Ringvorlesung "Chemisch Biologische Synthese"

Ringvorlesung "Chemisch Biologische Synthese"
3. Aminosäuren und Peptide (3h)
3.1. Aminosäuren und deren Synthese
3.2. Peptidsynthesen
3.3. Globale Strukturen
(T. Schrader)
(T. Schrader)
(T. Schrader)
3.1. Aminosäuren und deren Synthese
a) Allgemeines zu Aminosäuren: evtl. aus Voet-Voet. Wichtig: Bausteine aller Peptide,
Seitenketten machen nach der Faltung die Funktion der meisten Peptide als
Biokatalysatoren und Rezeptoren aus. 20 proteinogene, 8 essentielle Aminosäuren.
Zwitterionische Struktur auch im Kristall, dadurch gute Löslichkeit in Wasser, schlechte
in org. Lösungsmitteln sowie hohe Schmelzpunkte (~300°C). Klassifizierung in unpolare,
polare und geladene Seitenketten. Nomenklatur in 3-Buchstaben- (Ala, Ser) bzw. EinBuchstaben-Codes (K,L,F). Meistens L-, bei Bakterienzellwänden meist D-; meist α−,
aber auch β− wichtig (z. B. in Medikamenten). Herausforderungen bei der Synthese:
Amphiphiler Charakter (N-/C-Schützung) und Racemisierungstendenz (auch bei
Peptidsynthesen ein Problem, z.B. über Oxazolinonbildung).
Abb. Alle Aminosäuren mit Seitenketten und Buchstabencodes.
Unpolar:
H2N
CO2H
H2N
CO2H
H2N
CO2H
H2N
CO2H
H2N
CO2H
Gly
Ala
Val
Leu
Ile
G
A
V
L
I
Polar:
S-Me
NH
Ph
H2N
CO2H
CO2H H2N
HN
CO2H
H2N
CO2H
OH
H2N
CO2H
Phe
Pro
Met
Trp
Thr
F
P
M
W
T
O
O
OH
H2N
CO2H
SH
H2N
OH
NH2
NH2
CO2H H2N
CO2H
CO2H H2N
H2N
CO2H
Ser
Cys
Asn
Gln
Tyr
S
C
N
Q
Y
Geladen:
NH2
NH2
CO2H
HN
NH
N
NH
CO2H
H2N
CO2H
H2N
CO2H
CO2H H2N
H2N
CO2H
H2N
CO2H
Asp
Glu
Lys
Arg
His
D
E
K
R
H
1
Klassische Aminosäuresynthesen werden vorausgesetzt: Strecker, Gabriel, Erlenmeyer,
Schöllkopf. Literaturverzeichnis für neuere Reviews über asymmetrische Synthesen, z. B.: R.
M. Williams, Synthesis of optically active α-Amino Acids, Pergamon, Oxford, 1989; R. O.
Duthaler, Tetrahedron 1994, 50, 1539-1650; H. Heimgartner, Angew. Chem. 1991, 103, 271297.
Es gibt auch bei dem einfachen Grundgerüst der Aminosäuren mehrere prinzipielle Wege, um
das N-C-C-System aufzubauen. Zu jedem Weg findet man Hunderte von Synthesen in der
Literatur. Die besten neueren wollen wir kennenlernen.
EX
Ac
N
C
PG O
Nu
N
R1
R1
Ac
Ac
OR2
C
O
N
H
OR2
C
O
OR2
"N"δ+
C
O
OR2
NC
Ac
N
R1
a) α-Aminosäuren: katalytische Hydrierung (Monsanto-Prozeß für L-DOPA gegen
Parkinson, Nobelpreis für Knowles), Ausblick Dehydrogenasen und andere enzymatische
Verfahren.
OR
OH
OR
OMe
OH
Rh-I
P
DIPAMP
Ac-NH
CO2H
H2N
Dehydro-Aminosäure
P
CO2H
Ph
Ph
OMe
L-DOPA
ee = 93%
DIPAMP
b) evtl. Claisen-Umlagerung chelatisierter Enolate (Kazmeier); aus T. Wirth-Highlight:
Angew. Chem. 1997, 109, 235-237 über α-alkylierte α-Aminosäuren:
R1
O
F 3C
N
H
R3
O
O
R2
1. LHMDS
2. MXn
R1
Claisenuml.
