Enzymkinetik 20112012 01

Erstabgabe:
Enzymkinetik
Praktikum Stoffwechselphysiologie
WS 2011/2012
Versuch Enzymkinetik
Gruppe XY
Betreuer:
Praktikanten:
Versuchstag:
1
Erstabgabe:
Enzymkinetik
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ............................................................................................................................................ 3
2. Theorie................................................................................................................................................. 3
2.1 Enzyme ...................................................................................................................................... 3
2.1.1 Definition ................................................................................................................................ 3
2.1.2 Aufbau .................................................................................................................................... 3
2.1.3 Katalysestrategien .................................................................................................................. 3
2.1.4 Hauptklassen der Enzyme ...................................................................................................... 4
2.1.5 Beeinflussung der Enzymaktivität .......................................................................................... 4
2.1.6 Enzyminhibitoren ................................................................................................................... 4
2.1.7 Enzymregulation ..................................................................................................................... 5
2.1.8 Enzymkinetik .......................................................................................................................... 6
2.2 Glykolyse und Lactatdehydrogenase (LDH) ................................................................................... 8
2.2.1 Glykolyse................................................................................................................................. 8
2.2.2 Aerobe Umsetzung des Pyruvats............................................................................................ 9
2.2.3 Anaerober Abbau von Pyruvat ............................................................................................... 9
2.2.4 Cori-Zyklus ............................................................................................................................ 10
3. Material und Methoden ..................................................................................................................... 11
3.1 Bestimmung von KM und Vmax; Berechnung der spezifischen Enzymaktivität ........................... 11
3.2 Bestimmung des pH-Optimums .................................................................................................. 12
4. Ergebnisse: ........................................................................................................................................ 13
4.1 Versuch 1 ..................................................................................................................................... 13
4.2 Versuch 2: .................................................................................................................................... 18
5. Diskussion .......................................................................................................................................... 20
5.1 Versuch 1: .................................................................................................................................... 20
5.2 Versuch 2: .................................................................................................................................... 20
6. Quellen .............................................................................................................................................. 21
2
Erstabgabe:
Enzymkinetik
1. Einleitung
In diesem Versuch stand die Einführung in die Enzymuntersuchung im Vordergrund. So
wurden speziell das pH-Optimum und die Enzymaktivität der Lactatdehydrogenase bestimmt.
2. Theorie
2.1 Enzyme
2.1.1 Definition
Enzyme sind Biokatalysatoren. Sie sind also Makromoleküle, die die Einstellung des
chemischen Gleichgewichts einer Reaktion beschleunigen, dabei aber nicht verbraucht
werden. Enzyme sind substratspezifisch, das bedeutet, dass sie nur spezielle Moleküle mit
einer ganz bestimmten Struktur binden können. Desweiteren sind Enzyme auch
wirkspezifisch, was heißt, dass sie das gebundene Substrat nur auf eine Art und Weise
umsetzen.
2.1.2 Aufbau
Enzyme sind meist Proteine, also Polypeptidketten aus Aminosäuren (AS), es gibt jedoch
auch andere katalytisch aktive Verbindungen, zum Beispiel RNA. Der Ort an dem die
Substratumsetzung im Enzym erfolgt heißt aktives Zentrum. Hier befinden sich die Reste der
Aminosäuren, die für die Bindung mit dem Substrat wichtig sind. Neben kovalenten
Bindungen, werden die Substrate meist über Wasserstoffbrückenbindungen oder Van-derWaals-Wechselwirkungen am Enzym fixiert. Enzyme können auch einen Nichtproteinanteil
kovalent gebunden haben. Dieser wird prosthetische Gruppe genannt und ist maßgeblich an
der katalytischen Aktivität des Enzyms beteiligt. Ein Beispiel für ein Enzym mit einer solchen
prosthetischen Gruppe ist das Cytochrom C mit seiner Häm-Gruppe (Fe2+-Ion eingeschlossen
von einem Porphyrinring). Manche Enzym benötigen für den Umsatz ihres Substrates keinen
kovalent gebundenen Nicht-Proteinanteil, sondern sogenannte Co-Faktoren bzw. CoSubstrate. Diese Verbindungen sind nicht permanent an das Enzym gebunden, aber essentiell
für dessen katalytische Wirkung. Beispiele für Co-Faktoren und Co-Substraten sind das
Coenzym-A und das ATP.
2.1.3 Katalysestrategien
Man unterscheidet grundsätzlich vier Katalysestrategien, die Säure-Base-Katalyse, die
Katalyse durch Annäherung, die kovalente Katalyse und die Metall-Ionen vermittelte
Katalyse.
Bei der Katalyse durch Annäherung werden die beiden Reaktionspartner in der räumlich
richtigen Orientierung durch Binden an das Enzym einander näher gebracht, wodurch die
Reaktion dann besser ablaufen kann (Bsp.: Nukleosidmonophosphat-Kinase). Bei der MetallIonen vermittelten Katalyse wird ein Metall-Ion (z. B.: Zn2+, Fe2+) dazu genutzt
beispielsweise ein negativ geladenes Zwischenprodukt zu stabilisieren (Bsp.:
Carbonanhydrase). Bei der kovalenten Katalyse, wird das Substrat kovalent an das Enzym
gebunden und dadurch umgesetzt (Bsp.: Chymotrypsin). Die Reaktion der
Lactatdehydrogenase, die in diesem Versuch genauer untersucht wird ist der Säure-BaseKatalyse zu zuordnen, hierbei wird die Reaktion durch H+- oder OH--Ionen beschleunigt.
