Isolation von Insertionssequenzen mit Hilfe von sacB

Isolation von Insertionssequenzen mit Hilfe von sacB
Insertionssequenzen (IS) sind transponierbare Elemente, die keine Gene für selektierbare
Eigenschaften tragen sondern nur für ihre Transposition kodieren. Eine positive Selektion für
solche Elemente ist daher nicht möglich. Da bei Transposition in ein Gen dieses Gen mutiert, kann
eine indirekte Identifizierung von IS über die Analyse spontaner Mutanten erfolgen. Zur direkten
Selektion spontaner (Insertions-)Mutanten kann das (zumindest in Gram-negativen Bakterien)
konditional letale Gen sacB von Bacillus subtilis genutzt werden. Das sacB-Gen kodiert für das
Enzym Levansucrase, das durch Saccharose induziert wird und in B. subtilis als Exoenzym
vorliegt. Es katalysiert die Reaktion Saccharose + Akzeptor (z.B. Fruktose) → Glukose + Fruktose
– Akzeptor. Es vermittelt auf diese Weise die Levansynthese, die mit der Saccharosespaltung
gekoppelt ist. In Gram-negativen Bakterien führt die Expression dieses Gens in Medien mit
Saccharose zur Lyse der Zellen. Zellen, die das Gen (z.B. auf einem Plasmid) tragen, können
folglich auf Medien mit Saccharose keine Kolonien bilden, es sei denn, das sacB-Gen ist durch
eine spontane Mutation inaktiviert worden oder das Plasmid und damit das sacB-Gen ist verloren
gegangen. Durch plattieren auf Medien mit Saccharose und dem Antibiotikum, mit dem für das
Plasmid selektiert wird, wird für das Plasmid mit einem inaktiven sacB-Gen selektiert. Durch die
Analyse der Plasmide der Saccharose-resistenten Klone kann zumindest in einem Teil der
Mutanten gezeigt werden, dass die Ursache für die Saccharose-Resistenz die Insertion fremder
DNA in das sacB-Gen ist.
Das sacB-Gen ist außerdem bei einer gezielten Mutagenese hilfreich. Bei dieser Mutagenese wird
zunächst das Gen, das man mutagenisieren möchte, in ein Plasmid kloniert, das in dem zu
mutagenisierenden Stamm nicht replizieren kann. Danach wird das Gen – meist in vitro – mutiert.
Das Plasmid mit dem mutierten Gen wird dann in den zu mutierenden Stamm übertragen. Durch
homologe Rekombination kann das Wildtyp-Allel gegen das mutierte Gen ausgetauscht werden.
Wenn auf dem Plasmid außerdem sacB liegt, kann auf einem Medium mit Saccharose (aber ohne
Antibiotikum zur Selektion für das Plasmid) für die komplette Rekombination (gene replacement)
selektiert werden.
Praktischer Teil
Material:
E. coli S17-1 pLU4 (bla, sacB)
Medien:
LB (Luria Broth, Luria Agar), Komplettmedium für E. coli:
10 g Pepton (tryptisch verdaut)
5 g Hefeextrakt
5 g NaCl
(15 g Agar)
ad 1000 ml aqua dest.
30 %ige Saccharose-Lösung
Antibiotikumkonzentration: - Ampicillin (Amp) 100 µg/ml)
Durchführung:
E. coli S17-1 PLU4 wird in 3 ml LB in Gegenwart von Ampicillin über Nacht kultiviert
die gewachsene Kultur wird morgens 1:10 in LB Amp umgesetzt und nach ca. 4h
Inkubation bei 30°C in 0,9 % NaCl verdünnt (10-1, 10-2, 10-3) und je 0,1 ml auf LB
Agarmedium mit 15 % Saccharose und Ampicillin (100 µg/ml) ausplattiert
zur Bestimmung der Gesamtzellzahl wird eine Verdünnungsreihe angelegt und die 10-4,
10-5, 10-6 Verdünnung ausplattiert (je 0,1 ml) auf LB Amp
auf dem Saccharose-Medium gewachsene Kolonien werden noch einmal auf das
gleiche Medium gepickt um falsch positive Klone zu identifizieren
je 10 Klone werden dann in 4 ml LB Amp über Nacht kultiviert
von den gewachsenen Kulturen wird eine Plasmidpräparation durchgeführt
zum Vergleich wird vom ursprünglichen Stamm (S17-1 pLU4) ebenso das Plasmid
isoliert
Auswertung:
Bestimmen Sie die Frequenz der sacB Inaktivierung. Vergleichen Sie die isolierten Plasmide.
Anhand der beigefügten Restriktionskarte soll die Lokalisation des IS Elements und die Größe
bestimmt werden. Dazu sollen entsprechende Restriktionsspaltungen durchgeführt und
ausgewertet werden. Anhand von vorhandenen IS Sequenzen soll eine mögliche Zuordnung der
erhaltenen IS Elemente in pLU4 ermitt elt werden.
KpnI
EcoRV
(100)
EcoRV
(6800)
KpnI
(6400)
pnI