Affinitätschromatographie/Elektrophorese
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Inhaltsverzeichnis Vorbemerkungen ........................................................................................................................................ 1 Affinitätschromatographie/Elektrophorese .............................................................................................. 5 Theoretischer Hintergrund ........................................................................................................................ 5 Versuchsbeschreibung ............................................................................................................................. 8 Fragen/Aufgaben .................................................................................................................................... 16 Geräte und Materialien ........................................................................................................................... 17 Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration ............................................................................... 18 Theoretischer Hintergrund ...................................................................................................................... 18 Versuchsbeschreibung ........................................................................................................................... 21 Fragen/Aufgaben .................................................................................................................................... 27 Geräte und Materialien ........................................................................................................................... 28 Nukleinsäuren und PCR ........................................................................................................................... 29 Theoretischer Hintergrund ...................................................................................................................... 29 Versuchsbeschreibung ........................................................................................................................... 32 Fragen/Aufgaben .................................................................................................................................... 36 Geräte und Materialien ........................................................................................................................... 37 Affinitätschromatographie/Elektrophorese Vorbemerkungen Ort und Zeit Die Seminare zu den jeweiligen Kurstagen werden am Vortag im Seminarraum des Instituts für Biochemie (Chemiegebäude Raum 55 B) abgehalten. Die ersten Seminare finden bereits am Dienstag, den 14.10.2003 statt (siehe Aushang). Der praktische Teil für alle Gruppen findet in der Zeit vom 15.10 bis 17.10. 2003 statt. Beginn ist um 8.30 s.t. am Mittwoch, den 15.10.2003 im Praktikumsraum im 3. Obergeschoss des Chemiegebäudes, Raum 356. Im Praktikum gibt es keine festen Arbeitsplätze. Den Gruppen wird jeweils am Kurstag ein Arbeitsplatz zugewiesen. Ziel des Praktikums Ziel des Praktikums ist, dem Studenten grundlegende Methoden der Biochemie zu vermitteln und dabei einige Prinzipien der Biochemie zu veranschaulichen. Das Biochemische Grundpraktikum umfasst Experimente zur Elektrophorese (z.B. SDS-Gelelektrophorese, Agarosegelelektrophorese) Chromatographie (z. B. Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration) Molekularbiologie (z.B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)). Im Rahmen des Praktikums sollen die Studenten die physikalisch-chemischen Grundlagen wichtiger biochemischer Arbeitstechniken kennen lernen: Pipettieren kleinster Volumina Zell- und Gewebeaufschluss Zentrifugation Herstellung und Eigenschaften von Puffern Chromatographische Trennverfahren (Säulenchromatographie) Elektrophoretische Trennverfahren Spektroskopische Untersuchungsmethoden (Photometrie; Fluoreszenz) Wir hoffen, dass das Praktikum in dieser Form das Interesse der Studenten an der Biochemie fördert, und dass jeder durch engagierte Mitarbeit zum Gelingen der Experimente beiträgt. Für Hinweise und Vorschläge, die zur Verbesserung dieses Praktikums beitragen, sind wir offen. 1 Affinitätschromatographie/Elektrophorese Gruppeneinteilung Gruppen Dienstag A1-5 Seminar B1-5 Seminar C1-5 Seminar Mittwoch Donnerstag Affinitätschromatographie/ Ionenaustauschchromatogr Elektrophorese aphie und Gelfiltration Nukleinsäuren und PCR Ionenaustauschchromatogr aphie und Gelfiltration Freitag Nukleinsäuren und PCR Affinitätschromatographie/ Ionenaustauschchromatogr Elektrophorese aphie und Gelfiltration Nukleinsäuren und PCR Affinitätschromatographie/ Elektrophorese Vorbereitung auf den Versuchstag, Eingangskolloquium Zur Vorbereitung auf den Versuchstag ist es erforderlich, das Skript vorher gründlich gelesen zu haben. Das Skript ersetzt allerdings nicht ein Lehrbuch. Vor Beginn des Versuchs wird ein Eingangskolloquium durchgeführt, in dem zu den jeweiligen Stichworten und den Versuchsanleitungen Fragen gestellt und adäquate Antworten erwartet werden. Versuchsanleitung und Versuchsausführung Die Ausführung der Versuche erfolgt nach den vorliegenden Versuchsanleitungen. Zur Bearbeitung der Versuche sind Arbeitspapier DIN A4, Taschenrechner und Zeichengerät mitzubringen. Protokoll Zu jedem abgeschlossenen Versuch gehört ein Protokoll. Dieses sollte folgendermaßen aufgebaut sein: 1. Name, Datum, Gruppe 2. Thema 3. Kurze Einleitung (5 -10 Sätze) 4. Material und Methoden (falls abweichend vom Skript) 5. Ergebnisse (Messwerte in Form von Tabellen; Auswertung, mathematisch, graphisch; Abbildungen selbsterklärend beschriftet) 6. Diskussion (Bewertung der Ergebnisse, Vergleich mit Literaturdaten (sofern vorhanden) bzw. mit zu erwartenden Ergebnissen, Fehlerbetrachtung) Das Protokoll muss von jeder Gruppe beim Assistenten abgegeben und von diesem abgezeichnet werden. Die Protokolle sind bis spätestens am folgenden Versuchstag dem Assistenten vorzulegen. 2 Affinitätschromatographie/Elektrophorese Haftung Alle Apparaturen und andere Gegenstände, insbesondere die Pipetten sind mit größter Sorgfalt zu behandeln. Messgeräte dürfen nur nach vorheriger Einweisung durch den Assistenten in Betrieb genommen werden. Sicherheitsvorschriften Es ist darauf zu achten, dass bei allen Laborarbeiten die Sicherheit am Arbeitsplatz gewährleistet ist. Der Arbeitsplatz wird jeder Gruppe sauber und aufgeräumt übergeben. Die Gruppe hat selbst für Ordnung und Sauberkeit am Arbeitsplatz zu sorgen und diesen nach Beendigung des Experiments ebenso wie die verwendeten Geräte gesäubert zurückzulassen. Zuwiderhandeln gegen die Sicherheitsvorschriften kann den Ausschluss vom Praktikum nach sich ziehen. Auf folgende Punkte ist besonders zu achten: 1. Informieren Sie sich bitte über Maßnahmen der Ersten Hilfe. 2. Während des Aufenthaltes in den Praktikumsräumen ist Schutzkleidung (Laborkittel) zu tragen. 3. Überbekleidung ist in den Garderobenschränken abzulegen. Notfalls teilen Sie bitte einen Schrank mit einer/m Kollegin/en. 4. Informieren Sie sich über die Anordnung von Verbandskästen und Feuerlöschern. 5. Essen, Trinken und Rauchen ist in den Praktikumsräumen nicht gestattet. 6. Jede Mitnahme von Chemikalien aus den Praktikumsräumen ist untersagt. 7. Ausstehende Chemikalien sollen nur in den zum Versuch notwendigen Mengen aus den Vorratsflaschen entnommen werden. Nicht gebrauchte Lösungen dürfen nicht in die Vorratsflaschen zurückgegeben werden. 8. Stopfen von Lösungsmittelflaschen dürfen ebenso wenig wie Pipetten untereinander vertauscht werden. 9. Lösungsmittel und Lösungen sollen nur mit mechanischen Pipetten bzw. unter Verwendung von Pipettierhilfen (Peleus-Bälle, Pumpetten u.a.) dosiert werden. 