3
Erstabgabe:
Enzymkinetik
Jedoch nutzen Enzyme meist nicht nur eine Katalysestrategie, sondern setzten ihre Substrate
durch eine Kombination mehrerer dieser Katalysetypen um.
2.1.4 Hauptklassen der Enzyme
Die Enzyme werden im Enzyme Coding System (E. C. System) in 6 Hauptklassen und
mehrere Unterklassen unterteilt. Die Hauptklassen werden unterschieden in Oxidoreduktasen,
die Oxidation und Reduktionen katalysieren. Zu dieser Hauptklasse gehört auch die in diesem
Versuch verwendete Lactatdehydrogenase. Dann gibt es noch die Transferasen, die die
Übertragung von Gruppen von einem Molekül auf ein anderes katalysieren. Die Hydrolasen
spalten Moleküle unter Einbau von Wasser. Die Lyasen katalysieren Eliminierungs- und
Additionsreaktionen während die Isomerasen Umlagerungsreaktionen beschleunigen. Die
sechste Hauptklasse ist die der Ligasen, die die Verknüpfung von Molekülen unter ATPVerbrauch katalysieren.
2.1.5 Beeinflussung der Enzymaktivität
Man kann die Enzymaktivität auf ganz verschiedene Arten verändern. Beispielsweise kann
man die Temperatur erhöhen bzw. erniedrigen. Denn umso höher die Temperatur ist je
schneller bewegen sich die Teilchen. Dies bedeutet dass die Wahrscheinlichkeit, dass ein
Substratmolekül auf ein Enzym trifft steigt, weshalb auch die Umsatzrate erhöht wird. Wird
die Temperatur jedoch zu stark erhöht, denaturiert das Enzym, also verändert seine Struktur,
weshalb dann keine Substratbindung also auch kein Umsatz mehr möglich ist. Wird die
Temperatur stark verringert, bewegen sich die Teilchen langsamer, darum sinkt auch die
Wahrscheinlichkeit, dass ein Substratmolekül auf ein Enzym trifft, die Umsatzrate sinkt. Aber
nicht nur die Temperatur hat einen Einfluss auf die Enzymaktivität auch der pH-Wert spielt
dabei eine entscheidende Rolle. Denn die Reste der AS verändern ihre Eigenschaften je nach
pH-Wert, dadurch kann sich auch die Struktur des Enzyms umgewandelt werden, wodurch
die Umsetzung des Substrates behindert wird. Aus diesem Grund hat jedes Enzym ein
Temperatur- und ein pH-Wert-Optimum, bei welchem die höchste und beste
Umsatzgeschwindigkeit des Enzyms vorliegt. Desweitern kann auch die Enzymaktivität durch
das Vorhandensein von Schwermetallionen oder Inhibitoren herabgesetzt werden. Auch der
Körper hat mehrere Mechanismen entwickelt um die Aktivität seiner Enzyme zu regulieren.
Beispiele hierfür sind allosterische Effektoren, Isoenzyme, proteolytische Spaltung und noch
einiges mehr, worauf später genauer eingegangen wird.
2.1.6 Enzyminhibitoren
Hierbei werden erst einmal zwei Arten der Enzyminhibition unterschieden: die irreversible
und die reversible Inhibition.
Die irreversible Inhibition kann nicht rückgängig gemacht werden. Das inhibierte Enzym
kann seiner Aufgabe nicht mehr nachkommen und muss abgebaut werden. Solche
irreversiblen Inhibitoren sind meist Schwermetallionen, wie Quecksilber oder Arsen, oder
Penicilline.
Bei der reversiblen Inhibition kann das betroffene Enzym wieder in seine aktive Form
überführt werden. Auch hier gibt es wieder eine Einteilungen nach der die reversiblen
Inhibitoren unterschieden werden können: die kompetitiven und die nicht kompetitiven
Inhibitoren. Die kompetitiven Inhibitoren konkurrieren mit den Substratmolekülen um die
Bindungsstelle im aktiven Zentrum des Enzyms. Dieser kompetitive Hemmstoff muss also
4
Erstabgabe:
Enzymkinetik
eine ähnliche Struktur wie das Substrat aufweisen. Die kompetitive Hemmung kann durch
eine Erhöhung der Substratkonzentration abgeschwächt werden.
Bei der nicht kompetitiven Inhibition bindet der Hemmstoff außerhalb des aktiven
Zentrums am Enzym und verursacht dadurch eine Konformationsänderung des
Biokatalysators. Durch die veränderte Struktur kann nun nur noch langsam Substrat falls
überhaupt binden, wodurch die Umsatzrate stark sinkt.
2.1.7 Enzymregulation
Wie bereits erwähnt besitzt der Körper viele Mechanismen um die Enzymaktivität zu
regulieren. Einerseits kann er die Aktivität der Enzyme mit Hilfe von allosterischen
Effektoren verringern. Diese allosterische Effektoren gehören zu den nicht kompetitiven
Hemmstoffen und binden außerhalb des aktiven Zentrums des Enzyms. Durch die Bindung
eines solchen Effektors kann die Enzymaktivität erhöht oder auch erniedrigt werden. Je
nachdem um welches Enzym es sich handelt, führt die Konformationsänderung zur
Bindungsmöglichkeit des Substrates oder eben zum Gegenteil.
