Angiogenese
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Therapeutische Strategien zur Behandlung maligner Erkrankungen Tumorentstehung: Verschiedene Kontrollinstanzen müssen überwunden werden Die Proliferation normaler Zellen wird durch 6 verschiedene Kategorien von Kontrollmechanismen reguliert. Für die Bildung eines metastasierenden Tumors müssen diese inaktiviert werden, d.h. in Tumorzellen müssen sich multiple Mutationen ereignet haben. Unabhängigkeit von Wachstumsfaktoren Blockierung von Apoptose Induktion von Neo-Angiogenese (aus: Hanahan and Weinberg, Cell 100:57, Figure 1) Überwindung der Wachstumsinhibition Invasion & Metastasierung Uneingeschränkte Replikation Tumorentstehung: Verschiedene Kontrollinstanzen müssen überwunden werden Erworbene Eigenschaft Beispiel Unabhängigkeit von Wachstumsfaktoren Aktivierung von Onkogenen: H-Ras Überwindung der Wachstumsinhibition Verlust des Tumorsuppressors RB Blockierung von Apoptose Überexpression von Bcl-2 Uneingeschränkte Replikation Aktivierung der Telomerase Induktion von Neo-Angiogenese Produktion von VEGF-Induktoren Gewebeinvasion & Metastasierung Inaktivierung von E-Cadherin Therapeutische Ansätze zur gezielten Tumorbehandlung • Eingriff in gestörte Signalwege – Angiogenese – Wachstumskontrolle – Apoptoseinduktion – Zellzykluskontrolle – Invasion, Metastasierung • Therapieansätze – Signaltransduktionsinhibitoren („small molecules“) – siRNA, Antisense-Oligonukleotide – Antikörper, Peptide (Liganden, Rezeptoren) Vaskulogenese / Angiogenese Vaskulogenese: Gefäßneubildung während der Embryonalentwicklung aus Hämangioblasten Angiogenese: Gefäßneubildung aus bestehenden Gefäßen (Gefäßsprossung) Angiogenese Aufbau der Gefäße und Kapillaren Arterie Bindegewebe Elastische Fasern glatte Monozelluläre Schicht endothelialer Zellen Muskulatur Kapillare Basalmembran Zelluläre Prozesse der Angiogenese 1. Proteolyse der Basalmembran 2. Proliferation und Migration in Richtung eines angiogenen Stimulus 3. Lumenbildung/Fusion mit anderen Gefäßen 4. Gefäßreifung Physiologische Angiogenese Beispiele für physiologische Angiogenese: Vaskulo- und Angiogenese in der Embryonalentwicklung Menstruationszyklus, Schwangerschaft Regeneration/Wundheilung Angiogenese-assoziierte Krankheiten zu viel: Chronische Entzündungen (z.B. Rheumatoide Arthritis) Psoriasis („Schuppenflechte“) Diabetische Retinopathie Tumore zu wenig: Ischämie Schlaganfall Wundheilungsstörungen Ohne Angiogenese ist das Tumorwachstum eingeschränkt 100-200 um Ohne Neubildung von Gefäßen ist das Wachstum von Tumoren durch die O2-Diffusion limitiert auf einen Durchmesser von etwa 200 µm (etwa 10 Zell-Lagen). Ohne Angiogenese ist das Tumorwachstum eingeschränkt Vergrößerung der Tumormasse um neugebildete Gefäße. Ohne Angiogenese ist das Tumorwachstum eingeschränkt Tumor eingesetzt in die vordere Augenkammer Cornea Tumorgröße Tumor auf der Iris wachsend Tumor auf der Iris wachsend Tumor eingesetzt in die vordere Augenkammer Iris Linse Tage Angiogenese erleichtert Metastasierung Invasion Angiogenese Intravasation Primärtumor Basalmembran Mikro-Metastasen Extravasation Adhäsion an Blutgefäßwand in distalen Organen Metastasierung Migration Metastasierung korreliert eng mit der Vaskularisation des Tumors. Enger Zusammenhang zwischen Vaskularisierung und Malignität! Angiogenese als Angriffsziel in der Tumortherapie? Problematik konventioneller Tumortherapien: zielen nicht spezifisch auf Tumorzellen, sondern allgemein auf stark proliferierende Zellen (Nebenwirkungen) Tumorzellen sind genetisch instabil, können durch Mutation Resistenzen gegen die Therapie entwickeln (Selektion aggressiverer Tumore) Vorteile einer anti-angiogenen Therapie: zielt auf Tumorgewebe