10. Machen Sie sich mit der Funktionsweise der Pipetten (PipetmanP Gilson) vertraut (Fragen Sie Ihren Assistenten)! 11. Organische Lösungsmittel, Lösungen, die organische Lösungsmittel enthalten, und Lösungen, die andere Gefahrenstoffe enthalten, müssen in den dafür vorgesehenen Behältern entsorgt werden. Literatur Folgende Literatur (in alphabetischer Reihenfolge) kann zum Studium herangezogen werden: 1. Karlson, P., Doenecke, D. & Koolman, J. (1994). Kurzes Lehrbuch der Biochemie für Mediziner und Naturwissenschaftler, 14. Auflage, Thieme, Stuttgart. 2. Pingoud, A. & Urbanke, C. (1997). Arbeitsmethoden der Biochemie, de Gruyter, Berlin. 3. Nelson, D. L. & Cox, M. M. (2001). Lehninger Biochemie. 3. edit, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. 3 Affinitätschromatographie/Elektrophorese 4. Pingoud, A. Urbanke, C., Hoggett, J., Jeltsch, A. Biochemical methods : a concise guide for students and researchers (2002) Weinheim. Wiley-VCH 5. Jeremy M. Berg; John L. Tymoczko; Lubert Stryer. Biochemistry (2002) - 5. ed., international ed., 2. printing. - New York : Freeman 6. Donald Voet ; Judith G. Voet ; Charlotte Pratt. Lehrbuch der Biochemie (2002)/ - Weinheim : WileyVCH 7. Koolman, J. & Roehm, K.-H. (2003). Taschenatlas der Biochemie. 3., vollst. ueberarb. und erw. Aufl. Thieme, Stuttgart. Die meisten Lehrbücher sind in einigen Exemplaren in den Bibliotheken der Universität vorhanden. Eine Anschaffung eines Biochemie-Lehrbuchs empfiehlt sich in jedem Fall für Studenten, die die Säule Biochemie im Hauptstudium wählen wollen. Das Lehrbuch: Biochemistry. Berg, Jeremy M.; Tymoczko, John L.; and Stryer, Lubert. New York: W. H. Freeman and Co.; 2002. ist seit kurzem auch am National Center for Biotechnology Information (NCBI) online verfügbar: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Books 4 Affinitätschromatographie/Elektrophorese Affinitätschromatographie/Elektrophorese Theoretischer Hintergrund Stichworte Die folgenden Stichworte geben Ihnen eine Orientierung, welche Inhalte an diesem Praktikumstag behandelt werden: Proteinreinigung, Affinitätschromatographie, Spektroskopische Methoden (Photometrie, Absorption, Fluoreszenz), SDS- Gelelektrophorese Proteinreinigung Reine biologische Materialien (ein Protein, definierter Komplex) sind die Voraussetzung für das in vitro Studium der Funktion. Das molekulare Verständnis biologischer Prozesse hat sich parallel zur Verbesserung der Trennmethoden entwickelt. Proteinreinigung ist anspruchsvoll: viele Moleküle mit sehr ähnlichen Eigenschaften, in teilweise geringer Mengen, die oft unstabil sind, müssen voneinander getrennt werden. Rekombinante Verbesserung Expression der erlaubt Möglichkeiten eine (bis 40 Abbildung 1: Überblick über die Herstellung und Analyse rekombinanter Proteine enorme % des Gesamtproteins in Mikroorganismen) Chromatographie Das Substanzgemisch in mobiler Phase läuft durch eine stationäre Phase (mehr oder weniger poröse Partikel (beads) in einer Säule). Wechselwirkungen (Adsorption bzw. Verteilung) zwischen gelösten Molekülen und Oberfläche der stationären Phase bestimmen die Wanderungsgeschwindigkeit und Trennleistung. Die Bedingungen (Ionenstärke, pH etc) müssen richtig gewählt sein, damit akzeptable Wanderungsgeschwindigkeit und gute Trennung resultiert (Stärke der Wechselwirkungen muss optimal eingestellt werden). Abbildung 2: Schema zur Affinitätschromatographie 5 Affinitätschromatographie/Elektrophorese Affinitätschromatographie Prinzip: Immobilisierung eines spezifischen Liganden, der nicht-kovalent, spezifisch und stark an das zu reinigende Protein bindet (z.B. Substrat, Inhibitor, Antikörper etc.) Die Elution erfolgt mit kompetitierenden Liganden oder durch Veränderung der Pufferzusammensetzung, so dass die Bindung von Protein und Ligand verändert wird. Vorteil: An Stelle kleiner physikalischer Unterschiede zwischen verschiedenen Proteinen werden die spezifischen Eigenschaften eines Proteins gezielt ausgenutzt, was eine hohe Reinigungsleistung ermöglicht und somit zur Reduktion der Zahl der Reinigungsschritte führt. Nachteil: Die Affinitätschromatographiematrix muss oft selbst hergestellt werden; kleine Liganden müssen über längere Linker fixiert werden (synthetischer Aufwand). Bei zu hoher Affinität ist die Elution erschwert. Heute: Rekombinante Proteine können mit Affinitäts-tags für die Reinigung versehen werden. Beispiele: Tandem Affinity Purification (TAP) Technology:: Durch zwei Affinitätstags an einem Protein lassen sich Komplexe, in denen dieses Protein vorhanden ist, hochspezifisch aufreinigen. Affinitäts-tag Matrix Antigen Antikörper (immobilisiert) 6His Ni-NTA Strep-tag II (Peptid) Streptactin (Streptavidin-Derivat) Glutathion-S-Transferase Glutathion-Sepharose Calmodulin-Bindungs-Peptid (CBP) Calmodulin-Affinitätsmatrix IgG Bindungsdomänen von Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) IgG Maltose-Bindungs-Protein Amylose-Matrix 6 Affinitätschromatographie/Elektrophorese Ni-NTA-Affinitätschromatographie Mit der Affinitätschromatographie (AC) lassen sich gezielt Proteine (oder andere Substanzen) aufgrund einer reversiblen Wechselwirkung zwischen dem Protein (oder Teilen des Proteins) und einem spezifischen Liganden, der an eine chromatographische Matrix gebunden ist, aus einem Gemisch heraus isolieren. Diese Chromatographiemethode bietet oftmals einen sehr hohen Aufreinigungsgrad. Ein Beispiel der AC stellt die Aufreinigung von Proteinen dar, die einen Histidin-tag tragen (das sind z.B. sechs aufeinander folgende Histidinreste am N- oder C-Terminus eines Proteins) mittels Ni-NTA MetalAffinitätschromatographie dar (siehe Abbildung 3). Der Ligand ist in diesem Fall das Ni2+ Ion, das über Nitrilotriessigsäure ans Säulenmaterial gebunden ist. Die Proteine binden über die benachbarten Histidinreste an das Ni2+ und somit an die Chromatographiematrix. Die Elution der gebundenen Proteine kann durch saurem pH, Metallionenkomplexbildner (z.B. EDTA) oder Imidazol erfolgen. Abbildung 3: Schema zur Ni-NTA-Affinitätschromatographie: Links oben: Wechselwirkung zwischen immobilisierten NTA-Ligand und zwei benachbarten Histidinresten; Rechts: typische Analyse einer Affinitätschromatographie mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Ü = Überstand; D = Durchlauf; W = Waschschritt; E1-E3 = Elution). Man bemerke, dass in den Eluaten E2 und E3 nur eine einzige Proteinbande zu sehen ist. 7 Affinitätschromatographie/Elektrophorese Versuchsbeschreibung Aufgabe In diesem Versuch wird ein rekombinantes GFP-Protein (Grün-Fluoreszierendes Protein aus der Hydromeduse Aequorea victoria), das am C-Terminus einen Hexa-Histidin-tag trägt, aus einem bakteriellen Affinitätschromatographie Zelllysat in mittels einem Schritt gereinigt. Die Aufreinigung wird zunächst durch die GFP-Fluoreszenz und anschließend durch SDS-Gelelektrophorese verschiedener Fraktionen, die während der Aufeinigung anfallen, verfolgt. Weiterhin soll der Einfluss von Temperatur und Detergentien auf die Stabilität des Proteins untersucht werden. GFP-Protein Das GFP-Protein ist mittlerweile als Werkzeug der modernen Zellbiologie nicht mehr wegzudenken. Als Fusionsprotein mit einem anderen Protein erlaubt es dessen direkte Visualisierung in lebenden Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Seine Fluoreszenz verdankt es einem zyklischen Tripeptid (aus Serin-Tyrosin-Glycin; siehe Abbildung 4), das im Proteininneren des GFP-Proteins dann die charakteristische Fluoreszenz zeigt. Das Wildtyp-GFP absorbiert UV- und Blaulicht mit einem Maximum bei 395 nm und einem Nebenmaximum bei 470 nm. Das Emissionspektrum hat sein Maximum bei 509 nm mit einer Schulter