Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 2
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Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 2 Diese Präsentation befindet sich auf der Lehr-Inhalts Seite des Inst f. Medizinische Genetik unter www.meduniwien.ac.at/hp/medizinische-genetik/lehre Helmut Dolznig Inst. F. Medizinische Genetik MedUni Wien Institut für Medizinische Genetik Präsentation: Ernst Müllner / Georg Weitzer Der praktische Teil der 2. Übung findet statt am: Zentrum für Pathobiochemie und Genetik Währingerstraße 10 Übungssaal I, 1. Stock Institut für Medizinische Genetik Enzymatische Methoden Enzymatische Reaktionen • • • • Enzym = E Substrat = S Produkt = P Coenzym (Cosubstrat) = E +S ES E + S + CoE EP ES-CoE CoE E+P EP-CoE´ E + P + CoE´ Coenzym verändert sich zunächst (CoE à CoE ), wird aber in einer anderen Reaktion wiedergewonnen, daher auch der Name Cosubstrat Institut für Medizinische Genetik Enzymatische Reaktionen ein anderes Beispiel E + S1 + S2 à S1-E-S2 à E-P à E + P Das aktive Zentrum des Enzyms fixiert die Substrate in einer optimalen Position, um deren Reaktion zu erleichtern. Institut für Medizinische Genetik Was Sie wissen sollten: Aktivität von Enzymen (Biokatalysatoren) wird beeinflusst durch • pH- Wert (Optimum, aber auch Denaturierung) • Temperatur (Optimum, aber auch Denaturierung) • Hemmstoffe (in der Medizin: Medikamente!) – kompetitive (erhöhen den Km Wert) – nicht-kompetitive Anmerkung: bei der kompetitiven Hemmung konkurrieren ein Agonist (Substrat) und ein Antagonist (Hemmstoff) um die Bindungsstelle an einem Enzym. Bei der nicht-kompetitiven Hemmung bindet der Antagonist nicht an der Substrat-Bindungsstelle. Institut für Medizinische Genetik Enzymatische Reaktionen pH-Wert Optimum am Beispiel der Verdauungs-Enzyme Pepsin (im Magen) und Trypsin (im Darm). Typisches Temperatur Optimum der Enzymaktivität bei 37°C Einzelne Enzyme können durchaus davon abweichen. Institut für Medizinische Genetik Für die Reaktionsgeschwindigkeit v einer enzymatischen Reaktion gilt: [E] x [S] Km = v= [ES] Km entspricht der Substrat-­‐ Konzentra(on, bei der das Enzym mit der HälGe der maximalen Geschwindigkeit arbeitet. vmax x [S] [S] + Km Michaelis-Menten Gleichung Die Reak(onsgeschwindigkeit v einer enzyma(schen Reak(on in Abhängigkeit von der Substratkonzentra(on [S] nach der Michaelis-­‐ Menten Gleichung kann auch grafisch dargestellt werden. Institut für Medizinische Genetik Graphische Darstellung der Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion v In diesem Bereich: Bestimmung der Substratkonzentration In diesem Bereich: Bestimmung der Enzymmenge v... Umsatzgeschwindigkeit vmax ... Maximale Reaktionsgeschwindigkeit Km = [S] bei vmax / 2 (Km = Michaelis-Menten Konstante) ([S] = Substratkonzentration) [S] ... daher K in mol/l m Abbildung aus: Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - Vom Molekül zur Zelle, Facultas Verlag, Hans Goldenberg (Hg.) Institut für Medizinische Genetik es gilt: [E] = [ES] Umwandlung der Kurve höherer Ordnung in eine lineare Funktion durch einen doppelt-reziproken Plot Institut für Medizinische Genetik Lineweaver-Burk Diagramm y = kxx + d → y = d + kxx Geradengleichung k = Steigung 1 / v = 1 / vmax + (Km / vmax) x 1 / [S] Durch Umformung der Michaelis-­‐ Menten Gleichung in eine doppelt-­‐ reziproke Form kann die Reak(onsgeschwindigkeit einer enzyma(schen Reak(on in einem Lineweaver-­‐Burk Diagramm dargestellt werden. Dies hat vor allem für die Auswertung der Daten Vorteile. k = (1 / vmax) / (1 / Km) Institut für Medizinische Genetik Beispiel 1 Kine5sche Untersuchung der Lactatdehydrogenase: Bes5mmung der Km durch Messung der Reak5ons-­‐Geschwindigkeit bei verschiedenen Substrat-­‐Konzentra5onen v modifiziert nach „Ergänzung“, H. Goldenberg Institut für Medizinische Genetik [S] Was macht die Lactatdehydrogenase? C2H5OH-COOH + NAD+ Lactat CH3CO-COOH + NADH + H+ gemessene Reaktionsrichtung Pyruvat COO COO HO C H C O CH3 Coenzym / Cosubstrat CH3 Diagnose von Herzinfarkt durch die Aktivitätsbestimmung von herzspezifischen Enzymen im Blut • Kreatinkinase (CK-MB) • Laktatdehydrogenase (LDH) LDH in der Leistungs-Diagnostik im Sportbereich Institut für Medizinische Genetik Was macht