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Projekt für strukturierte Doktorandenausbildung
(Dr.med./Dr.med.dent.) in der HBRS
1. Ich habe ein Projekt für die strukturierte Doktorandenausbildung (Start 16.07-06.08.12
oder früher); ca. 9 Monate experimentelle Arbeit aus den Gebieten: Zellbiologie,
Molekularbiologie, Biochemie, Immunologie, Signaltransduktion, Onkologie,
Zelldifferenzierung etc.)
X
ja
Titel:
Verantwortlich:
Abteilung:
nein
Dr. Luciana Berod, Postdoc Fellow/ Prof. Dr. med. Tim Sparwasser
Institut für Infektionsimmunologie
TWINCORE, Zentrum für Experimentelle und Klinische
Infektionsforschung, Feodor-Lynen-Straße 7, 30625 Hannover
http://www.twincore.de/infektionsimmunologie
Adresse (e-mail): [email protected]
[email protected]
2. In meinem Labor finden mindestens 1x wöchentlich Arbeitsgruppenbesprechungen
sowie „Journalclubs“ statt.
X
ja
nein
3. Eine Betreuung der Doktorarbeit ist ganztägig vorhanden
X
ja
nein
4. Das Projekt beinhaltet tierexperimentelle Arbeiten
X
ja
nein
5. Finanzierung
(falls die HBRS dies nicht leisten kann)
ja
nein
Bitte elektronisch zurück an: [email protected]
Projekttitel: Bedeutung von Mustererkennungsmolekülen in der mykobakteriellen
Infektion
Projektleiter: Prof. Dr. med. Tim Sparwasser
Name des Betreuers/in, der/ die ganztägig im Labor ist: Dr. Luciana Berod
Ziel des Projektes:
Die Tuberkulose (Tb) ist eine chronisch-persistierende Infektion, bei der sich der Erreger,
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), den vielseitigen Abwehrmaßnahmen selbst eines intakten
Immunsystems entziehen kann. Da Dendritische Zellen (DCs) als Hauptmediatoren der
adaptiven Immunantwort gelten und sowohl Immunität als auch Toleranz induzieren, könnte
die Erkennung von Mykobakterien durch DCs über sog. Mustererkennungsmoleküle (z.B.
Toll-like-Rezeptoren, TLRs; Lektine) in der Frühphase der Infektion den entscheidenden
Mechanismus für die Entstehung von Toleranz bzw. Immunität darstellen. Verschiedene
Subpopulationen von DCs exprimieren unterschiedliche Mustererkennungsmoleküle und es
ist ungeklärt, welche DCs in vivo z.B. über die Expansion oder Induktion von regulatorischen
T Zellen (Tregs) Toleranz bzw. protektive T Helfer (Th)1 und Th17Antworten induzieren. In
diesem Projekt soll es untersucht werden, welche Bedeutung die Abwesenheit von TLR
signalling auf DC (Sub)Populationen für die angeborene und die adaptive Immunantwort hat.
Diese Studien werden nicht nur neue Erkenntnisse über die Pathogenese der chronischen
Infektionen bringen, sondern auch wichtige Information für die Entwicklung neuer
Impfstrategien gegen mykobakterielle Infektionen.
Stand der Forschung:
Ein Drittel der Weltbevölkerung ist nach aktuellen Schätzungen mit Mycobacterium
tuberculosis (Mtb) infiziert, damit gilt die Tb als wichtigste bakterielle Infektion weltweit, die
durch das Entstehen multiresistenter Stämme teilweise nur noch unzureichend antibiotisch
behandelbar ist. Mykobakterien werden überwiegend über die Atemwege übertragen und sind
für fast 2 Millionen Todesfälle pro Jahr verantwortlich. Die akute aktive Tuberkulose macht
nur ca. 10% aller Infektionen aus, meist sind die betroffenen Individuen asymptomatisch und
nicht kontagiös. Die mykobakterielle Infektion wird zum Teil lebenslang durch das
Immunsystem kontrolliert, und eine aktive Tuberkulose bricht erst dann aus, wenn diese
Balance zwischen Erreger und Wirt gestört wird. Eine Impfung gegen Tb mit Mycobacterium
bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) zeigt zwar bei Kindern einen gewissen Schutz, wirkt
jedoch nicht protektiv gegen die häufigste Form, die Lungen-Tb des Erwachsenen.
