in utero Elektroporation Eine Methode zur Studie der embryonalen
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in utero Elektroporation (IUE) Eine Methode zur Studie der embryonalen Entwicklung im zentralen Nervensystem der Maus Jan Baumgart In utero Elektroporation flag - Technik - Funktionsprinzip (ROSA26) Platicity-related Gene (PRG 1) GFP - Einleitung - Untersuchung zur physiologischen Rolle von PRG-1 anhand der IUE Zusammenfassung merge E19 (PRG1(flag)-pCAG Schematische Darstellung der einzelnen Schritte der in utero Elektroporation Vorläuferzellen (SVZ) Ventrikel multipotente Stammzellen gliale Vorläuferzellen Astrozyten neurale Vorläuferzellen Oligodendrozyten verschieden ausgereifte Nervenzellen Plasmid GFP zu untersuchendes Protein ROSA 26 • Mauslinie enthält eine gefloxte Gensequenz zusätzlich (E. Coli-lacZ gene) • lacZ -gene kodiert die Beta-Galaktosidase • Beta-Galaktosidase Aktivität kann auf 2 einfachen Wegen nachgewiesen werden: • A: X-Gal – Färbung (blau) B: Antikörperfärbung (rot) Cre-Rekombinase “schneidet” das loxP-flankierte DNA-Segment, welches die Expression des lacZ Gens verhindert, aus. EcoRV PKG neo CRE EcoRV 4 x pA lacZ ROSA 26 P0 Kortex (5d nach IUE) Beta-Gal GFP merge P9 Hippocampus (15d after IUE) X-GAL GFP merge In utero Elektroporation flag - Technik - Funktionsprinzip (ROSA26) Platicity-related Gene (PRG 1) GFP - Einleitung - Untersuchung zur physiologischen Rolle von PRG-1 anhand der IUE Zusammenfassung merge E19 (PRG1(flag)-pCAG Liver Leber uscle M Muskel idney K Niere Testis Hoden kb Herz Heart Gehirn ain Br Milz pleen S Lung Lunge Die Entdeckung von PRG-1 Suche nach Genen, die nach einer entorhinalen Kortexläsion eine dynamische Expression aufweisen. 9,50 7,50 4,40 2,40 1,35 prg-1 Northern Blot PRG-1 ist ein gehirnspezifisches, neuronales Protein adult 1dal prg-1 radioaktive in situ Hybridisierung Plasticity-Related-Gene -1 Bräuer et.al. Nature Neuroscience (2003) Das Protein PRG-1 S N Y E I N Y K V E P T D C D3 D C Y R K S K I S S L C V Y N V D S G S P S Q C F N E T P V V T D L Q H G D1 T L L G S S I S T Q A C Y F E N D V I Y Y I R G M P Y V T F H K S A F T R G P F V L L K T S I Q S P D2 L 298 P I E P G L L G H F F G D Q L A C TM6 TM5 TM2 TM3 TM4 TM1 I M T I G S Y I T A A L I I L L I L A S LS A I L V A G F L Y G Y F A LFT IC G G C S A F L VV P A S L V A F V I L G Y V P LV F G M A L V G V HT N F Y S Y F E P V N E I I K S M V F A C L L G T F T P I L L L R L L K T P L V S 277 Y L F S D T S R C S R A E V C 170 N F D S N L L M S C Q H 337 R A S D G A D N G K K R R N L I G I G S R V N A K N A V L S S L K P S G E R P K G T D L N Q D P S R G E D L A I G K T H N H R D A R A E G I L N S S M G A N S F T V M S E K G M A P S T L S R P T Q R A I I E V D A N A R K L N T L P R A N T L T V H T S P G G G L G Q PS R S K Q L T V E D P V R R N A S I H A S M D S A W R G G L R A A Q K E S P PS E P L S M K R S E N K L P E S S S R M E I S R E T D M V Q R V G V R S Q G R L D I S G A G P N G S I Q S R S C G D H H V P P G C N N S M P G G P R V S E G R A G S S G A Q G N Q Y L K I Q P G T V L R V H I Q T E E P Q N C D V T K E A A K L W K A R A S S S K P S T S I N E S R M NH2 N C T G S I N Q P