NAD+? Nico(namid-­‐Adenin-­‐Dinucleo(d ist ein Elektronen transpor(erendes Coenzym, das an zahlreichen Redox-­‐Reak(onen des Stoffwechsels beteiligt ist. Dabei kann es reduziert werden und maximal zwei Elektronen (dann geschrieben als NADH) aufnehmen. Hier gezeigt am Beispiel der Umwandlung (Oxida(on) von Ethanol zu Acetaldehyd, durch das Enzym Alkohold-­‐ dehydrogenase, ADH. Institut für Medizinische Genetik Institut für Medizinische Genetik Absorptionsspektrum von NAD+ und NADH Im Gegensatz zu NAD+ zeigt NADH ein starkes Absorptionsmaximum bei 340 nm (langwelliges UV-Licht). Im Zuge der Reaktion von Pyruvat zu Lactat nimmt (durch gleichzeitige Umwandlung von NADH in NAD+) die Absorption von UV-Licht ab. Institut für Medizinische Genetik modiziert nach „Ergänzung“, H. Goldenberg 340 Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität ... ... und Darstellung der Ergebnisse in einem Lineweaver-Burk Diagramm LDH spielt vor allem eine Rolle bei einer Nebenreaktion der Glykolyse im Citratzyklus. Durch die Umwandlung von Lactat zurück zu Pyruvat in der Leber (Cori Zyklus) wird NADH produziert, das seinerseits als energielieferndes Co-enzym der Atmungskette zur ATP Bildung beiträgt. -1 / Kapp Institut für Medizinische Genetik Im Praktikum wird hingegen die Umwandlung von Pyruvat in Lactat gemessen, wobei NAD+ gebildet wird. Messen der Umsatzgeschwindigkeít bei verschiedenen Substratkonzentrationen [S] = [Pyruvat] nochmals: gemessen wird die Reaktion in der Richtung vom Pyruvat zum Lactat, wobei NADH in NAD+ umgewandelt wird. zunächst Herstellung einer Verdünnungsreihe „Ergänzung“, H. Goldenberg Institut für Medizinische Genetik Probenvorbereitung alle Volumina in µl „Ergänzung“, H. Goldenberg Durch Zugabe von 20 µl Lactatdehydrogenase wird die Reaktion gestartet Institut für Medizinische Genetik Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität Zusatz von LDH niedrige Pyruvatkonzentration hohe Pyruvatkonzentration modiziert nach „Ergänzung“, H. Goldenberg k = v für gegebene [S] Institut für Medizinische Genetik Lambert-Beersches Gesetz E=ε x cxd E = Extinktion c = Konzentration E = log (1/T) = log (I0/I) ε = spez. Molarer Extinktionskeoff. d = Schichtdicke T = Transmission I0 Lichtquelle Photometer Institut für Medizinische Genetik I Prisma Detektor Küvette d = 1 cm Photometer Institut für Medizinische Genetik Messung der Extinktionsänderung bei jeder Substratkonzentration E=εxcxd c = E / (ε x d) Δc / Δt = ΔE / (ε x d x Δt) = v Abnahme der Extinktion in Abhängigkeit von der Dauer der Reaktion messen (wie in der Grafik zuvor dargestellt). Institut für Medizinische Genetik Arbeitsplatz Institut für Medizinische Genetik Institut für Medizinische Genetik Auswertung der Messdaten durch Umwandlung in ein Lineweaver-Burk Diagramm ... Zusatz von LDH Jedes k (Steigung links) entspricht einem Punkt im Diagramm rechts. Institut für Medizinische Genetik Institut für Medizinische Genetik ... durch Eingabe in ein Computer-Datenblatt (Excel, I) Institut für Medizinische Genetik ... durch Eingabe in ein Computer-Datenblatt (Excel, II) nicht alles muss immer stimmen ... Institut für Medizinische Genetik Berechnung der vmax „Ergänzung“, H. Goldenberg Δc(s) / Δt = ΔE / (ε x d x Δt) = v Institut für Medizinische Genetik Geschafft! Institut für Medizinische Genetik Beispiel 2 Bestimmung der LactatdehydrogenaseAKTIVITÄT im Serum bei verschiedenen Enzymmengen in diesem Bereich (= bei hoher SubstratKonzentration) arbeitet man zur Bestimmung der Enzymmenge ... v modiziert nach „Ergänzung“, H. Goldenberg Institut für Medizinische Genetik [S] Beispiel 2 ... während man eine (relativ) große Enzymmenge einsetzt um Substratkonzentrationen zu bestimmen. v modiziert nach „Ergänzung“, H. Goldenberg Institut für Medizinische Genetik [S] Institut für Medizinische Genetik Experimentelle Vorbereitungen „Ergänzung“, H. Goldenberg 1. Lösungen 2 bis 4 mischen 2. LDH Lösung zugeben 3. Abnahme der NADH Konzentration messen Institut für Medizinische Genetik Gemessen wird wieder die Abnahme der Extinktion pro Zeiteinheit, aber diesmal in Abhängigkeit von der Enzymmenge k = ΔE / min Zusatz von LDH wenig Enzym viel Enzym modiziert nach „Ergänzung“, H. Goldenberg Aktivität (U/l) = ΔE / min x Konstante Institut für Medizinische Genetik
