Die Institute Institut für Molekulare Virologie

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Die Institute
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Institut für Molekulare Virologie
Institute of Molecular Virology
Neuherberg
(Direktor / Director: Prof. Dr. Volker Erfle)
ie Bedeutung von Infektionen im allgemeinen, und besonders die von
Virusinfektionen, für bestimmte wichtige Erkrankungen des Menschen nimmt zu
als Folge der weitreichenden Veränderungen
unserer Lebensumstände. Zum einen handelt es sich um Infektionskrankheiten mit
neu auftretenden Erregern wie AIDS und
BSE. Zum andern spielen veränderte Wechselwirkungen zwischen Virus und Wirtsorganismus unter neuen Umweltbelastungen
oder bei der Anwendung neuer Therapien
eine Rolle. Die Schwerpunkte der Arbeiten
liegen daher in der Aufklärung von Mechanismen der Virus-Persistenz, der VirusVermehrung und der Krankheitsentstehung
durch Virus-Infektionen auf dem Hintergrund sich verändernder Belastungen des
Wirtsorganismus. Auf der Grundlage der
gewonnenen Erkenntnisse werden neue
diagnostische und therapeutische Konzepte
entwickelt. Das Wissen um die Strategien,
mit denen Viren und Zellen interagieren und
dabei den zellulären Stoffwechsel und das
Immunsystem beeinflussen, bietet zudem
einen Ausgangspunkt, Viren oder VirusBestandteile als Werkzeuge für die Immunund Gentherapie zu verwenden.
Ziele der derzeitigen Arbeiten sind
• Beschreibung der Einflüsse retroviraler
Kontrollgene und -elemente auf die Steuerung zellulärer Prozesse.
• Aufklärung zellulärer Mechanismen, die
die Replikation von Retroviren kontrollieren („antivirale Faktoren“).
• Entwicklung und Anwendung viraler Vektoren für Immunprophylaxe und Therapie
mit Schwerpunkt Pockenvirusvektoren.
• Untersuchung der spezifischen Immunantworten bei Virus-Infektion und nach Vakzi-
D
he importance of infections, particularly of viral infections, for the development of major human diseases is
increasing as a result of the far-reaching
changes taking place in our way of life.
Health problems not only result from epidemics associated with new pathogenic
viruses or agents, like AIDS or BSE, but also
from changes in the interaction between
viruses and the host organisms as a result
of environmental pollution or the application
of new therapies in medicine. Therefore,
research in the Institute of Molecular
Virology is focused on the mechanisms of
viral persistence, viral replication, and the
development of disease following virus
infections, with respect to the changing
burden on the host organism. The results
obtained will be used to develop new
diagnostic and therapeutic concepts. The
knowledge of the strategies with which
viruses infect cells and influence cellular
pathways and the immune system will
provide a basis for the use of viruses – or
parts of them – as tools for immune and
gene therapy.
Current research focuses on the
following.
• Effects of retroviral control genes and
elements on cellular regulation processes
• Elucidation of cellular mechanisms that
control retroviral replication (antiviral
factors)
• Development and application of viral
vectors in immunoprophylaxis and
therapy with special emphasis on pox
virus vectors
• Evaluation of specific immune responses
in viral infections and after vaccination
and immune therapy (immunomonitoring)
T
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nierung und Immuntherapie (Immunmonitoring).
Zum Jahresende waren im Institut 16 Wissenschaftler, 4 technische Mitarbeiter und
9 Doktoranden beschäftigt. 9 der MitarbeiterInnen wurden über Drittmittel finanziert.
Die Transportsignale des HIV-RevProteins und ihre Rolle bei der intrazellulären Lokalisation von HIV-Rev
R. Brack-Werner
Proportion of nuclear fluorescence (%)
In HIV-infizierten Personen können sich
Virus-Reservoirs bilden, die nicht nur der
Therapie mit antiviralen Medikamenten,
sondern auch dem Immunsystem nur
schwer oder gar nicht zugänglich sind.