R I M Q V I A M S K Q Q G V L Q S S P K N A E G S T V T R Y K N N E P H A E V R R H P T S L T D VK W K W S G S G E G E T S S P G E V I I P I Q I P E K N I D S S S L R Q T Y E L N D L N R D S E S C E S L K D S F G S G D R K R S N E E S G I E S T D H L R S S S V T L S N G K R R S G E V P T V R I T I I T I G H H H L 766 I D P E R S N S P E N T R N I F Y K G T S P T R A Y K COOH Hohe Homologien zu LPPs extrazellular Plasma Membrane LPP2 PRG-3 intrazellular LPP1 PRG-5 LPP3 PRG-4 PRG-1 PRG-2 „Lipid-Phosphatase-Related Proteins“ - 6 Transmembrandomänen - ca. 400 AS hydrophiler C-terminaler Bereich - 3 charakteristische, extrazelluläre Domänen (Eingruppierung in die PAP2 Superfamilie) Bräuer et.al. Nature Neuroscience (2003) Modifiziert nach Sigal et. al., Biochem J (2005) Beobachtungen zur PRG-1-KO Mauslinie PRG-1-KO Mäuse zeigen erhöhte juvenile Sterberate 50 Reduziertes Körpergewicht zw. P9-P35 (+/- x +/-) Theoretische Verteilung WT 50% Het 25% WT 25% KO 40 20 PRG-1-KO 30 20 10 0 +/- +/+ -/- Körpergewicht [g] Anteil an der Gesamtanzahl der Mäuse [%] Heterozygote Verpaarung -/gestorben -/- (gestorben) = S(geborene Jungtiere) – S (abgesetzte Tiere) *** 15 *** *** 10 *** 5 *** 0 WT PRG-1-KO P5-6 P9-11 P10-14 P20-22 P25-27 P30-35 P42-56 P21 Trimbuch et al 2009 Beobachtungen zur PRG-1-KO Mauslinie PRG-1-KO Mäuse entwickeln spontane Anfälle ca. drei Wochen nach der Geburt Elektrophysiologische Messungen bei P21 in PRG-1-KO Mäusen In Kooperation mit der AG Prof. Dietmar Schmitz vom Neurowissenschaftlichen Forschungszentrum (NWFZ) CA1 Pyramidenzellen von PRG-1-KO Mäusen sind übererregbar WT WT KO KO 0.5 mV 1.6 CA1 50 ms 1.4 KO 1.2 S ch fe af r- K CA l ol er at al Het 1.0 0.8 WT 0.6 0.4 3 DG 0.2 0.0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 F iber Volley [mV] Keine Veränderungen der intrinsischen Eigenschaften der Zellen mEPSC WT mIPSC KO ** mIPSC Frequenz [Hz] Erhöhte mEPSC Frequenz 4 mEPSC Frequenz [Hz] KO Schnitte sind übererregbar (Messung der exzitatorischen Feldpotentiale) 3 2 1 0 WT KO 15 pA 3 1s 2 1 0 WT KO NWFZ, P. Beed, AG Schmitz Post-Präsynaptische retrograde Aktion von PRG-1 präsynaptischer Terminal Glu ? Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Synaptischer Spalt WT KO Postsynaptisches glutamaterges Neuron Trimbuch et al 2009 In utero Elektroporation von PRG-1-KO und PRG-1-cKO Mäusen PRG-1 Expression / Deletion in einzelnen CA1 Neuronen 45° Plasmid DNA CA1 + L.V. Ctx - P21 R.V. 1 CA CA3 DG E15 0° 3.V. CA3 DG In utero Elektroporation von PRG-1-KO und PRG-1-cKO Mäusen PRG-1 Expression / Deletion in einzelnen CA1 Neuronen PRG-1 Expressionsvektor Cla I mPRG-1 cDNA 2.3 kb Cre Rekombinase Expressionsvektor BamH I Hind III Cre Xho I Cla 1 kb + T4 DNA Polymerase EcoR V Trimbuch et al 2009 In utero Elektroporation von prg-1 in PRG-1-KO Mäusen PRG-1 Expression in einzelnen CA1 Neuronen KO CA3 Präsynapse CA1 al er t la ol K rfe f ha Sc KO CA 3 PRG-1-KO Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu synaptischer Spalt PRG -1 -1 PRG KO DG GFP +PRG-1 CA1 Postsynapse -/- -/- 15 pA PRG-1-KO (+PRG-1) 1s mEPSC Frequenz [Hz] 5 4 PRG-1 3 ** 2 1 0 KO KO + PRG-1 „Rescue of function“ Merge Trimbuch