R3
TFA N
M O
O
R2
H3O+
R2
R3
R1
H2N
O
OH
2
c) Chirale Imidazolinone und Oxazolidinone aus Glycin (Seebach)
H2N
O
CHO +
H2N
1. LDA
N
2. R--X
N
Boc
1. H+
H
N
2. Camphersulfonsäure
N
H
OMe
O
1. Boc2O
2. Me3OBF4
N
Boc
OMe
N
1. BuLi in situ
OMe
N
4N TFA/H2O
H2N
2. R'-CH=CH-CO2R"
R
N
Boc R R'
CO2R"
CO2Me
R2
R1
d.r.>97:3
d.r.>97:3
d) evtl. Einbau in Peptide über 3-Amino-2H-Azirine (Heimgartner) ; aus T. Wirth-Highlight:
Angew. Chem. 1997, 109, 235-237 über α-alkylierte α-Aminosäuren
e) Asymmetrische Strecker-Varianten (aus: T. Lindel, Nachrichten 2000, 48, 790-792; und:
L. Yet, Angew. Chem. Highlight 2001, 113, 900-901):
NH
R-CHO + NH 3 + HCN
R
NH2
H
R
NH2
H3O+
R
CN
CO2H
Klassische Strecker-Variante der Synthese von α-Aminosäuren
1. 5 Mol% cat.,
-70°C, 1d
N
+ HCN
R
H
O
MeOH/HCl
F3C
2. TFAA
N
R
NH2
CN
Pd(PPh3)4
R
CO2Me
N
< 95% ee
cat.
tBu
O
10 Mol% cat.,
10 Mol% Ti(OiPr)4,
CN
Ph
N
R
N
Ph
2 Äquiv. TMSCN,
i-PrOH, RT, 1d
R
N
H
Ph
< 99% ee
Cl
tBu
Jacobsen-Katalysatoren (Al und metallfrei)
Ph
N
Al
X
OH
tBu H
N
O
O
tBu
tBu
O
N
H
OtBu
OMe
O
cat.
Benzhydrylamine (Snapper, Hoveyda)
3
1. 9 Mol% cat,
2 Äquiv. TMSCN,
20 Mol% PhOH
1. HCl (g)
2. DDQ
H
N
R
2. 2N HCl
H
N
H
R
NH2
H
R
3. 1N HCl
4. Amberlyst A-21
CN
CONH2
Ph Ph
P
O
O
Cl Al
O
O
P
Ph Ph
< 96% ee
cat.
Shibasaki-Binole mit Al (Lewissäure/base)
Br
Br
OH
OH
OH
OH
+
Br
HO
1. 2 Äquiv. HCN
2. 1 Äquiv. R-CHO
4 Stufen
NH3+Cl-
HN
3. 1 Äquiv. HO
-40°C, 1 d H2N
R
R
CN
CO2Me
Br
0.1 Äquiv.
0.1 Äquiv.
+
+
Zr(OtBu)4
0.3 Äquiv.
O
cat.
N
Me
Br
Br
OtBu
O
Zr
Br
N
NMI
O
Zr
O
O
NMI
0.1 Äquiv.
Br
Br
O
OtBu
Br
Kobayashi-Binole mit Zr
f) β-Aminosäuren: Amino Acids 1996, 11 (3-4), 397-405; N. Sewald: Darstellung von
chiralen β-Aminosäuren über as. kat. Michael-Addition mit dem Feringa-System; dazu
neuere (Highlight von Magriotis, Angew. Chem. 2001, 113, 4507-4509):
Noyori:
NHAc
H2 (1 atm), BINAP
NHAc
PPh 2
PPh 2
H
Ru(OAc)2, 0.5 Mol%
MeO2C
MeO2C
96% ee
Sibi:
O
N
N
MgBr2, H2N-OBn
O
N
NH-OBn
N
R
cat., 30 Mol%
O
O
N
R
< 95% ee
N
cat.
g) Chem. Soc. Rev.: 1996, 25, 117-128: As. Synthese von β-Aminosäuren.
