Optimierung biologischer Systeme
Werbung
Vorlesung Biotechnologie für Bioinformatiker Juli 2004 Optimierung biologischer Systeme Christoph Wittmann & Elmar Heinzle Technische Biochemie, Universität des Saarlandes Einsatz biologischer Systeme in der Biotechnologie Citrat Ethanol EPO 1 Biotechnologische Produktion – Idealer Mikroorganismus Gewünschtes Produkt Substrat möglichst hoher Umsatz des Substrates in das gewünschte Produkt Biotechnologische Produktion – realer Mikroorganismus Gewünschtes Produkt Substrat Unerwünschte Regulation Katabolismus Unerwünschte Nebenprodukte Transport Anabolismus Optimierung der Zellen 2 Optimierung biologischer Systeme Genetischer Bauplan Eine Vielzahl an Genen codiert für den Phänotyp eines Mikroorganismus Optimierung durch Änderung des Bauplans (Mutation) Optimierung biologischer Systeme Wildtyp ungünstige Eigenschaften klassische Stammoptimierung rationale Stammoptimierung Produktionsstamm günstige Eigenschaften 3 Klassische Stammoptimierung Ungerichtete Mutation Chemische Agenzien, UV-Licht zufällige Schädigungen der DNA, zumeist Punktmutationen, Selektion / Screening Auswahl „guter“ Stämme aus der Vielzahl der Mutanten, Selektion auf gewünschte Eigenschaften eingesetzt in der Biotechnologie seit ca. 1950 (Strategie analog der Evolution) Ungerichtete Mutation zufällige Schädigungen der DNA geringe Überlebensrate 4 Selektion viele Stämme, kurze Zeit, quantitativ Primary Screen ca. 30.000 bis 300.000 Mutanten high-throughput miniaturisiert, automatisiert Secondary Screen die besten 50 bis 500 Mutanten weiterführende Untersuchungen Auswahl weniger Mutanten Weitere Verbesserung Anwendungsbeispiel Klassische Stammoptimierung Herstellung Feed-Back-resistenter Mutanten zur Über-Produktion von Aminosäuren Produktion von Lysin mit C. glutamicum 5 Beispiel - Klassische Stammoptimierung Herstellung Feed-Back-resistenter Mutanten zur Über-Produktion von Aminosäuren E A E B D C in Wildtyp-Stämmen unterliegt die Aminosäuresynthese typischerweise einer Feed-back-Inhibierung zumeist ist das erste Enzym des SWW kontrolliert Regulation der Lysin-Biosynthese in C. glutamicum Kultivierungsprofil des Wildtyps Lysin Intrazelluläre Akkumulation von Lysin und Threonin führt zum Abschalten der Synthese praktisch keine Sekretion von Lysin ins Medium Gewinnung von Produktionsmutanten über Ausschalten/Umgehung der Feed-Back-Inhibierung 6 Regulation der Lysin-Biosynthese in C. glutamicum Lysinproduktion ist kontrolliert über Feed-Back-Inhibierung der Aspartokinase Konformationsänderung des Enzyms nach Bindung von Lysin/Threonin ATP Aspartat ADP (A) P Aspartyl-P (B) Aspartat X Threonin Lysine Beispiel - Klassische Stammoptimierung Wildtyp deregulierte Mutante Aspartate Aspartate Threonine Ziel Stammoptimierung ∆-PDC Diaminopimelate Lysine keine Überproduktion von Lysin Threonine ∆-PDC Diaminopimelate Lysine Überproduktion von Lysin 7 Beispiel - Klassische Stammoptimierung Mutation des Wildtyps von C. glutamicum zur Produktion von Lysin Wildtyp Inkubation mit chemischen Agenzien, UV-Licht zufällige, ungerichtete Schädigung der DNA tausende von zufälligen Mutanten Einsatz toxischer Strukturanaloga zur Selektion Problem Feed-Back-Inhibierung durch L-Lysin COOH H2N CH CH2 CH2 CH2 CH2 CO H 2N CH OH CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 L-Lysin bindet WT-Aspartokinase NH2 Feed-Back-Inhibierung Bindung ist reversibel 8 Einsatz toxischer Strukturanaloga zur Selektion S(Aminoethyl)Cystein COOH H2N CH CH2 S CH2 CH2 COOH H2N CH CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 NH2 L-Lysin H CO H 2N CH OH CO CH 2 S CH 2 CH 2 H 2N CH OH CH 2 CH 2 CH 2 2 NH CH 2 AEC NH 2 L-Lysin bindet WT-Aspartokinase