et al 2009 In utero Elektroporation von cre in PRG-1-cKO Mäusen prg-1 Deletion in einzelnen CA1 Neuronen WT CA3 Präsynapse CA1 l ra e t lla o r-K ff e ha Sc WT CA 3 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu synaptischer Spalt PRG -1 -1 PRG GFP WT DG KO CA1 Postsynapse fl/fl PRG-1-cKO (WT) 15 pA -/PRG-1-cKO (+Cre) 1s Phänotyp ist direkt verursacht durch fehlendes PRG-1 auf der postsynaptischen Seite mEPSC Frequenz [Hz] 5 * 4 PRG-1 3 2 1 0 WT Einzel-zellKO Nicht aufgrund genereller Entwicklungsstörungen des neuronalen Netzwerkes Merge Trimbuch et al 2009 Einfluss von PRG-1 auf die Phospholipid-vermittelte Signaltransduktion Einfluss des Phosphatase-Motifs auf die PRG-1 Funktion H253K Mutation einführen IUE von pPRG-1-H253K ergibt keinen „Rescue of function“ D1 D2 D3 KXXXXXXRP SXH RXXXXXHXXXD 119 LPP1 166 215 AKYTIGSLRP SFYSGHSSFSMYC LSRVSDYKHHWSDVT IQLSTGYQAP SFPSQHATLAAFA LTRITQYKNHPVDVY 197 PRG-1 248 296 PRG-1-KO PRG-1-KO + PRG-1 H253K H253K phosphatase domain mPRG-1 cDNA BamH I 2.3 kb identical AS AS with similar chemical structure pCAGmPRG1H253K 3 mEPSC Frequenz [Hz] Cla I GFP 2 merge 1 0 KO H253K Motiv beeinflusst Funktionsfähigkeit von PRG-1 Trimbuch et al 2009 Zusammenfassung LP A2 präsynaptischer Terminal Glu G Glu LP A2 Glia LP LP Glu Glu Glu Glu Glu G Glu LPA 2 Glu LP LP LP synaptischer Spalt LP LP LP Glia LP PRG -1 -1 PRG PSD ? ? L/LP postsynaptisches postsynaptisches glutamaterges glutamaterge Neuron Neuron ? Aufnahme Mechanismus ? Interaktionspartner Trimbuch et al 2009 In utero Elektroporation flag - Technik - Funktionsprinzip (ROSA26) Platicity-related Gene (PRG 1) GFP - Einleitung - Untersuchung zur physiologischen Rolle von PRG-1 anhand der IUE Zusammenfassung merge E19 (PRG1(flag)-pCAG Vorteile Nachteile • schnell und einfach • kostspielig • bestimmte Zellpopulationen selektierbar • Keine Aussage für Gesamtorganismus • Studie mehrerer Gene gleichzeitig • begrenzte Anzahl an Zellen wird transfiziert Ultrschall-gestütze IUE in utero Elektroporation slice-Elektroporation postnatale EP/virale Inj. S-EP P-EP/v.I. IUE UG-IUE E0 E9 E12 E16 E18 P0 P30 Danke für Ihre Aufmerksamkeit 2009 Thorsten Trimbuch*, Prateep Beed*, Johannes Vogt*, Sebastian Schuchmann, Nikolaus Maier, Markus Schuelke, Nora Streu, Olga Kieselmann, Irene Brunk, UlfStrauss, Hagen Wende, Carmen Birchmeier, Stefan Wiese, Michael Sendtner, Jan Baumgart, Beate Geist, Nicolai E. Savaskan, Anja U. Bräuer, Olaf Ninnemann, Dietmar Schmitz*, Robert Nitsch* PRG-1 is a novel player at the synapse , modulating excitatory transmission via lipid phosphate-mediated signaling CELL in press 2008 Timour Prozorovski*, Ulf Schulze-Topphoff*, Robert Glumm, Jan Baumgart, Friederike Schröter, Olaf Ninnemann, Elise Siegert, Ivo Bendix, Oliver Brüstle, Robert Nitsch, Frauke Zipp* and Orhan Aktas* Sirt1 critically contributes to theredox-dependent fate of neural progenitors Nat Cell Biol 10, 385-394 2007 Brandt, N., Franke, K. Rasin, M.R., Baumgart, J., Vogt, J., Khrulev, S., Hassel, B., Pohl, E.E., Sestan, N., Nitsch, R. and Schumacher, S. The neural EGF family member CALEB/NGC mediates dendritic tree and spine complexity. EMBO J26, 2371-2386
