Magnetresonanzspektroskopie an lebenden neuronalen Stammzellen

39. DGMP Tagung 2008 in Oldenburg
Magnetresonanzspektroskopie an lebenden neuronalen
Stammzellen
Ramm, Paul1,2; Plötz Sonja1; Couillard-Després, Sébastien1; Kremer, Werner2;
Kalbitzer, Hans Robert2; Aigner, Ludwig1
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Universität Regensburg, Klinik und Poliklinik für Neurologie
Universität Regensburg, Institut für Biophysik und biophysikalische Chemie
Einleitung:
Das Darstellen von Stammzellen in vivo ist sowohl für die Diagnostik als auch für die Therapieüberwachung
bei einer Vielzahl von Erkrankungen des Zentralnervensystems von großem klinischen Interesse. Ein Ansatz in
der Magnetresonanztomographie ist das Markieren von Stamm- und Vorläuferzellen in vitro mit magnetischen
Nanopartikeln [1]. Um jedoch nicht nur das Schicksal transplantierter Stammzellen verfolgen zu können,
sondern auch endogene Neurogenese sichtbar zu machen, wird eine Möglichkeit untersucht, spektroskopische
Unterschiede der einzelnen Zellarten und Differenzierungsstadien ortsaufgelöst zu detektieren. Um spätere in
vivo Messungen quantifizieren zu können, wird in einem ersten Schritt hochaufgelöste 1H-NMR Spektroskopie
an lebenden Zellkulturen verschiedener neuraler Zellarten in Abhängigkeit ihres Differenzierungsgrades
durchgeführt.
Material und Methoden:
Alle hochaufgelösten 1H-NMR in vitro Messungen werden an Bruker Advance Spektrometern durchgeführt,
deren Protonenresonanzfrequenzen bei 600 bzw. 800 MHz liegen. Neurale Stamm- und Vorläuferzellen des
embryonalen und adulten Nagergehirns werden als Neurosphären unter serumfreien Bedingungen kultiviert und
unterschiedlichen Differenzierungsbedingungen unterworfen [2,3]. Die Zellen werden dreimal mit PBS-Puffer
gewaschen um Rückstände der Nährmedien zu entfernen. Zellpellets bestehend aus ca. 1-10 Millionen Zellen
werden in Agarose eingebettet um eine möglichst homogene Verteilung in der Probe und damit geringe
Linienbreiten in den Spektren zu erhalten. Spätestens 30 min nach der Probenpräparation werden sog. PulseAcquire-, T2-gefilterte CPMG- und diffusionsgewichtete LED [4] Spektren mit gradientenbasierter Wasserunterdrückung (Excitation Sculpting) [5] aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen werden durch den
Vergleich mit diversen Datenbanken [6-8] und mit Hilfe von zweidimensionalen NMR-Messungen (COSY und
TOCSY) zugeordnet.
Analyse:
Ausgewertet werden zum einen die Intensitäten typischer Metabolite, die in neuralen Zellen vorkommen, u.a.
Cholin, Creatin, NAA und Laktat. Zum anderen werden Veränderungen der Intensitätsverhältnisse von
Resonanzen der Methylenketten zu denen der terminalen Methylgruppen quantifiziert, die auf die Bildung von
zytoplasmatischen Fetttröpfchen schließen lassen [9]. Zusätzlich werden die Spektren mit Hilfe statistischer
Methoden, wie z.B. der Hauptkomponentenanalyse (PCA) [5], auf zell- und differenzierungsstypische Muster
hin untersucht. Parallel zur MR Untersuchung werden die Zellen hinsichtlich ihrer Identität mittels
Expressionsanalysen zelltypspezifischer Marker analyisiert.
Zusammenfassung und Ausblick:
In vitro NMR-Spektren von lebenden, neuralen Zellen unterschiedlichen Ursprungs, Zustandes und
Differenzierungsgrades zeigen signifikante Abweichungen bzgl. der Zusammensetzung typischer Metabolite und
Lipide [10]. In zukünftigen in vivo Messungen werden die voxelbasierten Spektren des sog. Magnetic Resonance
Spectroscopic Imaging (MRSI) bzgl. dieser Unterschiede mit Hilfe von a priori Methoden und statistischen
Analysen untersucht.
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39. DGMP Tagung 2008 in Oldenburg
Literatur:
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Magn. Reson. Ser. A, 115, 260-264, 1995
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Wishart DS et al., HMDB: The Human Metabolome Database, Nuc. Acid Res., 35, 2007, www.hmdb.ca
Biological Magnetic Resonance Data Bank, www.bmrb.wisc.edu
Spectral Database for Organic Compounds, http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/cre_index.cgi?lang=eng
Hakumäki J et al., 1H NMR visible lipids in the life and death of cells, Trends Biochem. Sci., 25(8), 357-362, 2000
Manganas et al., Magnetic Resonance Spectroscopy Identifies Neural Progenitor Cells in the Live Human Brain,
Science, 318, 960, 2007
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