Experiment 11

Experiment 11: Bakterielle Transformation
Schürch Anita, Aschwanden Janine, Sulzer Andrea
Kuenzle Sandra, Oertig Monica, Kohler Martin
Assistentin Munti Yuhana
Brock Kapitel 9.6, 10.16, 7.2
Einleitung
Bakterien besitzen neben der chromosomalen DNA, noch eine zweite DNA Quelle: Die Plasmide! Auf
diesen extrachromosomalen "DNA-Ringen" sind Informationen gespeichert, die auf andere Bakterien
übertragen werden können. So können wichtige Gene weitergegeben werden, die Organismen
kommunizieren auf dem Gen-Niveau. Dies ist der Mechanisms durch welchen z.B. Resistenzen
einzelner Bakterien gegen Antibiotika weitergegeben werden. Bakterien mit einem AntibiotikaResistenz Gen haben einen Selektionsvorteil, und können die Resistenz mittels Plasmid an andere
Bakterien, selbst über Artgrenzen hinweg, weiter geben.
In diesem Experiment wird demonstriert, wie DNA durch den Prozess der Transformation auf andere
Bakterien übertragen werden kann.
Transformation von pGLO
Es geht darum, einem Bakterium ein fremdes Plasmid (das pGLO-Plasmid) durch Transformation
einzupflanzen:
Das pGLO-Plasmid mit seinen wichtigsten Gensequenzen
Die 4 wichtigsten Gensequenzen des pGLO sind:
ori:
Der Startpunkt der Replikation
araC:
Die Gensequenz, die normalerweise für AraC, ein Regulator Protein für Enzyme des
Arabinose-Stoffwechsels, kodiert. AraC wird normalerweise nur produziert, wenn
Arabinose vorhanden ist. Wenn keine Arabinose in die Zelle gelangt, können die
folgenden Sequenzen durch die RNA-Polymerase nicht abgelesen werden.
GFP:
Green fluorescent protein: Ein Gen, das in gewissen Quallen vorkommt, die grün
leuchten. Dieses Leuchten wird erst durch Anregung mit UV-Licht sichtbar. Das
GLO-Genprodukt wird als Indikator für erfolgreiche Transformation des GLO-Gens
herangezogen.
bla:
Diese Sequenz kodiert für eine β-Lactamase, ein Enzym, das den β-Laktam Ring des
Ampicillins spalten kann.
Vorgehen
Um dieses Plasmid in eine E. coli Zelle durch Transformation einpflanzen zu können, mussten wir die
Zellen zuerst kompetent machen. Das geschieht, indem man sie mit hohen Konzentrationen an CaCl2
behandelt. Danach sind die Organismen in der Lage, die Plasmide aufzunehmen. Die E. coli Bakterien
wurden schlussendlich auf vier Agar-Nährmediums-Schalen ausgeplattet:
1. Nährmedium (LB= Luria Bertani agar) +Ampicillin.
2. Nährmedium (LB) + Ampicillin + Arabinose.
Kontrollen (Zellen, die nicht mit dem pGLO-Plasmid behandelt wurden):
3. Nährmedium (LB) + Ampicillin.
4. Nährmedium (LB)
Ergebnisse
Wachstum (W)/ Leuchten (L)
Medium
E. coli ohne pGLO-Behandlung
LB
W+++ / LLB + Ampicillin
W- / LLB + Ampicillin + Arabinose
n.d
E. coli mit pGLO-Behandlung
n.d
W+ / LW+ / L +
(W+ = Wachstum; W- = kein Wachstum)
(L+ = Leuchten; L- = kein Leuchten)
n.d. = nicht durchgeführt
Auswertung / Diskussion
Wie man der Tabelle entnehmen kann, hat unser Versuch sehr gut funktioniert.
Kontrolle (Zellen, die nicht mit dem pGLO-Plasmid behandelt wurden):
Wenn nur das Nährmedium vorhanden war, wuchsen die Bakterien sehr gut. Es entstand ein
einheitlicher Rasen. Wenn aber Ampicillin zugegeben wurde, so starben alle Bakterien, da keine das
“rettende” Ampicillin-Resistenzgen “bla” enthielten.
Zellen, die mit dem pGLO-Plasmid behandelt wurden (Transformanten):
Bei der Probe mit pGLO zeigte sich ein anderes Bild: Auf einer Schale mit LB und Ampicillin wuchsen
die Bakterien zwar, es zeigte sich allerdings kein einheitlicher Rasen. Im Gegenwart von Ampicillin
überlebten nur jene Organismen, die das Plasmid aufgenommen, und β-Lactamase produziert hatten. Es
entstanden einzelne Kolonien. Um diese Kolonien herum gab es noch vereinzelte nicht-resistente
Bakterienkolonien, die überleben konnten, weil die benachbarten resistenten Bakterien ihre βLactamase ein wenig ins Medium abgaben.
Bei der letzten Schale konnte man das Ergebnis betrachten: Die Kolonien leuchteten unter UV-Licht
grün. Durch die Zugabe von Arabinose wurde das Regulator-Protein AraC aktiviert, die Polymerase
konnte an die DNA binden und die folgende Sequenz mit GFP transkribieren. Dadurch entstand das
Green Fluorescent Protein, welches nach Anregung mit UV leuchtet!
Literatur
•
Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W. W., Prasher D.C. 1994. Gene Fluorescent Protein as a
Marker for Gene Expression, Science (263): 802-805.