Solche möglichen Reservoirs sind z.B. die
Astrozyten des Gehirns, die zwar mit HIV
infiziert werden, aber nur wenige Nachkommenviren produzieren. Unsere Vorarbeiten
haben gezeigt, dass diese Astrozytenspezifische Blockade auf einer fehlerhaften
Funktion des regulatorischen Rev-Proteins
von HIV beruht.
Die Hauptfunktion von Rev ist der Transport von im Kern transkribierter viraler RNA
ins Zytoplasma. Rev nutzt zelluläre Transportwege, um zwischen Zellkern und Zyto100
RevM5-GFP
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15.5
10
0
GFP
Phase
0h
1h
2h
20 h
Abb. 1: Zeitabhängige, nukleäre Akkumulation
von RevM5-GFP nach Behandlung der Zellen mit
dem Kernexportinhibitor Leptomycin B
194 GSF
At the end of the year, there were
16 scientists, 4 technicians, and 9 postgraduate students at the Institute,
9 of them supported by grant funds.
plasma zu pendeln. In infizierten Zellen, in
denen HIV stark vermehrt wird, akkumuliert
Rev im Kern. In Zellen, wie z.B. den Astrozyten des Gehirns, in denen HIV gar nicht
oder nur schwach repliziert wird, findet sich
das Rev-Protein vor allem im Zytoplasma.
In eukaryotischen Zellen sind Kern und
Zytoplasma durch eine Membran getrennt.
Der Transport von regulatorischen Proteinen
zwischen Zytoplasma und Kern erfolgt aktiv
durch die Kanäle nukleärer Porenkomplexe
über die Erkennung von Transportsignalen
oder passiv durch Diffusion. Viele verschiedene Signale sind bekannt, die den nukleären
Import (NLS: nuclear localization signals),
den nukleären Export (NES: nuclear export
signals) oder den Transport in beide Richtungen (NS: nucleocytoplasmic shuttling
signals) steuern. Rev besitzt ein nukleäres
Lokalisationssignal (NLS, AA35-50) und ein
nukleäres Exportsignal (NES, AA75-84). Die
REV-NLS-Region wird erkannt durch den
nukleären Transportrezeptor Importin β, die
Rev-NES-Region durch den Rezeptor Crm-1.
Mit Hilfe von Rev-Mutanten, ihrer Fluoreszenzmarkierung durch Fusion mit GFP
(green fluorescent protein) und quantitativer
Fluoreszenzmikroskopie untersuchten wir
den Einfluss der Transportsignale NLS und
NES auf die nukleäre Lokalisation des
Rev-Proteins infolge aktiver Transportvorgänge. Eine passive Diffusion von Rev
zwischen Zytoplasma und Zellkern konnte in
unseren Experimenten durch die Verwendung von großen Rev-Fusionsproteinen mit
mehreren GFP-Domänen ausgeschlossen
werden.
Die in der NLS-Region veränderte RevMutante M5 wurde auch weiterhin aktiv in
den Kern transportiert, obwohl sie nicht
mehr an den Transportrezeptor Importin β
binden kann. Um die Akkumulation im Kern
und somit auch die Sichtbarkeit des fluoreszierenden Proteins zu verstärken, wurden
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die Zellen in diesen Untersuchungen mit
dem Export-Inhibitor Leptomycin B behandelt (Abb. 1). Eine solche Akkumulation von
RevM5 im Zellkern konnte auch durch Inaktivierung der NES-Region erzielt werden.
Experimente mit den für den Export wichtigen NES-Sequenzen zeigten zudem, dass
mit dieser Region auch Import-Aktivitäten
verbunden sind. Es ist uns gelungen, den
für diese bidirektionale Aktivität verantwortlichen Bereich durch Mutationsanalyse zu
identifizieren (AA 77-80).
