Vermehrung eines Virus der Columbia SK-Gruppe (ME

P. HAUSEN
1028
Vermehrung eines Virus der C olum bia SK-Gruppe (ME-Virus) in L-Zellen
I I . M itt.: Untersuchungen über die Proteinsynthese in infizierten Zellen
Von
P e te r
H ausen
Aus der biologisch-medizinischen Abt. des Max-Planck-Instituts für Virusforschung, Tübingen
(Z. Naturforschg. 18 b, 1028— 1031 [1963] ; eingegangen am 12. Juni 1963)
In Suspensionen von ME-infizierten L-Zellen synthetisiert jede Zelle mindestens 1-105 bis 3 -IO5
Viruspartikel. Das Virusprotein, das später zum Aufbau der Virusteilchen verwendet wird, wird
1 —2 Stdn. vor dem Erscheinen der polyederartigen Viruspartikel gebildet. Durch die Virusinfektion
wird die Gesamtprotein-Synthese in den L-Zellen gehemmt.
Wie die Ergebnisse der I. Mitteilung 1 gezeigt
haben, läßt sich beim ME-Virus das polyederartige
Viruspartikel mit Hilfe von Hammelerythrocyten
isolieren. Damit ist die Möglichkeit gegeben, die Bil­
dung dieser Einheit auf einfache Weise genauer zu
verfolgen, wenn man seine Bausteine mit radioakti­
ven Isotopen markiert. In unseren Experimenten be­
nutzten wir diese Kombination, um den zeitlichen
Verlauf der Synthese des später im Virus erscheinen­
den Proteins zu studieren und so Hinweise darüber
zu gewinnen, ob das vor den infektiösen Virusparti­
keln serologisch nachweisbare, lösliche Antigen ein
Baustein des Viruspartikels oder nur ein Nebenpro­
dukt seines Vermehrungsprozesses ist. Im Anschluß
an diese Arbeiten wurde auch noch der Einfluß der
Virusinfektion auf die Gesamtprotein-Synthese in
der Wirtszelle untersucht.
seine Radioaktivität bestimmt. Nach einer gewissen Zeit
wurde zu der Zellsuspension ein Überschuß (0,5 mg/ml)
von 12C-Leucin zugefügt. Anschließend wurden dann
weitere Proben entnommen.
Das Ergebnis dieses Versuches ist in Abb. 1 gra­
phisch dargestellt. Der Einbau von 14C-Leucin in
Protein beginnt ohne wesentliche Verzögerung und
wird mit konstanter Rate fortgesetzt. Durch Zugabe
von 12C-Leucin im Überschuß wird die Inkorpora­
tion von 14C-Leucin augenblicklich gehemmt. Dem­
nach ist in unserem Versuchsansatz ein rascher Aus­
tausch von 14C-Leucin gewährleistet und eine Stö­
rung durch „Pool-Effekte“ nicht zu erwarten.
Methoden
Die hier verwendeten Methoden sind in der I. Mittei­
lung beschrieben worden 1.
Min.—
Ergebnisse
1. Vorversuch zu den Markierungs-Experimenten
Abb. 1. Einbau von 14C-Leucin in das Gesamtprotein von
nicht-infizierten L-Zellen und Hemmung des Einbaues durch
Zugabe von 12C-Leucin.
Zunächst war zu prüfen, inwieweit die Versuchs­
ergebnisse durch einen mangelhaften Austausch von
14C-Leucin zwischen Außenmedium und intrazellulä­
rem Aminosäurevorrat beeinflußt werden können.
Zu diesem Zweck wurden L-Zellen in 14C-Leucin-haltigem Medium (0,001 mg/ml; 50 /<C/mg) suspendiert
und bei 37 °C bebrütet. Zu verschiedenen Zeiten nach
dem Ansetzen wurden Proben entnommen, das in ihnen
enthaltene Protein mit TCE gefällt, gewaschen und
1 P.
H
ausen,
Z. Naturforschg. 18b. 1022 [1963].
2. Menge der in L-Zellen gebildeten Viruspartikel
Studien über die biologischen Eigenschaften von
ME-Virus, das aus infizierten Mäusegehirnen ge­
wonnen war. hatten ergeben, daß etwa 1000 physi­
kalische Partikel nötig sind, um eine Infektion aus­
zulösen. Um festzustellen, ob dieses Verhältnis von
phvs. Part. : PBE = 1000 : 1 auch für das in L-Zel­
len gebildete Virus zutrifft, ließen wir seine Synthese
in Gegenwart von 14C-Leucin ablaufen und ermittel­
ten dann aus der Menge des im hämadsorbierbaren
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VERMEHRUNG DES ME-VIRUS IN L-ZELLEN II
Material enthaltenen Isotops die ungefähre Zahl der
Virusteildien.