4
h) in Arbeit: Review von D. Seebach über seine β-Peptide (Angew. Chem. 2003). Hier nur
die Synthesen, die Strukturen später im dritten Teil bei den globalen Strukturen; Eur. J.
Org. Chem. 1999, 335-360; 2000, 1-15 (beides Synthesen); Angew. Chem. 1999, 1223 (βsheets).
i) Mit β-Aminosäuren macht man die wichtigen β-Lactamantibiotika. Die beste katalytische
asymmetrische β-Lactamsynthese (Highlight von Magriotis, Angew. Chem. 2001, 113,
4507-4509):
O
Me 2N
Cl
NMe2
O
Me2N
+
Ph
NMe2 Cl
+
H
Ph
Ts
Nu
H
O
Nu
H
Ph
OMe
N
Ts
CO 2Et
StaudingerReaktion
10 Mol%
H
- Protonenschwamm
H
O
N
H
EtO2C
+ Nu
Nu = N
H
Ph
Bz-O
H
3.2. Peptidsynthesen:
a)
Problematik der Verknüpfung von freien Aminosäuren: Schutzgruppen und
racemisierungsfreie quantitative Amidknüpfung. Die Fmoc, Boc und Z-Schutzgruppe
sowie der t-Butylester und Benzylester (an und ab). Alle Seitenketten müssen ebenfalls
geschützt werden, am besten so, daß sie alle in einem Schritt milde wieder entfernt
werden können (heute vor allem Trifluoressigsäurespaltung bevorzugt).
R1
O
R1
X
PG1-NH
+
H2N
O-PG2
Z-NH
O-PG2
PG2 = tBu, Bn
O
O
N
H
O
R2
O
PG1 = Z, Boc, Fmoc
O
PG1-NH
R2
O
H
N
O
O
H
N
H
Boc-NH
O
N
H
Fmoc-NH
Aufbringen von PG1 und PG2 mit Z-Cl, Boc2O, Fmoc-Cl, Isobuten, Benzylchlorid; Abspalten
mit H2/Pd-C / TFA und Piperidin (Fmoc, E1cb).
b) Lösungssynthese mit Kupplungsreagenzien. Aktivierung der Säure über: gemischte
Anhydride, Aktivester, DCC/EDC-HOBt-Methode, HATU/HBTU, PyBop, PyClop, T3P.
Probleme bei der Peptidsynthese: Man braucht eine racemisierungsfreie, quantitative und
schnelle Kupplung ohne Nebenprodukte. Oft tritt aber gerade durch Protonierung oder
Deprotonierung der aktivierten Peptide eine teilweise Racemisierung ein. Folgende
Nebenreaktionen muß ein gutes Kupplungsreagenz daher vermeiden:
5
1. Azlacton-Bildung:
H
HN
H
O
R
O
H
R
X
OH
N
X
O
O
R
B
O
N
......
O
N
+
BH
R'
R'
R'
R'
O
R
2. Unerwünschte Cyclisierungen:
R
R
Dipeptid-Ester bilden
spontan Diketopiperazine.
O
H
N
H2N
OR''
NH
O
R'
O
O
HN
R
O
R
R'
Z-geschützte Peptide können
Hydantoine bilden.
O
NH HN
R''
O
O
Spezielles Problem von
Boc-Aminosäuren.
HN
N CHR'
R O
C C
H OR''
CO R''
O
O
R'
O
C
NH OR''
+
R'NH
R
C
H
O
HN
O
O
H
O
R'
O
HN
O
R'NH
O
O
R'
3. Racemisierung:
R
OH
R'NH
R
C
OR''
OH
OR''
4. Überaktivierung:
R'''HN
R'
R'''HN
O
C
OH
DCC
R'
R'
R'''HN
O
C
OX
R'
O
R'''HN
O
O
symmetrisches Anhydrid
N-Acylharnstoff
Oxazolon
Literatur: J. Pept. Protein. Res. 1987, 29, 574; Angew. Chem. 1963, 75, 282; THL 1992,33,
2815.
6
Übersicht über die gebräuchlichsten Kupplungsreagenzien:
N
C
N C N
N
N
DCC
N
X
Mukayiama, BEP, ....