Unsere Ergebnisse weisen darauf hin,
dass HIV-Rev beide bisher bekannnten
Transportsignale für die nukleäre Lokalisation nutzen kann und zudem in der Lage ist,
auch über Importin β-unabhängige Transportmechanismen in den Zellkern zu gelangen. Zukünftige Untersuchungen haben ein
besseres Verständnis dieser nukleären
Transportwege und -mechanismen zum Ziel,
die der mangelhaften Funktion des RevProteins und somit letztendlich der geringen
Virusvermehrung in Gehirnzellen zugrunde
liegen.
wurden. Mit Hilfe dieses Chips können unter
anderem Expressionsprofile endogener Retroviren in unterschiedlichen menschlichen
Geweben untersucht werden. Abbildung 2
zeigt als Beispiel das HERV-Expressionsprofil von T47D-Zellen, einer menschlichen
Brustkrebszelllinie, die nach Behandlung mit
Steroidhormonen retrovirale Partikel freisetzt. Von den in T47D-Zellen aktiven HERVTypen werden zwei unterschiedliche HERVRNA-Genome, das mit dem Mausmammatumorvirus (MMTV) verwandte HERV-K-T47D
und das mit dem murinen Leukämievirus
(MLV) verwandte HERV-FRD, in Partikel
verpackt. Anhand des Retrovirus-Chips
konnte auch gezeigt werden, dass endogene
Retroviren zelltyp-spezifisch exprimiert
werden und verschiedene Gewebe anhand
der Expressionsmuster unterschieden werden können. Untersuchungen an MenschMaus-Hybridzelllinien ergaben Expressions-
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Nachweis der Aktivität humaner
endogener Retroviren mit Hilfe eines
Retrovirus-spezifischen DNA-Chips
C
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E
F
Ch. Leib-Mösch
G
Die mehr als 8% retrovirale Sequenzen im
humanen Genom (HERVs) sind zu einem
großen Teil noch immer aktiv. Insbesondere
ihre regulativen Einheiten, die sogenannten
LTRs, können die Transkription von Genen
steuern, wie wir anhand von isolierten LTRSequenzen in Zellkultur gezeigt haben. Um
nun die endogene Aktivität dieser retroviralen Elemente in verschiedenen menschlichen Zellen und Geweben verfolgen zu
können, haben wir einen Microarray entwickelt, der den gleichzeitigen Nachweis der
wichtigsten bekannten endogenen und
exogenen Retroviren anhand ihrer pol-Gene
(reverse Transkriptase) erlaubt. Das Testsystem basiert auf einer Multiplex-PCR mit
fluoreszenzmarkierten Primern. Die Amplifikate werden anschließend an einen Glaschip hybridisiert, auf den vorher Retrovirusspezifische Oligonukleotide aufgebracht
H
B
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HERV-K-T47D
B
C
D
HERV-FRD
E
F
G
H
Abb. 2: Aktivitätsprofil humaner endogener
Retroviren in der Brustkrebszelllinie T47D. Nicht
alle der in T47D-Zellen aktiv exprimierten HERVSequenzen (A) werden in retrovirale Partikel (B)
verpackt. Die Dots A1, A7, D1, E1, E12 und H1
sind Markierungspunkte, die zur Lokalisierung
des Arrays dienen.
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profile, die sich von beiden parentalen
Zelllinien ableiten. Weitere Anwendungsbereiche für den Retrovirus-spezifischen Microarray sind das Überwachen von Vektorpräparationen, die z.B. für gentherapeutische Zwecke eingesetzt werden sollen, um
mitverpackte endogene Mäuseretroviren
aufzuspüren oder der Nachweis der Übertragung animaler Retroviren auf menschliche
Zellen durch Xenotransplantation.
Verträglichere Pockenimpfstoffe
G. Sutter, I. Drexler
Obwohl die Pocken seit 1976 weltweit als
ausgerottet gelten, haben die Diskussionen
um die aktuelle, weltpolitische Sicherheitslage Fragen zur Verfügbarkeit von Pockenimpfstoffen wieder aufgeworfen. Impfstoffe
gegen Pocken (Variola Virus; smallpox)
stehen zwar seit mehr als 200 Jahren zur
Verfügung, haben allerdings zum Teil erhebliche Nebenwirkungen. Inzwischen wurden
zwar besser verträgliche Impfstoffe entwickelt, Aussagen zu ihrer Schutzwirkung
beim geimpften Menschen konnten jedoch
aufgrund des Fehlens natürlicher Infektionen bisher nicht gemacht werden.