irreversibel, dauerhafte Inhibierung der Lysinsynthese, (Zelltod) bindet WT-Aspartokinase reversibel Inkubation von Mutanten in Anwesenheit von AEC COOH H2N CH CH2 S CH2 CH2 COOH H2N CH CH2 S CH2 CH2 NH2 NH2 H CO H 2N CH OH CH 2 S CH 2 CH 2 NH 2 AEC Mutante mit nicht mutierter Aspartokinase, nicht lebensfähig in Anwesenheit von AEC COOH H2N CH CH2 S CH2 CH2 AEC NH2 Mutante mit mutierter Aspartokinase (Mutation in Lysin-Bindungsstelle) Stamm lebensfähig in Anwesenheit von AEC 9 Selektion von Feed-Back-resistenten Mutanten von C. glutamicum zur Produktion von Lysin zuvor erhaltene, zufällige Mutanten Ausplattieren Selektions-Agar mit α-Amino-Ethyl-Cystein toxisches Struktur-Analogon von Lysin, irreversible Bindung der Aspartokinase an der Lysinbindungsstelle lebensfähige, wachsende Kolonien Mutation in der Lysin-Bindungsstelle der Aspartokinase Feed-Back-Resistente Stämme weiteres Screening Feed-Back-resistente Mutanten von C. glutamicum Wildtyp Feed-back resistente Mutanten 10 Schutz optimierter Stämme durch Patentierung Lysin-Patent für USA von Kyowa Hakko (Japan) von 1973 Klassische Stammoptimierung Selektion Mutation Analyse 11 Klassische Stammoptimierung ist ein Iterativer Prozess Classical Strain Improvement Mutagenesis Screening / Selection Klassische Stammoptimierung Vorteile leicht durchzuführen schrittweise Optimierung in aufeinander folgenden Mutations/Selektions-Zyklen möglich nur geringe Kenntnisse des Metabolismus notwendig fast jeder industriell genutzte Stamm ist heutzutage klassisch optimiert 12 Klassische Stammoptimierung Nachteile lange Dauer/ hoher Aufwand bis zum gewünschten Stamm Konstruktion von Dead-End-Mutanten Akkumulation unerwünschter Mutationen (ca. 10 pro Zyklus) (metabolic burden) „gute“ Mutationen können nicht kombiniert werden kein Wissenszuwachs über den Organismus genetische Änderungen eng begrenzt (einzelne Gene) Zielgerichtete Optimierung wünschenswert Verbesserung klassischer Optimierungsstrategien iterative Mutation Selektion Klassische Vorgehensweise 1x Mutation iterative Rekombination Genome Shuffling gezieltes „Kreuzen“ von Mutanten (Sex in the Tube) mit der Möglichkeit, gute Mutationen zu kombinieren, führt zu deutlich höheren Verbesserungssraten 13 The Power of Genome Shuffling 6.2 g/L Produkt 8.2 g/L Produkt 20 Jahre Arbeit, 20 iterative Zyklen 1 Million Assays 1 Jahr Arbeit, 2 iterative Zyklen 24.000 Assays 1 g/L Produkt 1 g/L Produkt Genome Shuffling Auswahl von 11 Mutanten Auswahl von 7 Mutanten VT sehr effektive Methode zur Optimierung von Stämmen, Kombination guter Mutationen, wenig Metabolic Burden NT kein rationaler Ansatz, Kenntnisgewinn, eingeschränkte Mutationen, Dead End Mutanten 14 Metabolic Engineering Targeted improvement of cellular activities by manipulation of enzymatic, transport, and regulatory functions of the cell with the use of rDNA technology. Jay Bailey (1991) Science Gezielte Manipulation der DNA durch Genetic Engineering (rekombinante DNA Technologie) Gen-Knockout Gen-Austausch Gen-Duplikation Gen-Insertion Zielgerichtete Modifikationen möglich Schlüssel zum Erfolg ist die Identifikation geeigneter Targets 15 Stammoptimierung durch Metabolic Engineering Analyse Synthese Design Metabolic Engineering Analyse Genom, Transcriptom, Proteom, Metabolom, Synthese Design Mutation, Genetic Engineering Knock-out, Amplifikation Metabolic Redirection Attenuation / Amplification Modification of Control viele erfolgreiche Anwengungen 16 Beispiele – Metabolic Engineering Steigerung der Produktausbeute Erweiterung des Produktspektrums Ethanol Aminosäuren (Glutamat, Lysin) 1,3-Propandiol Antibiotika Polyketide Biopolymere Xylitol Erweiterung des Substratspektrums Optimierung