bei 540 nm. Durch Mutagenese konnten Varianten des Abbildung 4: Grün-fluoreszierendes Protein GFP-Proteins ihr Links, Struktur des fassförmigen (engl. -barrel) GFP- Fluoreszenzmaximum im gelben bzw. blauen Proteins (Cartoon-Darstellung) und Strukturformel des Wellenlängenbereich Chromophors. Rechts, Absorption- und Emissionsspektrum erzeugt werden, haben die ( Blue Fluorescent Protein, BFP, Yellow-Fluorescent des GFP-Proteins. Protein, YFP bzw. Cyan-Fluorescent Protein, CFP) 8 Affinitätschromatographie/Elektrophorese Teil 1: Ni-NTA Affinitätschromatographie über Spin-Säulchen Probengefäß Proben für SDS-PAGE 1,5ml Eppis 0,5ml Eppis H Beschreibung HG Zellhomogenat PG Pellet des Homogenats nach Zentrifugation Ü ÜG Überstand nach Zentrifugation D1+D2 DG Durchlauf der Affinitätschromatographiesäule W1+W2 W1G; W2G E1+E2 E1G, E2G Waschfraktionen Eluate der Affinitätschromatographiesäule Im Laufe des Versuchs erhält man verschiedene Fraktionen. Diese sind jeweils FETT hervorgehoben. Diese Fraktionen werden in 7 zuvor zu beschriftenden 1,5-ml- Reaktionsgefäßen aufbewahrt: (Gefäß „H“ wird Ihnen zu Beginn des Versuches ausgehändigt). Für die Probenanalyse auf einem SDS-Gel werden acht 0,5-ml Reaktionsgefäße benötigt (zu beschriften mit HG bis E2G), in die jeweils 5µl Lämmli-Auftrags-Puffer (LAP 5x) pipettiert wird. Die Aufreinigung des GFP Proteins kann anhand der Fluoreszenz des GFP-Proteins verfolgt werden. Hierzu werden die Fraktionen unter der UV-Handlampe (Anregung bei 354 nm) auf Fluoreszenz untersucht. (Achtung, nicht in die Lampe schauen!). Die Schritte 1-5 werden von einem Assistenten durchgeführt, da in diesem Praktikum keine Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO) vorgesehen sind. Zur besseren Übersicht ist auf einer der folgenden Seiten ein Schema für den Versuchsablauf dargestellt. 1. Zellpellet auf Eis für 15 min auftauen lassen 2. Zellen in 1 ml Lysispuffer gründlich resuspendieren (mehrfach vorsichtig mit der Pipette auf- und abpipettieren) 3. Zugabe von 1 mg Lysozym (100 µl einer 10 mg/ml Lösung) 4. Für 30 min auf Eis inkubieren 5. Homogenisieren der Zellen durch Ultraschall (Microtip; 15 sec 6-8) 6. 20 µl Probe vom Homogenat in das Reaktionsgefäß (HG) überführen 9 Affinitätschromatographie/Elektrophorese 7. Zentrifugation des restlichen Homogenats für 30 min bei 14000 U/min in der Tischzentrifuge Überstand in Reaktionsgefäß (Ü) pipettieren und auf Eis stellen (Kontrolle unter UV-Handlampe bei 354 nm) 8. Pellet mit 1 ml Lysispuffer resuspendieren. 20 µl des resuspendierten Pellets in Reaktionsgefäß (PG) stellen 9. 20 µl Probe aus dem Überstand (Ü) in Reaktionsgefäß (ÜG) überführen 10. In der Zwischenzeit wird die Spin-Säule (bereits mit 600 µl Lysispuffer equilibriert) ausgegeben 11. Flüssigkeit unter der Spin-Säule verwerfen und die Spin-Säule bei 2000 U/min für 30 sec. „trocken“ zentrifugieren 12. Spin-Säule in Gefäß D1 stellen 13. 600 µl des Überstandes (klares Lysat) auf die Spinsäule auftragen und bei ca. 700g (2000 U/min) für 2 min zentrifugieren. (Kontrolle des Durchlaufs unter UV-Handlampe bei 354 nm; sollte nicht fluoreszieren) 14. Spinsäule in Gefäß D2 stellen 15. Restlichen Überstand (Ü) auf die Spinsäule auftragen und bei ca. 700g (2000 U/min) für 2 min zentrifugieren. (D1) und (D2) in Gefäß D1 vereinigen. 20 µl hiervon in das Reaktionsgefäß (DG) überführen 16. Spinsäule in Gefäß W1 stellen 17. 500 µl Waschpuffer auf die Spinsäule auftragen und bei ca. 700g (2000 U/min) für 2 min zentrifugieren. (Kontrolle unter UV-Handlampe bei 354 nm, sollte nicht fluoreszieren); 20 µl der Waschfraktion (W1) in ein neues Reaktionsgefäß (W1G) stellen 18. Schritte 16+17 mit Gefäß W2 wiederholen (W220 µl in W2G pipettieren) 19. Säule in Gefäß E1 stellen 20. Protein 2 mit je 100 µl Elutionspuffer eluieren (Zentrifugation direkt in die Reaktionsgefäße E1 bzw. E2 bei 700g (2000 U/min) für 2 min) (70 % des Proteins sollten sich jetzt im ersten Eluat befinden/ Kontrolle unter UV-Handlampe bei 354 nm, sollte jetzt fluoreszieren). Je 20 µl von E1 und E2 in je ein Reaktionsgefäß (E1G) bzw. (E2G) pipettieren. Die Eluate E1 und E2 aufheben, da sie für den 3. Versuchsteil benötigt werden. 10 Affinitätschromatographie/Elektrophorese Homogenat H Gelprobe HG Zentrifugation Pellet resuspendieren Pellet (PG) Gelprobe PG Überstand in neues Gefäß überführen Überstand Ü Gelprobe ÜG Probe auf Säule auftragen Durchlauf D1+D2 Gelprobe DG Waschfraktion W1 Gelprobe W1G Waschfraktion W2 Gelprobe W2G Eluat1 Gelprobe E1G Eluat2 Gelprobe E2G Säule Waschen Säule Waschen Elution 11 Affinitätschromatographie/Elektrophorese Teil 2: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Zur Analyse von Proteinen und Proteingemischen eignet sich die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Protein + denaturierendes Detergenz (i.a. geladene Detergentien) Detergentien sind amphipathische Moleküle, die stark mit hydrophoben Teilen von Proteinen interagieren und die globuläre Struktur aufbrechen SDS (Natriumdodecylsulfat) wird von Proteinen im konstanten Verhältnis von ca. 1,4 g SDS/ g Protein gebunden (1 SDS Molekül/ 2 Aminosäuren), Ladung von gebundenem SDS dominiert → Molekulargewicht proportional (Mr) (konstante Ladung/Masseneinheit) Die Trennung erfolgt auf Grund der Siebeffekte des Gels in der Reihenfolge der molaren Massen. Gute Reproduzierbarkeit, Mr auf 5-10% genau bestimmbar (Eichproteine) Abbildung 5: relative Mobilität geht linear mit log Mr SDS-Gelelektrophorese sehr gute Auflösung (~1 kDa) A: Aufbau der Apparatur; B: Funktion Komplexe (Oligomere) werden in einzelne Ketten von -Mercaptoethanol und SDS (siehe Text) getrennt reduzierende/nicht reduzierende Bedingungen →Information über Disulfidbrücken Beim Umgang mit Acrylamid jeden Hautkontakt vermeiden! Handschuhe bieten nur bedingt Schutz! In diesem Experiment werden ein 6%iges Sammelgel sowie ein 15%iges Trenngel verwendet. Das jeweilige verwendete Gelsystem hängt von den aufzutrennenden Proteinen ab. Trenngel: 15 % Acrylamid/Bisacrylamid 0,1 % SDS 840 mM Tris/HCl 8,8 Sammelgel : 6 % Acrylamid/Bisacrylamid Gießen des Gels 1. Glasplatten gründlich mit Wasser und einem Spülmittel 0,1 % SDS 125 mM Tris/HCl 6,8 reinigen, mit Reinstwasser abspülen und anschließend auf ein Papiertuch legen, Seitenspacer und Bodenspacer positionieren. Öhrchenplatte aufsetzen, die siehe S. 17 Spacer ausrichten und die Kassette mit den drei Metallklammern fixieren, die Klammern dabei mit den Druckflächen auf Höhe der Spacer setzen, da sonst das Glas brechen kann. 12 Affinitätschromatographie/Elektrophorese Die Kassette wird dann senkrecht auf die untere Klammer gestellt und entlang der Spacer mit flüssiger Agarose oder Agar mit Hilfe einer Pasteurpipette abgedichtet. 2. Grenzlinie für Trenngel ca. 1,5 cm unter dem oberen Glasrand der Öhrchenplatte mit einem EddingStift markieren. 3. Für ein kleines Polyacrylamidgel werden 7 ml Trenngellösung in ein Reagenzglas pipettiert. Durch Zugabe von je 1/500 Volumen (14 µl) TEMED (N,N,N‘,N‘-Tetramethylethlyendiamin) und 1/500 Volumen Ammoniumperoxodisulfat (APS) (14 µl) wird die Polymerisation gestartet. Zum Mischen wird das Reagenzglas mit Parafilm verschlossen und mehrmals durch Invertieren gemischt. Nach dem Mischen wird die Lösung sofort in die vorbereitete Gelkassette bis zur Markierung gegossen. 4. Das Trenngel sofort mit Ethanol überschichten, so dass sich eine glatte Oberfläche bildet. 5. Nach ca. 10 min ist das Acrylamid polymerisiert. Der Ethanol kann abgegossen werden. (Restflüssigkeit kann mit einem Filterpapier abgesaugt werden). 6. Für die Herstellung des Sammelgels werden 3 ml Sammelgellösung + 1/500 Volumen TEMED (6 µl) und 1/500 Volumen APS (6 µl) vermischt (Parafilm) und die Kammer damit bis zum Rand gefüllt. 