Auch kann das Eintreten des chemischen Gleichgewichtes über Isoenzym beschleunigt
werden. Die Isoenzyme besitzen alle eine unterschiedliche Struktur, wodurch sich auch ihr
pH-Optimum beispielsweise verändern kann, katalysieren jedoch die gleiche Reaktion. Die
Isoenzyme ermöglichen es dem Körper in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen
Bedingungen mit den Enzymen zu arbeiten, zu denen das Milieu am besten passt. Auch für
die in diesem Versuch verwendete Lactatdehydrogenase besitzt der Körper unterschiedlichste
Isoenzyme. Die Lactatdehydrogenase ist ein Tetramer, besteht also aus vier Untereinheiten,
die entweder vom Typ M oder H sind. Die Lactatdehydrogenase im Herzen enthält vier
Untereinheiten vom Typ H, die Lactatdehydrogenase in der Skelettmuskulatur besteht aus
vier M-Untereinheiten. Es gibt auch noch andere Isoenzyme der Lactatdehydrogenase (LDH),
die eine Mischung aus M- und H-Untereinheiten aufweisen (LDH-3 im Lungengewebe: 2 H 2
M).
Auch ein effektives Mittel des Körpers Enzyme zu aktivieren bzw. zu deaktivieren ist die
Interkonversion. Bei diesem Mechanismus der Enzymregulation wird an eine freie OHGruppe des Enzyms eine Phosphatgruppe angehängt oder auch davon abgespalten. Dabei ist
zu beachten, dass es Enzyme gibt, die in dephosphoryliertem Zustand aktiv sind und welche
die erst aktiv werden, wenn sie eine Phosphatgruppe angehängt bekommen.
Ebenfalls eine Möglichkeit ein Enzym in eine aktive Konformation zu überführen ist die
proteolytische Aktivierung. Hierbei wird wenn das Enzym gebraucht wird ein Teil der
Peptidsequenz mit Hilfe von Proteasen abgespalten, wodurch das Enzym endlich die Struktur
erhält, die es ihm möglich macht, sein Substrat zu binden und umzusetzen. Diese Art der
Enzymaktivierung wird vor allem bei Enzymen des Verdauungstraktes gemacht, damit diese
während des Transportes von ihrem Bildungsort zum Wirkort nicht den Organismus selbst
abbauen (Selbstverdauung).
Der Körper kann die Umsetzungsrate von Substraten nicht nur über Aktivierung und
Deaktivierung bereits vorhandener Enzyme steuern, er kann auch die Syntheserate von den
Genen für die Enzyme anregen bzw. stoppen über Gen-Induktion bzw. Gen-Repression.
Bei der Gen-Induktion führt das Vorhandensein eines bestimmten Effektors zur Aktivierung
eines Transkriptionsfaktors und damit zu einer erhöhte Expression von bestimmten Genen,
5
Erstabgabe:
Enzymkinetik
die das Enzym codieren. Bei der Gen-Repression zeigt sich der umgekehrte Fall. Hier führt
das Vorhandensein eines Repressors zum Stopp der Genexpression von bestimmten Genen.
2.1.8 Enzymkinetik
Unter dem Begriff Enzymkinetik versteht man die Beschreibung eines sich zeitlich ändernden
Systems. Vor allem die Theorien von Michaelis und Menten haben auf die Beschreibung
großen Einfluss. Diese beiden haben die Michaelis-Menten-Konstante eingeführt, die die
Substratkonzentration angibt, bei der das Enzym mit der halbmaximalen Geschwindigkeit
arbeitet. Die Theorien von Michaelis und Menten gelten jedoch nur unter zwei Bedingungen.
Diese lauten: die Rückreaktion (Reaktion vom Produkt mittels dem Enzym zurück zum
Substrat) kann vernachlässigt werden und das immer die gleiche Anzahl von Enzym-SubstratKomplexen vorhanden ist. Die Michaelis-Menten-Gleichung lautet:
= ೘ೌೣ ∗[]
ಾ []
v0: Anfangsgeschwindigkeit
vmax: maximale Geschwindigkeit
KM: Michaelis-Menten-Konstante
[S]: Substratkonzentration
Trägt man die aus der Michaelis-Menten-Gleichung erhaltenen Geschwindigkeiten gegen die
Substratkonzentrationen auf, erhält man das Zeit-Umsatz- oder auch Michaelis-MentenDiagramm (Abb. 1). In dieser Darstellung nähert sich die Geschwindigkeit asymptotisch der
maximalen Geschwindigkeit an, erreicht diese aber nie, was ein Nachteil dieser Darstellung
ist.