mit nur geringen Nebenwirkungen für normale Gewebe wird kontrolliert durch extrazelluläre Signalmoleküle und Rezeptoren auf der Zelloberfläche (gute Interventionsmöglichkeiten) Wie wird Tumor-Angiogenese induziert? Kammer mit permeabler Membran Tumorzellen Wie kommunizieren Tumorzellen mit Endothelzellen? Signalmoleküle Kammer wird unter der Haut eingesetzt Tumorzellen geben lösliche Stoffe (Signalmoleküle) in das umgebende Gewebe ab, die Gefäßwachstum anregen. “TAF”s: Tumor-Angiogenese-Faktoren Angiogenese (“Transfilter-diffusion studies; Greenblatt & Shubik, 1968; Ehrmann & Knoth, 1968) 1971: Judah Folkmann Antiangiogenese als Strategie zur Behandlung von Tumoren Wie wird Tumor-Angiogenese induziert? Angiogenese wird streng kontrolliert durch die Balance von pro- und anti-angiogenen Faktoren. In normalen Geweben überwiegen anti-angiogenetische Faktoren bis neue Gefäße benötigt werden (Wundheilung etc.). Wie wird Tumor-Angiogenese induziert? kleiner, lokalisierter Tumor „angiogener Schalter “ erhöhte Konzentration proangiogener Substanzen Pro-angiogene Signalmoleküle induziert Angiogenese „Angiogenic Switch“ gegenüber antiangiogenen Substanzen verschiebt das Gleichgewicht in Richtung Angiogenese wachsender, potentiell metastasierender Tumor Wie wird Tumor-Angiogenese induziert? Tumoren setzen angiogene Signalmoleküle aus der Klasse der Wachstumsfaktoren frei: •bFGF (basic fibroblast growth factor = FGF-2, endothelial mitogen) •VEGF (Vascular Endothelial Growth factor) Ergo: Tumorzellen stimulieren die Entwicklung ihres eigenen Versorgungssystems! Angiogenese und Tumorentwicklung Tumor Endothelzelle VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) = VPF (Vascular Permeability Factor) die Synthese wird durch Hypoxie induziert (über den Transkriptionsfaktor HIF-1: „hypoxia-inducible transcription factor“) aktiv als sezerniertes, glykosyliertes, homodimeres Protein wirkt mitogen und chemotaktisch auf Endothelzellen stimuliert die Expression u.a. von Metalloproteasen und Plasminogen Aktivatoren wirkt anti-apoptotisch auf Endothelzellen VEGF-A = „VEGF“ 5 Gene (VEGF-A, -B, -C, -D and PlGF) VEGF-A der wesentliche angiogene Faktor VEGF-C, -D regulieren lymphatische Angiogenese verschiedene Spleißvarianten gesteigerte Expression von VEGF korreliert mit höherer Invasivität und Metastasierung von Tumoren, sowie einer schlechteren Prognose VEGF-Rezeptoren VEGF bindet die RTKs VEGF-R1 und -R2 (und Neutropiline) VEGF-R2 (auch Flk-1 oder KDR): der wesentliche Mediator der mitogenen und angiogenen Effekte von VEGF VEGF-R1 (auch Flt-1): eventuell decoy-Funktion; wichtige Rolle in der Hämotopoese; Regulation der Expression von Matrixmetalloproteasen und Wachstumsfaktoren Neuropiline (NRP-1, NRP-2): binden VEGF und verstärken die Interaktion von VEGF/VEGF-R2 (VEGF-R3 (auch Flt-4): bindet VEGF-C und -D, hauptsächlich in lymphatischen Geweben exprimiert) VEGF und VEGF-Rezeptoren löslicher VEGF-R1 Neuropilin VEGF-R1 VEGF-R2 VEGF-R3 Angiogenese Lymphangiogenese Unterschiede zwischen normaler und Tumor-assoziierter Vaskulatur Tumor Normal Normale Vaskulatur ist sehr geordnet, unverzweigt, fast parallel angeordnet. Tumorvaskulatur ist ungeordnet, unregelmäßig, “geknäult”, und von unterschiedlicher Größe. Unterschiede zwischen normaler und Tumor-assoziierter Vaskulatur Tumor Normal Normale Vaskulatur ist sehr geordnet, unverzweigt, fast parallel angeordnet. Tumorvaskulatur ist ungeordnet, unregelmäßig, “geknäult”, und von unterschiedlicher Größe. Sauerstoffmangel ist das primäre Signal, das die Synthese des Wachstumsfaktors VEGF induziert HIF-1: Hypoxia Inducible Factor - 1 HIF-1 ist ein Transkriptionsfaktor, der bei Hypoxie spezifisch Gene einschaltet, die für das