Infizierte L-Zellen wurden unmittelbar nach der In­
fektion 1-mal mit leucinfreiem Gewebekulturmedium
gewaschen, um intrazelluläres 12C-Leucin möglichst
weitgehend zu entfernen, und dann mit 14C-Leucin-haltigem Medium inkubiert. 8 Stdn. p.i. wurden die Zellen
lysiert, die Viruspartikel an Erythrocyten adsorbiert
und ihre Radioaktivität bestimmt (s. Methoden I. Mitt.).
Für die Berechnung der Virusmenge aus der gefunde­
nen Radioaktivität und der spezifischen Aktivität des
angebotenen Leucins wurde angenommen, daß das 14CLeucin in den Zellen nur unwesentlich durch 12C-Leucin
verdünnt wird, und daß weiterhin der für das EMCVirus gefundene Wert von 8,7 g Leucin/100 g Virus­
protein 2 auch für das ME-Virus gültig ist.
Legt man diese Annahmen zugrunde, so ergibt
sich aus den Meßwerten (s. Tab. 1 ), daß mindestens
1 bis 3'10° Viruspartikel von der einzelnen L-Zelle
synthetisiert werden. Da nach den Ergebnissen der
I. Mitteilung (s. dort Legende Abb. 1) jede Zelle
50 —200 PBE bildet, sind etwa 1000 polyederartige
Viruspartikel für die Bildung eines Plaque erforder­
lich. Danach verhält sich das in L-Zellen produzierte
ME-Virus in dieser Hinsicht ähnlich wie das in
Mäusegehirnen gebildete.
Experi­
ment
Nr.
I
y-Leucin im
hämads. Virus
aus 1 ml
Zellsuspension
II
Viruspart./ml
Zellsuspension
[• 10u ]
III
Viruspart./
Zelle
1
2
3
4
5
0,30
0,30
0.15
0,29
0,33
5,2
5,2
2,6
5,0
5,7
2,6 • 105
2,6 • 105
1,3-105
2,5 • 105
2,9 • 105
1029
lichkeit und Genauigkeit durchzuführen. Deshalb
wurden sowohl die Synthese des Virusproteins als
auch das Auftreten der Viruspartikel unter Verwen­
dung von 14C-Leucin ermittelt.
Eine Suspension infizierter L-Zellen in Leucin-freiem
Kulturmedium wurde in zwei Teile geteilt. Zu einer
Hälfte wurde sofort nach der Infektion (Zeit 0 ) 14CLeucin (5 juClmg; 0,02 mg/ml) zugesetzt und davon
stündlich Proben von 10 ml entnommen. Um den Ein­
bau von weiterem 14C-Leucin zu verhindern, wurden
diese Proben sofort bei —70" eingefroren (Reihe I;
Viruspartikel). Aus der anderen Hälfte der infizierten
Kultur wurden jede Stde. 10 ml einer Zellsuspension ent­
nommen und diese dann in einem besonderen Gefäß mit
14C-Leucin inkubiert. Diese Proben wurden erst 8 Stdn.
p.i. eingefroren (Reihe II; Virusprotein) . Später wur­
den die Zellen in allen Proben durch 3-maliges Einfrie­
ren und Auftauen lysiert. Nachdem Material für die
HA- und Plaque-Teste sowie für die Bestimmung der
Radioaktivität im Gesamtprotein entnommen war, wurdas Lysat 1-mal mit Frigen extrahiert und dann mit Ery­
throcyten behandelt. Die Radioaktivität der an die Blut­
zellen adsorbierten Viruspartikel wurde im Ge i g e r M ü l l e r - Zähler gemessen.
In Abb. 2 ist das Ergebnis dieses Versuches zu­
sammenfassend graphisch dargestellt. Die zur Kon­
struktion der Kurven dienenden Werte sind in
Tab. 2 enthalten. Die Werte für das Virusprotein
wurden aus den Differenzen der Proben 0 —8 und
X — 8 (Reihe II) errechnet. Aus dem Vergleich der
Kurven geht hervor, daß das Virusprotein 1 —2 Stdn.
vor dem Auftreten der polyederartigen Viruspartikel
synthetisiert wird.
Tab. 1. Ermittlung der Anzahl der in L-Zellen gebildeten
Viruspartikel. Die Werte in Spalte I wurden aus der Radio­
aktivität des in die Viruspartikel eingebauten 14C-Leucins be­
stimmt. Zur Berechnung der Anzahl der Viruspartikel (II)
wurde ein Verhältnis von 8,7 g Leucin/100 g Virusprotein 2
angenommen. Die Zellkonzentration in diesen Versuchen be­
trug 2 -IO6 Zellen/ml (s. Methodik d. 1. Mitteilung).