PF6-
Me2N
N
N
O
N
X
Alkyl
EDC
NMe2
NMe2
N
N
N
N NMe2
PF6
O P
NMe2
Me2N
N
NMe2
N
OH
X
X = C : O-HBTU
X = N : O-HATU
X = C : N-HBTU
X = N : N-HATU
BOP
N
N
N N
O P
PF6-
O
O
N
O
P
N
N
O
O
O
P Prop
Prop P
O
O
P
O Prop
Cl
2
BOP-Cl
PyBOP
N
P Cl
3
PyClop
T3P
R1
R1
gemischte Anhydride:
PF6-
OH + Cl
Boc-NH
R3N
O
O
O
O
O
Boc-NH
O
O
O
H2N
O-tBu
R1
R2
H
N
Boc-NH
O
O-tBu
R2
O
R1
R1
Aktivester:
O
Boc-NH
F
O
Boc-NH
O
O
NO2
F
F
F
F
DCC/HOBt:
Zweiter Schritt:
O
R
O
N
N
N
O
N
C
O
N
H
R
O
N
N
R'-NHR''
N
R
O
R''N R
7
Hydroxybenztriazol vermeidet eine Überaktivierung der Carbonsäure auf der IminoesterZwischenstufe, die zu unerwünschten Nebenreaktionen führt wie Zyklisierungen,
Harnstoffbildung, Oxazolonbildung und - Racemisierung!
Literatur zu unerwünschten Nebenreaktionen: Pept. Protein. Res. 1987, 29, 574; Angew.
Chem. 1963, 75, 282; THL 1992,33, 2815.
Literatur zu DCC: JOC 1989, 54, 1922; JACS 1966, 88, 1013; JACS 1966, 88, 1020.
Literatur zu wasserlöslichen Varianten (EDC): JOC 1961, 61, 2525.
T3P:
Ganz neu ist dieses preiswerte Kupplungsreagenz (Clariant), das ebenfalls racemisierungsfrei
arbeitet und wasserlösliche Phosphonat-Nebenprodukte liefert, die sehr bequem durch
Ausschütteln abtrennbar sind:
O
O
O
Prop P
P Prop
O
O
P
O Prop
T3P
O
O
O
Prop P
P Prop
O
O
P
O Prop
O
R-CO2H
R
O
P Prop
O
O P O P O
Prop
Prop O
O
NMP
R-NH2
Produkt
Literatur: Chem Commun. 1999, 1842.
HATU / HBTU: Dies ist der Merzedes Benz unter den Kupplungsreagenzien!
PF6-
Me2N
NMe2
NMe2
N
N
N
N
N
N
N
N
O
H NR
2
N
N
OH
N
N
OH
R
O
N
N
N
O
PF6-
Me2N
NMe2
NMe2
N-HBTU und O-HBTU
N
N
N
O
NMe2
NMe2
N-HATU und O-HATU
(NGE)
Lange Zeit wurde O-HBTU als vorliegende Struktur postuliert; die Kristallstruktur lieferte
jedoch N-HBTU; leider ist die reaktivere Spezies jedoch O-HBTU; dafür gibt es seit neuestem
auch eine effiziente Synthese. TBTU = HBTU mit Tetrafluoroborat als Gegenion.
Der Vorteil von HATU ist ein Nachbargruppeneffekt (NGE) des Pyridin-Stickstoffs mit der
freien Aminogruppe, der deren Nucleophilie erhöht: JOC 1998, 63, 9678; Angew. 2002, 114,
457. Der Mechanismus der Kupplung verläuft wie folgt:
8
N
RCOO
N
N
O
-
-
NMe2
N
NMe2
NMe2
PF6
Me2N
PF6
N
N
O
-
ON
N
N
N
N
N
O
NMe2
O
O
Me2N
R
NMe2
O
R
Me2N
O
O
R
NMe2
-
HOBt
NMe2
O
N
NMe2
N
Amin
+ O
N
O
Produkt
NMe2
R
O
Bop und PyBop: Allgemein sind phosphorhaltige gute Abgangsgruppen sehr beliebt.