Abbildung 1: Michaelis-Menten-Diagramm
http://www2.chemie.uni-erlangen.de/projects/vsc/chemie-mediziner-neu/kinetik/bilder/michaelis_menten.gif, 14.02.2012
Will man den KM-Wert und die maximale Geschwindigkeit genauer ablesen, hat sich die
lineare Transformation des Michaelis-Menten-Diagrammes in das Lineweaver-Burk6
Erstabgabe:
Enzymkinetik
Diagramm (Abb. 2) bewehrt. Bei dieser Art der Darstellung wird die die reziproke
Geschwindigkeit gegen die reziproke Substratkonzentration aufgetragen. Hierbei ist der
Schnittpunkt mit der y-Achse identisch mit der reziproken maximalen Geschwindigkeit und
der Schnittpunkt mit der x-Achse ist der negative, reziproke KM-Wert.
Abbildung 2: Lineweaver-Burk-Diagramm
http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/8/bc/biokatalyse/bilder/line_burk_o_t.gif, 14.02.2012
Die eben erwähnten Gleichungen und Diagramme gelten nur für die ungehemmte
Enzymreaktion. Tritt nun eine Inhibition der Enzyme auf, verändert sich der KM-Wert bzw.
die maximale Geschwindigkeit vmax. Bei einer kompetitiven Hemmung bleibt vmax gleich, KM
jedoch wird größer (Abb. 3). Bei der nicht kompetitive Hemmung bleibt KM gleich, vmax
jedoch wird kleiner (Abb. 4).
Abbildung 3: Lineweaver-Burk-Diagramm einer kompetitiven Hemmung
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/ed/Lineweaver-Burke_plot_competitive_inhibition.svg/400pxLineweaver-Burke_plot_competitive_inhibition.svg.png, 14.02.2012
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Erstabgabe:
Enzymkinetik
Abbildung 4: Lineweaver-Burk-Diagramm einer nicht kompetitiven Hemmung
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/aa/Lineweaver-Burke_plot_non-competitive_inhibition.svg/400pxLineweaver-Burke_plot_non-competitive_inhibition.svg.png, 14.02.2012
2.2 Glykolyse und Lactatdehydrogenase (LDH)
2.2.1 Glykolyse
Die Glykolyse ist der erste Schritt des Glucoseabbaus und läuft anaerob im Cytoplasma ab.
Sie wird zur ATP-Gewinnung und zur Herstellung von C2-Bausteinen genutzt. In der
Glykolyse wird die Glucose über mehrere Schritte zu zwei Pyruvat abgebaut. Dabei entstehen
nachdem Einsatz von zwei ATP, die zur Aktivierung der Glucose eingesetzt werden, 4 ATP.
Insgesamt werden pro Mol Glucose zwei Mol ATP und zwei Mol NADH frei. Ein Überblick
der Glykolyse ist in Abb. 5 dargestellt.
Abbildung 5: Übersicht Glykolyse
aus dem Skript der Vorlesung: Biochemie II
Die Gesamtgleichung für die Glykolyse lautet:
8
Erstabgabe:
Enzymkinetik
2.2.2 Aerobe Umsetzung des Pyruvats
Im menschlichen Körper wird das Pyruvat meist aerob zuerst in Acetyl-CoA abgebaut, um
dann in den Citratcylus (Abb. 6) eingeschleust zu werden. Hier wird das Acetyl-CoA dann
vollständig zu CO2 und den entsprechenden Anzahlen von Reduktionsäquivalenten abgebaut.
Die Reduktionsäquivalente (NADH, FADH2) die für den weiteren Glucoseabbau notwendig
sind, werden in der Atmungskette unter Aufbau eines Protonengradienten und anschließender
ATP-Synthese rückoxidiert. Im aeroben Abbau von Glucose werden so über Glykolyse,
Citratcyclus und Atmungskette insgesamt 30 Mol cytosolisches ATP pro Mol Glucose
gewonnen.
Abbildung 6: Übersicht über den Citratcyclus
aus dem Skript der Vorlesung: Biochemie II
2.2.3 Anaerober Abbau von Pyruvat
Beim anaeroben Abbau von Pyruvat wird zur Glykolyse kein zusätzliches ATP gewonnen.
Der einzige Zweck der Gärung, egal ob alkoholische oder Milchsäuregärung, ist die
Rückgewinnung der Reduktionsäquivalente (NADH NAD+), damit die Glykolyse nicht
zum Stillstand kommt. Also wird durch den anaeroben Abbau von Glucose nur zwei ATP
gewonnen.
Bei der alkoholischen Gärung wird Pyruvat zuerst zu CO2 und Ethanal umgewandelt. Das
Ethanal wird schließlich zu Ethanol oxidiert, wobei das NAD+ zurückgewonnen wird. Diese
Reaktionen werden von der Pyruvatdecarboxylase und der Alkoholdehydrogenase katalysiert.
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Erstabgabe:
Enzymkinetik
Bei der Milchsäuregärung wird das Pyruvat mit Hilfe der Lactatdehydrogenase in Lactat
umgewandelt, wie in Abb. 7 dargestellt. Die Milchsäuregärung wird nicht nur von
Lactobazillen durchgeführt, sondern auch von Muskelzellen bei nicht ausreichender
Sauerstoffversorgung und den roten Blutkörperchen.
Abbildung 7: Ablauf der Milchsäuregärung
2.2.4 Cori-Zyklus
Der Cori-Zyklus ist nach seinen Entdecker Grety und Carl Cori benannt und beschreibt den
Zyklus den im Muskel entstanden Lactat zur Leber nimmt, um dort wieder in Glucose
umgewandelte zu werden. Die in der Leber so erhaltene Glucose wird in das Blut abgegeben,
aus dem es bei Bedarf erneut vom Muskel aufgenommen und zu Lactat abgebaut werden
kann.
