anfangsextinktion (E0) messen,
indem die Küvette mit der Lösung ins Photometer gestellt wird, der Wert abgelesen und in die
Tabelle 2.1 eingetragen wird
 nach 30 Sekunden erneut den Wert ablesen und eintragen (Die Küvette bleibt die ganze Zeit
im Photometer stehen)
Tabelle: 2.1
Lösung
E(340nm)
Zeit [s]
1
2
3
4
5
15
30
 bei konstanter Extinktion: 0,1ml LDH (Laktatdehydrogenase) direkt in die Lösung geben und
mit der Spitze umrühren
REAKTION STARTET JETZT! DIREKT ZEIT MESSEN!
 alle 15 sec in einem Zeitraum von 2 min die Extinktion ablesen und in Tabelle 2.2
eintragen (Die Küvette bleibt die ganze Zeit im Photometer stehen!)
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Enzymologie
3-19
 mit den Lösungen 2-5 gleichermaßen verfahren (vorher jedes Mal neu das Photometer mit
H2O nullen)
Tabelle 2.2
E(340nm)
Lösung
Zeit [s]
1
2
3
4
5
15
30
45
60
75
90
105
120
2. Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration
a) Für jede Pyruvatkonzentration (Lösungen 1-5) einen Graphen zeichnen. (Extinktion gegen
Zeit)
b) Die Anfangsgeschwindigkeit (v0) mit Hilfe des Lambert-Beerschen-Gesetz für jeden
Graphen ermitteln. Eine Beispielrechnung pro Substratkonzentration ist für das Protokoll
ausreichend. Bitte machen Sie kenntlich, welche Extinktionswerte Sie für die Berechnung
benutzt haben. Wichtig: verwenden Sie immer den gleichen Zeitraum.
ΔE=*c*d

E

d
c
=
=
=
=
Extinktionsabnahme
molarer Extinktionskoeffizient von NADH bei 340nm=6,2*103 (l*mol-1*cm-1)
Schichtdicke, 1cm
Änderung der NADH-Konzentration
Linearen Anfangsbereich der einzelnen Graphen ermitteln und die Extinktionsabnahme (E) pro Zeit
(t), die in diesem Bereich liegt, berechnen. Daraus ergibt sich dann folgende
Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion, v0,:
c
v0=
E
=
t
E [mol]
=
*d*t
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E * 0,16 [µmol]
=
( 6,2*103*t) [min* l ]
t [min * ml]
Enzymologie
3-20
Tabelle 2.3
Substratkonz.
Extinktionsabnahme Anfangsgeschw.
v0
1/v0
(in der Lösung)
1/[S]
mol/(ml*min)
(ml*min)/mol
mmol/l
l/mmol
Lösung pro Zeit ( ……… min)
Nr.
E/t
[S]
1
2
3
4
5
Berechnung der Pyruvatkonzentration:
Pyruvatvolumen [ml]
Verdünnungsfaktor [1-5] =
Gesamtvolumen [ml]
Pyruvatkonzentration (1-5) [mmol/l] = Ausgangskonzentration [0,5mmol/l] * Verdünnungsfaktor [1-5]
3. Zeichnen des Michaelis-Menten-Plot und der Lineweaver-Burk-Darstellung
a) Für den Michaelis-Menten-Plot werden die Anfangsgeschwindigkeiten (v0) gegen die
Pyruvatkonzentrationen [S] aufgetragen und die Michaelis-Menten Konstante (KM), sowie die
Maximalgeschwindigkeit der Reaktion, die bei Substratsättigung erreicht wird (vmax), ermittelt.
b) Der Lineweaver-Burk Plot ist eine doppel-reziproke Darstellung von v0 und [S], also in Form von
1/vo und 1/[S]. KM wird als x-Achsen Schnittpunkt im negativen Bereich (-1/KM ) und vmax als yAchsen Schnittpunkt (1/ vmax) abgelesen und umgerechnet.
