Diss. ETH &+ - ETH E
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Diss. ETH &+& Diss. ETH No. 9677 Embryonic Chick Brain Cells as for a Potential Model Developmental Toxicity: An Immunocytochemical Study A dissertation submitted to the SWISS federal institute of TECHNOLOGY ZURICH degree of for the Doctor of Natural Sciences presented by Gabriella G. Wyle Gyurech - eidg. dipl. Apothekerin born April 3rd, citizen of Zurich accepted on (ZH) the recommandation of Prof. K. Dr. Ch. 1963 Battig, examiner Reinhardt, co-examiner Prof. T. Koller, co-examiner 1992 V Summary Optimal culture conditions for monolayer and aggregate with monolayers adequate To cultures had to be coated with differentiation of nerve of fetal calf and collagen chick brain cells in among other required, adequate supplementation an growth mechanically dissociated polylysine in order to enable time to inhibit same vivo conformity of our cell culture system, differentiation of three oligodendrocytes) with major cell types of the CNS we studied We found that including the cells in cultures showed nerve formation of a network in cells. Some of the cells in glial were on the other arranged Additionally, into occasional hand, layer a large a and their much spans. longer life triggered Our culture system demonstrated that cell types, timing an early patterns in monolayers as on suspected teratogen, glial fibrillary could be found. In found in aggregates. This of differentiation. However, well our system is course as an adequate model, of differentiation more we was not only of (ontogeny). species develop in very similar in aggregates. We conclude that cells from have very similar properties. compounds. Cadmium concentrations known to be toxic to humans. humans. In preferentially neurotoxic chloride differing was Phenytoin, a in concentrations which elicit CNS therapeutic concentrations, phenytoin changed of phenytoin. MPTP had cultures: In differentiated to myelinisation patterns of nerve cells. This mutagen effect may be potentials tyrosine hydroxylase cell types, and the extent of their cell culture with four model generally cytotoxic in in periphery of the aggregates. tissue from other embryonic tissue of different species toxicity in onset propose that we Furthermore, cultures based our differentiation, due to the closed tissue-like system of aggregates differentiation, but also of the We tested in vivo and in vitro. number of astrocytes could be found; these expression of these differentiation. Thus, and system closely parallels in vivo development in the ratios of our of no myelinisation could be probably in vivo monolayers but and the arrangement into distinct synapse-like knots towards the extensive differentiation is of extensive monolayers, protein (GFAP) positive astrocytes, aggregates, signs growth We also examined the immunocytochemical staining. in aggregates and the formation of positive cells excessive (nerve cells, astrocytes, monaminergic transmitter system with cell-type specific markers acidic an an of glial cells. verify in layers culture medium a Cell culture dishes for serum. cells but at the things, a reference to the effects in monolayer the growth teratogenic and aggregate monolayers we found only generally cytotoxic effects, indicating that no VI MPP+ had been synthesized. In aggregates, effects Ara-C typical was toxic and for MPP+, indicating that preferentially teratogenic toxic to glial and cells in quantitative measures are of the other hand, monolayers toxicity supprisingly good agreement with in vivo is a we found no of the and should be used toxicity; compounds which pass aggregates, to test for the the toxicity resulting from biotransformation. quick in our our cultures screen of overall short-term then be tested with teratogenicity of derivates of was in vitro system We submit that monolayer screen should or We found that both data. We propose that as a are effects, which indicates compounds promising screen for developmental toxicity in humans. can found neurotoxic in concentrations which mostly post-mitotic. in monolayer cultures we MPTP had been biotransformed to MPP+. in humans. In aggregates, that cells in two-week-old aggregates qualitative on compounds VII ZUSAMMENFASSUNG Optimierung der Kulturbedingungen fur Flach- Die