Die Grundlage aller Schutzimpfungen
gegen Pocken sind verschiedene Stämme
des Vaccinia-Virus, die durch viele Passagen
in der Zellkultur so abgeschwächt wurden,
dass sie – obwohl lebend – keine oder nur
schwache Krankheitsbilder hervorrufen.
Allerdings mangelte es bisher an Möglichkeiten, die Effizienz dieser Impfstoffe anhand spezifischer Immunparameter zu
beurteilen. Insbesondere Vaccinia Virusspezifische T-Zellantworten waren bislang
schwierig zu analysieren.
Nachdem wir das T-Zell-Epitop VP35#1
identifiziert hatten, waren wir in der Lage,
Vaccinia-spezifische zelluläre Immunantworten zu untersuchen. Dieses Epitop stammt
von einem viralen Strukturprotein und
wurde von humanen und murinen zytotoxischen CD8+ T-Zellen erkannt. Zudem findet
sich VP35#1 in allen Orthopoxviren, d.h.
auch in Variola-Viren. Beim Vergleich verschiedener Vaccinia-Virusstämme auf ihre
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VP35#1-spezifische Immunogenität in Mäusen wurde auch das Vaccinia-Virus MVA
(„modified vaccinia virus Ankara“) eingesetzt. Obwohl MVA sich im Wirtsorganismus
nicht mehr vermehren kann, induzierte
dieser Virusstamm eine ähnlich starke zelluläre Immunantwort wie die vermehrungsfähigen Vaccinia-Virusstämme. Außerdem
konnten wir durch Impfprophylaxe mit MVA
Mäuse vor einer schweren Erkrankung infolge einer Infektion mit dem vermehrungsfähigen Vaccinia-Stamm Western Reserve
schützen.
Wir konnten somit zeigen, dass sich die
Effizienz neuer Pockenimpfstoffe mit immunologisch messbaren zellulären Parametern
korrelieren lässt. MVA als nicht mehr vermehrungsfähiges Vaccinia-Virus ist ein
vielversprechender Kandidat für diese neue
Generation von sicheren, verträglicheren
Vakzinen.
Therapeutische Vakzinierung bei
HIV-Patienten
A. Cosma, D. Busch (KKG „Vakzinologie“)
Die Behandlung von HIV-infizierten Patienten
mit hoch-wirksamen, anti-retroviralen Medikamenten (HAART) kann die Virusvermehrung schnell und über lange Zeiträume
hinweg senken. Entsprechend konnte durch
Einführung medikamentöser Therapien die
Mortalität von HIV-Infektionen erheblich
vermindert werden. Allerdings kann direkt
durch HAART der Erreger weder eliminiert
oder die Replikationsaktivität vollständig
blockiert werden, noch stellt sich eine
Immunitätslage ein, die eine Viruskontrolle
nach Absetzen der Therapie ermöglicht.