Abbildung 8: Cori-Zyklus
http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Cori-Zyklus.svg&filetimestamp=20100612182903, 14.02.2012
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Erstabgabe:
Enzymkinetik
3. Material und Methoden
3.1 Bestimmung von KM und Vmax;
Berechnung der spezifischen Enzymaktivität
Materialien:
343 mg Muskel von Xenopus, Potter-Elvejhem-Homogenisator, Eis zur Kühlung,
Kühlzentrifuge Heraeus Multifuge X1R, Reagenzgläser, Eppendorfgefäße, Küvetten,
Pipetten, Pipettenspitzen, Photometer, Handystoppuhr, Whirlmix
Reagenzien:
Kalium-Phosphatpuffer
(0,05
M,
pH
7,0);
Pyruvat-Stammlösung
(100
mM);
Lactatdehydrogenase (LDH)-Extrakt; NADH (10 mg/ml)
Durchführung:
Der Froschmuskel, welcher vom Versuch Muskelbiochemie zur Verfügung gestellt wurde,
wurde mit 10 ml kalten Phosphatpuffer versetzt und unter Eiskühlung im Homogenisator
homogenisiert. Das Homogenisat wurde anschließend in der Kühlzentrifuge bei 4 °C und
5000 U/min für 10 min zentrifugiert. Vom erhaltenen Überstand wurde 1 ml entnommen, mit
1 ml kaltem Phosphatpuffer versetzt und unter Eiskühlung aufbewahrt. Diese Lösung diente
als LDH-Extrakt.
Parallel dazu wurde aus einer 100 mM Pyruvat-Stammlösung eine Verdünnungsreihe mit
folgenden Konzentrationen hergestellt: 100, 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 5, 4, 3 und 2 mM. Diese
wurden auf dem Whirlmix gründlich durchmischt.
Nun wurden Küvetten nach folgendem Pipettierschema (Tabelle 1) befüllt.
Tabelle 1: Pipettierschema zur Enzymaktivitätsbestimmung
Lösung
Proben
Lehrwert
Phosphatpuffer
3,0 ml
3,1 ml
LDH-Extrakt
0,05 ml
0,05 ml
NADH
0,05 ml
-
jeweilige Pyruvatlösung
0,05 ml
-
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Erstabgabe:
Enzymkinetik
Zuerst wurde die Extinktion der Lehrwertprobe im Photometer bei 340 nm bestimmt und das
Photometer so kalibriert. Danach wurde die Extinktion der einzelnen Proben bei 340 nm
gemessen, wobei zu jeder Probe die jeweilige Pyruvatlösung erst ca. 30 s vor der Messung
zugegeben wurde. Die Lösungen wurden daraufhin für 30 s mit der Pipette gut durchmischt
und anschließend ins Photometer eingesetzt. Die Extinktionen wurden direkt nach dem
Einsetzen, sowie nach 15, 30, 45, 60, 75 und 90 s gemessen. Für die exakte Zeitmessung
wurde eine Handystoppuhr verwendet.
Die Lösungen mit den Pyruvatkonzentrationen 2 und 4 mM wurden je zweimal gemessen.
3.2 Bestimmung des pH-Optimums
Materialien:
Photometer, Küvetten, Pipetten, Pipettenspitzen, Handystoppuhr
Reagenzien:
KH2PO4/K2HPO4-Puffer mit folgenden pH-Werten: pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9; 30
mM Pyruvatlösung aus Versuch 1
Durchführung:
Es wurden nun Proben anhand des Schemas aus Versuch 1 hergestellt, jedoch jeweils 2
Proben mit Phosphatpuffern der verschiedenen pH-Werte für eine Doppelbestimmung.
Zu jeder dieser Proben wurde daraufhin 30 s vor jeder Messung 0,05 ml der 30 mM
Pyruvatlösung gegeben, gut mit der Pipette durchmischt und anschließend photometrisch die
Extinktion bei 340 nm bestimmt. Die Extinktion wurde je einmal direkt nach dem Einsetzen
in das Photometer und einmal nach 1 min gemessen.
12
Erstabgabe:
Enzymkinetik
4. Ergebnisse:
4.1 Versuch 1
Tabelle 2: Konzentrationsangaben
Pyruvatkonzentration S /
mM
100
50
40
30
20
10
8
6
5
4
3
2
tatsächliche Pyruvatkonzentration St /
mM
1,59
0,79
0,63
0,48
0,32
0,16
0,13
0,10
0,08
0,06
0,05
0,03
1/ St / 1/ mM
0,63
1,26
1,58
2,10
3,15
6,30
7,88
10,50
12,60
15,75
21,00
31,50
In Tab. 2 sind die Konzentrationsangaben aufgelistet, sowie die tatsächliche
Pyruvatkonzentration, die sich bei einem Verdünnungsfaktor von 63 ergab. In Tab. 3 die
Ergebnisse der Extinktionsmessung am Photometer. Der Wert für 60 s bei einer
Pyruvatkonzentration von 4 mM wurde wegen zu starker Abweichung in der weiteren
Auswertung nicht mehr berücksichtigt.
