Elektrophorese

Elektrophorese
Definition
Elektrophorese ist die Wanderung geladener Teilchen im elektrischen
Feld.
Unterschiedliche Ladungen und Größen der Teilchen bewirken eine
unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit
Historie
Arne Tiselius:
30er Jahre des 20. Jahrhunderts
Nobelpreis: 1948
Trennung von menschlichem Serum in 4 Komponenten
Albumin, Globuline ", $ und (
Wandernde Grenzschichten-Elektrophorese im U-Rohr nach Tiselius mit
Schlieren Optik
Weiterentwicklung zur Zonenelektrophorese
antikonvektive Träger
Papier, Agargele und Kieselgele
sehr diffuse Banden wegen Eigenladung
Inerte Matrices
•
Stärkegele (1955, Smithies)
Trennung von DNA-Fragmenten
•
Celluloseacetatfolien (1957, Kohn)
Klinische Routineuntersuchungen
•
Polyacrylamidgele (1959, Raymond und Weintraub)
Inert, vollständig transparent, höchstes Auflösungsvermögen für DNA-Fragmente, Proteine und Peptide
•
Agarosegele (1961, Hjertén)
Trennung von DNA-Fragmenten, Immunelektrophorese
Disk-Elektrophorese,
1964, Ornstein und Davies
Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese
•
Grundlage moderner hochauflösender Elektrophoresemethoden
in Gelen und Kapillaren
Isoelektrische Fokussierung (IEF), 1966
•
pH-Gradient mit Trägerampholyten
•
sehr hoch auflösende Elektrophoresemethode
•
Proteine wandern in einem pH-Gradienten bis zu dem pH-Wert,
der ihrem isoelektrischen Punkt (pI) entspricht
•
seit 1982 immobilisierte pH-Gradienten
SDS (Natriumdodecylsulfat), 1967, Shapiro, ViÁuela und Maizel
•
Denaturierung von Proteinen
•
Molekulargewichtsbestimmung (SDS-PAGE)
Gradientengele, 1967, Margolis und Kenrick
Zweidimensionale Elektrophorese (2D-PAGE)
(1975 O’Farrel und Klose)
•
Erste Dimension: IEF
•
Zweite Dimension: SDS-PAGE
•
seit 1988 2D-PAGE mit immobilisierten pH-Gradienten (Görg)
•
Auflösung mehrerer Tausend Proteine auf 20 cm x 20 cm
Blotting-Techniken, 1975, Southern
•
Southern-Blot (DNA-Fragmente aus Agarose-Gelen)
•
Northern-Blot (RNA-Fragmente)
•
Western-Blot (Proteine)
Kapillarelektrophorese (ab 1983)
Elektrophorese - Grundlagen
Drei Verfahren
Zonenelektrophorese:
homogenes Puffersystem
Isotachophorese:
diskontinuierliches Puffersystem
Isoelektrische Fokussierung:
Trennung im pH-Gradienten
Medien
In Lösung:
In Matrices:
Kapillaren, dünne Pufferschicht
(Konvektion)
Membran, Gel (Teilchen werden in Matrix
retardiert)
Polyacrylamidgele
Radikalische Polymerisation
Acrylamid und N,N’-Methylenbisacrylamid
Theoretische Grundlagen
Definition
Die elektrophoretische Beweglichkeit (Mobilität) ist eine substanzspezifische
Größe, die die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld bestimmt
und damit für die Trennung entscheidend ist.
Kraft im elektrischen Feld
Fe = qCE
mit q = zCe
q: Ladung
z: Ladungszahl
e: Elementarladung in Coulomb
Reibungskraft
Fr = fcCv
v: Wanderungsgeschwindigkeit
fc: Reibungskoeffizient
Gleichgewicht beider Kräfte: konstante Wanderungsgeschwindigkeit
Fe = Fr
qE = fcCv
Mobilität u (Stokessche Gesetz)
0: Viskosität der Lösung
r: Radius des hydratisierten Ions
nicht-kugelförmige Moleküle
empirischer Zusammenhang:
M: Molekulargewicht
d: 1/3 bis 2/3
Joulesche Wärme
c: molare Konzentration des Analyten
E: elektrische Feldstärke
8: Äquivalenzleitfähigkeit
Molekulargewichtskurve
Gel
T=
100 × ( A + B)
% ( w:V )
V
C=
100 × B
% ( w:V )
A+ B
•
SDS-Gradientengel
•
Molekulargewichte in logarithmischer Auftragung
•
Laufstrecke linear auftragen
Vertikale Elektrophoreseapparatur
Gelgießstand
Kapillarelektrophorese
capillary electrophoresis (CE)
Prinzip
Trennung geladener Teilchen durch unterschiedliche
Wanderung in einer Kapillarsäule, die eine wässrige
Elektrolytlösung enthält.
