Versuch 6 - Leitenzyme

Versuch 6
„Leitenzyme“
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Semester:
Betreuer:
Max Mustermann
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X
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Dr. Kojro
Einleitung
Ziel dieses Versuches ist der Nachweis von bestimmten Leitenzymen im Cytosol von
Leberzellen und im Plasma von Mitochondrien aus Leberzellen. Leitenzyme sind
Enzyme, deren Vorkommen typisch für einen bestimmten Zelltyp und ein bestimmtes
Organell ist. Zum Beispiel sind Enzyme der Glykolyse typisch für das Cytoplasma,
Enzyme des Citratcyklus dagegen sind Leitenzyme des Mitochondrienplasmas.
Zur Gewinnung von reinem Cytoplasma und reinem Mitochondrienplasma bedient
man sich der Methode der Aufschließung und Homogenisation von Zellen und
Zellorganellen und der fraktionierten Zentrifugation dieser.
Speziell werden bei diesem Versuch die Glutamat-, die Lactat- und die IsocitratDehydrogenase untersucht. Bei allen drei Enzymen handelt es sich um
Oxyreduktasen.
Material und Methode
Der Versuch wurde exakt nach Versuchsanleitung durchgeführt. Die genaue
Vorgehensweise bei der fraktionierten Zentrifugation ist detailliert in der
Versuchsanleitung dargestellt. Die gesamte Trennung wird unter ständiger Kühlung
durchgeführt um Abbauprozesse zu verhindern.
Der Nachweis der Enzyme erfolgt mit dem optischen Test am Photometer. Als
Chromophor dient NAD(P)H dessen Konzentration in der Lösung direkt proportional
zur Konzentration an entstandenem Produkt ist. NAD(P)H zeigt ein
Absorbtionsmaximum für Licht der Wellenlänge 350nm, während dies für NAD(P)+
nicht der Fall ist.
Entsteht bei der Reaktion die reduzierte Form des Coenzyms so wird dem
Reaktionsansatz die Extinktion E=0 zugeordnet, wird jedoch der Chromophor
(NAD(P)H) oxidiert und verliert somit seine Eigenschaften als solcher, wird dem
Reaktionsansatz eine Extinktion > 0 zugeordnet. Somit ist beides Mal der Betrag der
Änderung der Extinktion direkt proportional zur Reaktionsgeschwindigkeit.
Ergebnisse
b) Glutamat-Dehydrogenase-Test
Reaktionsansatz 1 (wird der Extinktion E = 0,7 bei 366nm zugeordnet, da NADH verbraucht wird)
+ Cytosol
Zeit (s)
0
20
40
60
+ Mitochondrienplasma
Zeit (s)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
Extinktion
0,550
0,520
0,520
0,520
Extinktion
0,690
0,650
0,610
0,570
0,520
0,475
0,445
0,420
0,390
0,380
0,355
0,345
0,330
0,320
0,310
0,305
0,295
0,292
0,290
0,285
0,285
0,285
Glutamat-Dehydrogenase-Test
0,8
0,7
Extinktion
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Zeit (s)
Glutamat Dehydrogenase (Cytosol)
Glutamat Dehydrogenase (Mitochondrien)
450
c) Isocitrat-Dehydrogenase-Test
Reaktionsansatz 3 (wird der Extinktion E = 0 bei 366nm zugeordnet, da NADPH entsteht)
+ Cytosol
Zeit (min)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
+ Mitochodrienplasma
Extinktion
0,050
0,155
0,250
0,320
0,360
0,380
0,390
0,390
Zeit (min)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
Extinktion
0,020
0,055
0,090
0,120
0,155
0,190
0,220
0,250
0,280
0,300
0,320
0,335
0,345
0,355
0,360
0,360
Isocitrat-Dehydrogenase-Test
0,45
0,4
0,35
Extinktion
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Zeit (min)
Isocitrat-Dehydrogenase (Cytosol)
Isocitrat-Dehydrogenase (Mitochondrien)
8
d) Lactat-Dehydrogenase-Test
Reaktionsansatz 5 (wird der Extinktion E = 0,7 bei 366nm zugeordnet, da NAPH verbraucht wird)
+ Cytosol
Zeit (min)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
+ Mitochondrienplasma
Extinktion
0,690
0,460
0,340
0,260
0,220
0,205
0,200
0,200
Zeit (min)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
Extinktion
0,700
0,680
0,670
0,660
0,642
0,630
0,610
0,600
0,590
0,580
0,560
0,550
0,540
0,525
0,510
Lactat-Dehydrogenase-Test
0,8
0,7
Extinktion
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Zeit (min)
Lactat-Dehydrogenase (Cytosol)
Lactat-Dehydrogenase (Mitochondrien)
8
Auswertung
Zu b): Glutamat-Dehydrogenase (GDH) Test
Die GDH besteht bei Vertebraten aus sechs identischen Untereinheiten und wird
allosterisch reguliert. ATP und GTP sind allosterische Inhibitoren, ADP und GDP
dagegen allosterische Aktivatoren.
