Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
1
1 EINLEITUNG
4
1.1 Epigenetik
4
1.1.1 Modifizierte Nukleotidbasen - 5'-Methylcytosin
5
1.1.2 CpG-lnseln
6
1.1.3 Methylierungsmuster
7
1.1.4 Wirkungsweise von DNA Methylierung
8
1.1.5 Biologische Funktion d e r DNA-Methylierung
9
Phylogenetische Aspekte
9
Entwicklung der Gameten und Prägung
10
X-Inaktivierung
10
Gewebsspezifische Methylierung
10
1.1.6 DNA-Methylierung und Krankheit
11
Krebs
11
Imprinting Syndrome
12
Komplexe Erkrankungen
12
1.1.7 Autosomale allelspezifische Methylierung (ASM)
13
1.1.8 Altersabhängige Methylierung - epigenetische Drift
14
1.1.9 Allelspezifische Genexpression
16
1.2 Adipositas
16
1.2.1 Adipositas
16
1.2.2 Syndromale Formen der humanen Adipositas
18
1.2.3 Nicht-syndromale Formen der humaner Adipositas
18
1.2.4 Hormone in d e r Regulation der Energiehomöostase
19
1.2.5 Beteiligung des MCFI & MCHR1 an der Regulation von Energieaufnahme & - v e r b r a u c h
21
1.2.6 Humane Assoziationsstudien MCHR1
22
1.2.7 Genomischer Kontext MCHR1
23
2 MOTIVATION
25
3 MATERIAL, METHODEN UND TECHNIKEN
26
3.1 M a t e r i a l
26
iii
http://d-nb.info/1029604606
3.1.1 Individuen und DNAs
26
Blutproben
26
Fett
26
3.1.2 Zelllinen
26
3 . 2 Allgemeine Labortechniken
27
3.2.1 DNA/RNA Extraktion
27
3.2.2 DNA/RNA Konzentrationsbestimmung
28
3.2.3 Synthese von cDNA
29
3.2.4 Polymerasekettenreaktion - PCR
29
3.2.5 Geleiektrophorese und Gelextraktion
31
3.2.6 Reinigung der Nukleinsäuren
32
3.3 Methylierungsanalyse
32
3.3.1 Bisulfitbehandlung
32
3.3.2 Bisulfitspezifische PCR (BSP)
33
Ableiten der Primer
33
BSPs
33
3.3.3 Klonierung
34
3.3.4 Sequenzierung nach Sanger
35
3.3.5 Analyse d e r Sequenzen
36
Bestimmung des Methylierungsstatus
3 . 4 Expressionsanalyse von MCHR1
37
37
3.4.1 Pyrosequenzierung
37
3.4.2 Realtime quantitative PCR (RT-qPCR)
39
3.5 Zellkultur
40
3.5.1 Kultivierung der Zellen
40
3.5.2 Stammhaltung und Wieder-Inkulturnahme der Zellen
40
3.5.3 Inhibitor-Experiment m i t LCLs
40
3 . 6 Statistische M e t h o d e n
41
3.6.1 Die grafische Darstellung im Box-Whisker-Plot
41
3.6.2 Statistische Testverfahren
41
Hardy-Weinberg-Gesetz/Gleichgewicht
41
Statistischer Vergleich zweier Stichproben
42
Varianzanalyse (analysis o f variance, ANOVA)
42
Chi-Quadrat-Test
42
Korrelationsanalyse
43
iv
Partielle Korrelation
43
Korrektur f ü r multiples Testen nach Bonferroni
44
3.6.3 Die Suche nach einem Kontrollgen
44
3.6.4 Korrelationsanalyse d e r Methylierung
44
3 . 7 Chemikalien, Flüssigkeiten und Kits
45
Chemikalien, Puffer, Lösungen
45
Verwendete Kits
47
4 ERGEBNISSE
48
4 . 1 Genotypisierung von M C H R 1
48
4 . 2 Methylierungsstatus von M C H R 1 in Leukozyten
49
4.2.1 Allelspezifische Methylierung in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren
49
Allelspezifische Methylierung (ASM)
49
Altersabhängigkeit der allelspezifischen Methylierung
51
BMI-Abhängigkeit des Methylierungsstatus
52
Geschlechtsspezifische Analyse
54
4.2.2 Charakterisierung d e r Methylierung in der untersuchten Region
54
Methylierungsklassen, Häufigkeitsverteilung
54
CpG-spezifische Analyse
55
Korrelation der Methylierung zwischen CpGs
56
4.2.3 Kontrollgen WFIKKN2
58
4 . 3 Allelspezifische Expressionsanalyse von heterozygoten Individuen mittels PSQ
59
4 . 4 M C H R 1 in lymphoblastoiden Zelllinien (LCLs)
60
4.4.1 Allelspezifische Methylierung
60
4.4.2 Allelspezifische Expressionsanalyse
63
4.4.3 Kopienzahlbestimmung von MCHR1
64
4.4.4 5'-Aza-2'-Desoxycytidin-induzierte Demethylierung
65
4 . 5 M e t h y l i e r u n g und Expression von M C H R 1 in F e t t g e w e b e
67
4.5.1 Methylierungsstatus von MCHR1 in Fettgewebe
67
ASM und Altersabhängigkeit d e r Methylierung
67
BMI assoziierter Methylierungsstatus
68
CpG Analyse
69
4.5.2 Expression von MCHR1 im Fettgewebe
Expression in humanen Fett- und Referenzgeweben
69
69
V
qPCR-HPVs
5 DISKUSSION
70
73
5.1 Allelspezifische Methylierung d e r CpG-lnsel im ersten Exon von MCHR1
73
5.2 Altersabhängigkeit d e r DNA-Methylierung von MCHR1 in Blutgewebe
77
5.3 Allelspezifische mRNA-Expression von MCHR1
80
5.4 /WCHRl-Expression in Fettgewebe
84
5.5 Korrelation MCHR1-ASM und BMI
85
5.6 Neue M e t h o d e n zur DNA-Methylierungsanalyse
87
5.7 Ausblick
89
6 ZUSAMMENFASSUNG
91
REFERENZEN
I
DANKSAGUNG
XI
EHRENWÖRTLICHE ERKLÄRUNG
XII
vi