7. Nun drückt man den „Elektrophorese-Kamm“ in das flüssige Sammelgel. Falls der Flüssigkeitsspiegel etwas absinkt, wird mit Hilfe einer Pasteurpipette etwas Sammelgel nachgefüllt. (Vorsicht, nichtpolymerisiertes Acrylamid ist giftig) 8. Nach 10 min ist auch das Sammelgel polymerisiert und nun werden die Klammern und der Bodenspacer entfernt. Einbau des Gels in die Elektrophoreseapparatur, Probenauftrag und Start der Elektrophorese 1. In das untere Reservoir der vertikalen Elektrophoresekammer wird SDS-Elektrophoresepuffer gefüllt. 2. Das Gel wird in eine vertikale Elektrophoresekammer eingespannt. Beim Einsetzen in den SDSElektrophoresepuffer ist darauf zu achten, dass a) die Öhrchenplatte zum oberen Pufferreservoir gewandt ist und b) keine Luftblasen zwischen Glasplatte und Gelunterseite eingeschlossen werden. Am besten verhindert man dies, indem man die Gelkassette schräg in die Kammer einsetzt und langsam gerade aufstellt. Mit zwei Klammern wird die Kassette in der Kammer fixiert. Anschließend wird mit Agarose abgedichtet) 3. Die obere Kammer wird nun ebenfalls mit SDS- Elektrophoresepuffer gefüllt. Spur Probe Volumen. (µl) 4. Bevor man den Kamm zieht, kann man mit einem wasserfesten 1 Marker 6,0 2 HG 12,5 3 PG 12,5 Der Kamm wird nun vorsichtig aus dem Gel herausgezogen 4 ÜG 12,5 und die Taschen mit einer Spritze mit aufgesetzter Kanüle 5 DG 12,5 gespült. (Evtl. müssen die Stege der Taschen mit der Kanüle 6 W1G 7,5 ausgerichtet werden). 7 W2G 7,5 8 E1G 2,5 9 E2G 2,5 10 E1G 12,5 11 E2G 12,5 12 LAP 1 5,0 Stift die Position der Taschen kennzeichnen; dies erleichtert später das Auftragen der Proben. 5. 6. Die Probenlösungen werden für 2 min auf 95 °C erhitzt, auf Eis abgekühlt, anschließend gevortext und in der Zentrifuge kurz zentrifugiert (< 1 min). Der Marker (Lösung steht fertig 13 Affinitätschromatographie/Elektrophorese vorbereitet zur Verfügung), und die Probenlösung werden auf das Gel ausgetragen (siehe rechts). 7. Der Kammerdeckel wird nun aufgesetzt und die Kabel in das Netzspannungsgerät eingesetzt (Rot = Plus = Anode; Schwarz = Minus = Kathode) 8. Spannungsnetzgerät anschließen (darauf achten, dass der Schalter zunächst auf „off“ steht). Im Modus „set“ Stromstärke auf 30 mA / Gel einstellen, Spannung auf Maximalwert einstellen. Schalter von „off“ auf „on“. (Diese Angaben hängen vom jeweiligen Spannungsnetzgerät ab) 9. Die Elektrophorese wird für ca. 45 min durchgeführt, so dass das Bromphenolblau gerade noch im Gel verbleibt. 10. In der Zwischenzeit können die Fragen beantwortet werden. Färben von SDS-Polyacrylamidgelen mit Coomassie Die Visualisierung von Proteinbanden wird durch Inkubation des Gels in einer Färbelösung erreicht. Die zwei gebräuchlichsten Methoden sind die Silberfärbung und die Färbung mit Coomassie (siehe rechts). Die Silberfärbung ist zwar sensitiver als die CoomassieFärbung, und detektiert 2-5 ng Protein pro Bande in einem Gel. Allerdings ist diese Methode aufwendiger und teurer. Die Silberfärbung hängt von der Reaktion von Silber mit Sulfhydryl (-SH) oder Carboxyl-Gruppen (COOH) in Proteinen ab, wodurch die Methode nicht zur Quantifizierung geeignet ist, da die Färbung von Protein zu Protein stark variieren kann. Die CoomassieFärbung, obwohl weniger sensitiv (50 ng Protein / Bande sind gerade noch zu sehen), ist quantitativ und wird hier im Folgenden beschrieben. 1. Abschalten des Spannungsnetzgerätes. Kabel aus Spannungsnetzgerät ziehen. Gelkammerdeckel abnehmen. Puffer abgießen, Klammern entfernen und Gelkassette herausnehmen. (Apparatur, Glasplatten etc. mit Wasser reinigen) 2. Eine der beiden Glasplatten mit einem Spatel vorsichtig „anhebeln“ (nicht im Bereich der „Öhrchen“, da diese leicht abbrechen) und die Glasplatte abnehmen. 3. Evtl. mit einer Glasplatte die Taschen zu ¾ abschneiden 4. Gel in ein Becherglas mit ca. 200 ml Coomassie-Färbelösung (enthält Methanol) geben, die Gele in der Färbelösung einmal aufkochen, ab und zu schwenken, um eine gleichmäßige Färbung zu erreichen. 5. Die Färbelösung danach durch einen Filter in das Sammelgefäß gießen (Vorsicht, nicht das Gel mit in den Filter gießen). 6. Das Gel mit Wasser kurz abspülen und mit ca. 200 ml Entfärbelösung bedecken und einige Minuten darin kochen, den Vorgang mit frischer Entfärbelösung mind. 1 wiederholen. Die gebrauchte Entfärbelösung wird durch einen Filter mit Aktivkohle ins Sammelgefäß zurückgegossen. 14 Affinitätschromatographie/Elektrophorese 7. Die fertig gefärbten Gele können bis zur Dokumentation durch den Assistenten in Wasser aufbewahrt werden. Teil 3: Thermische Denaturierung des GFP-Proteins Aufgabe Der Einfluss von Temperatur und SDS auf die Aktivität des GFP-Proteins soll untersucht werden. Die Versuchsdurchführung soll selbstständig entwickelt und vollständig protokolliert werden. Die Rahmenbedingungen des Versuchs sind unten angegeben. Rahmenbedingungen Die Fluoreszenz des GFP-Proteins hängt von der Umgebung des Fluorophors ab, also von der Integrität der Proteinstruktur. Wird das Protein denaturiert (durch Hitze, Detergentien etc.), verringert sich die Fluoreszenz. Das Aufgereinigte GFP-Protein soll auf verschiedene Temperaturen für 2 min erhitzt werden. Nach Entnahme aus dem Heizblock soll sofort bzw. nach weiteren 5 min die Fluoreszenz unter der UVHandlampe beobachtet und mit einer Referenz verglichen werden. Des Weiteren wird der Einfluss von SDS auf die Proteinstabilität getestet. Beobachtete Fluoreszenz (-, ±, +)1 Temperatur Sofort Nach 5 min RT ( ca. 22 °C) 50 °C 70 °C 95 °C 0.2 % SDS 0.2 % SDS + 70°C 2 % SDS 2 % SDS + 70 °C 1 - (keine/kaum Fluoreszenz); ± (verringerte Fluoreszenz), + (unveränderte Fluoreszenz) 15 Affinitätschromatographie/Elektrophorese Fragen/Aufgaben 1. Welche Aufgabe hat das Lysozym bei der Herstellung des Zellextraktes? 2. Warum absorbiert der Fluorophor des GFP Proteins (siehe rechts) im sichtbaren Bereich, während z.B. die Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan Absorptionsmaxima bei 280 nm haben? 3. Welches Prinzip liegt der Elution des His-tag Proteins mit Imidazol zu Grunde? 4. Wie könnte die Elution des His-tag Proteins von der NiNTA-Matrix noch erfolgen? (Denken Sie an die Ladungseigenschaften von Histidin). 5. Wozu dient das Natriumdodecylsulfat (SDS; siehe rechts) bei der Gelelektrophorese? 6. Wozu enthält der Auftragspuffer -Mercaptoethanol (siehe HO rechts)? 7. Zeichnen SH Sie schematisch eine SDS-PAGE von Immunoglobulin in An- bzw. Abwesenheit von Mercaptoethanol im Probenpuffer! 8. Berechnen Sie die molare Konzentration für das GFPProtein, wenn Sie in einer Lösung eine Absorption von 0.5 bei 397 nm gemessen haben. Die Schichtdicke d der Küvette sei 1 cm, der molare Extinktionskoeffizient von GFP ε397nm beträgt 30000 cm-1M-1, Wieviel µg Protein haben Sie dann in 10 µl? (Molekulargewicht = 28600 entspricht einer molaren Masse von 28600 g/mol). 9. Zur Bestimmung des Molekulargewichts eines Proteins soll von Ihnen der Logarithmus des Molekulargewichts, log(Mr), für die Markerproteine gegen die relativen, elektrophoretischen Mobilitäten im SDS-Gel aufgetragen. (Die relative, elektrophoretische Mobilität (Rf-Wert) eines Proteins ist das Verhältnis der Laufstrecke des Proteins vom Auftragspunkt zu der Laufstrecke des Farbstoffs (Bromphenolblau). 10. Bestimmen Sie das apparente Molekulargewicht von GFP anhand seines Rf-Wertes in dem von Ihnen durchgeführten Experiment! 