mechanisch dissoziierten Zellen die von Ganzhirnen Zugabe von foetalem Kalberserum Kulturschalen mit Entwicklung Kollagen und zum Aggregatkulturen und aus embryonaler Hiihnchen ergab, Kulturmedium und die dass Beschichtung der Polylysine unerlasslich waren fur eine gute der Nervenzellen und fur eine Unterdriickung von ubermassigem Gliawachstum. Ubereinstimmungen unserer Kulturem mit in vivo Um verfolgten wir die Entwicklung von drei Verhaltnissen zu iiberpriifen, des ZNS, namlich der Hauptzelltypen Nervenzellen, der Astrocyten und der Ohgodendrocyten, und der Zellen des monaminergen Transmitter-Systemes mittels zellspezifischer vitro. Dabei zeigte sich, dass Nervenzellen in den Kulturen Eigenschaften differenzierter Zellen annahmen, wie eines Netzwerkes in Flachkulturen, die Schichten in Anordnung zum Marker in vivo und in weitgehende Beispiel die Ausbildung der Nervenzellen in deutlichen Aggregaten oder die Bildung synapsenartiger Verdickungen Tyrosinhydroxylase-positiven Zellen. in Gliazellen entwickelten sich vereinzelt zu (glial fibrillary acidic protein)-positiven Zellen mit der fur Typ-2 Astrocyten GFAP typischen Sternform in Flachkulturen. Myelinisierung nachgewiesen werden. Anzahl von vereinzelt Zellen zu Hingegen In konnte in Flachkulturen keine Aggregatkulturen GFAP-positiven Astrocyten und nachgewiesen werden. wegen deren dreidimensionalen, Lebensdauer der Kulturen in Zellen in differenzierte eine grosse auch Myelinisierung konnte Aggregatkulturen konnten sich vermutlich organotypischen Anordnung und der viel Aggregaten viel weitgehender entwickeln als langeren in Flachkulturen. Unser Zellkultursystem loste ein friiheres Einsetzen der aus als dies in vivo der Fall des proportionalen war. Hingegen Differenzierung fanden wir eine gute Vorkommens der verschiedenen gut mit den in vivo Ablaufen iiberein. Wir schliessen vorliegende Zellkultursystem nicht nur Ubereinstimmung Zelltypen mit Verhaltnissen. Weiter stimmte der Ablauf und der Grad der aus der Zellen in vivo Differenzierung sehr diesen Daten, dass das ein gutes Model fur in vivo Differenzierung ist, sondern auch dass der Ablauf der Entwicklung (Ontogenese) der verschiedenen Zelltypen durch unser anderen Arbeiten Kultursystem richtig wiedergegeben wird. zeigte eine weitgehende Ubereinstimmung Zellkulturen mit Zellkulturen dass embryonales besitzt. aus Hirngewebe anderer der Der Entwicklung Tierspezies. Gewebe verschiedener Tierarten sehr ahnliche Vergleich Wir mit unsere folgerten, Eigenschaften vin Die Zellkulturen wurden darauf mit 4 Modellsubstanzen getestet: Cadmiumchlorid hatte in toxisch unseren Zellkulturen, in Konzentrationen, welche auch fur den Menschen wirken, eine allgemein cytotoxische Wirkung. Phenytoin, ein potentielles Teratogen, war in Konzentrationen, welche Toxizitat fiihren, vorallem neurotoxisch. In Phenytoin einem zu beim Menschen vorallem therapeutischen abartigen Wachstum von Nervenzellen. zu ZNS- Konzentrationen fiihrte Diese mutagene Wirkung von Phenytoin auf Nervenzellen konnte ein Hinweis auf die teratogene Wirkung von Phenytoin sein. MPTP wirkte unterschiedlich in Flach- und Aggregatkulturen: In Flachkulturen fanden wir MPTP vor, ein Hinweis Wirkung von lediglich eine allgemein darauf, dass MPTP nicht zum toxische neurotoxischen MPP+ metabolisiert worden war. In Aggregatkulturen hingegen fanden wir eine ausgepragte, fiir MPP+ typische Neurotoxizitat. Ara-C war in Falchkulturen in erster Linie toxisch fur Gliazellen, in Konzentrationen welche fur den Menschen toxisch und teratogen sind. In Hinweis, dass zur Aggregaten hingegen war Zeit der Behandlung keine Wirkung feststellbar, die Zellen schon ein grosstenteils postmitotisch waren. Qualitativ aber auch quantitativ an unseren deshalb in waren Zellkulturen in guter unseren Erfahrungen Ergebnisse Ubereinstimmung Zellkulturen ein Substanzen auf Toxizitat und die geeignetes toxikologischen Priifungen mit in vivo Daten. Wir in vitro Teratogenitat gefunden mit den verschiedenen der System zur Pruning von zu haben. Aufgrund Zellkultursystemen schlagen wir vor, Flachkulturen fur schnelle Kurzzeittests zur Ermittlung des Wirkung von Metaboliten iiberpriift werden. der dass toxischen Potentials einer Substanz verwendet werden. In einem zweiten Schritt kann mittels die toxische glauben Aggregatkulturen