zellulärer Eigenschaften Pentose-Metabolismus zur Ethanolbildung Cellulose-Depolymerisierung Stärke-Abbau Xenobiotika-Abbau Änderung Stickstoff-Metabolismus Prevention von Overflow-Metabolismus Genetische Stabilität Verringerung Maintenance-Bedarf Änderung Substrat-Aufnahme Biotechnologische Produktion von L-Lysin Glucose NADP NADPH NH4+ Phosphoenolpyruvate Pyruvate Oxoglutarate Glutamate L-Aspartate 1 Oxaloacetate ATP Isocitrate ADP L-Aspartyl-phosphate NADPH NADP L-Aspartylsemialdehyde 2 L-2,3 Dihydropicolinate 3 Oxoglutarate NADPH NADP NADPH L-Threonineex NADP L-Piperidine2,6 dicarboxylate Succinyl-CoA CoA NH4+ NADPH N-Succinyl2-amino-6-ketopimelate Glutamate NADP Oxoglutarate • • • • • • • Biosyntheseweg Transport Nebenproduktbildung Precursorstoffwechsel Cofaktorsynthese Regulation Erhaltungsstoffwechsel L-Isoleucineex NH4+ NADPH 23 NADP N-Succinyl2,6-L,L-Diaminopimelate Succinate L,L-Diaminopimelate D,L-Diaminopimelate CO2 L-Lysine Optimierung 1 Austausch 2 Knockout 3 Amplifikation Aspartokinase HS-DH, HS-Kinase Dihydropicolinat-Reduktase L-Lysineex 17 Stammoptimierung durch Gen-Austausch Austausch Wildtyp-Stamm Produktions-Stamm mit alternativem Gen mutiertes Gen ursprünglich über klassische Optimierung gewonnen Optimierung der Lysinproduktion Aspartate Austausch Wildtyp-Gen für Aspartokinase gegen mutiertes Gen (301->Tyr) 3PG Threonine ∆ -PDC Feed-back resistente Aspartokinase Austausch eines einzigen Nukleotids gegenüber dem Wildtyp Lysin (g/L) LysC-Mutante Diaminopimelate Lysine Wildtyp Zeit (h) 18 Stammoptimierung durch zusätzliche Gen-Kopien (Amplifikation) Wildtyp-Stamm mit einem Produktsynthese-Gen Produktions-Stamm mit vielen Produktsynthese-Genen Optimierung der Lysinproduktion Aspartate Amplifikation von dap A (Dihydropicolinat-Reduktase) über Plasmid-codierte Expression 3PG Threonine ∆-PDC Diaminopimelate Lysine 19 Änderung des Produktspektrums Aspartate Lysinproduzent AK HD HK Threoninproduzent Threonin ∆-PDC Diaminopimelate Lysine Optimierung der Lysinproduktion Phosphoenolpyruvat Aspartate 3PG Threonine Amplifikation der WT-PEP-Carboxylase besseres Wachstum keine Erhöhung der Lysinbildung Amplifikation der WT-Aspartokinase schlechteres Wachstum keine Erhöhung der Lysinbildung ∆-PDC simultane Amplifikation von AK und PEPC Lysinbildung = 250 % vom Wildtyp ! Diaminopimelate Lysine Lysine schwierige Vorhersage genetischer Änderungen Stephanopoulos (2001) ECB 10, Madrid 20 Erweiterung des Substrat-Spektrums durch heterologe Expression eines SWW Nachwachsende Rohstoffe Produktion von Bioethanol Bakterien / Hefen Bioethanol CO2 Beispiel - Erweiterung des Substrat-Spektrums Bioethanol Produktion aus nachwachsenden Rohstoffen Gunasekaran und Chandra Raj (2001) Madurai Kamaraj University, India 21 Erweiterung des Substrat-Spektrums Z. mobilis als interessanter Organismus zur Ethanolbildung P= YP/S = erzielte Ethanol-Konzentration (g/l) Produktausbeute (g(g) Nellaiah, Karunakaran and Gunasekaran (1988) J. Ferment. Technol. Erweiterung des Substrat-Spektrums Z. mobilis kann keine Pentose-Zucker metabolisieren XyloseFraktion Unvollständige Nutzung von Cellulose/Hemicellulose-Mischungen 22 Genetic Engineering von Z. mobilis Einbau der Gene zur Xylose-Aufnahme und des PPP Klonierung und Expression heterologer Gene aus E. coli Simultane Aufnahme von Glucose und Xylose Zhang, Eddy, Deanda, Finkelstein and Picataggio (1995) Science. 