Hier ist der Mechanismus ganz ähnlich, aber es entsteht das besser lösliche
Phosphorsäuretriamid (Vorteil: Trispyrrolidinophosphinoxid ist nicht giftig wie HMPT).
N
N
N
N
N N
O P
N NMe2 PF 6
O P
NMe2
Me2N
PF6N
N
Bop
PyBop
PyClop: geht auch gut bei sterisch anspruchsvollen Carbonsäuren.
PF6
N
P Cl
3
-
PF6
N
-
P X
PF6
Base
O
R
N
HO
3
-
P O
R
3
O
PyClop
X = OBt (PyBOP)
X = Cl
RNH2
RNH2
O
P O +
N
3
O
R
R N
H
R
O + Oxazolinon
2
9
c)
Festphasensynthese (Merrifield, Nobelpreis): Harze (Wang), Ankuppeln der ersten
Aminosäure, Repetitive Kupplung der Bausteine und Entschützung am Harz, Kaisertest
et al. auf vollständige Kupplung, Abspaltung vom Harz. HPLC-Analytik und Aufreinigung (evtl. Beispiel). Erreichbare Größe heute: 30 Aminosäuren-max. 50
Aminosäuren.
R1
O +
Fmoc-NH
O 2
R1
1. DMAP
O
HO
O
H2N
2. Piperidin
O
Wang-Harz
O
Fmoc-HN
OH
R2
R1
O
Fmoc-NH
DIC/HOBt
R2
TFA
O
N
H
freies Peptid
O
Zum Test auf vollständige Kupplung verwendete man früher Ninhydrin, dessen Färbung
durch Zusätze nach blau verstärkt wurde (Kaisertest). Viel empfindlicher (Nachweis von <1%
freier Aminogruppen) ist aber der rote Azofarbstoff NF31, der kovalent an die freien
Aminogruppen des unvollständig gekuppelten Pepids auf einem selektierten Harzkügelchen
gebunden wird. Die rote Farbe zeigt unvollständige Kupplung an.
R1
O
O2N
N
N
O
N
O
NO2
+
O
H2N
O
NF31
Nach Abspaltung des Peptids vom Harz unter gleichzeitiger Entfernung sämtlicher
Seitenketten-Schutzgruppen (meistens mit TFA) erfolgt die Reinigung über präparative HPLC
und anschließend die Reinheitskontrolle über analytische HPLC. Beispielchromatogramme
eines rohen und eines gereinigten Oligopeptids:
roh:
10
gereinigt:
d) Sequenzanalyse: Edman-Abbau (vollautomatisch, Identifikation über HPLC mit UVDetektion).
Val-Tyr-His-Ala
+ Ph-N=C=S
Ph
H
N
H
N
Ph-OH
H
O
N
O
N
H
S
N
H
O
H+
N
NH
H3O+
Ph-OH
H
O
N
N
H
N
O
S
+
H2N
Ph
O
N
H
N
N
H
N
1. OHO
S
Ph
Ph
2. H3O+
H
N
O
N
NH
H
O
S
O
H
N
OH
S
Ph N
H+
O
Lenkung der Cyclisierung wahrscheinlich über HSAB (Thiazolinon: weiches protoniertes
Amid - Angriff vom Schwefel; Thiohydantoin: hartes Carboxylkation: Angriff vm harten
Stickstoff).
e)
Größere Peptide: Peptidligation: klassische Verfahren über Thioester und Cysteine.
Neuere Varianten (Kießling etc.) über die Staudinger-Reaktion an beliebiger Stelle.
Native Ligation an Cysteinen (gut bis ~100 Aminosäuren):
H2N-Peptid
N
H
H2N-Peptid
X + NaSPh
O
H2N-Peptid
N
H
S
O
N
H
S-Ph +
O
Peptid-OH
H2N
HS
R1
H2N-Peptid
Peptid-OH
H2N
O
intramolekular!