Die GDH katalysiert die oxidative Desaminierung von Glutamat bei der eine
Aminogruppe in Form eines Ammoniumions freigesetzt wird. Dazu benötigt sie H2O
Ungewöhnlicher Weise kann sie als Elektronenakzeptor (donor) entweder NAD+ oder
NADP+ verwenden.
Die Freisetzung der Aminogruppe erfolgt nur in der
mitochondrialen Matrix der Leber durch die Glutamat-Dehydrogenase.
Reaktion der Glutamat-Dehydrogenase:
Glutamat + NAD+ (oder NADP+) + H2O
NH4 + α-Ketoglutarat + NADH (oder NADPH) + H+
+
In unserem Versuch lief die Reaktion genau umgekehrt, da NADH, NH4+ und
a-Ketoglutarat zugegeben wurden.
Bei Zugabe von Mitochondrienplasma zum Reaktionsansatz fiel die Extinktion vom
Anfangswert (E = 0,7 = Extinktion des Reaktionsansatzes) bis auf den Wert 0,3 ab.
Die Stoffe im Ansatz befinden sich somit bei diesen Endbedingungen im chemischen
Gleichgewicht.
Bei Zugabe von Cytosol zum Reaktionsansatz fiel die Extinktion vom Anfangswert
E=0,7 schlagartig auf 0,55 ab. Dann änderte sie sich nicht mehr. Deshalb kann man
davon ausgehen, dass es zu keiner Reaktion kam und die Extinktionsänderung
durch zufälliges Berühren des Kalibrationsrädchens am Photometer zustande kam.
Die Erklärung, dass die plötzliche Extinktionsänderung auf Verunreinigungen
(Flourophore) im Cytoplasma zurückzuführen ist, ist unlogisch, denn sonst würde
man dies auch bei den anderen Reaktionen bei Zugabe von Cytoplasma
beobachten, was aber nicht der Fall ist.
Aus den Ergebnissen lässt sich darauf schließen, dass die GDH nur im
Mitochodrienplasma, nicht aber im Cytosol der Leberzellen vorkommt, was auch der
Theorie entspricht.
Zu d): Lactat-Dehydrogenase (LDH) Test
Im kontrahierenden Skelettmuskel übersteigt unter anaeroben Bedingungen- etwa
bei starker Anstrengung- die Geschwindigkeit der Pyruvatproduktion durch die
Glykolyse die Rate der Pyruvatoxidation durch den Citratcyklus.
Ferner ist die Geschwindigkeit der NADH-Bildung in der Glykolyse unter diesen
Bedingungen größer als die Rate der NADH-Oxidation in der Atmungskette. Die
Fortdauer der Glykolyse hängt davon ab, ob genügend NAD+ zur Oxidation des
Glycerinaldehyd-3-phpsphats zur Verfügung steht. Die Anhäufung von NADH und
Pyruvat wird durch die Lactat-Dehydrogenase unterbunden, die NADH zu NAD+
oxidiert und Pyruvat zu Lactat reduziert.
