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MET H ODE N & AN WE N DU NGEN
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Lebensmittelanalyse
Multiplexer Immunnachweis zur Testung
von Allergenen
TETSUYA UEDA
PRECISION SYSTEM SCIENCE, MATSUDO-SHI, JAPAN
Eine neue vollautomatische Analyseplattform kann zur hochsensitiven
Detektion von Allergenen in der Nahrungsmittelproduktion eingesetzt
werden.
A highly-sensitive, fully-automated multiplex assay platform can be used
for detection of antigen on site.
Allergennachweis in Nahrungsmitteln
ó Weltweit steigt die Zahl der Allergiker kontinuierlich an, darunter eine Mehrheit von
Nahrungsmittelallergikern [1], für die die
Kennzeichnung von potenziellen Allergenen
A
in Nahrungsmitteln eine effektive Maßnahme zur Vermeidung allergischer Reaktionen
ist. Einige Länder, wie z. B. die EU-Mitgliedsstaaten, Japan, Australien, Neuseeland und
die USA, definieren deshalb gesetzliche Vor-
gaben zur Kennzeichnung wichtiger, potenzieller Allergene, die in Nahrungsmitteln enthalten sind. So können die Nahrungsmittel
identifiziert werden, die Allergene aus z. B.
Milch, Eier, Weizen, Erdnüssen oder Krustentieren enthalten. Gemäß diesen gesetzlichen Vorgaben müssen Tests zum Nachweis
der wichtigsten Lebensmittel-Allergene während der Nahrungsmittelverarbeitung durchgeführt werden. ELISA-Tests, Immunchromatografie, Western Blot, PCR und/oder Massenspektroskopie sind die etablierten Testmethoden zur Detektion von Allergenen in
Nahrungsmitteln während des Produktionsprozesses. Diese Testverfahren sind jedoch
zeitintensiv und müssen durch speziell
geschultes Personal durchgeführt werden. Sie
sind deshalb nicht ohne Weiteres im Bereich
der Verarbeitung (on site) zu etablieren.
Kleine, kompakte Analyseplattformen wie
das LuBEA-System von Precision System
Science, die einfache Testungen durch hochsensitive Multiplex-Nachweise ermöglichen,
wären deshalb für den Bereich der Nahrungsmittelverarbeitung sehr geeignet.
Das Analysesystem LuBEA
B
Das kleine, vollautomatische Analysesystem
LuBEA (Line up Beads Assay) verwendet zur
Durchführung der Analysen beschichtete
Beads, mit denen ein speziell designtes Tip
befüllt wird (BIST, Bead array in Single Tip,
Abb. 1). In diesem „Kapillartip“ sind 40 bis 50
Beads aufgereiht. Jedes Bead hat einen Durchmesser von einem Millimeter und kann je
¯ Abb. 1: Konzept des LuBEA-BIST-Systems.
A, Vorgefüllte Kartuschen enthalten BIST (Bead
array in Single Tip) und Reagenzien (Reaktionspuffer, Wasch- und Substratlösung) zur Durchführung des Multiplex-Nachweises. B, Das
BIST-Kapillartip enthält 40 bis 50 Beads. Diese
können mit unterschiedlichen Molekülen, wie
Antikörper, Antigene oder Nukleinsäuren,
beschichtet sein. Zur Veranschaulichung des
Prinzips des multiplexen Nachweisverfahrens
sind drei Beads dargestellt, die drei spezifische
Antigene mittels der an die Beads gebundenen
Antikörper nachweisen. Weitere Erläuterungen
siehe Text.
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nach Anwendung mit Proteinen,
Antikörpern oder Nukleinsäuren
beschichtet worden sein. Dies
ermöglicht Produktentwicklern,
ihre testspezifischen Assays und
Reagenzien für dieses System zu
entwickeln. Die Beads werden mit
einem Nachweismolekül beschichtet, in definierter Ordnung
ins BIST gefüllt und können
anschließend zur vollautomatisierten Multiplex-Detektion der
Antigene in einer Probe verwendet werden (Abb. 1B). Durch die
Beladung der Beads mit unterschiedlichen Oligonukleotiden
kann das BIST aber auch zur multiplen SNP(single nucleotide polymorphism)-Typisierung verwendet werden.
Das System verwendet vorgefüllte Kartuschen und führt alle
Analyseschritte wie Inkubation,
Waschschritte, enzymatische
Reaktionen, Detektion und Analyse vollautomatisch durch. Nach
der Bestückung des Instruments
mit der Probe, der Kartusche und
dem BIST wird das System verschlossen und der Lauf gestartet.
Am Ende des Laufs werden die
eindeutigen Ergebnisse des Multiplex-Nachweises grafisch dargestellt.
Im Folgenden wird die Multiplex-Detektion von drei Lebensmittel-Allergenen durch diese
Analyseplattform beispielhaft
gezeigt. Das Kapillartip, welches
für die Allergen-Identifizierung
aus den Nahrungsmitteln verwendet wurde, ist mit Beads
gefüllt, die mit drei unterschiedlichen monoklonalen Antikörpern
beschichtet wurden (Abb. 1B).
Jeweils zwei Beads wurden mit
anti-Hühnerlysozym-, mit antiOvalbumin- oder mit anti-KaseinAntikörpern beschichtet. Unbeschichtete Beads dienen als Negativkontrolle im Multiplex-ImmunEnzymtest. In Abbildung 2 sind
die Ergebnisse im Einzelnen dargestellt. Sind die korrespondierenden Antigene in der Probe enthalten, binden diese an „ihren“
Antikörper und werden mittels
Chemilumineszenz im System
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˘ Abb. 2: Multiplex-Detektion von NahrungsmittelAllergenen mittels Antikörper-beschichteten Beads
im BIST. Einzelpeaks repräsentieren das Chemilumineszenzsignal am jeweiligen Bead nach spezifischer Bindung des Antigens an den monoklonalen
Antikörper. A, Hühnerlysozym/Ovalbumin/Kasei
n-Triplexnachweis. B, Ovalbumin/Kasein-Duplexnachweis.
C, Hühnerlysozym/Ovalbumin-Duplexnachweis. D,
Hühnerlysozym/KaseinDuplexnachweis. HEL:
Hühnerlysozym; OVA: Ovalbumin.
nachgewiesen und als Peak
grafisch dargestellt. Diese
Ergebnisse zeigen, dass das
LuBEA-BIST-System zum Multiplex-Immunnachweis für
Allergene in Nahrungsmitteln
durchaus geeignet ist.
ó
Literatur
[1] Hugh A, Sampson MD (2004) Update
on food allergy. J Allergy Clin Immunol
113:805–819
[2] Kirsch S, Fourdrilis S, Dobson R
(2009) Quantitative methods for food
allergens: a review. Anal Bioanal Chem
395:57–67
Korrespondenzadresse:
Dr. Gottfried Leo Selders
PSS Europe GmbH
Spiesheimer Weg 32
D-55286 Wörrstadt
Tel.: 06732-9388-14
Fax: 06732-9388-20
[email protected]
www.pss-europe.de
A
B
C
D
N: Negativkontroll-Bead
O: anti-OVA-Mab-coated Bead
H: anti-HEL-Mab-coated Bead
C: anti-Casein-Mab-coated Bead