R1
Umesterung
- PhS-
HS
R1
R1
N
H
Peptid-OH
HN
O
O
O
11
P. E. Dawson et al., Science 1994, 266, 776. Neuere Varianten (gut bis ~300 Aminosäuren):
Repetitive Kupplung von Peptidfragmenten mit N-terminalem geschützten Cystein und Cterminalem Thioester am Harz. Entschützung des neuen N-terminalen Cysteins bereitet die
nächste Runde vor:
pH 7
PG-Cys-Peptid-COSR
+
Cys-Peptid
Sepharose
H2O
PG-Cys-Peptid-CO-NH-Cys-PeptidSepharose
- PG
H3N+-Peptid-COSR
H3N+-Peptid-CO-NH-Cys-Peptid-CO-NH-Peptid
Sepharose
Staudinger-Ligation (Kießling et al., beliebige Stelle):
O
Peptid
O
X + HS
PPh 2
N
Peptid
PPh 2
-N2
Peptid
H2O
PPh 2
S
Peptid
PPh 2
O
N-Peptid
O
N3-Peptid
S
Peptid
S
Iminophosphoran
O
Peptid
f)
N
H
Peptid
via:
N N N Peptid
R PPh 2
Biochemische Peptidligation: Proteinsplicing und Konformations-assistierte Ligation.
3.3. Globale Strukturen:
a) Einführung über Peptidfaltung: Nach der Biosynthese in den Ribosomen falten sich die
entstandenen Proteinstränge zur nativen, bioaktiven Koformation von alleine? Hier
handelt es sich um einen immer noch unzureichend verstandenen Ordnungsprozeß mit
faszinierender Perfektion und Schnelligkeit: binnen weniger Sekunden werden Trillionen
potentieller Konformationen in die thermodynamisch stabilste umgewandelt, bei der sich
das gesamte Protein ansammelt; nur diese ist biologisch aktiv. Bei Fehlfaltungen
assistieren "Helferlein": Chaperone sind große molekulare Proteinkästen mit definierten
Bereichen für die ungestörte Faltung von gestreckten Polypeptidketten, die aus dem
Ribosom kommen. Mehr dazu unten.
Übersicht Peptidfaltung: M. Karplus, C. M. Dobson, A. Sali, Angewandte Chemie 1998, 110,
908-935. Karplus führt Energiehyperflächen mit komplexen Fortschrittsvariablen ein, die
12
ähnlich wie die bei den Reaktionen kleiner Moleküle (H + H2) nur wenige günstige
Trakejtorien erkennen lassen, auf denen die Faltungsreaktion wahrscheinlich wie ein Golfball
ins thermodynamische Loch rollt, ohne viel Zeit zum Abtasten aller möglichen Wege zu
verbrauchen.
Abb. 8-5 (Voet-Voet: S. 193: Hypothetische Faltung eines dimeren Proteins: Zuerst entsehen
lokale Sekundärstrukturen, die sich nach und nach übereinander lagern und schließlich die
enge kompakte Faltung ergeben, die im letzten Schritt zum Dimer aggregiert. Heute diskutiert
man hydrophobe Cluster von unpolaren Aminosäureresten als nucleation sites solcher
Sekundärstrukturen. Die wichtigsten attraktiven Wechselwirkungen scheinen also solvophobe
und dispersive WWen zu sein.
13
Chaperone:
Die Chaperone binden ATP, welches über ihre ATP-Synthase-Aktivität hydrolysiert wird und
so die Konformation der Chaperone verändert. Dadurch wird die Affinität für das nichtnative
Protein ganz stark verändert. Nach Zusammensetzung der molekularen Kapsel (Gro-El und
Gr-ES) erfolgt die Faltung des Proteins. Nach ATP-Hydrolyse geht der Gro-El und Gro-ESKomplex auseinander, und das gefaltete Protein wird wieder heraus gelassen.
Übersicht Chaperone: S. Walter, J. Buchner, Angewandte Chemie 2002, 114, 1142-1158.
b) Nur zwei Bindungen in α-Aminosäuren sind drehbar; damit verbinden sich die
charakteristischen Diederwinkel θ und φ. Diese kann man per NMR-Experiment über die
Karplus-Gleichung ermitteln (Bystrov-Modifikation für den zusätzlichen Stickstoff:
Faktor 1.09 für die höhere Elektronegativität). In letzter Zeit ist es auch gelungen, Peptide
mit externen Liganden konformationell zu fixieren. Der Nachweis erfolgte z.B. über die
Karplus-Analyse der 3JH,H-Kopplungskonstanten (s. unten: Aminopyrazole als β-FaltblattLiganden). Die konformationelle Freiheit unterschiedlicher Aminosäuren im
Peptidverband wird durch zweidimenionale sogenannte Ramachandran-Plots dargestellt
und zeigt auch direkt die unterschiedliche Tendenz von Aminosäuren, bestimmte
Konformationen zu bevölkern.