Die Lactatbildung ist im Stoffwechsel ein totes Gleis. Das Lactat muss in Pyruvat
zurückverwandelt werden, bevor es metabolisiert werden kann. Der einzige Zweck
der Reduktion von Pyruvat zu Lactat ist die Regenerierung von NAD+, so dass die
Glykolyse im aktiven Skelettmuskel und in den Erythrocyten fortschreiten kann.
Die Lactatbildung bringt nur Zeitgewinn und verlagert einen Teil der Stoffwechsellast
von der Muskulatur auf die Leber.
Aufgrund des hohen NADH/NAD+-Verhältnisses im kontrahierenden Muskel wird dort
weit mehr Lactat als Pyruvat abtransportiert. Das in die Leber eingetretene Lactat
wird zu Pyruvat oxidiert, eine Reaktion, die durch das niedrige NADH/NAD+Verhältnis im Cytosol der Leber begünstigt ist. Das Pyruvat wird dann durch die
Gluconeogenese in der Leber in Glucose umgewandelt.
Die Umwandlung von Lactat zu Pyruvat und umgekehrt wird durch Unterschiede in
den katalytischen Eigenschaften der Lactat-Dehydrogenasen verschiedener Gewebe
erleichtert. Die Lactat-Dehydrogenase ist ein Tetramer aus zwei verschiedenen 35kD-Untereinheiten: Der H-Typ dominiert im Herzmuskel, der homologe M-Typ im
Skelettmuskel und in der Leber. Diese Untereinheiten schließen sich zu fünf
verschiedenen Tetrameren zusammen: H4, H3M1, H2M2, H1M3 und M4. Man nennt
diese Typen Isoenzyme.
Das H4-Isoenzym (Typ 1) besitz eine höhere Affinität zu den Substraten als das M4Isoenzym (Typ5). Ein weiterer Unterschied besteht darin, dass H4 von hohen
Pyruvatkonzentrationen allosterisch gehemmt wird, M4 dagegen nicht. Die
Eigenschaften der anderen Isoenzyme liegen dazwischen, je nach dem Verhältnis
der beiden Kettentypen. Die Vermutung liegt nahe, dass speziell H4 Lactat zu
Pyruvat oxidiert, das dann vom Herzmuskel als Brennstoff verwendet werden kann.
Der aerobe Stoffwechsel des Herzens erlaubt, dass Pyruvat in den Citratcyklus
eingeschleust wird. Dagegen ist M4 prädestiniert, in umgekehrter Richtung zu
arbeiten, also Pyruvat in Lactat umzuwandeln, so dass die Glykolyse unter
anaeroben Bedingungen weiterlaufen kann.
Reaktion der Lactat-Dehydrogenase in unserem Versuch:
Pyruvat + NADH + H+
Lactat + NAD+
Bei Zugabe von Leberzellen-Cytosol zum Reaktionsansatz fiel die Extinktion schnell
ab (Reaktion = Anwesenheit von LDH), bei Zugabe von Mitochondrienplasma fiel die
Extinktion auch ab, allerdings nicht so schnell wie bei Zugabe des Cytosols.
Verunreinigung durch LDH oder andere Dehydrogenase oder andere Substanz
die auf den optischen Test reagiert.
Dies entspricht auch der Theorie, denn die LDH katalysiert in der Leber die Bildung
von Pyruvat aus Lactat.
Das Pyruvat wird dann in der Gluconeogenese weiterverarbeitet zu Glucose. Die
Gluconeogenese findet im Cytosol statt, daher ist es naheliegend, das Pyruvat auch
dort aus Lactat herzustellen.
Es ist also viel LDH im Cytosol- keine im Mitochondrienplasma der Leberzellen.