4. Ermittelung von KM und vmax
a) Vergleichen Sie die ermittelten Werte KM und vmax
zwischen Michaelis Menten Plot und
Lineweaver-Burk-Darstellung. Rechnen Sie gegebenenfalls die Werte in die erforderlichen
Einheiten um und tragen Sie diese in die Tabelle 4 ein. Wenn sich KM und vmax voneinander
unterscheiden, welchen Grund könnte das haben? Führen Sie hierfür die Vor-und Nachteile des
jeweiligen Darstellungsverfahrens (Michaelis-Menten-Plot bzw. Lineweaver-Burk-Darstellung) an.
Tabelle 4
Michaelis-Menten-Plot
Lineweaver-Burk-Darstellung
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KM
Vmax
[mol/l]
[mmol / l * min ]
Enzymologie
3-21
Übungsaufgaben
1. Eine reine Enzymlösung (100 µg Enzym/ml, MG 80.000) hat eine Aktivität von 50 U/ml. Wie groß
ist die Wechselzahl?
2. Hexokinase hat im Gehirn ein KM von 10-5 mol/l und in der Leber ein Km von 10-3 mol/l.
a) In welchem der beiden Organe läuft bei ständig abnehmender Glc-Konzentration die Reaktion
länger mit maximaler Geschwindigkeit ab?
b) Wie groß muss die Glucose-Konzentration in mg/ml intrazellulärer Flüssigkeit in beiden
Organen sein, damit die Reaktion mit halbmaximaler Geschwindigkeit abläuft ? (MG Glc = 180)
3. Formulieren Sie die Reaktionsgleichung der
a) Alkoholdehydrogenase (ADH) mit Coenzym.
b) Die Reaktion zeigte mit verschiedenen Konzentrationen Äthanol [S] folgende
Geschwindigkeiten:
[Äthanol] mM
Vo ( E340/5 min)
0,75
0,094
1,00
0,115
1,50
0,148
3,00
0,206
12,00
0,293
Ermitteln Sie graphisch KM für Äthanol und Vmax der ADH.
c) Einen Umsatz von 0,356 105 µmol NADH/l min mg Protein errechnet man aus Vmax. 1 % der
für die Messung verwendete Proteinfraktion war ADH. MG = 80.000. Berechnen Sie die
Wechselzahl der ADH
4. Eine Reaktion 1. Ordnung beginnt mit einer Anfangskonzentration des Substrates von 10-5 mol/l.
Sie ist eine Reaktion 1. Ordnung. Nach 6 Minuten ist die Hälfte des Substrates umgesetzt.
a) Wie groß ist k;
b) Wie groß ist die Konzentration nach 10 Minuten?
5. In einer Isomerase Reaktion werden 2,5 mg Enzym vom Molekulargewicht 125.000 eingesetzt. KM
wurde zu 3.10-3 mol/l bestimmt und Vmax zu 275 µmol/Min.
a) Wie groß ist die Wechselzahl?
b) Berechnen Sie die Anfangsgeschwindigkeit bei einer Substratkonzentration von 7,5 mmol/l
6. a) Für welche Reaktion wird Vitamin K als Cofaktor benötigt?
b) Für welchen physiologischen Vorgang ist diese Reaktion von Bedeutung?
7. a) Wie beinflusst ein erhöhter ADP-Gehalt die Umlaufgeschwindigkeit im Citratzyklus?
b) Auf welche Enzyme des Citratzyklus wirkt ADP?
8. a) Welches Organell der Zelle enthält vor allem Hydrolasen?
b) Nennen Sie drei Stoffklassen, die dort hydrolysiert werden.
9. Stellen Sie den Effekt, den ein Enzym auf die Aktivierungenergie einer Reaktion hat, in einer
einfachen Graphik dar
10. Wie beinflusst ein kompetitiver Inhibitor Vmax und KM einer enzymatischen Reaktion?
11. a) Nennen Sie einen Inhibitor der Acetylcholinesterase, der eine kovalente Bindung mit dem
Enzym eingeht.
b) Nennen Sie die betroffene Aminosäure.
 2011 Zentrum Biochemie