16 Affinitätschromatographie/Elektrophorese Geräte und Materialien Geräte Tischzentrifuge Spinsäule (1) UV-Handlampe Gelkassette (2 Glasplatten, 3 Spacer, 1 Kamm, 3 Klammern) Vertikalelektrophoresekammer Spannungsnetzgerät (Power-Supply) Heizgerät Abzug Materialien für die Proteinaufreinigung Ni-NTA-Agarose (Qiagen) Bakterielles Zelllysat aus GFP-überproduzierendem E. coli Stamm 2-ml Reaktionsgefäße (7) 0,5-ml Reaktionsgefäße (8) Lysispuffer (ca. 3 ml) 5 mM Imidazol 0,3 M NaCl 50 mM Na-Phosphat, pH 8,0 Waschpuffer (ca. 1.5 ml) 20 mM Imidazol 0,3 M NaCl 50 mM Na-Phosphat, pH 8,0 Elutionspuffer (250 µl) 200 mM Imidazol 0,3 M NaCl 50 mM Na-Phosphat, pH 8,0 Lösungen für die SDS-Gelelektrophorese Trenngel Färbelösung 15 % (w/v) Acrylamid:Bisacrylamid (29:1) 0,2 %(w/v) Coomassie Brilliant Blue R 250 0,42 M Tris-HCl pH 8,8 0,05 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue G 250 0,1 % (w/v) SDS 40 %(v/v) Ethanol 5 % (v/v) Methanol Sammelgel 10 % (v/v) Eisessig 6 % (w/v) Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) 0,13 M Tris-HCl pH 6,8 Entfärbelösung 0,1 % (w/v) SDS 7 %(v/v) Eisessig Polymerisations-Starter/Katalysator 40 % (w/w) Ammoniumperoxodisulfat Molekulargewichts-Standard für SDSGelelektrophorese N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Merck Protein-Standardmischung IV: (1 mg/ml) Cytochrome C; Mr = 12400 SDS-Elektrophorese-Laufpuffer Myoglobin; Mr = 16900 25 mM Tris Carboanhydrase; Mr = 30000 190 mM Glycin Ovalbumin; Mr = 42700 0,1 % (w/v) SDS pH 8,3 Albumin; Mr = 66300 Laemmli-Auftragspuffer (LAP 5) (50 µl Ovotransferrin Mr = 78000 160 mM Tris-HCl pH 6,8 Abdichtagarose 2 % (w/v) SDS 2 % in H2O 5 % (v/v) -Mercaptoethanol 40 % (v/v) Glycerin 0,1 % (w/v) Bromphenolblau SDS-Lösung (1 ml) 10 % (w/v) SDS 17 Ionenaustauschchromatographie / Gelfiltration Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration Theoretischer Hintergrund Struktur und Eigenschaft von Aminosäuren, isoelektrischer Punkt, Proteinstruktur (Primär-, Sekundär-, Tertiär-, Quartärstruktur), Denaturierung, Ionenaustauschchromatographie, Proteinnachweisverfahren. Aminosäuren (Grundstruktur siehe rechts) lassen sich nach verschiedenen Kriterien (Eigenschaften der Seitenkette R) gruppieren z.B. 1. unpolar, 2.= polar, 3.= geladen (sauer/basisch). Charakteristisch für alle Aminosäuren ist die zwitterionische Form bei pH 7, d.h. die -Aminogruppe ist protoniert, während die Carboxylgruppe deprotoniert vorliegt. Abbildung 6 Strukturformel und Namen von Aminosäuren: Peptide und Proteine entstehen aus Aminosäuren durch Ausbildung einer Säureamidbindung zwischen der Carboxylgruppe der einen Aminosäure und der Aminogruppe der nachfolgenden Aminosäure (Abbildung 7). 18 Ionenaustauschchromatographie / Gelfiltration A B Abbildung 7: Bildung und Hydrolyse der Peptidbindung (A); Struktur der Peptidbindung (B). Isoelektrischer Punkt (pI, IP oder auch IEP) gibt den pH-Wert an, an dem die Nettoladung eines Molekül (z.B. ( IP Aminosäure, Peptid pK ( 10 ) pK ( 01) 2 oder Protein) gleich Null ist. Er berechnet sich gemäß ), wobei die beiden pK-Werte entscheidend sind, die von der einfach negativen zur ungeladenen (Ladungszustand -10) Spezies bzw. von der ungeladenen zur einfach positiv geladenen Spezies (0+1) führen (siehe Abbildung 8). Abbildung 8: Titrationskurve des Glycins: Im Sauren (pH =0) liegt die Aminosäure zunächst als Kation vor und geht dann mit zunehmenden pH-Wert über ein nach aussen hin ungeladenes Zwitterion (Betain) in ein Anion über. Im vorliegenden Fall ist der IP für Glycin IP pK pK 1 2 / 2 = 5.97. Aus Nelson, D. L. & Cox, M. M. (2001). Die Begriffe Primär-, Sekundär- (-Helix, -Faltblatt, turns, etc.) Tertiär-, Quartärstruktur (Abbildung 9) sollten kurz beschrieben werden können. Sekundär-, Tertiär- und Quartätstruktur werden durch folgende Wechselwirkungen „zusammengehalten“ (Abbildung 10): 19 Ionenaustauschchromatographie / Gelfiltration Abbildung 9: Primär-, Sekundär-, Tertiär-, Quartärstruktur. Aus Nelson, D. L. & Cox, M. M. (2001). Abbildung 10: Wichtige Wechselwirkungen, die in Proteinen auftreten (1) Wasserstoffbrückenbindungen (hier zwischen der Carbonylgruppe und der Iminogruppe von Peptibindungen); (2) Disulfidbrücke zwischen zwei Cysteinresten; (3) ionische Wechselwirkung (Asparat und Lysin); (4) „hydrophobe“ Wechselwirkungen zwischen unpolaren Seitenketten (Valin und Isoleucin). Aus: Karlsson, 1988. Ionenaustauschchromatographie Das Verfahren beruht auf der elektrostatischen Bindung von geladenen Molekülen an eine gegensätzlich geladene Matrix Abbildung 11: Prinzip der Ionenaustauschchromatographie 20 Ionenaustauschchromatographie / Gelfiltration Die Bindung von Proteinen ist abhängig vom isoelektrischem Punkt der bindenden Moleküle, pH und Ionenstärke (Salzkonzentration) Die Phasen der Chromatographie umfassen o Probenauftrag o Waschen der Säule (schwach-gebundene Proteine werden von der Säule entfernt) o Eluieren der gebundenen Moleküle durch Schwächung der elektrostatischen Wechselwirkung (Erhöhung der Salzkonzentration, Variation des pH) Die Ionenaustauschchromatographie flüssigkeitschromatographischen ist eine Trennmethoden. Das der ihr für die zugrunde Biochemie liegende wichtigsten Prinzip ist die Wechselwirkung von gelösten positiv oder negativ geladenen Teilchen mit einer gegensinnig geladenen festen Matrix. Man unterscheidet nach dem gelösten Teilchen die Anionenaustausch- von der Kationenaustauschchromatographie. Um die gebundenen Teilchen wieder von der Matrix abzulösen, wird in der Regel mit Hilfe eines Ionenstärkegradienten (z.B. 0 – 500 mM NaCl) oder pH-Gradienten eluiert. Biomoleküle tragen je nach pH-Wert positive, keine oder negative Ladungen. Der isoelektrischen Punkt (pI) ist der pH Wert, an dem das Biomolekül insgesamt ungeladen vorliegt (siehe Abbildung 8). Neben der reinen Nettoladung der Moleküle ist die Ladungsverteilung für viele Eigenschaften der Moleküle von Bedeutung. Anionenaustauschchromatographie Anionen (in der Lösung = mobile Phase) binden an Kationen (meist quartäre Ammoniumverbindungen, die an eine Matrix gebunden sind = stationäre Phase). Die Elution kann durch Salz oder Erniedrigung des pHWertes erfolgen. Zur Bindung z.B. eines Proteins sollte der pH > pI sein. Beispiele für starke und schwache Anionenaustauschmaterialien sind MonoQ (-CH2N+(CH3)3) oder DEAE-Sepharose (- CH2N+H(CH3)2). Kationenaustauschchromatographie Kationen (mobile Phase) binden an Anionen (stationäre Phase). Die Elution kann durch Salz oder Erhöhung des pH-Wertes erfolgen. Zur Bindung z.B. eines Proteins sollte der pH < pI sein. Beispiele für starke und schwache Kationenaustauschmaterialien sind MonoS (-CH2SO3-) oder CM-Cellulose (-COO-). Versuchsbeschreibung Aufgabe Die Taq-DNA-Polymerase hat herausragende Bedeutung aufgrund ihrer Verwendung in der PCR (siehe Versuchstag „Nukleinsäuren“). Taq-DNA-Polymerase hat ein Molekulargewicht von 94000 und einen isoelektrischen Punkt (pI) von 6,04. Für den Versuch wurde das Gen für die Taq-DNA-Polymerase, das auf einem Plasmid vorliegt, in E. coli exprimiert. Im Gegensatz zu E. coli lebt Thermus aquaticus bei Temperaturen zwischen 50 °C und 80 °C. Die Aufreinigung des Proteins erfolgt aufgrund der Thermostabilität des Proteins. Durch Erhitzen der Zellhomogenates auf 75 °C denaturieren und aggregieren die meisten Proteine aus E. coli und können durch einen einfachen Zentrifugationsschritt von der in Lösung verbleibenden Taq-DNA-Polymerase abgetrennt werden können. Anschließend wird die angereicherte Taq-DNA-Polymerase mittels Anionenaustauschchromatographie weiter aufgereinigt. Die Aufreinigung des Proteins wird durch einen kolorimetrischen Assay (BCA-Assay) verfolgt. 21 Ionenaustauschchromatographie / Gelfiltration Teil 1: Anionenaustauschchromatographie Im Laufe dieses Versuchsteils werden Aliquots oder Fraktionen erhalten, die für den zweiten Versuchsteil benötigt werden. Diese Fraktionen sind jeweils mit FETTEN Buchstaben/Zahlen gekennzeichnet. Diese Probenlösungen werden in zuvor zu beschriftenden 2-ml Reaktionsgefäßen aufbewahrt. (H, Ü, Ü1, D1, D2, D, W1, W2, W3, W4, E1-E8). Zur besseren Übersicht ist auf der folgenden Seiten ein Schema für den Versuchsablauf dargestellt. Die Schritte 1-3 werden von den Assistenten durchgeführt, da in diesem Praktikum keine Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO) durchgeführt werden sollen. 