Unter dem Begriff CE werden verschiedene Trenntechniken
zusammengefasst; die häufigste Variante ist derzeit die
Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
Apparatur:
In die mit Pufferlösung gefüllte Kapillare wird an einem Ende
(meist Anodenseite) eine geringe Probenmenge eingebracht
und Hochspannung angelegt
•
Ionen wandern unterschiedlich schnell durch Kapillare
K Trennung
•
Detektor
K Elektropherogramm
Bauteile der CE-Apparatur
Trennkapillare
•
Länge: 20-200 cm
•
ID:
25-100 :m
•
Ungefüllt, beschichtet oder gefüllt
•
Material: Quarz (fused silicia) mit Außenbeschichtung
Glas, Polymere
Puffergefäße
•
Pufferlösung (pH meist zwischen 2,5 und 8,5)
•
Elektroden: Platinstäbe
Hochspannungsgenerator
•
- 30 kV bis + 30 kV (Strom 5 - 250 :A)
Dosierung
•
Probenaufgabe am anodischen Ende
•
Volumen: 2-20 nL
•
Dosiertechniken
Hydrodynamische Injektion (Druck, Vakuum, Gravitation)
Elektrokinetische Injektion (Spannungsimpuls)
Autosampler
Detektor
•
Detektionsvolumen:
< 1 nL
•
Optische Detektoren:
Detektionsfenster in der Kapillare
UV-VIS (feste oder variable Wellenlänge, DAD)
Fluoreszenz (evtl. nach Derivatisierung)
Leitfähigkeit, elektrochemische Detektion
ESI-MS
Thermostat
•
Abtransport der Wärme aus der Kapillare
Luft oder Kühlflüssigkeit
Theoretische Grundlagen der CE
Elektrophoretische Wanderung
Wanderung der Ionen in einem elektrischen Feld mit konstanter
Geschwindigkeit u zur entgegengesetzt geladenen Elektrode:
uep = :ep×E = :ep×U / L
uep
:ep
E
U
L
elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit
elektrophoretische Beweglichkeit (Mobilität) der Ionen
elektrische Feldstärke (E = U/L)
angelegte Spannung (Trennspannung)
Gesamtlänge der Trennkapillare
Wanderungsgeschwindigkeit ergibt sich aus Gleichgewicht
zwischen Beschleunigungskraft KB und bremsender
Reibungskraft KR :
KB = z C F C E
F
z
Faradaykonstante
effektive Ionenladung
Stockesches Gesetz für sphärische Teilchen:
KR = 6BChCrCu
h
dynamische Viskosität der Lösung
r
Stockescher Radius der Ionen (einschließlich
umgebender
Solvathülle)
Elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit uep
uep ~ z
Ladung der Spezies
~1/r Größe der Spezies
~ E Feldstärke
Theoretische Grundlagen der CE
Elektroosmotischer Fluss (EOF)
•
Oberflächenladung der Kapillareninnenwand bewirkt eine
Wanderung der ges. Pufferlösung in der Kapillare:
•
In Quarzkapillare verursachen Puffer mit pH-Wert > 4 eine
negative Aufladung der inneren Oberfläche infolge
Dissoziation der Silanolgruppen
•
Ausbildung einer elektrochemischen Doppelschicht mit fest
adsorbierten Kationen (starre Grenzschicht) und einer
diffusen Grenzschicht mit beweglichen, solvatisierten
Kationen
•
Kationenüberschuss im diffusen Teil der Doppelschicht
erzeugt einen gleichmäßigen und pfropfenförmigen Fluss der
gesamten Lösung in Richtung Kathode (nach Anlegen eines
elektrischen Feldes):
Elektroosmotischer bzw. elektroendosmotischer Fluss (EOF)
ueo = :eoAE
:eo
=
εζ
4πη
η: Viskosität
ε: Dielektrizitätskonstante der Doppelschicht
ξ: (Zeta-) Potential der Scherebene
•
Zeta-Potential (~ Zahl der Ladungen an Kapillarenwandung)
•
Der EOF ist stark pH-abhängig und im alkalischen deutlich
ausgeprägt; kann durch chemische Modifizierung der
Kapillarenoberfläche verändert werden.
Elektroosmotischer Fluss (EOF)
Aufbau (oben) und Potentialverlauf Q (unten) der elektrochemischen
Doppelschicht (x = Abstand von der Kapillare)
pH-Abhängigkeit
Elektrophoretische Wanderung und EOF
Gesamtmobilität
•
Die elektrophoretische Wandung wird vom EOF überlagert
•
Beobachtete Mobilität setzt sich aus beiden Beiträgen
zusammen:
:ges = :ep + :eo
Beispiel:
Analyt (Injektion an Anodenseite)
Kationen:
Anionen:
Neutralteilchen:
:ges = :ep + :eo
:ges = :ep - :eo
:ges = :ep
(keine Trennung)