Lit: (a) Delepierre, M.; Dobson, C. M.; Poulsen, F. M. Biochemistry 1982, 21, 4756. (b)
Bystrov, V. F. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 1976, 10, 41.
Abbildung Diederwinkel + Karplus-Gleichung: 3J = [Acos2θ - Bcosθ + Csin2θ ] / 1.09
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H θ H
N C
C'
O
J (NH-α-CH) Ac-L-Val-L-Val-OMe
NH(1)
NH(2)
3
complexation
[%]
free
8.2
8.5
0
Pyrazol
8.2
9.0
50
APCE
8.6
9.6
65
MAMP
9.8
10.0
85
PivAStyP
9.0
9.7
86
AcAStyP
9.6
9.8
93
TriFlAStyP
10.0
9.8
94
θ
θ
Abbildung: Aminopyrazol + Ac-Gly-Val-OMe. Kopplungskonstanten um die 10 Hz zeigen
perfekte β-sheet-Konformation an (Diederwinkel θ um die 180°).
Ramachandran-Plot: Voet-Voet, 144, 7-7 und 7-8. Ein Ramachandran-Plot stellt die erlaubten
Bereiche für Diederwinkel verschiedener Aminosäuren in Proteinen dar. Man sieht, daß ein
großer Teil des Konformationsraumes gar nicht zugänglich ist.
c) α-Helix und β-Sheet sind extrem wichtige Peptid-Sekundärstrukturen von fundamentaler
Bedeutung. Sie sollte genau verstanden werden (parallel, antiparallel, biologische
Funktion, Voet-Voet, auch β-Schleifen, 7-22). Pathologische Faltungsprobleme führen zu
schwersten Krankheiten, die unter dem Namen protein-folding deseases in die Literatur
eingegangen sind (BSE, Creutzfeld-Jakob, Alzheimer).
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Abb. α-Helix, β-Sheet (auch antiparallel). Betonung des H-Brückenmusters (vgl. Voet-Voet).
Abb. β-Schleife: Hier befinden sich Aminosäuren
wie Prolin, die gerne einen Knick in der
Hauptkette induzieren.
Abb.: Prionenstäbchen (links)
O
N N
N
H
O
N
H
N
N
H
O
H
O H NR
H
OMe
O H
NR
N RO H
H
N R
O H
H
H
NN
H H
N
N N
H
N
O
O
H
+ Alzheimer Amyloid-Plaque (rechts).
• ...Fast Screening Method:
PrP alone
PrP with
AmpOx
S
P
Abb.: Verkappen der β-sheets im Prionprotein: neue Therapie von BSE?
d) Kristallstrukturen von Proteinen werden durch die unterschiedliche Darstellung von αHelices und β-Sheets im Rückgrat übersichtlich; man erkennt im Vergleich sofort den
dramatisch unterschiedlichem Gehalt an Sekundärstrukturen in Proteinen
unterschiedlicher Funktion (von reinen β-Sheet zu reinen α-Helix-Proteinen). Die
Berechnung von Proteinstrukturen ist auch heute noch nur mit Homologie-Modeling und
ähnlichen Vereinfachungen möglich (SYBYL von Tripos und Insight von Accelrys, früher
MSI). Die Bestimmung von dreidimensionalen Strukturen erfolgt heute entweder über Xray (klassisch) oder in den letzten Jahren immer stärker auch durch NMR-Experimente
(Nobelpreis 2002 für K. Wüthrich, TROSY-Experiment, evtl. Abbildung). Man geht dabei
wie folgt vor: 15N-Markierung aller Aminosäuren und Peptidsynthese klassisch oder
molekularbiologisch durch Überexpression in Mikroorganismen; nach zweidimensionalen
COSY-Experimenten zur Zuordnung aller Aminosäureesignale Aufnahme von
dreidimensionalen NOESY-Spektren; Zuordnung aller NOESY-Kreuzpeaks und
quantitative dreidimensionale Reproduktion der Proteinstruktur über ComputerAlgorithmen; in vielen Fällen hervorragende Übereinstimmung mit Kristallstrukturen;
manchmal aber starke Abweichungen. Gute Ergänzung: X-ray zeigt meist hohe Auflösung
16
aller gut strukturierten Bereiche; NMR zeigt wahre Struktur in wäßriger Lösung und kann
auch Dynamik abbilden (wichtig für die molekulare Erkennung und Katalyse).