1. Zellpellet für 15 min auf Eis auftauen lassen 2. Pellet in 400 µl Puffer A gründlich resuspendieren (Das Resuspendieren kann durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren erfolgen. In der Regel 2-5 ml pro g Naßgewicht an Zellen). 3. 0,6 mg Lysozym (60 µl einer Lysozymlösung von 10 mg/ml) zusetzen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren 4. 400 µl Puffer B zugeben und 1 h bei 75 °C im Dri-Block inkubieren. 50 µl in Reaktionsgefäß (H) überführen. Dafür eine gestutzte Pipettenspitze benutzen. Anschließend den Rest zentrifugieren (10 min, Tischzentrifuge, 14,000 U/min; ca. 14,000g). Überstand vorsichtig in Reaktionsgefäß (Ü) dekantieren und das Pellet verwerfen. 5. Überstand mit 800 µl Puffer B versetzen 6. 120 µl Probe für Proteinbestimmung in Reaktionsgefäß (Ü1) überführen. 7. Überstand in zwei 750 µl Fraktionen auf die Säule auftragen (Flussrate: Tropfen pro min bitte notieren. Achtung! Säule darf nie trocken laufen) und den Durchlauf in Reaktionsgefäß (D1) und (D2) auffangen und vereinigen (→ D). 8. Anschließend mit 4750 µl Puffer B waschen und in Reaktionsgefäße W1, W2, W3 und W4 sammeln. 9. Taq-DNA-Polymerase mit 8200 µl Puffer C eluieren. Dabei 200 µl Fraktionen in Reaktionsgefäße E1 bis E8) sammeln. Die Polymerase eluiert üblicherweise in der Fraktion 2. 10. Mit den gesammelten Probenlösungen wird nun die Proteinbestimmung durchgeführt (siehe unten). 22 Ionenaustauschchromatographie / Gelfiltration Homogenat 50µl H 75°C,1h Zentrifugation Pellet verwerfen Überstand in neues Gefäß überführen +800µl PufferB Überstand Ü 120µl Ü1 Durchlauf auffangen und vereinigen D Probe auf Säule auftragen (2x750µl) Säule Waschen (4x750µl PufferB) W1 W2 Waschfraktionen auffangen W3 W4 Elution 8x200µl PufferC E1 E2 E3 E4 Eluate auffangen E5 E6 E7 E8 23 Ionenaustauschchromatographie / Gelfiltration Teil 2: Proteinbestimmung mit dem BCA-Reagenz Proteine lassen sich durch verschiedene Methoden sowohl qualitativ als auch quantitativ erfassen. Einige der am häufigsten verwendeten Methoden sind in Tabelle 1 kurz dargestellt. Tabelle 1 Übersicht einiger Proteinbestimmungsmethoden Methode Prinzip Messbereich BCA Reduktion von Cu2+ zu Cu+ 0.2 – 50 µg durch eine Reaktion mit Störung durch NH4+, EDTA; Überschuß an reduzierenden Peptidbindungen; Cu+- Substanzen Reaktion mit Bicichoninat UV-Absorption (280 nm) -* Absorption aromatischer 20-3000 µg u.a. Nukleinsäuren 0.2-20 µg Triton-X-100, SDS Aminosäuren Coomassie-Brilliant-Blau Bradford Bindung an basische und aromatische Aminosäurereste In diesem Versuch wird die BCA-Methode (Bicichoninsäure; Strukturformel siehe rechts) eingesetzt, die wenig störanfällig aber zugleich sensitiv ist. BCA-Arbeitslösung: 50 Volumenteile (7,5 ml) des BCA-Reagenz A und 1 Volumenteil (150 µl) BCA Reagenz B werden in einem Messzylinder gemischt. (Die anfänglich auftretende Trübung verschwindet nach Mischen und ergibt eine grüne Lösung.) Herstellung der BSA-Verdünnungsreihe Beschriftung von 1-ml Reaktionsgefäßen von „I – VII“. Gefäß „BSA“ enthält 2mg/ml Rinderserumalbumin Name der Volumen / [µl] aus Gefäß Wasser / Endkonzentration BSA [µl] / [µg/ml] BSA 125 1500 Verdünnung I 375 II 333 I 167 1000 III 375 II 125 750 IV 333 III 167 500 V 250 IV 250 250 VI 250 V 250 125 VII 100 VI 400 25 24 Ionenaustauschchromatographie / Gelfiltration Für die eigentliche Farbreaktion werden die Lösungen in eine Mikrotiterplatte (flacher Boden) nach folgendem Schema pipettiert: 1 2 3 4 5 6 7 I II III IV V VI VII A 8 I II III IV V VI VII H Ü1 D W1 W2 W3 W4 D E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 B B 11 12 H20 C Puffer Puffer Puffer A C 10 Puffer Puffer Puffer A B 9 H20 C E8 25 µl der jeweiligen BSA-Verdünnungsreihe bzw. der Probenlösung in die Mikrotiterplatte pipettieren und mit 200 µl BCA-Arbeitslösung mischen. (Dabei die Bildung von Luftblasen vermeiden – warum ?) Nach Inkubation der Mikrotiterplatte für 30 min bei 37 °C erfolgt die quantitative Auswertung mit Hilfe eines Mikrotiterplatten-Lesegerätes durch den Assistenten. Die Messung erfolgt bei einer Wellenlänge von 550 nm (Welche Farbe sollte daher der Farbkomplex haben?). Auswertung die Extinktionen (Messwerte) der BSA-Verdünnungsreihe werden gegen die entsprechenden Proteinkonzentration aufgetragen (Millimeterpapier) die Eichkurve (liegen die Messpunkte auf einer Geraden?) wird a) nach Augenmaß oder b) nach Berechnung der linearen Regressionsgeraden unter Verwendung der Geradengleichung y a bx gezeichnet (falls entsprechend ausgestattete Taschenrechner zur Hand sind) Ermittlung der Proteinkonzentration in den einzelnen Fraktionen nach Abzug der Extinktion der entsprechenden Pufferwerte anhand der Eichgeraden. 25 Ionenaustauschchromatographie / Gelfiltration Teil 3: Gelfiltration von Myoglobin Myoglobin (aus dem Pferdemuskel) hat ein Molekulargewicht von 16900 und einen isoelektrischen Punkt (pI) von 7,36. Das Protein ist ein Monomer und hat als Kofaktor Eisen und Häm gebunden. Myoglobin ist der Prototyp eines globulären Proteins, das fast ausschließlich aus -Helices besteht. In diesem Versuchteil soll Myoglobin von höher- und niedermolekularen farbigen Substanzen (Blue Dextran mit Molekulargewicht 2.000.000 und Azorubin, Molekulargewicht 600) durch Gelfiltration getrennt werden. Bei der Gelfiltrationschromatographie (= Abbildung 12: CartoonDarstellung von Myoglobin. Größenausschlusschromatographie; Molekularsiebchromatographie) trennt man Substanzen nach ihrer Größe bzw. ihrem hydrodynamischen Radius auf. Große Moleküle eluieren dabei schneller als kleine. Ausschlaggebend für die Trennung ist die (einheitliche) Porengröße des Säulenmaterials. Dieses bestimmt die Ausschlussgröße (z.B. Molekulargewicht > 10.000). Moleküle, die größer sind als die Ausschlussgröße, können nicht in die Poren eindringen, und eluieren daher eher von der Säule (V0: Ausschlussvolumen). Moleküle, die kleiner sind als die Ausschlussgröße, können in die Poren eindringen und eluieren bei einem bestimmten Volumen (Ve: Elutionsvolumen). Sind die Moleküle sehr klein, können sie sich so gut wie im gesamten Volumen der Säule aufhalten (Vt: Totalvolumen). Folgende Normierung hat sich als zweckmäßig erwiesen: K av Ve V0 Vt V0 Trägt man den log(Mr) gegen Kav auf, so erhält man eine Gerade. Versuchsdurchführung Ein Gemisch von Azorubin (0,05 % (w/v)), Myoglobin (20 mg/ml) und Blue Dextran 2000 (1 mg/ml) soll durch Gelfiltration getrennt werden. Hierzu wird eine Pasteurpipette mit ca. 3 ml Sephadex G-100, equilibriert mit 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7,5, gefüllt. Vom Gemisch werden 50 µl vorsichtig auf die Säule aufgetragen und dann mit 10 300 µl Puffer eluiert. Beobachten Sie, wie und in welcher Reihenfolge die Substanzen eluieren. Notieren Sie dabei das Volumen, bei dem die Substanzen von der Säule Abbildung 13: Prinzip der Gelfiltration eluieren. 26 Ionenaustauschchromatographie / Gelfiltration Fragen/Aufgaben 1. Warum wird die Lösung in Arbeitsschritt 4 auf 75 °C erhitzt? 2. Warum bindet Taq-DNA-Polymerase bei pH 5.0 an das Anionaustauschsäulenmaterial? Was würde passieren, wenn der pH 5,0 statt pH 7,9 betragen würde? 3. Welche Aminosäuren/ funktionellen Gruppen tragen zur Nettoladung eines Proteins bei? 4. Nach welchen Eigenschaften kann man Aminosäuren in verschiedene Gruppen einteilen? 5. Beschreiben Sie kurz, was man unter Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur von Proteinen versteht! 