267 Stammoptimierung durch Insertion Wildtyp-Stamm Produktions-Stamm mit heterologem Stoffwechselweg Insertion 23 Einbau zusätzlicher Gene zur Stammoptimierung 1. Plasmidkonstruktion 2. Transformation mit heterologem Pathway heterologe Gene Ori Locus Simultane Aufnahme von Glucose und Xylose Genetic Engineering von Z. mobilis Gunasekaran and Chandra Raj (2001) Madurai Kamaraj University, India 24 Produktion von Aceton/Butanol C. acetobutylicum „The Weizmann Bacterium“ Chaim Weizmann Erhöhung der Produktivität Produktion von Aceton/Butanol mit Chlostridium acetobutylicum pH Butanol Butyrat Acetat Aceton t 25 Umschalten von Säurebildung auf gewünschte Aceton/Butanol-Bildung Säurebildung (pH > 4,5) Solvent-Bildung (pH < 4,5) AK PTA Acetat Acetat Acetyl-CoA Acetoacetyl-CoA BK Butyrat Aceton Acetyl-CoA Ethanol Acetoacetyl-CoA PTB Butyryl-CoA Butyrat Butyryl-CoA Butanol Aufklärung der metabolischen Regulation Identifikation des SOL-Repressorproteins Regulation der Bildung von Aceton/Butanol (Sol Locus) SolR Operons für Bildung von Aceton/Butanol Repressorprotein 26 Repressorprotein bindet an die Regulatorsequenzen der einzelnen Operons und verhindert deren Transcription SolR Stategie Knock-out Mutation des SolR-Gens Knock-out Mutation des SolR-Gens führt zu deutlich verbesserter Produktivität Transcription mM Butanol mM Aceton mM Aceton WT 74 66 15 SolR Knock-out 249 140 21 27 Erhöhung der Butanol-Bildung in C. acetobutylicum AK PTA Acetyl-CoA Acetat Aceton BK Ethanol Acetoacetyl-CoA PTB Butyrat Butyryl-CoA Butanol Ansatz: Verringerung der Aktivität von Butyratkinase (BK) und Phosphotransbutyrylase (PTB) über antisense RNA Metabolic Design – Kontrolle des Metabolismus über antisense-RNA chromosomales Gen für BK Antisense-Plasmid gegen BK Transcription mRNA Translation Konkurrenzreaktionen as-RNA keine Translation Ribosombindung Abbau durch Doppelstrang-RNAsen 28 Herstellung von Konstrukten zur Unterdrückung der Transcription von BK und PTB BK PTB mRNA asRNA gegen BK asRNA gegen PTB Vergleich – Wildtyp und asRNA-Mutanten Messung spezifischer Enzymaktivitäten von BK und PTB PTB WT mut 1 mut 2 BK WT mut 1 mut 2 Einsatz von asRNA führt zu deutlich geringeren Aktivitäten von Butyratkinase und Phosphotransbutyrylase in den Mutanten 29 Veränderung zellulärer Eigenschaften Krokodile haben verblüffende Eigenschaften Beim Jagen setzen Krokodile auf den Überraschungseffekt: Auftauchen, Zuschnappen, Todesrolle, Fressen. Krokodile können beim Lauern – ohne Luft zu holen – mehr als eine Stunde unter Wasser bleiben Krokodile verfügen dazu über ein besonderes Hämoglobin dieses verringert bei Akkumulation von Bicarbonat im Blut drastisch seine Affinität für Sauerstoff 30 Krokodile verfügen dazu über ein besonderes Hämoglobin dieses verfügt über eine Bindungsstelle für Hydrogencarbonat (HCO3-) bei Akkumulation von Bicarbonat im Blut erfolgt dessen Bindung an das Hämoglobin drastische Verringerung der Affinität für Sauerstoff Transplanting a unique allosteric effect from crocodile into human haemoglobin oxygen saturation of Hb Hennakao et al. (1995) Nature 373 100 geringe BicarbonatKonzentration human 50 croco Hohe BicarbonatKonzentration 0 log(pO2) in blood croco: conformation change due to allosteric binding of bicarbonate oxygen binding affinity decreases 31 Transplanting a unique allosteric effect from crocodile into human haemoglobin Hennakao et al. (1995) Nature 373 allosteric binding effect via only 12 AA exchanges oxygen saturation of Hb low bicarbonate 100 Scuba 50 high bicarbonate 0 log(pO2) in blood Only a few mutations in key positions can create new properties of proteins and allow species to adapt to a new environment Metabolic Engineering interdisziplinäres Feld in Forschung und Industrie großes Potential zur Optimierung von Bioprozessen effektive Tools zur genetischen Modifikation großer Mangel im Verständnis von Funktion und Regulation des Metabolismus gezielte Änderungen führen nicht immer zum gewünschten Erfolg 32