Zu c): Isocitrat-Dehydrogenase (IDH) Test
Die Isocitrat-Dehydrogenase ist aus zwei identischen α- und β-Untereinheiten
zusammengesetzt. Jedes der beiden aktiven Zentren des Enzyms besteht aus den
Aminosäuren Asp311, Asp283 und Asp307. Jeweils zwei Aminosäuren (Asp311,
Asp307) stammen aus der einen Kette, die dritte (Asp283) aus der jeweils anderen.
In eukaryotischen Zellen gibt es zwei Isoenzyme der Isocitrat-Dehydrogenase, wobei
beide dieselbe Reaktion katalysieren, nämlich die Decarboxylierung von Isocitrat zu
α-Ketoglutarat. Das eine Isoenzym benötigt NAD+ als Cofaktor und katalysiert im
Citratzyklus (in den Mitochondrien) einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt, der
unter anderem durch Feedback-Hemmung vom Produkt, durch einen hohen
NADH/NAD+ Spiegel und durch ADP gehemmt wird.
Teilsequenzen des Citratzyklus sind auch extramitochondrial gelegen, so dass sie an
anabolen Vorgängen teilhaben können.
z.B. Citrat  α-Ketoglutarat
Fumarat Oxalacetat
Die zweite Isoform der Isocitrat-Dehydrogenase hat als Cofaktor NADP+. Sie kommt
sowohl im Mitochondrienplasma wie auch im Cytosol vor. Sie katalysiert die
α-Ketoglutarat Bildung im Cytosol. Diese ist wichtig für den Aminosäurestoffwechsel.
Ein weiteres Produkt der Reaktion ist NADPH2, welches als Reduktionsäquivalent
für anabole Stoffwechselwege im Cytosol wie zB. die Fettsäurebiosynthese dient.
Reaktion der Isocitrat-Dehydrogenase im Versuch:
Isocitrat + NADP+
α-Ketoglutarat + CO2 + NADPH + H+
Bei Zugabe von Leberzellen-Cytosol zum Reaktionsansatz stieg die Extinktion
schnell an (Reaktion = Anwesenheit von IDH), bei Zugabe von Mitochondrienplasma
stieg die Extinktion auch an, allerdings nicht so schnell wie bei Zugabe des Cytosols.
Das lässt darauf schließen, dass im Mitochondrienplasma der Leberzellen weit
weniger NADP+ spezifische IDH vorhanden ist, als im Cytosol dieser.
Die NADP+ spezifische IDH im Cytosol ist notwendig für die Bildung von
Reduktionäquivalenten
für
anabole
Stoffwechselwege
wie
zB.
die
Fettsäurebiosynthese, die aucch im Cytosol ablaufen. Daher ist es logisch, dass dort
eine hohe Konzentration an diesem Enzym vorhanden ist.
Das Vorkommen von NADP+ spezifischer IDH im Mitochondrienplasma könnte man
dadurch erklären, dass die hier die Hauptfunktion der IDH die Bereitstellung von
α-Ketoglutarat für den Citratcyklus ist. Die NADP+ spezifische IDH katalysiert hier
also eine anaplerotische Reaktion.
Fazit
Kennt man die Enzyme eines bestimmten Zelltyps und eines Organells, kann man
durch Nachweise der Leitenzyme erstens nachweisen, ob die gewonnene Fraktion
frei von anderen Bestandteilen ist und zweitens, um welchen Zelltyp, welche
Organellen, bzw. um welches Plasma es sich handelt.
Daher benutzt man nur Enzyme, die in einem Kompartiment vorkommen, in einem
anderen nicht (hier die Glutamat- und die Lactat-Dehydrogenase). Allerdings kann
man zur Probe aber auch ein Enzym benutzen, das in beiden Kompartimenten
allerdings in verschiedenen Konzentrationen vorkommt (hier die Isocitrat
Dehydrogenase).
Literatur:
-Skript zum Biochemischen Grundpraktikum, Institut für Biochemie, J.-G.-Universität-Mainz
-Biochemisches Praktikum, Kleber, Schlee, Schöpp, Verlag: Gustav Fischer, 1997
-Biochemie, Stryer, Verlag: Spektrum, 1994 (2. durchgesehene Auflage)