Versuchsprotokoll 1.3. Sequenzbestimmung von Proteinen

Versuchsprotokoll 1.3.
Versuchsprotokoll 1.3. Sequenzbestimmung von Proteinen
Einleitung
Um die Anfangssequenz aus drei Aminosäuren eines Proteins zu bestimmen, benutzen wir eine
Methode, bei der schrittweise vom N-terminalen Ende des Proteins eine Aminosäure nach der anderen
abgespalten wird. Diese Methode wird nach ihrem Erfinder, Pehr Edman,
„Edman-Abbau“
bezeichnet.
Bei dem Edman-Abbau sind folgende Schritte wichtig:
Peptid + Phenylisothiocyanat Æ Phenylthiocabamyl-Derivat Æ Phenylthiazolinon-Derivat +
Peptidkette (n-1)Æ Phenylthiohydantion-Derivat (PTH-Aminosäure).
Die Reaktionsgleichungen sind im Kapitel 1.3 im Skript abgebildet.
Diese Schritte werden insgesamt 3mal wiederholt.
Zur Charakterisierung der in jedem Schritt abgespaltenen Aminosäure wird nach dem Edman-Abbau
eine Dünnschichtchromatographie mit einer Vergleichsprobe durchgeführt. Zusätzlich wird die
Konzentration der PTH-Aminosäuren berechnet.
Durchführung
Der Versuch wird wie im Skript auf den Seiten 39 bis 44 durchgeführt. Die möglichen Proteine sind
auf den Seiten 51 bis 54 aufgelistet.
Beim ersten Lösen des Proteins in 0,5ml Wasser und 0,5ml Pyridin muss 48µl N-Dimethylallylamin
hinzugeben werden. Die Menge wird folgendermaßen berechnet:
n (Dimethylallylamin) = 85,15 g/mol
d = 0,7 g/ml
M = 0,4 mol/l
d=m/VÆV=m/d
n = m/M Æ m = n * M
ÆV=n*M/d
V = 48µl
Durch die Zugabe von Phenylisothiocyanat wird dieses an das N-terminale Ende des Proteins
gekoppelt.
Die Benzol-Extraktion dient dem extrahieren des überschüssigen Phenylisothiocyanats.
Die Zugabe von Tween 80 macht die Proteinmischung viskoser, was für die Gefriertrocknung
notwendig ist.
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Zum Entfernen des Nebenprodukts Phenylthioharnstoff wird Ethylacetat hinzugegeben, da der
Phenylthioharnstoff für die weitere Reaktion unerwünscht ist. Der Phenylthioharnstoff bildet sich aus
Phenylisothiocyanat, was voerst mit Wasser zu Anillin reagiert. Dieses Anillin reagiert mit einem
weiteren Phenylisothiocyanat zu Phenylthioharnstoff.
S
C
HN
NH
Abb. 1: Phenylthioharnstoff
Auswertung:
Nach der ersten Kopplung, Spaltung und Umwandlung in Phenylthiohydantoin bestimmen wir ein
Spektrum mit Hilfe des UV-Photometers im Bereich der Wellenlängen 350nm – 200nm.
Die Kurve ist hier dargestellt:
Kurve 1: Spektrum der 1.
AS von 350-220 nm
Zu erkennen ist hier, dass das Maximum um die 270nm erreicht wird und danach die Extinktion
wieder absinkt. Dies liegt daran, dass cyclische Aminosäuren bei dieser Wellenlänge gut absorbieren.
Für die Bestimmung der Auftragsmenge bei der Dünnschichtchromatographie haben wir zusätzlich die
Extinktion bei einer Wellenlänge von 269nm gemessen.
Die gemessene Extinktion ist 0,369. Jetzt lässt sich die Auftragsmenge wie folgt errechen:
Extinktion von 1 entspricht 1µl
Extinktion von 0,369 entspricht 2,71µl, da die Auftragsmenge zur Extinktion umgekehrt proportional
ist.
Die so errechnete Menge wird mit den drei Vergleichsproben aufgetragen.
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Nach der Dünnschichtchromatographie wurde folgendes Bild aufgezeichnet:
Valin
Methionin
Bild 1: Chromatographie der ersten N-terminalen Aminosäuren
Auf dem Bild sind von rechts nach links die Vergleichsproben III und meine Probe aufgetragen
worden. Dann folgt rechts die Vergleichsprobe II, welcher sich die Vergleichsprobe I anschließt. Die
Zusammensetzung der Vergleichsproben ist auf Seite 45 im Skript abgebildet, wobei bei
Vergleichsprobe III die Aminosäure Tryptophan (Trp, W) nicht beinhaltet ist. Zu beachten ist, dass die
Bilder 1 bis 3 spiegelverkehrt zu den im Skript abgebildeten Mustern sind.
Anhand des Bildes 1 kann man erkennen, dass es sich bei meiner Probe um 2 Aminosäuren handelt.
Dies lässt darauf schließen, dass das mir unbekannte Protein aus 2 Peptidketten besteht.
Es handelt sich um die Aminosäuren Valin und Methionin. Die Aminosäure Valin ist auf dem DCBild gut zu erkennen. Dagegen ist die Aminosäure Methionin nur ganz schwach zu erahnen.
Da nun die Extinktion bei einer Wellenlänge von 269nm und die Aminosäuren bekannt sind, kann
man nun wie unter 1.3.4 (Skript Seite 43) die Konzentration der PTH-Aminosäuren in der gesamten
Probe nach der Formel
µMolPTH = a/b * K * E269
berechnen.