Makrophagen gelten als Hauptzielzellen und zugleich wichtigste Effektorzellen der frühen
mykobakteriellen Infektion, danach sind vor allem CD4+ und CD8+ T Zellen der adaptiven
Immunantwort für die Kontrolle der Infektion verantwortlich. Die Rolle von DCs in der
Tuberkulose wurde erst in jüngster Zeit intensiver untersucht: Dendritische Zellen spielen
nach derzeitigem Kenntnisstand eine Schlüsselrolle in der Regulation der adaptiven
Immunität und können durch die Induktion von Tregs auch Toleranz induzieren. Ähnlich wie
Makrophagen besitzen DCs Oberflächenrezeptoren für Mykobakterien, wie z.B. den FcRezeptor, Komplementrezeptoren (CD11b, CD11c) und den Mannoserezeptor (MR), und
gelten außerdem als Hauptproduzenten von Interleukin 12 (IL-12), das eine essentielle
Bedeutung in der Induktion von Th1 Antworten und damit in der Kontrolle der
mykobakteriellen Infektion besitzt. In vivo Experimente haben gezeigt, dass das TLR Adapter
Molekül MyD88 eine essentielle Rolle in der Tb Infektion spielt, die sogar für das Überleben
entscheidend ist. Da MyD88 nicht nur TLR, sondern auch IL1ß und IL18 Signalwege
vermittelt und möglicherweise bislang unbekannte TLR-unabhängige Funktionen in
Bitte elektronisch zurück an: [email protected]
Phagozyten besitzt, besteht Bedarf an weiterführenden Studien. Die relative Bedeutung von
TLR/MyD88 Signalwegen in vivo im Vergleich zwischen DCs und Makrophagen ist mangels
gewebespezifischer knock-out Modelle bislang ungeklärt.
Eigene Vorarbeiten:
Wissenschaftlicher Schwerpunkt am Institut für Infektionsimmunologie ist die Untersuchung
von DCs, Makrophagen und T Zellen im murinen Modell. Hier besteht langjährige Erfahrung
in den klassischen in vitro (z.B. GM-CSF, FLT3L DC Kulturen, Proliferationsassays,
Suppressionsassays, Zytotoxizitätsassays, ELISA etc.), ex vivo (Gradienten- und BeadsIsolation und Multiparameter FACS Analyse von DC Subpopulationen und T Zellen,
Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie, Histologie) und in vivo (Immunisierungsprotokolle,
Infektionsmodelle) Experimentalsystemen. Alle Modelle, die für das Projekt relevant sind,
stehen am Institut zur Verfügung. Das Infektionsmodell mit BCG wurde von Frau Dr. Berod
in unserem Labor etabliert. Die verschiedenen Methoden, die für das Projekt nötig sind,
wurden ebenfalls optimiert (Infektionsdosis, Zeitpunkte der Analyse usw.) sodass ein
unmittelbarer Beginn der praktischen Arbeiten möglich ist.
Forschungs-/Arbeitsplan:
Für die bislang unbeantwortete prinzipielle Frage der Bedeutung des zentralen
Adaptermoleküls für TLR Signalwege, MyD88, in DCs versus Makrophagen werden BCG
infizierte Mäuse, die MyD88 nur in CD11c+ Zellen exprimieren (DCMyD88) mit
entsprechenden Tieren, die MyD88 in Makrophagen „angeschaltet“ haben (MACMyD88),
verglichen. Als Kontrollen dienen sog. „wild-typ“ (WT=nicht genetisch verändert) und
MyD88-defiziente (sog. „Komplett-knock-out = k/o in allen Körperzellen) Tiere. Initial sollen
die in vitro und in vivo Experimente mit Mycobacterium bovis (BCG) durchgeführt werden.
