Gesteigerte NLRP3-InfIammasom-abhängige Interleukin

Aus dem Department Innere Medizin
Klinik für Pneumologie
(Leiter: Universitätsprofessor Dr. J. Müller-Quernheim)
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Gesteigerte NLRP3-InfIammasom-abhängige Interleukin-lß Produktion
in peripheren Blutmonozyten von Sarkoidosepatienten
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2014
von Roman Johannes Smonig
geboren in Graz
http://d-nb.info/1065827415
III
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
V
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
VHI
TABELLENVERZEICHNIS
VHI
ABKÜRZUNGEN
IX
1 EINLEITUNG
1
1.1 Sarkoidose: Grundlagen
1
1.1.1 Definition, Epidemiologie, Klinik
1.1.2 Ätiologie
1.2 Sarkoidose: Immunpathogenese
1.2.1 Angeborene und adaptive Immunantwort
1.2.2 Pattern-Recognition Rezeptoren
1.2.3 Toll-like Rezeptoren (TLR)
1.2.3.1 TLR2
1.2.3.2 TLR4
1.2.3.3 TLR9
1.2.4 NOD-like Rezeptoren (NLR)
1.2.5 Granulomformation
1.2.6 Allgemeines zu Monozyten
1.2.7 Propionibacterium acnes
1.2.8 Serum Amyloid A
1.3 Interleukin-lß und Inflammasom
1.3.1 Die Interleukin-1 Familie
1.3.2 IL-lß: intrazelluläre Prozessierung
1.3.3 Inflammasom
1.3.4 Inflammasom-Aktivierung in Monozyten versus Makrophagen
1.3.5 IL-lß und autoinflammatorische Erkrankungen
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1.4 microRNA
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1.4.1 Allgemeines
1.4.2 microRNAs und die Immunantwort
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1.5 Zielsetzung und Fragestellung
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2 MATERIAL UND METHODEN
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2.1 Materialien
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2.1.1 Geräte
2.1.2 Software
2.1.3 Verbrauchsmaterialien
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21
21
IV
2.1.4 Kits und Mastermix
2.1.5 Kulturmedien und Chemikalien
2.1.6 Stimulanzien
2.1.7 Antikörper
2.1.8 Oligonukleotide und Primer
2.1.9 Puffer und Lösungen für IL-lß ELISA
2.2 Methoden
2.2.1 Auswahl der Patienten und gesunden Kontrollpersonen
2.2.2 Gewinnung von peripheren Blutzellen
2.2.3 Zellisolation
2.2.3.1 Isolation mononukleärer Zellen aus peripherem Blut (PBMCs)
2.2.3.2 Isolation von Monozyten aus PBMCs
2.2.4 Zellzählung mittels Türk'scher Lösung
2.2.5 Stimulation der Zellen in Kultur und Gewinnung von Überständen
2.2.5.1 Stimulation der Monozyten in Kultur
2.2.5.2 Gewinnung von Überständen fiir ELISA und Zellen zur RNA-Isolation
2.2.6 RNA-Isolation
2.2.6.1 RNA-Isolation mit dem RNeasy MiniKit
2.2.6.2 Isolation der microRNA mit dem mirVana™Kit
2.2.6.3 Messung der RNA-Konzentration mittels Photometrie
2.2.7 Enzym-linked-immunosorbant-assay (ELISA)
2.2.7.1 Hintergrund.
2.2.7.2 Zytokin-ELISA-VerSuchsanleitung
2.2.7.3 Caspase-1 undSAA-ELISA-Versuchsanleitung
2.2.8 Polymerase Chain Reaction (PCR)
2.2.8.1 Hintergrund.
2.2.8.2 NLRP3-PCR-Versuchsanleitung
2.2.8.3 miRNA223-PCR-Versuchsanleitung
2.2.9 Statistik
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3 RESULTATE
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3.1 Interleukin-lß Produktion in peripheren Blutmonozyten von
Sarkoidosepatienten versus Normalpersonen
37
3.1.1 Einleitung
37
3.1.2 Stimulation für 24 Stunden
37
3.1.2.1 Studienpopulation
37
3.1.2.2 IL-lß Produktion nach Stimulation mit LPS, P.a. Lysat und Pam3Csk
38
3.1.3 Stimulation für 4 Stunden
39
3.1.3.1 Studienpopulation
39
3.1.3.2 IL-lß Produktion nach Stimulation mit LPS, P.a.-Lysat, Pam3Csk
und SAA
39
3.1.3.3 Korrelation der IL-lß Konzentration in den Überständen mit den
Sarkoidose-Aktivitätsparametern ACE, sIL-2R undNeopterin im Serum ....41
3.2.3.4 Korrelation der IL-lß Konzentration in den Überständen mit der
Lungenfunktion
42
V
3.2 Serum Amyloid A bei Sarkoidosepatienten versus Normalpersonen
3.2.1 Studienpopulation
3.2.2 Erhöhte SAA-Konzentrationen in Serumproben von Sarkoidosepatienten
3.3 NLRP3-Inflammasom Expression in peripheren Blutmonozyten von
Sarkoidosepatienten versus Normalpersonen
3.3.1 Studienpopulation
3.3.2 Ergebnisse NLRP3-PCR
3.4 Caspase-l-Aktivität in Zellkulturüberständen peripherer Blutmonozyten von
Sarkoidosepatienten versus Normalpersonen
3.4.1 Studienpopulation
3.4.2 Ergebnisse Caspase-1-ELISA
3.5 miR-223-Expression in peripheren Blutmonozyten von Sarkoidosepatienten
versus Normalpersonen
3.5.1 Studienpopulation
3.5.2 Ergebnisse miR-223-PCR
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4 DISKUSSION
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4.1 Gesteigerte IL-lß Produktion peripherer Blutmonozyten von
Sarkoidosepatienten nach Stimulation mit verschiedenen TLR-Liganden
50
4.2 Mögliche Gründe für die überschießende IL-lß Produktion
51
4.2.1 Gesteigerte NLRP3-Inflammasom-Aktivierbarkeit
4.2.2 Gesteigerte Aktivität der inflammatorischen Caspase-1
4.2.3 Genetische Einflüsse und microRNA-Dysregulation
4.2.4 Expansion der CD14+CD16+ Monozyten
4.2.5 Mögliche Therapieansätze
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55
55
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4.3 Sierum Amyloid A und Sarkoidose
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4.4 Ausblick
61
5 ZUSAMMENFASSUNG
62
6 LITERATURVERZEICHNIS
63
7 DANKSAGUNGEN
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