Kristallstruktur von:
α-Helix-reich: Calmodulin: Voet 18-21, S. 496. Cytochrom c: Voet 20-18, S. 543.
Myoglobin: 7-41, S. 167.
Das Cytochrom b in der Atmungskette vermittelt Elektronentransferreaktionen durch die
zwischen den Helices eingelagerten Hämgruppen, welche jeweils an Histidinen aufgehängt
sind.
Dazu Schemabild des Adrenalinrezeptors, der eine Bindungsmulde von 7
membrandurchspannenden Helices bildet, die das Adrenalinmolekül binden und das Signal
über die Membran weiterleiten:
Adrenalin
Nach Andocken des Adrenalinmoleküls
wird das Signal über eine Konformationsänderung
im Inneren des Rezeptors über die Membran ins
Zellinnere geleitet und dort weiter verstärkt.
P
P
P
P
P
P
P
Signal
17
Myoglobin (links) ist ein globuläres (kompaktes) Protein, welches durch die α-Helices
äußerst steif gebaut ist. Zwei Histidine tragen auch hier wieder die Hämgruppe, die für den
Transport von Sauerstoff verantwortlich ist. Calmodulin (rechts) bindet Ca2+-Ionen und
reguliert damit deren Spiegel. Die α-Helix in der Mitte trennt als Abstandhalter zwei
globuläre Domänenn, die über ihre Carbonylsauerstoffe im Rückgrat jeweils zwei Ca2+-Ionen
binden können.
β-Sheet-reich: Concanavalin A: Voet 7-43, S. 169; Carboanhydrase: Voet 7-44, S. 169.
(In der Nähe befinden sich auch auch viele schöne Abbildungen von β-Schleifen etc.! Dazu
werden Elektronendichteverteilungen und Röntgenbeugungsmuster gezeigt - Empfehlung).
Concanavalin A (links) besteht praktisch nur aus zwei β-Faltblättern, bildet also zwei steife
Wände. Es gehört zur wichtigen Familie der Lectine, die spezifisch Zucker binden, hier
besonders α-D-Glucose. Carboanhydrase (rechts) hat die Funktion, CO2 in Hydrogencarbonat
HCO3- zu überführen. Dazu benutzt es ein über drei Histidine gebundes Zink2+-Kation,
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welches ein gebundenes Wasser deprotoniert und als nucleophiles OH--Teilchen an CO2
angreifen läßt Für diese katalytische Funktion sind die drei Histidine in β-Faltblätter
eingelagert und bilden dadurch die optimale steife Anordnung zur gleichzeitigen Bindung des
Zn2+-Kations.
Dazu Kofaktoren in Enzymen gebunden: Beispiel der Alkoholdehydrogenase mit NAD+ in
der Rossman-Spalte:
TROSY-Experiment und NMR-Strukturen. Aus der Homepage von Kurt Wüthrich:
Rinder-Prionprotein
Menschliches Prionprotein
Erkennen Sie die beunruhigende Ähnlichkeit!?
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Wie funktioniert eine dreidimensionale
Strukturbestimmung mit NMR?
H
Nach 13C- und 15N- Markierung erfolgt zunächst
die vollständige Zuordnung aller 1H-, 13C- und 15N-Kerne
über COSY-Experimente (blau). Anschließend werden
alle NOE-Kontakte zwischen Protonen vermessen und
quantitativ ausgewertet (rot). Die Summe aller NOE's
liefert schließlich die dreidimensionale Anordnung.
O
H3C
15
13
O
COSY H
15
O
N
C
N
13
C
H
H
CH2
NOE
H
20