Hinzu kommen Probleme der PatientenCompliance, Resistenzentstehung und die
beachtlichen Kosten einer – mit nicht unerheblichen Nebenwirkungen belasteten –
medikamentösen Langzeittherapie. Dass
HIV-spezifische Immunreaktionen prinzipiell
in der Lage sind eine HIV-Infektion zu kontrollieren und eine Progression hin zu AIDS
zu verhindern, zeigt eine spezielle Patientengruppe (so genannte „long-term non-progressors“, LTNP), die ohne HAART die
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Viruslast konstant halten kann. Durch die
kürzliche Entwicklung neuer Technologien
und Verfahren für die genaue Analyse HIVspezifischer Immunantworten, z.B. durch
den Einsatz von MHC-Tetrameren zur Untersuchung von zytotoxischen T-Zellen und
T-Helferzellen, konnte gezeigt werden, dass
sich LTNP insbesondere durch starke HIVspezifische T-Helferzellantworten von anderen Patienten unterscheiden. Zahlreiche
grundlagenwissenschaftliche Studien der
letzten Jahre bestätigen die zentrale Funktion von CD4+ T-Helferzellen innerhalb der
komplexen Regulationsvorgänge, die zur
Ausbildung schützender Immunantworten
notwendig sind. Auf Basis dieser Erkenntnisse könnte eine therapeutische Impfung,
die das Gleichgewicht bestehender HIVspezifischer Immunreaktionen zu einer
verbesserten Virus-Kontrolle hin verschiebt,
einen vielversprechenden neuen Therapieansatz darstellen.
HIV-Nef ist ein nach Infektion früh exprimiertes regulatorisches Protein, das wesentlich zur Virulenz von HIV und zur Pathogenese von AIDS beiträgt. Damit stellt HIV-Nef
eine attraktive Zielstruktur für die Entwicklung von Impfstoffen dar. Impfvektoren auf
Basis des replikations-defizienten Vaccinia
Stamms „MVA“ haben in den bisherigen
klinischen Anwendungen insbesondere
durch ihre gute Verträglichkeit und Sicherheit sowie ihre starke Immunogenität überzeugt. Dabei werden mit MVA Immunisierungen nicht nur zytotoxische T-Zellen
aktiviert, es lassen sich auch effektive CD4+
T-Zellantworten und Antikörper-Bildung
nachweisen.
Wir konnten kürzlich erstmals die Effekte
einer therapeutischen Impfung mit einem
HIV-Nef-exprimierenden MVA-Vektor innerhalb einer klinischen Studie untersuchen.
Hierzu wurden 10 chronisch HIV-infizierte
Patienten, die sich seit einiger Zeit unter
medikamentöser Behandlung befinden,
geimpft und die nachfolgenden Veränderun-
gen auf HIV- bzw. Nef-spezifische Immunreaktionen mit modernsten Immunmonitoring-Techniken überwacht. Die Impfung
selber zeigte keine ersichtlichen Nebenwirkungen, insbesondere ließen sich keine
negativen Effekte auf die bestehende HIVErkrankung nachweisen. Gleichzeitig konnten in den meisten Patienten deutliche
Immunreaktionen auf die Zielstruktur HIVNef gemessen werden. Interessanterweise
bestanden diese Immunreaktionen insbesondere aus Nef-spezifischen T-Helferzellantworten, die vor Beginn der Behandlung
in keinem der Patienten nachweisbar waren.
Diese Daten zeigen nicht nur auf, dass durch
die therapeutische Immunisierung eine
zuvor unterdrückte HIV-spezifische T-Helferzellpopulation im Patienten reaktivierbar ist,
in einigen der Patienten ließen sich nach
Impfung sogar Mengen an HIV-spezifischen
T-Helferzellen nachweisen, wie sie für
Patienten mit Medikamenten-unabhängiger
Viruskontrolle (LTNP) typisch sind. Möglicherweise kann also eine therapeutische
Impfung die Qualität spezifischer Immunität
so modulieren, dass sich eine verbesserte,
vielleicht sogar Medikamenten-unabhängige
Viruskontrolle einstellt.
Diese faszinierende Interpretation unserer
Befunde wird weiter dadurch unterstützt,
dass der am besten auf die Impfung angesprochene Patient bis heute keinen weiteren
Anstieg der Viruslast gezeigt hat, obwohl die
Therapie mit anti-viralen Medikamenten
abgesetzt wurde. Allerdings zeigten die
meisten anderen Patienten, die mit einer
Therapie-Unterbrechung einverstanden
waren (insgesamt 6), keine verbesserte
Kontrolle der Infektion und mussten schnell
wieder auf eine medikamentöse Therapie
umgestellt werden. Möglicherweise ist dies
ein Hinweis darauf, dass für eine weitere
Erfolgsverbesserung der therapeutische
Vakzinierung zukünftig neben HIV-Nef
weitere Zielstrukturen in das Impfschema
integriert werden sollten.