Tabelle 3: Ergebnisse der Extinktionsmessung
Pyruvatkonzentration/
mM
100
0s
15 s
30 s
45 s
60 s
75 s
90 s
0,940
0,854
0,791
0,721
0,660
0,602
0,551
50
0,791
0,700
0,624
0,540
0,455
0,380
0,313
40
0,927
0,837
0,747
0,647
0,557
0,441
0,384
30
0,875
0,773
0,700
0,601
0,541
0,412
0,323
20
0,904
0,800
0,701
0,581
0,483
0,391
0,309
10
0,860
0,757
0,670
0,575
0,489
0,411
0,349
8
0,877
0,780
0,705
0,652
0,580
0,516
0,473
6
0,860
0,740
0,700
0,676
0,650
0,627
0,611
5
0,937
0,847
0,797
0,766
0,757
0,800
0,811
4
0,912
0,833
0,781
0,778
0,904
0,871
0,867
3
0,954
0,913
0,878
0,863
0,851
0,843
0,840
2
1,016
1,000
0,988
0,984
0,977
0,972
0,971
13
Erstabgabe:
Enzymkinetik
Mit Formel (1) wurden die Werte für ∆c(NADH), also die Konzentrationsänderung von
NADH bestimmt, die in Tab. 4 zu den jeweiligen Messzeiten dargestellt sind.
= × × (1)
d = 1 cm
E: Extinktion; ε: substanzspezifischer Extinktionskoeffizient; c: Konzentration;
d= Küvettendicke
Nach Umformen von Formel (1) und mit einem Extinktionskoeffizienten
(NADH)=6220000 cm²/ mol bei 340 nm ergeben sich die folgenden Werte.
Tabelle 4: Werte für ∆c(NADH)/ mol
Pyruvatkonzentration/ mM 0 s
15 s
30 s
45 s
60 s
75 s
90 s
100 1,51125E-07 1,37299E-07 1,2717E-07 1,15916E-07 1,06109E-07 9,67846E-08 8,85852E-08
50
1,2717E-07 1,1254E-07 1,00322E-07 8,68167E-08 7,31511E-08 6,10932E-08 5,03215E-08
40 1,49035E-07 1,34566E-07 1,20096E-07 1,04019E-07 8,95498E-08 7,09003E-08 6,17363E-08
30 1,40675E-07 1,24277E-07 1,1254E-07 9,66238E-08 8,69775E-08 6,62379E-08 5,19293E-08
20 1,45338E-07 1,28617E-07 1,12701E-07 9,34084E-08 7,76527E-08 6,28617E-08 4,96785E-08
10 1,38264E-07 1,21704E-07 1,07717E-07 9,24437E-08 7,86174E-08 6,60772E-08 5,61093E-08
8 1,40997E-07 1,25402E-07 1,13344E-07 1,04823E-07 9,32476E-08 8,29582E-08 7,6045E-08
6 1,38264E-07 1,18971E-07 1,1254E-07 1,08682E-07 1,04502E-07 1,00804E-07 9,82315E-08
5 1,50643E-07 1,36174E-07 1,28135E-07 1,23151E-07 1,21704E-07 1,28617E-07 1,30386E-07
4 1,46624E-07 1,33923E-07 1,25563E-07 1,2508E-07 1,45338E-07 1,40032E-07 1,39389E-07
3 1,53376E-07 1,46785E-07 1,41158E-07 1,38746E-07 1,36817E-07 1,35531E-07 1,35048E-07
2 1,63344E-07 1,60772E-07 1,58842E-07 1,58199E-07 1,57074E-07 1,5627E-07 1,56109E-07
Bei einer verwendeten Muskelmasse von 343 mg ergeben sich pro Gramm Muskelmasse die
in Tab. 5 dargestellten Werte für die Konzentrationsänderung von NADH.
14
Erstabgabe:
Enzymkinetik
Tabelle 5: Werte für ∆c(NADH) pro Gramm Muskelmasse/ mol/ g
Pyruvatkonzentration/ mM
100
50
40
30
20
10
8
6
5
4
3
2
0
2,77577E-05
2,33578E-05
2,73738E-05
2,58383E-05
2,66947E-05
2,53954E-05
2,58974E-05
2,53954E-05
2,76691E-05
2,69309E-05
2,81711E-05
3,0002E-05
15
2,52182E-05
2,06706E-05
2,47162E-05
2,28263E-05
2,36236E-05
2,23538E-05
2,3033E-05
2,18518E-05
2,50115E-05
2,45981E-05
2,69604E-05
2,95295E-05
30
2,33578E-05
1,84264E-05
2,20585E-05
2,06706E-05
2,07002E-05
1,97848E-05
2,08183E-05
2,06706E-05
2,3535E-05
2,30625E-05
2,59269E-05
2,91751E-05
45
2,12908E-05
1,59459E-05
1,91056E-05
1,77472E-05
1,71566E-05
1,69795E-05
1,92532E-05
1,99619E-05
2,26196E-05
2,29739E-05
2,5484E-05
2,9057E-05
60
1,94895E-05
1,34359E-05
1,64479E-05
1,59755E-05
1,42627E-05
1,44399E-05
1,71271E-05
1,91942E-05
2,23538E-05
2,66947E-05
2,51296E-05
2,88503E-05
75
1,77768E-05
1,12212E-05
1,30225E-05
1,21662E-05
1,1546E-05
1,21366E-05
1,52372E-05
1,8515E-05
2,36236E-05
2,57202E-05
2,48934E-05
2,87027E-05
In den Abb. 9 - 11 sind die Zeit-Umsatz-Diagramme für die verschiedenen
Substratkonzentrationen aufgetragen. Die Gleichungen der Regressionsgeraden und der
Bestimmtheitsgrad R² sind jeweils zugeordnet.