3. Zeitlicher Verlauf der Synthese des Virusproteins
In den folgenden Experimenten sollte der Verlauf
der Bildung desjenigen Proteins, das später in den
Virusteilchen erscheint, mit dem Auftreten der poly­
ederartigen Viruspartikel verglichen werden. Letzte­
res läßt sich leicht mit Hilfe der HA-Reaktion und
des Plaque-Tests verfolgen. Es war aber wünschens­
wert, den Vergleich mit Methoden gleicher Empfind2 P.
T.
E. M . M a r t i n , S. S ved , R. C.
Biochem. J. 80, 597 [1961].
F a u lk n e r ,
S. W o r k ,
V a le n tin e
u.
Abb. 2. Bestimmung des zeitlichen Verlaufs der Synthese des
Virusproteins und der Viruspartikel in L-Zellen. (Zusammen­
fassung der Daten aus Tab. 2.)
In Abb. 2 ist außerdem noch die Kurve, die den
Einbau von 14C-Leucin in das Gesamtprotein der
Zelle wiedergibt, eingetragen. Angegeben sind die
Meßwerte aus den beiden angewendeten Markie­
rungsverfahren (0 —X und X — 8 Stdn. p.i.). Die
Kurve zeigt, daß die Rate der Gesamtprotein-Synthese in Abhängigkeit von der Zeit nach der Infek-
P. HAUSEN
1030
Zeit X
(Stdn. p. i.)
0
2
3
4
5
6
7
8
Imp./Min.
im hämads.
Virus
0
0
0
7,5
60
120
240
242
H AE/m l
PBE/m l
160
640
1280
1280
2560
5,0 • 103
2,9 • 104
5,6 • 104
7,4 • 106
3,2 • 107
5,5 • 107
1.1 • 10«
1,0 • 108
a) Bildung der polyederartigen Viruspartikel (Reihe I; Markierung von Zeit 0 bis Zeit X ) .
Zeit X
(Stdn. p. i.)
0
2
3
4
5
6
7
8
Imp./Min.
im hämads.
Virus
294
340
235
161
96.5
28.2
28,2
—
HAE/ml
2560
2560
2560
1280
2560
2560
2560
2560
b) Bildung des Virusproteins (Reihe II; Markierung von
Zeit X bis 8 Stdn. p.i.).
Tab. 2. Ermittlung des zeitlichen Verlaufs der Bildung der Viruspartikel (Reihe I) und des Virusproteins (Reihe II) durch
Markierung mit 14C-Leucin.
tion geringer wird. Der Einfluß der Virusinfektion
auf die Gesamtprotein-Synthese wurde im folgenden
Experiment noch näher untersucht.
4. Einfluß der ME-lnfektion auf die Gesamtprotein-
dann aber scharf ab. Zwischen 3 und 6 Stdn. p.i.,
d. h. zu der Zeit, zu der das Virusprotein gebildet
wird (s. Abb. 3), wurde bei allen Versuchen dieser
Art ein Abflachen der entsprechenden Kurve beob­
achtet.
Synthese der L-Zellen
Von einer Zellsuspension wurde die eine Hälfte mit
Virus infiziert, die andere mit einem Extrakt aus nor­
malem Mäusegehirn, der in gleicher Weise wie das
Impfvirus hergestellt war, behandelt. Die Zellen wur­
den danach gewaschen und im Gewebekulturmedium
bei 37 cC inkubiert. Zu verschiedenen Zeiten wurden
der Zellsuspension jeweils 2 ml entnommen und mit
14C-Leucin (5//C/mg; 0,02 mg/ml) weitere 15 Min. in­
kubiert. Nach dieser Zeit wurde das Protein mit 10-proz.
Trichloressigsäure gefällt und seine Radioaktivität be­
stimmt.
In Abb. 3 ist der Einbau von 14C-Leucin in das
Protein infizierter Zellen als Prozent des Einbaues
bei nicht-infizierten Kontrollzellen dargestellt. Kurz
nach der Infektion steigt der Einbau etwas an, fällt
Besprechung der Ergebnisse
Die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Ex­
perimente deuten darauf hin, daß die Synthese des
Proteins des ME-Virus etwa 1^2 Stdn. vor dem Auf­
treten der polyederartigen Virusteilchen einsetzt. Das
Ergebnis des in dieser Hinsicht wichtigen Versuches
(s. Abb. 3) kann nicht durch „Pool“-Effekte bestimmt
worden sein. Vorversuche hatten gezeigt, daß bei
den L-Zellen 14C-Leucin ohne Verzögerung aufge­
nommen und eingebaut wird, und daß deshalb ein
erheblicher intrazellulärer Vorrat an freiem Leucin
nicht existieren kann. Ein „Pool-Effekt“ würde sich
nicht nur auf die Virusprotein-, sondern auch auf
die Gesamtprotein-Synthese auswirken. Das ist aber
nach Abb. 3 nicht der Fall. Die Gesamtprotein-Syn­
these zeigt bei den zwei verschiedenen Markierungs­
verfahren nahezu den gleichen Verlauf.