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Zusammenarbeit
Der Leiter des Instituts ist o. Univ.-Professor für Virologie
und Leiter des Instituts für Virologie der Technischen
Universität München. Mit der TU München bestehen
außerdem Kooperationen innerhalb des Sonderforschungsbereiches 456 („Zielstrukturen für selektive
Tumorinterventionen“). Mit der LMU München bestehen
Kooperationen in den Sonderforschungsbereichen SFB
Transregio 6007 („Chromatin: Aufbau und Vererbung von
Struktur und Genaktivität“) und SFB 455 („Virale Funktionen und Immunmodulation“). Enge Kooperationen
bestehen darüber hinaus mit dem Klinikum Mannheim
der Universität Heidelberg.
Im Rahmen des Helmholtz (HGF) Forschungsbereichs
„Gesundheit“ integrierte sich das Institut in dem Programm „Infection & Immunity“ und kooperiert mit
anderen HGF-Einrichtungen u.a. auf den Gebieten
„Pathogenese“, „Mikroorganismen“ und „Prävention &
Therapie“. Die Entwicklung von viralen Vektoren für
Gentherapie und Vakzinierung wurde in Kooperation mit
nationalen und internationalen Forschungseinrichtungen
innerhalb der HGF-Strategiefonds „Infektionsabwehr und
Krebsprävention“ und „Virale Regulationsfaktoren:
Einfluss auf zelluläre Gene und ihre Rolle bei AIDS und
Tumorentstehung“ durchgeführt.
Kooperationen bestehen auch mit den Verbünden
FORGEN („Neue Vektoren für die Gentherapie“) und
FORPRION („The role of activated retroviral genes as
cofactors in prion-induced spongiform encephalopathy“)
der bayerischen Forschungsstiftung sowie verschiedenen
EU-Projekten („Development of nonreplicating poxviruses as new and improved recombinant vaccinia vectors“;
„Development of immunogenic and safe vaccinia virus
vaccines“; „Genomic HIV-1 vaccine trial“; „Novel vaccination strategies and vaccines for influenza control“;
„Increase in potency of vaccination with MVA vaccines”,
„AIDS vaccine integrated project (AVIP)”). Außerdem
besteht eine Kooperation mit Carl-Zeiss-Vision („Anpassung und Optimierung von Imaging-Verfahren“).
Ausgewählte Veröffentlichungen
Cosma, A., Nagaraj, R., Bühler, S., Hinkula, J., Busch, D.,
Sutter, G., Goebel, F., Erfle, V.: Therapeutic vaccination
with recombinant modified vaccinia virus Ankara-HIV-1
nef elicits a strong Nef specific T-helper cell response in
chronic HIV infected individuals. Vaccine 22, 21-29 (2003)
Demart, S., Ceccherini-Silberstein, F., Schlicht, S.,
Walcher, S., Wolff, H., Neumann, M., Erfle, V., BrackWerner, R.: Analysis of nuclear targeting activities of
transport signals in the human immunodeficiency virus
Rev protein. Exp. Cell Research 291, 484-501 (2003)
198 GSF
Drexler, I., Staib, C., Kastenmueller, W., Stevanovic, C.,
Schmidt, B., Lemonnier, F., Rammensee, H., Busch, D.,
Bernhard, H., Erfle, V., Sutter, G.: Identification of vaccinia
virus epitope-specific HLA-A*0201-restricted T cells and
comparative analysis of smallpox vaccines. PNAS USA
100, 217-222 (2003)
Seifarth, W., Spiess, B., Zeilfelder, U., Speth, C., Hehlmann, R., Leib-Mösch, C.: Assessment of retroviral
activity using a universal retrovirus chip. J. Virol.
Methods 112, 79 – 91 (2003)