c (NADH)/ mol//g*cm³)
0,00003
0,000025
y = -2E-07x + 3E-05
R² = 0,9997
0,00002
y = -2E-07x + 2E-05
R² = 0,9994
y = -2E-07x + 3E-05
R² = 0,9936
y = -1E-07x + 3E-05
R² = 0,9962
0,000015
0,00001
0,000005
100 mM
50 mM
40 mM
30 mM
0
0
20
40
Zeit t/ s
60
80
Abbildung 9: Zeit-Umsatzdiagramm(100 mM – 30 mM)
c (NADH)/ mol/ (g*cm³)
0,00003
0,000025
y = -2E-07x + 3E-05
R² = 0,9991
0,00002
y = -2E-07x + 3E-05
R² = 0,9991
y = -1E-07x + 3E-05
R² = 0,9893
y = -1E-07x + 2E-05
R² = 0,8644
0,000015
0,00001
0,000005
0
0
50
Zeit t/ s
20 mM
10 mM
8 mM
6 mM
100
Abbildung 10: Zeit-Umsatzdiagramm(20 mM – 6 mM)
15
90
1,62708E-05
9,24273E-06
1,13393E-05
9,53803E-06
9,12461E-06
1,03058E-05
1,39675E-05
1,80425E-05
2,39484E-05
2,56021E-05
2,48048E-05
2,86731E-05
Erstabgabe:
Enzymkinetik
0,000035
y = -9E-08x + 3E-05
R² = 0,8909
y = -9E-08x + 3E-05
R² = 0,8753
y = -5E-08x + 3E-05
R² = 0,9359
c (NADH)/ mol/(g*cm³)
0,00003
0,000025
0,00002
0,000015
y = -2E-08x + 3E-05
R² = 0,94
0,00001
5 mM
4 mM
3 mM
2 mM
0,000005
0
0
20
40
60
80
Zeit t/ s
Abbildung 11: Zeit-Umsatzdiagramm(5 mM –2mM)
Der Betrag beschreibt hier nun die Zunahme von Lactat. In dem dieser mit 60 multipliziert
wird, erhält man vLactatbildung, die Reaktionsgeschwindigkeit der Lactatbildung. Die Werte sind
in Tab. 6 dargestellt. Außerdem aufgetragen ist 1/ vLactatbildung. Diese Werte werden für das
Lineweaver-Burk-Diagramm benötigt.
Tabelle 6: Auswertungsergebnisse der Zeit-Umsatz-Diagramme
Pyruvatkonzentration/
mM
Betrag der
vLactatbildung/
1/ vLactatbildung/
Geradensteigung/ mol/
cm³*g*min/ mol
mol/ (cm³*g*s)
(cm³*g*min)
100
2,00E-07
1,20E-05
8,33E+04
50
2,00E-07
1,20E-05
8,33E+04
40
2,00E-07
1,20E-05
8,33E+04
30
1,00E-07
6,00E-06
1,67E+05
20
2,00E-07
1,20E-05
8,33E+04
10
2,00E-07
1,20E-05
8,33E+04
8
1,00E-07
6,00E-06
1,67E+05
6
1,00E-07
6,00E-06
1,67E+05
5
9,00E-08
5,40E-06
1,85E+05
4
9,00E-08
5,40E-06
1,85E+05
3
5,00E-08
3,00E-06
3,33E+05
2
2,00E-08
1,20E-06
8,33E+05
16
Erstabgabe:
Enzymkinetik
v(Lactatbildung)/ mol/(cm³*g*min)
In dem nun vLactatbildung gegen die tatsächliche Substratkonzentration aufgetragen wird, erhält
man den näherungsweisen Verlauf einer Michaelis-Menten-Kinetik. Man erkennt eine
Maximalgeschwindigkeit vmax=1,2E-05 mol/ (cm³*g*min). Die Michaeliskonstante KM
beträgt etwa 0,125 mM. Die graphische Darstellung ist in Abb. 12 zu sehen. In Abb. 13
wurden die Ergebnisse doppeltreziprok aufgetragen. Die Regressionsgerade samt
Geradengleichung und Bestimmungsgrad sind dargestellt. Dieses Lineweaver-BurkDiagramm ist jedoch nicht von Nutzen, da die Regressionsgerade die y-Achse im Negativen
schneidet und die x-Achse im Positiven. Es lassen sich aus diesem Diagramm keine
Erkenntnisse gewinnen.