Überleben unter diesen Bedingungen notwendig sind. HIF-1 ist ein Heterodimer, bestehend aus HIF-1α und HIF-1β. HIF-1α ist konstitutiv exprimiert. Bei hohem O2-Angebot: HIF-1α wird durch Prolyl-Hydroxylase hydroxyliert (O2abhängig). Dies bedingt die Bindung des von Hippel-Landau Tumorsuppressors (VHL), einer Ubiquitin-E3-Ligase. VHL-Bindung führt zur Ubiquitinierung und zum Abbau von HIF-1α. HIF-1: Hypoxia Inducible Factor - 1 Angiogenese Glukose/EnergieMetabolismus Proliferation/ Überleben Antiangiogene Therapiestrategien Inhibierung endogener proangiogener Faktoren (VEGF, bFGF) Inhibierung der Aktivierung und Differenzierung von Endothelzellen Inhibierung der Proliferation und Migration von Endothelzellen Inhibierung von Enzymen, die die Extrazelluläre Matrix abbauen (Matrixmetalloproteinasen) Induktion von Endothelzell-Apoptose ~ 100 Biotech- und große Pharmaunternehmen involviert in Antiangiogenese-Forschung mehr als 30 verschiedene Strategien werden bereits in klinischen Studien erprobt Antiangiogene Therapiestrategien Angiostatin: Wird durch Proteolyse aus Plasminogen generiert Induziert Apoptosis von Endothelzellen Endostatin: Wird durch Proteolyse aus Kollagen XVIII generiert Induziert die Expression antiangiogener Faktoren (thrombospondin1 etc.), reduziert die Expression proangiogener Faktoren (HIF-1α etc.) Angiogenese-Inhibitoren: Primärtumore Endostatin Injektion in Mäuse mit multiplen Tumoren: Größe der Primärtumore wird geringer, das Wachstum stoppt. Bei Unterbrechung der Behandlung erneutes Tumorwachstum. Tumore entwickeln keine Resistenz. EndostatinBehandlung Angiogenese-Inhibitoren: Metastasierung Injektion von Tumorzellen in Mäuse Bildung eines Primärtumors Entfernung des Primärtumors Angiostatin-Injektion: Angiostatin verringert das Auftreten und das Ausmaß der Metastasierung. Auf VEGF gezielte, antiangiogene Strategien KinaseInhibitoren Hypoxie Tumorzelle Anti-VEGFAntikörper Anti-RezeptorAntikörper Endothelzelle VEGF-A VEGF-R Tumorwachstum AntisenseOligonukleotide Lösliche Rezeptoren PeptidAntagonisten Angiogenese Auf VEGF gezielte, antiangiogene Strategien Auf VEGF gezielte, antiangiogene Strategien Präklinische Studien physikalische, chemische und pharmakologische Eigenschaften Phase 1 Verträglichkeit, Nebenwirkungen, Applikationsform Phase 2 Wirksamkeit Sicherheit Phase 3 größere Patientenkollektive Klinische Anwendung Auf VEGF gezielte, antiangiogene Strategien „Avastin“ - Bevacizumab (Genentech) humanisierter, monoklonaler anti-VEGF-Antikörper blockiert die Bindung von VEGF an seinen Rezeptor reduziert die Neubildung Tumor-assoziierter Gefäße, sowie die Metastasierung gut verträglich, keine Dosis-limitierende Toxizität in Kombination mit Chemotherapie verbessertes Ansprechen, verlängerte Zeit bis zum Fortschreiten der Krankheit, sowie verbesserte Gesamtüberlebensrate bei metastasierenden Karzinomen des Darms. Phase 3 für Brust-, Prostata-, Darm-, Nierenzell- und Lungentumore Auf VEGF gezielte, antiangiogene Strategien Auf VEGF gezielte, antiangiogene Strategien Tumorentstehung: Verschiedene Kontrollinstanzen müssen überwunden werden Unabhängigkeit von Wachstumsfaktoren Blockierung von Apoptose Induktion von Neo-Angiogenese (aus: Hanahan and Weinberg, Cell 100:57, Figure 1) Überwindung der Wachstumsinhibition Invasion & Metastasierung Uneingeschränkte Replikation Wachstumsfaktor-vermittelte Effekte ( z.B. EGF, PDGF, IGF, NGF) Wachstums faktor Wachstumsfaktorrezeptor R R K K Extrazellulärraum Zellmembran Zytoplasma Aktivierung Zellüberleben Tumorwachstum Angiogenese Metastasierung R= Rezeptor K= Rezeptortyrosinkinase Deregulation der wachstumsfaktorvermittelten Signaltransduktion (I) Mehr Wachstumsfaktor Wachstumsfaktorrezeptor R R K