6. Warum wird das Enzym durch Puffer C eluiert? 7. Warum zeigt Puffer A im BCA-Assay eine relativ hohe Absorption? 8. Berechnen Sie den isoelektrischen Punkt (pI) von Histindin pK1 (-Carboxylgruppe) = 2,1; pK2 (Aminogruppe) = 9,47; pKR (Seitenkette) = 6,0? 9. Berechnen Sie den isolektrischen Punkt für folgendes Tripeptid: His-Ala-Glu! Zeichnen Sie die Strukturformel des Tripeptids bei pH 0, pH 14 und am isoelektrischen Punkt! (Anmerkung: Um den IP zu berechnen, kann man sich zunächst überlegen, welche Nettoladung die Verbindung im sauren, also bei pH =0, hat. Dann muss man nur noch die beiden pK-Werte finden, die von der einfach positiv zur einfach negativ geladenen Spezies führen) pK1 (-Carboxylgruppe) = 2,1; pK2 (-Aminogruppe) = 9,47; pKR1 = 4,07 (Glu); pKR2 = 6,0 (His)! 10. Erklären Sie das Trennprinzip bei der Gelfiltration? 27 Ionenaustauschchromatographie / Gelfiltration Geräte und Materialien Geräte Pipetten Dri-Block® Tischzentrifuge Spinsäule Mikrotiterplatten-Reader oder Photometer Taschenrechner (ist mitzubringen) Materialien/Lösungen bakterielles Zelllysat aus Taq-DNA-Polymerase überproduzierendem E. coli Stamm DE52 (Anionenaustauschermaterial) Lysozym (10 mg/ml) Puffer A (Resuspensionspuffer) 50 mM Hepes-KOH, pH 7,9 50 mM Glucose 1 mM EDTA Puffer B (Bindungspuffer) 20 mM Hepes-KOH, pH 7,9 1 mM EDTA 0,5 %(v/v) Tween-20 0,5 % (v/v) IGEPAL CA 630 50 mM KCl Puffer C (Elutionspuffer) 20 mM Hepes-KOH, pH 7,9 1 mM EDTA 0,5 %(v/v) Tween-20 0,5 % (v/v) IGEPAL CA 630 200 mM KCl BCA-Reagenz A: 1,0 % BCA-Na2 (Bicinchoninsäure) 2,0 % Na2CO3 0,16 % NaK-Tartrat 0,4 % NaOH 0,95 % NaHCO3 pH auf 11,25 mit 50 % NaOH BCA-Reagenz B 4 % (w/v) CuSO4 28 Nukleinsäuren und PCR Nukleinsäuren und PCR Theoretischer Hintergrund Stichworte DNA/RNA (Struktur, Bausteine, genetischer Code etc), Replikation, Transkription, Reparatur, Polymerasekettenreaktion, Gelelektrophorese Abbildung 14: Struktur von Nukleinsäuren Links: Base (Purin oder Pyrimidin) und Zucker (Ribose, eine Pentose) bilden das Nukleosid. Das Nukleosid bildet zusammen mit dem Phosphat (Esterbindung) das Nukleotid. Im ATP sind zwei weitere Phosphate (diesmal über energiereiche Säureanhydridbindungen) an das erste Phosphat bzw. zweite Phosphat gebunden. Rechts oben: Formelausschnitt aus einem Einzelstrang DNA bzw. RNA; man beachte die negative Ladung an den Phosphodiesterbindungen, sowie am 5’ Ende. Rechts unten: Basenpaarungen in der DNA zwischen Thymin und Adenin (2 Wasserstoffbrücken) bzw. Cytosin und Guanin (3 Wasserstoffbrücken). 29 Nukleinsäuren und PCR Abbildung 15: Struktur und Replikation von DNA Oben: Einbau von dNTP an das 3’OH-Ende des Primer-Strangs. Unten: Replikationsgabel mit leading und lagging Strang an der (DNA Synthese erfolgt immer in 5’-3’-Richtung.) Prinzip der PCR-Reaktion Die PCR (polymerase chain reaction) ist heute als Methode für den Biologen nicht mehr wegzudenken. Seit ihrer ersten Beschreibung 1986 von Nobelpreisträger K. Mullis gibt es mehr als 100,000 Publikationen, in denen diese Methode Verwendung findet (DNA-Klonierung, Mutagenese, DNASequenzierung, forensische DNA-Diagnostik u.v.a.). Mit Hilfe der PCR kann genetisches Material in vitro vervielfältigt werden. Wesentlicher Bestandteil der PCR ist eine thermostabile DNA-Polymerase, die die Vervielfältigung der DNA katalysiert. PCR Komponenten DNA-Matrize (template) alle vier dNTPs (=Desoxynukleotidtriphosphate: dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sequenzspezifische Oligodesoxynukleotide (="Primer") hitzestabile Taq (=Thermus aquaticus) DNA-Polymerase. 30 Nukleinsäuren und PCR Darstellung der drei Reaktionsschritte Die DNA, welche als Vorlage (template) dient, liegt als Doppelstrang (dsDNA) vor. Denaturierung: Beim Erhitzen auf 95°C denaturiert der Doppelstrang in zwei Einzelstränge (single stranded, ssDNA). Annealing: Schnelles Abkühlen verhindert die Reassoziation der ssDNA zum Doppelstrang, so dass weiterhin Einzelstränge vorliegen. Schon während des Abkühlens lagern sich die im Reaktionsansatz vorliegenden, entgegengesetzt orientierten Primer (sense und charakteristischen komplementären antisense) Temperatur bei an Strangabschnitte einer die des für sie entsprechend Templates an (= Primerhybridisierung, annealing). Die „Schmelzpunkte“ der Primer und die damit zu verwendende Annealing-Temperatur lassen sich mit Hilfe verschiedener Computer-Programme berechnen. Als Faustformel kann man sich aber merken: 2 °C pro A/T und 4 °C pro G/C-Basenpaar. (Bsp.: GCGAACGTTCGACTCA: 7 (A+T) 2 °C + 9 (G+C) 4 °C = 50 °C). Die Spezifität der Primer-template-Wechselwirkung ist abhängig von der Länge der Primer: So kommt die Sequenz eines 10 Nukleotide langen Primer statistisch gesehen nur einmal in einer 106 (= 410) Nukleotiden langen Sequenz vor, die eines 20 Nukleotiden langen Primers sogar nur einmal in einer 10 12 (= 420) Nukleotiden langen Sequenz. Synthese: In Anwesenheit von dNTPs synthetisiert die TaqDNA-Polymerase angelagerten ausgehend Primern an von den den 3’-Enden Einzelsträngen der einen komplementären DNA-Strang. Es entsteht ein Doppelstrang (Primerverlängerung, extension). Durch diese in vitro- Replikation entstehen zwei neue doppelsträngige DNA-Moleküle, die ihrerseits wieder als Template dienen. Erneute Hitzedenaturierung führt dann zu vier Einzelsträngen, die wie im ersten Zyklus der Reaktion ergänzt werden. So wächst die Zahl an dsDNA-Molekülen nach 2n (n: Anzahl der Zyklen). Ein template kann also in 30 Zyklen theoretisch um das 109-fache amplifiziert werden: Die Zahl der Kopien N nach n Zyklen lässt sich mit folgender Formel berechnen N N 0 (1 E ) n , wobei N0 die Anzahl der Kopien zu Beginn der Amplifikation und E die Amplifikationseffizienz ist (0 < E < 1; wobei 0 = keine Amplifikation und 1 = maximale Amplifikation; Verdopplung aller Moleküle in jedem Zyklus); in der Regel liegt der Wert für die Amplifikationseffizienz E zwischen 0.6 und 0.8). 31 Nukleinsäuren und PCR Versuchsbeschreibung Aufgabenstellung In diesem Versuch wird DNA aus Bakterien mit Hilfe der PCR unter Verwendung der Taq-DNAPolymerase amplifiziert und mittels nativer Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Als template DNA werden drei verschiedene DNA-Proben eingesetzt, die zum einen das Wildtyp-Gen für das DNAReparaturprotein MutL enthalten, eine Deletionsvariante hiervon, bzw. eine Mischung beider Gene enthalten. Die verwendeten Primer binden außerhalb des Gens, so dass für beide Gene die gleichen Primer verwendet werden können. Neben der Amplifikation der beiden Gene soll die Abhängigkeit der PCR-Produktmenge von der Zyklenzahl untersucht, indem die PCR-Reaktion nach verschiedener Anzahl an Zyklen untersucht wird. Zur Analyse der PCR-Produkte wird eine Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel durchgeführt. Die Visualisierung der DNA erfolgt durch Färbung mit Ethidiumbromid. PCR-Reaktion Zusammensetzung eines 50 µl Reaktionsansatzes: Allgemeine PCR-Bedingung für die Taq-DNA-Polymerase (Variationen sind möglich und ggf. erforderlich!) Folgende Kombinationen von Plasmid-DNA und Taq-DNA-Polymerasen sollen verwendet werden: Alle Schritte werden auf Eis durchgeführt!! Alle Reagenzien auf Eis auftauen lassen und kurz vorher vortexen und kurz (<30 sec) zentrifugieren. (Bitte die Reihenfolge einhalten). Zunächst werden zwei Mastermixe hergestellt, die alle Komponenten bis auf die Plasmid-DNA enthalten. Berechnen Sie, welche Volumina Sie pipettieren müssen. Überlegen Sie dabei zunächst, welches Gesamtvolumen Sie benötigen! (Pipettierreihenfolge bitte einhalten) Master-Mix1 (für 10 Ansätze) Reagenz Konzentration im Vol. Mastermix1-Ansatz (µl) Steriles Reinstwasser (Restvolumen) dNTP-Mix, je 2 mM je dNTP, 400 µM Primer BBseqA 4 µM 0,8 µM Primer BBseqB 4 µM 0,8 µM