Zu beachten ist hier nur, dass sich der Wert für die Faktoren K aus zwei Faktoren zusammensetzt,
deren Mittelwert man für die Berechnung einsetzt.
a = 50µl, b = 20µl, E = 0,369
Mittelwert:
PTH-Valin = 0,192, PTH-Methionin = 0,175 Æ PTH-Mittelwert = 0,1835
Berechnung der Konzentration:
µMolPTH = 50µl / 20µl * 0,1835 * 0,369 = 0,169 , PTH-AS (Met, Val)= 0,169 µMol
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Nach der zweiten Kopplung, Umwandlung und Identifizierung wiederholt sich der Vorgang der
ersten Kopplung.
Auch hier wird ein UV-Photometrie durchgeführt. Die Kurve ist hier dargestellt.
Kurve 2: Spektrum der
zweiten AS bei 350-220
nm
Auch hier weist die Kurve ein Maximum bei ca. 270nm auf. Die Extinktion bei einer Wellenlänge
von 269nm beträgt 0,315. Die Berechnung der Auftragsmenge für die Dünnschichtchromatographie
berechnet sich wie auf Seite 2 dargestellt.
Die Auftragsmenge beträgt dieses Mal 3,2µl.
Nach der Dünnschichtchromatographie erhält man folgendes Bild.
Leucin
Bild 2: Chromatographie der zweiten Aminosäuren
Die Auftragsreihenfolge hat sich zur ersten Kopplung nicht geändert. Dieses Mal ist nur eine
Aminosäure zu erkennen. Vergleicht man die Aminosäure der Probe mit den Vergleichsproben so
kann man festhalten, dass es sich bei meiner Probe dieses Mal nur um Leucin handelt. Daraus kann
man schließen, dass sowohl die Alpha- als auch die Betakette an zweiter Position ein Leucin aufweist.
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Die Konzentration der PTH-Aminosäure wird wieder nach
µMolPTH = a/b * K * E269
errechnet.
a = 50µl, b = 20µl, E = 0,315
PTH-Valin = 0,18 (nur eine PTH-Aminosäure sichtbar)
Berechnung der Konzentration:
µMolPTH = 50µl / 20µl * 0,18 * 0,315 = 0,169 , PTH-AS (Leu) = 0,142 µMol
Nach der dritten Kopplung, Umwandlung und Identifizierung wiederholt sich der Vorgang der
vorangegangenen Aminosäurebestimmung.
Bei der UV-Photometrie erhält man folgende Kurve.
Kurve 3: Spektrum der
dritten AS von 350-220nm
Auch hier ist ein Maximum bei ca. 270nm zu erkennen. Der Kurvenverlauf hat sich jedoch gegenüber
den ersten beiden Photometrien stark verändert. Eine mögliche Erklärung könnten Verunreinigungen
sein. Aber auch die Tatsache, dass man das Peptid der 3. Kopplung und 3. Umwandlung unterworfen
hat, kann ein Grund für den extrem anderen Verlauf des Spektrums sein, da durch die Chemikalien die
Peptidkette auch angegriffen werden kann.
Bei einer Wellenlänge von 269nm tritt eine Extinktion von nur 0,168 auf.
Berechnet man somit die Auftragsmenge für die Chromatographie (Berechnung siehe erste Kopplung),
so muss man ca. 6µl auftragen.
Nach der Chromatographie erhält man folgendes Bild.
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Threonin
Serin
Bild 3: Chromatographie der dritten AS
Auch hier hat sich die Autragereihenfolge nicht verändert.
Vergleicht man die eigene Probe mit den Vergleichsproben, so kann man feststellen, dass es sich bei
den dritten Aminosäuren um Threonin und Serin handelt. Serin ist nicht als einzelner Punkt zu
erkennen, sondern eher als ein Schleier. Dies kann man dieses Mal auf die erhöhte Auftragemenge
zurückführen, da 3 Auftragungen á 2µl stattgefunden haben. Trifft man bei der zweiten und dritten
Auftragung nicht 100% den gleichen Punkt so kommt es zu einer Schleierbildung.
Die Konzentration der PTH-Aminosäuren wird wieder nach
µMolPTH = a/b * K * E269
errechnet.
Zu beachten ist hier nun wieder, dass sich der Wert für die Faktoren K aus zwei Faktoren
zusammensetzt, deren Mittelwert man für die Berechnung einsetzt.
a = 50µl, b = 20µl, E = 0,369
Mittelwert:
PTH-Threonin = 0,192, PTH-Serin = 0,194Æ PTH-Mittelwert = 0,193
Berechnung der Konzentration:
µMolPTH = 50µl / 20µl * 0,193 * 0,369 = 0,18 , PTH-AS (Threonin, Serin)= 0,18 µMol
Diskussion
Nach Beendigung der drei Durchgänge des Edman-Abbaus kann man nun anhand der abgebildeten
Proteinteilsequenzen im Skript diese mit den ersten drei bestimmten N-terminalen Aminosäuren der
eigenen Probe vergleichen.
Da es sich bei mir um 2 Peptidketten handelt, müssen die Ketten die Sequenz M bzw. V, L und T bzw.
S aufweisen.Somit können es zwei mögliche Proteine sein. Es handelt sich entweder um die
Hämoglobin Alpha und Beta Kette von Rindern oder um der Hämoglobin Alpha und Beta Kette
von der Ziege.
Anhang: Orginale der eingescannten Bilder
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