Neben dem Originalstamm (BCG-Pasteur) sollen verschiedene BCG Stämme benutzt werden,
die entweder das Modellantigen Ovalbumin (OVA) oder das Ag85b exprimieren bzw.
defizient für dieses Gen sind. Der Vorteil besteht hier, dass spezifische T Zellantworten im
sog. OT-I bzw. Ag85b-transgenem (P25) System detektierbar sind. Hauptzielgröße ist die
Analyse der angeborenen und adaptiven Immunität in DCMyD88, MACMyD88 und relevanten
Kontrollen (WT und komplett MyD88-defiziente Tiere). Weiterhin ist geplant, Luziferaseexprimierende Mykobakterien zu generieren. Die kodierenden Konstrukte sind bereits
vorhanden. Luziferase-Stämme könnten für das in vivo imaging (spezielle bildgebende
Verfahren für das Enzym Luziferase) benutzt werden und einen spannenden Einblick in den
Infektionsverlauf in den verschiedenen genetisch modifizierten Linien liefern. Weiterhin wird
die Aufnahme von lebenden BCG-GFP (grün fluoreszierendes Protein) in DCs und
Makrophagen mittels Fluoreszenzmikroskopie und konfokaler Mikroskopie untersucht.
Zusätzlich werden GMCSF-DC Kulturen aus den verschiedenen Stämmen benutzt. Hierfür
werden DCs zunächst mit GFP-exprimierenden BCG für unterschiedliche Zeit inkubiert.
Deren Aufnahme kann durch konfokale Mikroskopie verfolgt und die unterschiedlichen
Kompartimente durch spezifische Antikörper (z.B. α-Lamp1, α-EEA1) dargestellt werden.
Funktionell soll hier eine gesteigerte Antigenaufnahme / Prozessierung über sensitive Readouts wie den Einsatz von BCG-OVA oder BCG-Ag85b und die Ko-Kultur mit OT-I bzw. P25
Zellen (3H / CFSE Proliferationsassays, Zytokine) nachgewiesen werden. Die spezifische T
Zell Antwort kann ebenfalls in vivo detektiert werden. Dafür werden die Tiere mit lebenden
BCG intravenös (i.v.) injiziert. Nach 2 Wochen werden OT-I bzw. P25 Zellen transferiert.
Aufgereinigte CD4+ bzw. CD8+ T Zellen aus infizierten Mäusen sollen dann zu verschiedenen
Zeitpunkten in vitro mit OVA re-stimuliert und auf Zytokine im Kulturüberstand untersucht
werden. Dabei werden IL-4, TNF-α, Interferon-γ und IL17 Spiegel (ELISA, beads-basierte
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Testsysteme) als Indikatoren einer Th2 bzw. Th1 oder Th17 Immunantwort bestimmt.
Zusätzlich sollen mit den kultivierten und restimulierten CD4+ bzw. CD8 T Zellen
intrazelluläre Färbungen für IL-4 und Interferon-γ und IL-17 durchgeführt werden, die eine
Aussage über Th-1/2/17 Differenzierung auf Einzelzellniveau erlauben.
Methoden:
In vivo Infektionsmodelle, Zellkultur, Herstellung von Dendritischen Zellen und
Makrophagen aus dem Knochenmark, Durchflusszytometrie (FACS, MACS, Zellsortierung
und Analyse), Aufreinigung von T Zellen, Proliferationsassays, T Helfer-Zell
Differenzierung, ELISA, Fluoreszenzmikroskopie, gegebenenfalls Histologie, konfokale
Mikroskopie, Luziferase Imaging.
Referenzen:
Singh SK, et al.. Targeting glycan modified OVA to murine DC-SIGN transgenic dendritic cells enhances MHC
class I and II presentation. Mol Immunol, 2009 Dec;47(2-3):164-74.
Schaefer M, et al.. Decreased pathology and prolonged survival of human DC-SIGN transgenic mice during
mycobacterial infection. J Immunol, 2008 May 15;180(10):6836-45.
Lahl, K., C. Loddenkemper, C. Drouin, J. Freyer, J. Arnason, G. Eberl, A. Hamann, H. Wagner, J. Huehn, T.
Sparwasser. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. J Exp Med 2007
204:57
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