Endvolumen Master-Mix 1 Master-Mix2 (für 10 Ansätze) Reagenz Konzentration im Vol. Mastemix2-Ansatz (µl) Steriles Reinstwasser (Restvolumen) MgCl2 25 mM 3 mM Taq PCR-Puffer 10 2 Taq-DNA-Polymerase 5 U/µl 0,2 U/µl Endvolumen Master-Mix2 32 Nukleinsäuren und PCR Stellen Sie von den Plasmid-Stammlösungen (8.25 ng/µl) 20 µl Verdünnungen in Wasser her, die jeweils 0.5 ng/µl DNA enthalten sollen. Die Plasmid DNA-Verdünnungen in einem dünnwandigen PCR-Gefäß vorlegen und mit je 11,5 µl Master-Mix1 mit 12,5 µl Master-Mix2 mischen (siehe Tabelle nächste Seite). Anschließend werden alle Ansätze mit 1-2 Tropfen Paraffinöl überschichtet (wenn zu wenig Paraffinöl über den Ansätzen ist, verdampft das Wasser und sammelt sich am Deckel) und in den Thermocycler stellen und das zuvor eingestellte Programm starten. AnsatzZahl der Zyklen Vol. A25 B25 C25 D25 D5 D10 D15 D20 D25 Plasmid 1 (0.5 ng/µl) µl - 1 0,5 - - - - - - Plasmid 2 (0.5 ng/µl) µl - - 0,5 1 1 1 1 1 1 Wasser µl 1 - - - - - - - - MasterMix 1 µl 11,5 11,5 11,5 11,5 11,5 11,5 11,5 11,5 11,5 MasterMix2 µl 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 Gesamtvolumen µl 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Bedingungen für die PCR im Thermocycler: Dauer der PCR: ca. 100 min Zyklus-Nr. 1 2 3 T / [°C] 95 95 55 72 72 4 Zeit / [sec] 300 30 30 120 300 999 Wiederholungen 1 25 1 Nach 5, 10, 15 und 20 Zyklen (ca. 25, 40, 60, 75 min) werden die Reaktionsansätze D5, D10, D15 und D20 aus dem Thermocylcer entnommen und auf Eis gelagert Nach Beendigung der PCR werden die restlichen Proben entnommen und ebenfalls auf Eis gelagert. Agarosegelelektrophorese Zur Analyse der PCR-Reaktionen wird eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt, bei der DNA nach ihrer Länge aufgetrennt wird. Die Visualisierung der DNA erfolgt nach der Elektrophorese durch Färbung mit Ethidiumbromid und Anregung der Ethidiumbromid-Fluoreszenz bei 302 nm. 1. 0.8 %ige Agarose in TPE-Puffer wird kurz (wenige Minuten) in der Mikrowelle erhitzt bis sich die Agarose vollständig gelöst hat. Anschließend lässt man die Agarosegellösung unter Rühren langsam auf ca. 50 °C abkühlen (dann kann man das Gefäß auch unten gut anfassen) Auf keinen Fall zu heiße Agarose auf das Geltablett gießen, da dieses sonst beschädigt werden kann. 2. Das Geltablett wird in die vorgesehene Gießapparatur eingesetzt und die beiden Kämme positioniert. Anschließend wird die flüssige Agarose auf das Geltablett bis zu einer Höhe von ca. 5 mm eingefüllt. Die „erstarrte“ Agarose erkennt man daran, dass das Gel opak geworden ist. 33 Nukleinsäuren und PCR 3. Das Geltablett wird vorsichtig aus der Gießapparatur entnommen und in die HorizontalGelelektrophoresekammer eingesetzt. In die beiden Pufferreservoirs wird nun TPE-Puffer (1) eingefüllt bis die Geloberfläche gerade mit Puffer bedeckt ist. 4. Nun kann der Kamm vorsichtig aus dem Gel herausgezogen werden. 5. Je 20 µl der PCR-Ansätze werden entnommen und mit 5 µl 5 Agarose-Auftragspuffer versetzt. (Die Pipettenspitze vorsichtig unter das Paraffinöl führen und die Probe entnehmen; darauf achten, dass kein Paraffinöl mit abgenommen wird). Die Proben werden mit einer 20 µl Pipette in die Geltaschen pipettiert. Oberer Reihe Spur 1 2 3 Probe Marker A25 B25 5 20 Vol. / µl 4 5 6 7 8 C25 D25 - - - 20 20 20 - - - 3 4 5 6 7 8 Untere Reihe Spur 1 2 Probe Marker D5 D10 D15 D20 D25 - - 5 20 20 - - Vol. / µl 6. 20 20 20 Der Kammerdeckel wird nun aufgesetzt und die Kabel in das Netzspannungsgerät eingesetzt (Rot = Plus = Anode; Schwarz = Minus = Kathode) 7. Spannungsnetzgerät ausschalten (darauf achten das der Schalter zunächst auf „off“ steht). Im Modus „set“ Spannung auf 80 V einstellen, Stromstärke auf Maximalwert einstellen. Schalter von „off“ auf „on“ stellen. 8. Nachdem der dunkelblaue Farbstoff (Bromphenolblau ca. 1 cm vor dem Gelende angekommen ist, wird die Elektrophorese gestoppt. (nach ca. 45 min). 9. Schalter auf „off“ stellen, Kabel aus Netzspannungsgerät ziehen, Deckel abnehmen. Geltablett aus Gelkammer nehmen 10. Das Gel wird nun vorsichtig in eine 2,5 µM Ethidiumbromidlösung überführt (Vorsicht, Ethidiumbromid ist mutagen und damit krebserregend) und für 30 min inkubiert 11. Dann wird das Gel aus der Färbelösung entnommen und in Wasser für weitere 30 min entfärbt 12. Die Geldokumentation wird zusammen mit einem Assistenten durchgeführt. 34 Nukleinsäuren und PCR Abbildung 16: Erwartetes Ergebnis für den Marker (M) und die Proben B25, C25 und D25. Die Längen (in bp) der Markerbanden sind an der linken Seite des Gels angegeben. 35 Nukleinsäuren und PCR Fragen/Aufgaben 1. In welcher Richtung erfolgt die Synthese von RNA/DNA in der Zelle? 2. Nennen Sie Unterschiede bei der Synthese von RNA bzw. DNA! 3. Wie erfolgt die Synthese von DNA am Beispiel des Einbaus von dGTP in ein Stück DNA? Warum wird nicht dGMP oder dGDP als Baustein von der Zelle verwendet? 4. Zeichnen Sie einen Ausschnitt aus einem DNA-Einzelstrang (Strukturformeln)! Kennzeichnen Sie dabei die Base, Zucker und die Phosphatgruppe, das Nukleosid, das Nukleotid sowie das 5‘ und das 3‘-Ende! 5. Wie kann die (chemische) Hydrolyse von DNA bzw. RNA in ihre Bausteine (Nukleotide) erfolgen? (Welche Art von Bindung muss gespalten werden?) Welche Art von Bindung muss gespalten werden? 6. Worauf beruht die Färbung der DNA durch Ethidiumbromid (siehe rechts)? 7. Eine Bakterienzelle (z. B. E. coli) ist ca. 1 µm 1 µm 2 µm groß. Wie hoch ist dann die molare Konzentration des Genoms in einer Zelle? (NA= 6,022 1023 Teilchen / mol). Tip: Berechnen Sie zunächst das Volumen der Zelle. 8. Wie viele Zyklen (n) muss man bei einer PCR mindestens durchführen, um ein 500 bp langes DNA-Fragment aus einer einzigen Zelle so zu amplifizieren, dass man 50 ng PCR Produkt erhält (Amplifikationseffizienz E = 1; molare Masse eines Basenpaares 660 g/mol)? Berechnen sie zunächst die molare Masse des DNAFragmentes. Daraus kann man die Stoffmenge N (mol) von 100 ng PCR-Produkt berechnen. 9. Die E. coli DNA-Polymerase III synthetisiert DNA mit einer Geschwindigkeit von ca. 1000 Nukleotiden pro Sekunde. Das E. coli Genom hat eine Größe 4106 Basenpaaren und enthält nur eine einzige Replikationsursprung (origin of replication). Wie lange dauert es, bis das Genom verdoppelt ist? 10. Die Taq-DNA-Polymerase hat eine Fehlerrate von ca. 10 -4. Berechnen Sie den Anteil an fehlerfreien PCR-Produkten der Länge 1000 bp nach 20, 30 und 40 Zyklen. Wie hoch ist der Anteil, wenn anstelle der Taq-DNA-Polymerase die genauere Pfu-DNA- Polymerase (Fehlerrate ca. 10-6) verwendet wird? 36 Nukleinsäuren und PCR Geräte und Materialien Geräte Thermocylcer Agarosegelkammer Mikrowelle Power-Supply Färbebad UV-Leuchttisch Geldokumentationssystem PCR-Reagenzien dNTP-Lösung je 2 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP, pH 7,0 Taq-DNA-Polymerasepuffer 10 (Promega) 100 mM Tris-HCl, pH 9,0 bei 25 °C 500 mM KCl 1 % (v/v) Triton-X-100 MgCl2-Lösung 25 mM MgCl2 Primer BBseq-A (4 µM) (CCCGCGAAATTAATACGACTC); Länge: 21 Nukleotide; Tm: 49,7 °C; GC: 47,6 % Primer BBseq-B (4 µM) (CTTCCTTTCGGGCTTTGTTAG) ; Länge: 21 Nukleotide; Tm: 49,2 °C; GC: 47,6 % DNA-Plasmide (siehe Abb. 5) Plasmid 1 = pTX418; Plasmid 2 = pET EcoLN. Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl) Agarosegelelektrophorese TPE-Puffer (Tris-Phosphat-EDTA) 100 mM Tris-Phosphat pH 8,2 20 mM EDTA Agarose 0.8 % (w/v) Agarose in TPE-Puffer Abbildung 17: Plasmidkarten der verwendeten template DNA Plasmide. Die Positionen der Primer BBseqA und BBseqB sind an Position 293 und 2619 bei pTX418wt bzw. 293 und 1483 bei pET EcoL N. Ethidiumbromidlösung 1 % (w/v) Ethidiumbromid (ca. 25 mM) 37 Nukleinsäuren und PCR Längenstandard (Marker) 30 ng/µl -DNA gespalten mit EcoRV (siehe Abbildung 16) 38