Etwa zur gleichen Zeit, zu der nach den Markie­
rungs-Experimenten das Virusprotein synthetisiert
wird, ist in den infizierten Zellen ein nichthämadsorbierbares, lösliches Antigen nachzuweisen (s.
I. M itt.1). Es liegt nahe anzunehmen, daß dieses
Antigen mit dem vor den polyederartigen Viruspar­
tikeln erscheinenden Virusprotein identisch ist.
1 2
3
1
5
6
7
Stdn. p .i
—
8
►
Abb. 3. Veränderung der Proteinsynthese-Rate in infizierten
L-Zellen. Es sind 2 Experimente eingetragen ( x; • ) .
Faßt man diese und frühere Befunde zusammen,
so ergibt sich folgendes Bild von der Produktion des
ME-Virus: Zunächst werden Virus-RNS und-Protein
gebildet. Liegen ausreichende Mengen von diesen
VERMEHRUNG DES ME-VIRUS IN L-ZELLEN II
1031
Viruskomponenten vor, so treten sie zu den poly­
ederartigen Viruspartikeln zusammen. In diesem
Augenblick gewinnt das Virusprotein seine häm­
adsorbierende bzw. hämagglutinierende Fähigkeit,
wahrscheinlich durch Änderung seiner elektrostati­
schen Eigenschaften. Für diese Vorstellung spricht
weiterhin die Feststellung, daß die Viruspartikel
schon unter schonenden Bedingungen im schwach
sauren Milieu in Untereinheiten zerfallen, die unge­
fähr die Größe des löslichen Antigens besitzen und
im Komplementbindungs-Test, nicht aber im Hämagglutinations-Test, positiv reagieren.
Ebenso wie beim ME-Virus wird auch beim Polio­
myelitis- 3 und EMC-Virus4 zunächst Virusprotein
synthetisiert, ehe die reifen Viruspartikel erscheinen.
Der zeitliche Abstand ist aber hier geringer als beim
ME-Virus. Womöglich beruht das darauf, daß bei
diesen Virusstämmen die einzelnen Prozesse besser
koordiniert sind als bei unserem Modell-Virus. Dies
könnte auch die Ursache dafür sein, daß beim MEVirus in relativ großer Menge nicht-infektiöse, „feh­
lerhafte“ Viruspartikel entstehen.
Auch im Hinblick auf die Hemmung der Gesamtprotein-Synthese bestehen zwischen Polio- 5, EMC- 6
und ME-Virus weitgehende Parallelen. Unsere Ver­
suche lassen erkennen, daß im Zeitraum von 3 bis
6 Stdn. nach der Infektion die unter der Wirkung
des Virus einsetzende Hemmung der GesamtproteinSynthese durch einen gegenläufigen Prozeß beein­
flußt wird. Die zeitlichen Verhältnisse lassen vermu­
ten, daß es sich dabei um die Synthese des Virus­
proteins handelt. Die Hemmung der GesamtproteinSynthese im infizierten System läuft annähernd
parallel mit der Hemmung der RNS-Synthese im
Zellkern7, die früher auf autoradiographischem
Wege festgestellt wurde. Damit ist aber noch nicht
erwiesen, daß zwischen beiden Prozessen ein unmit­
telbarer Zusammenhang besteht. Untersuchungen,
die sich mit diesem Problem befassen, werden Ge­
genstand einer weiteren Mitteilung sein 8.
3 J . E. D a rn ell
[ I9 6 0 ] .
2 3 5, 74
6
Virology 19,
8
u.
L . L evintow , J .
biol. Chemistry
4 E. M. M a r t i n , persönliche Mitteilung.
5 E. F. Z im m e r m a n n , M . H e e t e r u . J. E.
400 [1963].
Ich bin Herrn Professor Dr. W . S c h ä f e r für seine
Unterstützung und anregende Diskussionen zu diesen
Arbeiten zu großem Dank verpflichtet. Herrn U. W a n ­
d e l danke ich für seine Mitarbeit.
Die Arbeiten wurden von der D e u t s c h e n F o r ­
s c h u n g s g e m e i n s c h a f t gefördert.
7
D a r n e ll,
E. M . M a r t i n , J. M a l e c , S. S ved u . T. S. W o r k , Biochem. J.
80, 585 [1961].
H . H a u s e n , Z. Naturforschg. 17 b , 158 [1962].
P. H a u s e n u . D. W . V e r u w o e r d , Virology, im Druck.