K Extrazellulärraum Zellmembran Zytoplasma Aktivierung R= Rezeptor K= Rezeptortyrosinkinase Bildung von Wachstumsfaktoren durch die Tumorzellen selbst (autokrines Wachstum) Deregulation der wachstumsfaktorvermittelten Signaltransduktion (II) Wachstums faktor Wachstumsfaktorrezeptor R R R R K K K K Extrazellulärraum Zellmembran Zytoplasma Aktivierung R= Rezeptor K= Rezeptortyrosinkinase Überexpression des Rezeptors Deregulation der wachstumsfaktorvermittelten Signaltransduktion (III) Wachstumsfaktorrezeptor R R K K Extrazellulärraum Zellmembran Zytoplasma Aktivierung R= Rezeptor K= Rezeptortyrosinkinase Expression eines konstitutiv aktiven Rezeptors Erb-B2/HER2/Neu • gehört zur Familie der Epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptoren (c-erbB-2) • Ko-Rezeptor: bindet selbst nicht an EGF-ähnliche Liganden, ist jedoch präferentieller Heterodimerisierungspartner der anderen Liganden-bindenden Erb-B-Rezeptoren • stärkerer Induktor mitogener Signalwege als andere Erb-B-Rezeptoren (stärkere Wachstumsfaktor-Bindung, mehr downstream Interaktionen, stärkeres Recycling) • Signaltransduktion über ras, MAPK, AKT • Onkogen: Gen-Amplifikation und Protein-Überexpression tritt bei ca. 30% der Frauen mit Mammakarzinom auf - ist assoziiert mit schlechter Prognose HER2-Genamplifikation und Überexpression Tumor Normal Möglichkeiten der Hemmung Hemmung der Ligandenbindung Hemmung der Rezeptortyrosinkinase Hemmung nachgeschalteter Signalwege Strategien zur Inhibition der ErbB-Rezeptoraktivität Anti-RezeptorAntikörper “Small molecule” TK-Inhibitor “Bispezifische Antikörper Konjugate Antikörper + Toxin Rekrutierung immunologischer Effektoren Signalinhibition Inhibition der TK-Aktivität Lyse / Apoptose Ak-mediierte Internalisierung zytotoxischer Substanzen Antisense Oligonukleotide gegen Ligand/Rezeptor Trastuzumab / Herceptin = Therapeutischer, humanisierter, monoklonaler Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne der RT-Kinase HER2/neu (humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor) Blockierung der HER2-Wachstumssignalkaskade. Extrazelluläre Bindung führt zur Internalisierung des Rezeptors, Inhibition der Zellzyklusprogression über p27kip1/CDK2, Proliferation wird gestoppt, Zellen arretieren in der G1-Zellzyklusphase, sterben apoptotisch 1998 in den USA (EG: 2000) zur Behandlung von Patientinnen mit HER2überexprimierendem Mammakarzinom zugelassen Nebenwirkungen: In 10% der Fälle treten Schädigungen des Herzmuskels auf. AKT Phosphorylierung bei Mammakarzinomen HER2/Neu AKT1 AKT2 Phospho-AKT Überexpression von HER2/neu ist assoziert mit AKT-Phosphorylierung D. Altomare, J. Testa Herceptin: Wirkungsmechanismus Herceptin HER2/neu x ↓pAKT ZellÜberleben ZellTeilung Zell-Invasion und -Migration Herceptin-Exposition inhibiert AKTPhosphorylierung und Dimerisierung von HER2/neu und HER3 Lane 1 – Kontrolle Lane 2 – Heregulin Lane 3 – Herceptin Relative Expression 153 209 ECD 69 ↓Signal ICD HER3 HER2/neu D. Altomare, J. Testa Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität Tumorzelle NK Perforin Lyse Antikörper Effektorzelle Phagozytose Die Effektivität von Herceptin und anderen Antikörpern ist verringert in der Abwesenheit der Interaktion von Antikörper-Fc-Domänen mit zellulären Fc-Rezeptoren Clynes, Presta, Ravetch Hemmung der intrazellulären Tyrosinkinase Bcr-Abl Chronisch Myeloische Leukämie (CML) Extrazellulär Zellmembran Kinaseinhibitor Imatinib (Glivec ®) Zytoplasma K Tumorzelle Intrazelluläre Kinase (Bcr-Abl) Tumorwachstum Angiogenese Das Philadelphia-Chromosom: Translokation t(9;22)(q34;q11) De Klein et al. Nature 300, 765 (1982), Groffen et al. Cell 36, 93 (1984) ABL - BCR/ABL Normal Leukämie BCR BCR/ABL Nukleus konstitutiv