1,400E-05
1,200E-05
1,000E-05
8,000E-06
6,000E-06
4,000E-06
2,000E-06
0,000E+00
,000
,500
1,000
1,500
2,000
Substratkonzentration St/ mM
Abbildung 12:Darstellung der Kinetik
17
Erstabgabe:
Enzymkinetik
1/ v(Lactatbildung)/ (cm³*g*min)/ mol
1,000E+06
8,000E+05
y = 21221x - 11441
R² = 0,8378
6,000E+05
4,000E+05
2,000E+05
0,000E+00
-5,000
5,000
-2,000E+05
15,000
25,000
35,000
1/ (Substratkonzentration St)/ 1/ mM
Abbildung 13: Lineweaver-Burk-Diagramm
4.2 Versuch 2:
Die Änderungen der Extinktionen pro Minute sind in Tab. 7 dargestellt. Die Mittelwerte sind
mitangegeben, außerdem die Standardabweichungen. Eine graphische Darstellung der
Ergebnisse findet sich in dem Säulendiagramm, zu sehen in Abb. 14.
Tabelle 7: Ergebnisse der Extinktionsmessungen
pH-Wert
4
5
6
7
8
9
∆E/ min
0,490
0,474
0,426
0,394
0,416
0,281
0,433
0,462
0,418
0,455
0,372
0,314
Standardabweichung
σ
0,040
0,008
0,006
0,043
0,031
0,023
∆Emittel/ min
0,462
0,468
0,424
0,425
0,394
0,298
18
Enzymkinetik
ΔE/ min
Erstabgabe:
0,500
0,450
0,400
0,350
0,300
0,250
0,200
0,150
0,100
0,050
0,000
4
5
6
7
8
9
pH-Wert
Abbildung 14: Graphische Darstellung der Extinktionsmessung
In Abb. 14 ist kein Ansatz einer Glockenkurve zu erkennen. Am stärksten änderte sich die
Extinktion pro Minute bei einem pH-Wert von 5. Im alkalischen ist eine deutlich erkennbare
Abnahme der Extinktion pro Minute aufgetreten.
19
Erstabgabe:
Enzymkinetik
5. Diskussion
5.1 Versuch 1:
Die in Abb. 12 dargestellte Kinetik zeigt den Verlauf einer Michaelis-Menten-Kinetik. Es
muss jedoch berücksichtigt werden, dass ein Wert wegen zu großer Abweichung von den
anderen Werten nicht mehr berücksichtigt wurde. Außerdem waren aus dem LineweaverBurk-Diagramm keine Werte zu entnehmen, da hier keine sinnvolle Auftragung möglich war.
Fehler könnten sich hier bei dem Herstellen der Lösungen ergeben haben. Außerdem ist ein
einwandfreies Funktionieren des Photometers nicht immer gewährleistet.
Um eindeutig aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten, hätten mehrere Bestimmungen
vorgenommen werden müssen. Die in dem Versuch vorgenommene Einzelbestimmung ist
somit nur bedingt aussagekräftig. Die diversen Ungenauigkeiten, welche durch Konstruktion
und Bedienung der Messinstrumente bestimmt sind, schlagen bei diesen einzelnen Werten zu
stark ins Gewicht. Außerdem können die Fehler von Werte zu Wert stark schwanken. Dies
erklärt auch, warum nicht alle gemessenen Werte den Erwartungen entsprechen.
5.2 Versuch 2:
Die Ergebnisse entsprachen hier nicht den Erwartungen. Es wurde ein Optimum der LactatDehydrogenase im neutralen Bereich bei pH 7 erwartet. In dem Histogramm, dargestellt in
Abb. 14 ist jedoch nur eine deutliche Abnahme im alkalischen Bereich ab pH 9 zu erkennen.
Im sauren Bereich ist jedoch entgegen den Erwartungen sogar das Maximum der
Enzymaktivität im sauren bei pH 5 aufgetreten. Dort war eine Abnahme der Extinktion pro
Minute von 0,468 gemessen worden.
Fehler könnten sich hier wieder am Photometer ergeben haben. Außerdem können nicht
korrekt eingestellte Puffer das Problem gewesen sein. Durchaus in Betracht zu ziehen ist, dass
die Lösungen vertauscht wurden und somit falsch zugeordnet wurden. Da die Werte im
sauren Bereich aber alle deutlich höher als die Erwarteten sind und auch nahe beieinander
liegen, würden die Auswirkungen begrenzt sein und nicht zu den Erwarteten Ergebnissen
führen.
Die berechneten Standardabweichungen, welche aus Tab. 6 zu entnehmen sind, sind nicht
besonders groß, die Werte liegen also nahe beieinander, was ein defektes Photometer als
Fehlerquelle somit ausschließt. Maßgebliche Fehlerquelle liegt somit in der Durchführung,
die für Anfänger nicht immer fehlerfrei zu bewältigen ist, und in den bereitgestellten
Lösungen. Für aussagekräftigere Ergebnisse hätten mehr Bestimmungen vorgenommen
werden müssen, darüber hinaus hätte man die Lösungen neu ansetzen können. Dies wurde aus
organisatorischen und zeitlichen Gründen jedoch nicht getan.
20
Erstabgabe:
Enzymkinetik
6. Quellen
− http://www1.tudarmstadt.de/fb/ch/Fachgebiete/OC/AKSchmidt/Avimec/UE/Hemmung.html#Irrevers
ibel
− http://de.wikipedia.org/wiki/Cori-Zyklus
− Skript der Vorlesung: Biochemie II
21