aktive Kinase ABL geringe Kinase-Aktivität ABL/BCR Funktion ? Zytoplasma BCR-ABL-Fusionsprotein: cytoplasmatische, konstitutiv aktive Kinase verringerte Adhäsion, verstärkte Mobilität Überleben, Proliferation, Differenzierung CML CML entsteht aus einer Stammzelle, die ein Granulozyten-Vorläufer ist (Molecular Cell Biology Lodish et al. Fig. 24.1) Leukämie ist charakterisiert durch Hyperproliferation unreifer weißer Blutzellen normal leukämisch Erythrozyten Weiße Blutzelle Hyperproliferation weißer Blutzellen Klinischer Verlauf: Phasen der CML Advanced phases Chronic phase Median 5–6 years stabilization Accelerated phase Blast crisis Median duration 6–9 months Median survival 3–6 months Provided by: Gleevec.com Chronisch myeloische Leukämie (CML) • Krebserkrankung des Blutes und des Knochenmarks • Proliferierungssignale in hämotopoetischen Stammzellen im “active state” eingefroren - zu viele Granulozyten • Kann jahrelang unauffällig bleiben, ein Teil tritt jedoch in die akzelerierte Phase und Blastenkrise ein (Risiko der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) mit hoher Lethalität) • Diagnose: Blutbild (erhöhte Granulozytenzahl), Philadelphia-Chromosom-Nachweis (ca. 90% der Fälle) Chronisch Myeloische Leukämie (CML) Jährliche Inzidenz: 1/100,000 (~15% aller Leukämien) Alters-Median: 30-60 Jahre Therapie-Optionen/Medianes Überleben: 4 Jahre mit konventioneller Chemotherapie (Hydroxyharnstoff, Busulphan) 6 Jahre mit auf IFNα-basierender Therapie Hoch-Dosis-Chemotherapie/allogene Knochenmarkstransplantation kann zur Heilung der CML führen Entwicklung von Tyrosinkinaseinhibitoren Unattraktiv: Inhibierung der Interaktion von TK und Ligand/Substrat durch niedermolekulare Inhibitoren Besser: Modulation der Kinase-Aktivität Mittel: ATP-kompetitive Inhibitoren Problematik: ~800 Serin/Threonin- und Tyrosinkinasen! Alle binden ATP in hoch konservierter Weise. Spezifischer Inhibitor für eine Kinase? Entwicklung von Tyrosinkinaseinhibitoren Triphosphatgruppe des ATPs wird gebunden durch mehrere konservierte, basische Aminosäurereste. Bilden zusammen mit Aspartatrest das katalytische Zentrum. Problem: Hoch-polare Moleküle wären erforderlich, um die Triphosphat/katalytische Site zu besetzen. schlechte orale Absorption, schlechte Zellpermeabilität, schlechte Pharmakokinetik Adenosin wird außer durch zwei H-Brücken über lipophile/van der Waals-Wechselwirkungen in einer geringer konservierten Umgebung gebunden fast alle ATP-kompetitiven KinaseInhibitoren zielen auf das Adenosin-Erkennungsmotif c-Abl-Kinasedomäne im Komplex mit Gleevec STI-571/Imatinib-Mesylate/Gleevec/Glivec In den 90er Jahren von Novartis Pharmaceuticals in High-Throughput Screens für Tyrosinkinase-Inhibitoren identifiziert Biochemical Screening: Enzymassays (radioaktiv, colorimetrisch oder fluoreszent) mit aufgereinigter Kinase und Substrat Gleevec: ein spezifischer BCR-ABL-Kinase-Inhibitor Cancer Res. 1996 Jan 1;56(1):100-4. Inhibition of the Abl protein-tyrosine kinase in vitro and in vivo by a 2-phenylaminopyrimidine derivative.Buchdunger E, Zimmermann J, Mett H, Meyer T, Muller M, Druker BJ, Lydon NB. Ciba Pharmaceuticals Division, Oncology Research Department, Ciba-Geigy Limited, Basel, Switzerland. Gleevec Gleevec™: in chronic phase CML Chronic Phase CML 1.0 Major cytogenetic response 0.9 0.8 Complete cytogenetic response 0.7 Fraction of patients that responded 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Months Since Start of Treatment 10 Data: Novartis Pharmaceuticals Corporation Aber: Resistenz-Entwicklung Entwicklung von Resistenzen gegen Gleevec unter Therapie - Überexpression von BCR-ABL - Mutation von BCR-ABL (Gleevec Bindung gestört) RTK-Inhibitoren in der Entwicklung
